專利名稱：一種提高重組蛋白分泌效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種提高重組蛋白分泌效率的方法。
背景技術(shù)：
人類利用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)治療性藥用蛋白已有數(shù)十年的歷史了。目前 人們主要釆用原核的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)以及真核的酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 來(lái)生產(chǎn)重組藥用蛋白。細(xì)菌生長(zhǎng)速度快，對(duì)其做遺傳修飾相對(duì)較容易些，尤 其是在工業(yè)化生產(chǎn)上成本要遠(yuǎn)低于哺乳動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)系統(tǒng)。但是細(xì)菌 表達(dá)系統(tǒng)由于其本身固有的一些缺陷，使其難以表達(dá)一些來(lái)源于高等真核生 物的復(fù)雜蛋白。其中一個(gè)主要的原因是細(xì)菌缺乏完善的翻譯后修飾系統(tǒng)，容 易使表達(dá)的重組蛋白形成不正確的折疊構(gòu)象以及缺少糖基化和乙?；揎?， 最終失去天然活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以有效克服細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)這些 不足之處，但是在細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)成本和重組蛋白產(chǎn)量上卻難以與細(xì)菌表達(dá) 系統(tǒng)相抗衡。雖然人們對(duì)提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)量做了許多優(yōu)化工作，在 一定限度上提高了產(chǎn)量，但是最終產(chǎn)量還是與細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)相差甚遠(yuǎn)(Wurm 2004)。 一種行之有效的提高產(chǎn)量的方法就是利用動(dòng)物乳腺作為生物反應(yīng)器。 乳腺生物反應(yīng)器具有高產(chǎn)量(l-20克/升)、低成本(轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的成本 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的1/100-1/10)和無(wú)病原污染等優(yōu)點(diǎn)。制備轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物乳腺生物反應(yīng)器的一般流程為構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠 驗(yàn)證乳腺表達(dá)載體在動(dòng)物乳腺中表達(dá)重組外源蛋白的效果，然后制備轉(zhuǎn)基因 大家畜以大規(guī)模生產(chǎn)重組外源蛋白，最終從乳汁中分離純化目的蛋白。由于 重組蛋白分泌到乳汁中，與表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的蛋白相比，其分離純化 工藝要相對(duì)簡(jiǎn)單(Hennighausen 1990; Clark 1998; Van Cott and Velander 1998)。 2006年一種商品名為ATyn，來(lái)自于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的抗血栓重組蛋白藥物被歐洲 藥品管理局批準(zhǔn)上市，標(biāo)志著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用于商業(yè)化生產(chǎn)藥物時(shí)代的到來(lái)。
對(duì)于如何提高重組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的產(chǎn)量，人們 已經(jīng)做了大量的優(yōu)化工作。這些工作主要集中轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的修飾，例 如選用較強(qiáng)的啟動(dòng)子，添加增強(qiáng)子和絕緣子，優(yōu)化密碼子，以及添加內(nèi)含子
等遺傳修飾(Fiering, Whitelaw et al. 2000; Lee and Young 2000; Zhang, Wu et al.2005)。但是關(guān)于提高重組蛋白分泌效率的研究工作相對(duì)較少，尤其是對(duì)轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物的分泌效率研究更少。
分泌性蛋白通常在其N端含有一段16-26個(gè)氨基酸長(zhǎng)的信號(hào)肽序列，信 號(hào)肽具有明顯的序列特征，它包括N端起始的蛋氨酸(甲硫氨酸)、帶正電 荷的氨基端區(qū)、高度疏水的中央核心區(qū)以及具有極性的羧基區(qū)。.牛卩酪蛋白 信號(hào)肽具有上述的所有特征，此外它的疏水核心區(qū)中亮氨酸與丙氨酸含量比 例為4: 2,研究表明當(dāng)疏水核心區(qū)中亮氨酸與丙氨酸含量比例在7: 3到2: 8范圍內(nèi)信號(hào)肽都具有正常的分泌功能，在有效的比例范圍內(nèi)提高亮氨酸的 含量可以促進(jìn)疏水螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，從而提高其分泌效率，牛(3酪蛋白 信號(hào)肽具有較高的亮氨酸/丙氨酸比值，因此被認(rèn)為是個(gè)具有較好分泌功能的 信號(hào)肽(Izard， Doughty etal.l995)。信號(hào)肽引導(dǎo)翻譯中的新生肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，
并進(jìn)行折疊和乙酰化、磷酸化等各種修飾，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基進(jìn)一步作糖基 化加工，最后以膜泡形式運(yùn)送到胞外(Walter, Gilmore et al. 1984; Rapoport, Jungnickel et al. 1996; Rapoport, Matlack et al. 1999)。然而，有一些蛋白，例如 轉(zhuǎn)錄因子Engrailed, Hoxa5和Pax6， HIV病毒蛋白Tat和皰疹病毒蛋白 VP22，以及其它一些蛋白，它們不含信號(hào)肽，但仍可以分泌至胞外，這些不 依賴信號(hào)肽的蛋白分泌形式被稱為非經(jīng)典分泌(Cleves 1997; Brooks, Lebleu et al. 2005; Amoys and Wang 2007; Dupont， Prochiantz et al. 2007)。非經(jīng)典分泌過(guò) 程中蛋白不經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基轉(zhuǎn)運(yùn)，而以一種或幾種不明機(jī)制直接運(yùn)輸至 胞夕卜(Derossi， Calvet et al. 1996; Joliot, Trembleau et al. 1997; Prochiantz and Joliot 2003)。
利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)分泌蛋白時(shí)，通常是給重組蛋白N 端添加一段經(jīng)典的信號(hào)肽序列。重組蛋白的分泌效率因信號(hào)肽和蛋白本身的 理化性質(zhì)的不同而有很大的差異，通常在表達(dá)一些非分泌性蛋白時(shí)經(jīng)常會(huì)遇到分泌效率低下的問(wèn)題；同時(shí)分泌效率還與選用的細(xì)胞系緊密相關(guān)，在一個(gè) 細(xì)胞系中可以獲得較好分泌效率的重組蛋白在另一個(gè)細(xì)胞系中很可能難以得 到同樣的表達(dá)分泌效果。 一個(gè)重要原因是細(xì)胞質(zhì)中的翻譯后修飾加工系統(tǒng)與 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的不同， 一些非分泌性蛋白在添加信號(hào)肽后，合成的新生肽鏈進(jìn) 入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，很可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的蛋白發(fā)生靜電和疏水交互作用，而且在 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的非還原性條件下容易形成二硫鍵，這些因素將導(dǎo)致肽鏈的錯(cuò)誤折疊， 無(wú)法形成正確的高級(jí)空間構(gòu)象，而不能被進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，最終將被
Sec61p復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中降解掉，嚴(yán)重影響了其分泌效率(Bamsh, Wang etal.2002)。非經(jīng)典分泌蛋白在細(xì)胞質(zhì)中完成肽鏈的合成并不進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，而 是被運(yùn)送到富含膽固醇和鞘糖脂的穴樣囊泡中，然后以一種尚未研究清楚的 機(jī)制分泌到細(xì)胞外。因?yàn)榉墙?jīng)典分泌過(guò)程中重組蛋白沒(méi)有進(jìn)入含有復(fù)雜蛋白 復(fù)合體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，不會(huì)發(fā)生由空間構(gòu)象引起的轉(zhuǎn)運(yùn)阻滯而導(dǎo)致的分泌效 率的降低。此外非經(jīng)典分泌不受細(xì)胞類型限制，所以它具有廣泛的應(yīng)用性， 容易從一種應(yīng)用推廣到另一種應(yīng)用中(Joliot and Prochiantz 2004; Sagan， Burlina et al. 2006)。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 要解決的技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是提供一種提高重組蛋白分泌效率的方法，本發(fā)明的又一 目的是公開(kāi)該方法在制備重組蛋白類藥物中的應(yīng)用。
(二) 技術(shù)方案
本發(fā)明提供了一種提高重組蛋白分泌效率的方法，它是將小鼠轉(zhuǎn)錄因子 Engrailed 2的同源異型結(jié)構(gòu)域中的分泌序列SS融合到重組蛋白的N端，其 中所述分泌序列SS的氨基酸序列為Ala Gin Glu Leu Ser Leu Asn Glu Ser Gln。
本發(fā)明所述的編碼分泌序列SS的核酸序列為 GCACAGGAGCTCAGCCTGAACGAGTCTCAG。
優(yōu)選地，所述重組蛋白為人過(guò)氧化氫酶。
本發(fā)明提供了重組人過(guò)氧化氫酶的經(jīng)典分泌表達(dá)載體psighCAT-EGFP, 其質(zhì)粒圖譜和構(gòu)建過(guò)程如附圖1所示。
本發(fā)明還提供了重組人過(guò)氧化氫酶的非經(jīng)典分泌表達(dá)載體 pSShCAT-EGFP,其質(zhì)粒圖譜和構(gòu)建過(guò)程如附圖1所示。
此外，本發(fā)明還公開(kāi)了所述方法在制備重組蛋白類藥物中的應(yīng)用。 (三)有益效果
本發(fā)明將小鼠轉(zhuǎn)錄因子Engmiled 2的同源異型結(jié)構(gòu)域中的分泌序列 SS:AQELGLNESQ加到融合了 GFP的人過(guò)氧化氫酶的N端，在CHO細(xì)胞中 表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)其分泌效率與原來(lái)的牛p酪蛋白信號(hào)肽引導(dǎo)的經(jīng)典分泌相比提 高到2.3倍，為工業(yè)生產(chǎn)中提高重組蛋白分泌效率提供了有效的解決手段。


圖1是經(jīng)典分泌和非經(jīng)典分泌表達(dá)載體構(gòu)建流程圖2是Nhel和Pstl雙酶切鑒定psighCAT-EGFP的電泳圖，其中，M表 示lkb梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1和2分別為pEGFP-Nl陽(yáng)性質(zhì)粒和經(jīng)典 分泌表達(dá)載體psighCAT-EGFP的Nhel和Pstl雙酶切結(jié)果，1.7kb條帶為融合 了牛P酪蛋白信號(hào)肽的人過(guò)氧化氫酶編碼序列，泳道3為psighCAT-EGFP的 Pstl酶切結(jié)果；
圖3是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖，其中，M表示100bp梯度 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，P表示陽(yáng)性質(zhì)粒psighCAT-EGFP的普通PCR結(jié)果，N表 示pEGFP-Nl陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，泳道1和2分別為psighCAT-EGFP和 pSShCAT-EGFP轉(zhuǎn)染；
圖4是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Western blot檢測(cè)結(jié)果圖，其中，P表示人過(guò)氧化 氫酶標(biāo)準(zhǔn)品，N表示pEGFP-Nl陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，泳道1和2分別為 psighCAT-EGFP和pSShCAT-EGFP轉(zhuǎn)染；
圖5是過(guò)氧化氫酶活性檢測(cè)圖，其中斜線柱形表示轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體 pEGFP-Nl,實(shí)心柱表示轉(zhuǎn)染分泌表達(dá)載體psighCAT-EGFP和pSShCAT-EGFP
的平均結(jié)果，^表示P〈0.01;
圖6是CHO細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)圖，其中，細(xì)胞核為DAPI染色，顯藍(lán)色 熒光，GFP為綠色熒光，PE為紅色熒光；A、 B和C表示轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體 pEGFP-Nl， G、 H和I為轉(zhuǎn)染經(jīng)典分泌表達(dá)載體psighCAT-EGFP， S、 T和U 為轉(zhuǎn)染非經(jīng)典分泌表達(dá)載體pSShCAT-EGFP，標(biāo)尺長(zhǎng)度20pm;
圖7是細(xì)胞分泌效率定量檢測(cè)結(jié)果圖，其中，經(jīng)典分泌的效率設(shè)為100， 圖為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明所述實(shí)施例所使用的載體、菌種、試劑及其來(lái)源 pEGFP-Nl載體(Clontech公司)，pMD19-T(TaKaRa公司)，ESTcDNA克隆 (IMAGE 4515735 )購(gòu)自Ivitrogen公司；宿主菌大腸桿菌DH5ot購(gòu)自Promega 公司，CHO細(xì)胞系購(gòu)自Ivitrogen公司；信號(hào)肽和非經(jīng)典分泌短肽的序列、引 物合成及序列測(cè)定由上海生工完成，Taq酶，T4DNA連接酶、內(nèi)切酶均來(lái)自 大連TaKaRa公司；抗人過(guò)氧化氫酶抗體購(gòu)自Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自 KPL公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、 PBS和胎牛血清購(gòu)自Gibico公司；脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000和RNA提取試劑TRIzo1均購(gòu)自Invitrogen公司，蛋白濃度測(cè) 定試劑盒、過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定試劑盒和細(xì)胞裂解液均購(gòu)自碧云天公司。酶 切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見(jiàn)《分子克隆(第 三版)》。
實(shí)施例1細(xì)胞分泌表達(dá)載體的構(gòu)建
1.1人過(guò)氧化氫酶經(jīng)典分泌表達(dá)載體構(gòu)建
經(jīng)典分泌載體整個(gè)構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖l，具體如下
以Invitrogen公司IMAGE編號(hào)4515735的EST cDNA克隆為模板，以 NCBI收錄的人過(guò)氧化氫酶基因全長(zhǎng)cDNA序列(登錄號(hào)NM_001752)為依
據(jù)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因編碼區(qū)序列，同時(shí)在序列的兩端分別引入Nhel和Pstl 酶切位點(diǎn)，并刪除了基因的終止密碼子。上游引物為Nhel F: 5'-TTGCTAGCAGATGAAGGTCCTCATCC-3'， 下游引物為 Pstl R: 5'-TTCTGCAGCAGATTTGCCTTCTCCCT-3'。將PCR產(chǎn)物回收后連接到 pMD19-T載體，進(jìn)行測(cè)序，證明序列正確后利用EcoRI和PstI作雙酶切，回 收1386bp片段，將回收產(chǎn)物連接到同樣經(jīng)過(guò)EcoRI和PstII雙酶切的 pEGFP-Nl載體,獲得pEcoRI-hCAT-EGFP載體；用HindIII和EcoRI雙酶切后， 回收208bp片段，連接到同樣經(jīng)過(guò)這兩種酶雙切的pMD19-T載體，獲得 pMD-hCAT-EcoRI載體。在距人過(guò)氧化氫酶翻譯起始位點(diǎn)15bp處有一 BamHI 酶切位點(diǎn)，所以在合成牛p酪蛋白信號(hào)肽DNA序列時(shí)，在其末端直接接上基 因的前15個(gè)bp序列，形成以下正負(fù)兩條鏈 +5,-CTAGC4ra44GGT(XTC47rC7TG(XTG(XTGG:rGGCrC rGGC(XTrC7C4 ATGGCTGACAGCCG&3'
-5 ，-GATCCCGGCTGTCAGCCAT7UCA4 04 GCC4 CC4 G
序列中斜體部分為牛(3酪蛋白信號(hào)肽，黑體部分為基因的前15bp序列，下劃線 為酶切位點(diǎn)序列。正負(fù)鏈100度水浴后退火形成5，末端帶Nhel和3，帶Bamffl酶 切位點(diǎn)的雙鏈DNA,連接到經(jīng)NheI和BamHI雙酶切的pMD-hCAT-EcoRI載體， 測(cè)序驗(yàn)證序列正確后，用NheI和EcoRI雙酶切載體，回收258bp連接到經(jīng)Nhel 和EcoRI雙酶切的pEcoRI-hCAT-EGFP載體，獲得人過(guò)氧化氫酶經(jīng)典分泌表達(dá) 載體psighCAT-EGFP。用Nhel和Pstl雙酶切鑒定結(jié)果表明1638bp的信號(hào)肽和人 過(guò)氧化氫酶融合序列已正確克隆進(jìn)載體(圖2)。
1.2人過(guò)氧化氫酶非經(jīng)典分泌表達(dá)載體構(gòu)建
非經(jīng)典分泌載體構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1 。
除了合成的非經(jīng)典分泌短肽DNA序列不同外，其余步驟與經(jīng)典分泌載體 的構(gòu)建方法一致。人工合成的小鼠轉(zhuǎn)錄因子Engmiled2的同源異型結(jié)構(gòu)域中的 分泌序列SS如下+:
CTAGCATGGC4C4G04GCTC4G(Xm^Ca4GrCTC^GATGGCTGACA GCCGG
GATCCCGGCTGTCAGCCATCra4a4CTCGrrC4GGCrG^GCr(X7CTGC
序列中斜體部分為SS序列，黑體部分為基因的前15bp序列，下劃線為 酶切位點(diǎn)序列。最終構(gòu)成的非經(jīng)典分泌表達(dá)載體命名為pSShCAT-EGFP，其 酶切鑒定結(jié)果與圖2—致。
實(shí)施例2 CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)檢測(cè) 2.1細(xì)胞培養(yǎng)及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
CHO細(xì)胞將種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 基中培養(yǎng)至70-80%匯合度時(shí)，按照說(shuō)明書(shū)要求，用Lipofectamine 2000脂質(zhì) 體將分泌表達(dá)載體psighCAT-EGFP和pSShCAT-EGFP以及對(duì)照空載體 pEGFP-Nl轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。
2.2 RT-PCR和Western blot檢測(cè)
轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，用TRIzol提取總RNA,并 用DNase去除殘留的DNA,作為模板，以O(shè)ligo dT引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈后， 用下面的一對(duì)引物擴(kuò)增人過(guò)氧化氫酶基因內(nèi)一段184bp長(zhǎng)的片段。上游引物 hCAT F 5'-TGCTGAATGAGGAACAGAGG-3'; 下游引物hCAT R 5'-GTGTGAATCGCATTCTTAGG-3'。 RT-PCR結(jié)果表明轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中的過(guò)氧 化氫酶基因已經(jīng)開(kāi)始在CHO細(xì)胞活躍地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄了 (圖3)。
轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，用碧云天公司的細(xì)胞 裂解液裂解，裂解產(chǎn)物以10000rpm離心10分鐘后取上清作Westernblot雜交。 雜交中使用的一抗為綿羊抗人過(guò)氧化氫酶多克隆抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物
酶偶聯(lián)的兔抗綿羊抗體。雜交結(jié)果表明轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中表達(dá)有GFP蛋白融 合的人過(guò)氧化氫酶(圖4)。
2.3過(guò)氧化氬酶活性檢測(cè)
T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞在37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，用細(xì) 胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后提取上清，用碧云天公司的過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑 盒測(cè)定樣品的酶活性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中過(guò)氧化酶活性比對(duì)照中有明顯 的提高，說(shuō)明表達(dá)的GFP融合的重組蛋白仍具有天然活性(圖5)。
2.4過(guò)氧化氫酶分泌效率檢測(cè)
6孔板中爬片的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)載體之后，于37。C培養(yǎng)24小時(shí)，取出蓋 玻片，用4。/。多聚甲醛于4。C固定10分鐘，避免用Triton作透膜處理，接著依次 與綿羊抗人過(guò)氧化氫酶多克隆抗體和PE偶聯(lián)的抗綿羊二抗孵育。細(xì)胞核以 DAPI染色，制備好的細(xì)胞免疫熒光樣品用含2.5。/。DABICO (w/v) ,90%甘油 (v/v)和50mMTris的抗熒光淬滅封片劑封片，于共聚焦熒光顯微鏡下觀察細(xì) 胞免疫熒光結(jié)果。結(jié)果如圖6所示，綠色熒光來(lái)自GFP，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核， 紅色熒光顯示分泌到細(xì)胞表面的重組人過(guò)氧化氫酶。圖6 A、 B和C為轉(zhuǎn)染對(duì) 照空載體pEGFP-Nl的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果，圖中可見(jiàn)GFP不僅分布在細(xì)胞質(zhì) 中，也分布在細(xì)胞核中，但它不分泌到細(xì)胞表面；圖6 G、 H和I為轉(zhuǎn)染 psighCAT-EGFP的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果，G表示融合GFP的人過(guò)氧化氫酶在細(xì)胞
內(nèi)分布情況，可見(jiàn)融合蛋白不僅分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，也有部分進(jìn)入細(xì)胞核， H中的紅色熒光顯示有部分融合蛋白已分泌到細(xì)胞表面，I為G和H的疊加效 果，表明只有極少比例的融合蛋白被分泌到胞外；圖6 S、 T和U為 pSShCAT-EGFP的細(xì)胞免疫熒光結(jié)果，與psighCAT-EGFP相比，融合蛋白在非 經(jīng)典分泌短肽SS的引導(dǎo)，趨于集中分布在緊靠細(xì)胞膜下的一圈細(xì)胞質(zhì)中，且 有較大比例的融合蛋白分泌到細(xì)胞外。
為了定量比較經(jīng)典分泌與非經(jīng)典分泌效率的差異，我們釆用NIHImage J 軟件對(duì)細(xì)胞免疫熒光圖作定量分析。圖中紅色和綠色熒光的面積和熒光強(qiáng)度
可用ImageJ軟件分別計(jì)算出，紅色熒光面積和熒光強(qiáng)度的乘積與綠色熒光相 應(yīng)的乘積的比值表示為分泌效率，如果把經(jīng)典分泌的效率定為100，則非經(jīng) 典分泌效率是它的2.3倍(圖7 )?？梢?jiàn)我們所用的SS短肽可有效提高蛋白的 分泌水平。
權(quán)利要求
1、一種提高重組蛋白分泌效率的方法，其特征在于將小鼠轉(zhuǎn)錄因子Engrailed 2的同源異型結(jié)構(gòu)域中的分泌序列SS融合到重組蛋白的N端，其中所述分泌序列SS的氨基酸序列為Ala Gln Glu Leu Ser Leu Asn Glu SerGln。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于編碼分泌序列SS的核酸序 列為GCACAGGAGCTCAGCCTGAACGAGTCTCAG。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述重組蛋白為人過(guò)氧化氫酶。
4、 一種重組人過(guò)氧化氫酶的經(jīng)典分泌表達(dá)載體psighCAT-EGFP,其質(zhì) 粒圖譜如附圖l所示。
5、 一種重組人過(guò)氧化氫酶的非經(jīng)典分泌表達(dá)載體pSShCAT-EGFP,其 質(zhì)粒圖譜如附圖l所示。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法在制備重組蛋白 類藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高重組蛋白分泌效率的方法，它是將小鼠轉(zhuǎn)錄因子Engrailed 2的同源異型結(jié)構(gòu)域中的分泌序列SS融合到重組蛋白的N端，所述分泌序列SS的氨基酸序列為Ala Gln Glu Leu Ser Leu Asn Glu Ser Gln。采用本發(fā)明所述方法得到的人過(guò)氧化氫酶的分泌效率與牛β酪蛋白信號(hào)肽引導(dǎo)的經(jīng)典分泌相比提高到2.3倍，為工業(yè)生產(chǎn)中提高重組蛋白分泌效率提供了有效的解決手段。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101173270SQ20071012110
公開(kāi)日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2007年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日
發(fā)明者何祖勇, 寧 李, 波 湯 申請(qǐng)人:北京濟(jì)普霖生物技術(shù)有限公司;李 寧