專利名稱：：狂犬病病毒組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開(kāi)涉及病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本公開(kāi)涉及可用于保護(hù)哺乳動(dòng)物免受狂犬病病毒感染的組合物和用于生產(chǎn)免疫原性組合物的方法。
背景技術(shù)：
：狂犬病仍然是感染人類和動(dòng)物的最可怕的傳染性疾病之一，盡管在其預(yù)防和控制方面已取得顯著的科學(xué)進(jìn)展。在世界不同地區(qū)，狂犬病表現(xiàn)為不同的問(wèn)題。在美國(guó)，狂犬病儲(chǔ)存宿主存在于許多野生動(dòng)物種類中，包括浣熊、臭鼬、狐貍和蝙蝠(Rupprecht等人，五merg./"/e".1(4):107-114,1995)。在橫跨美國(guó)的廣大地理區(qū)域發(fā)現(xiàn)了狂犬病傳染在這些陸生哺乳動(dòng)物中的爆發(fā)。例如，浣熊狂犬病影響從佛羅里達(dá)州到緬因州超過(guò)1百萬(wàn)平方公里的區(qū)域。盡管發(fā)達(dá)國(guó)家仍然存在野生動(dòng)物狂犬病，但利用野生動(dòng)物的口服免疫在控制和消除野生動(dòng)物狂犬病方面已經(jīng)取得進(jìn)展。盡管如此，狂犬病仍然是對(duì)公共衛(wèi)生的一種主要威脅，每年持續(xù)造成50,000至60,000人死亡(世界衛(wèi)生組織，2003年4月)。人類主要是通過(guò)被患有狂犬病的家養(yǎng)或者野生動(dòng)物咬傷而感染狂犬病病毒。在發(fā)展中國(guó)家，狗導(dǎo)致大約94%的人類狂犬病死亡。在非洲、亞洲和南美洲的大多數(shù)國(guó)家狗，狂犬病仍然是動(dòng)物流行性的，并且在這些國(guó)家中，狗導(dǎo)致該疾病引起的大部分人類死亡。因此，控制家養(yǎng)和野生動(dòng)物中的狂犬病病毒感染不僅降低這些動(dòng)物的死亡率而且降低人類接觸的風(fēng)險(xiǎn)。狂犬病病毒通過(guò)被感染動(dòng)物的咬傷或者抓傷造成的破裂皮膚傳送。接觸狂犬病病毒導(dǎo)致其滲透入外周、無(wú)髓鞘的神經(jīng)末梢，繼而通過(guò)逆向軸突運(yùn)輸傳播，復(fù)制只在神經(jīng)元中發(fā)生，并最后到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)。CNS的感染造成細(xì)胞機(jī)能障礙和死亡(Rupprecht&Dietzschold,LabInvest.57:603,1987)。因?yàn)榭袢〔《局苯訌募?xì)胞傳播到細(xì)胞，它基本上逃脫了免疫識(shí)別(Clark&Prabhakar,Rabies,In:Olson等人,eds"ComparativePathologyofViralDisease,2:165,BocaRaton,FL,CRCPress,1985)?？袢〔《?RV)是一種彈狀病毒-一種具有陰性有義極性的非節(jié)段RNA病毒。在彈狀病毒科(Rhabdoviridae)家族中，狂犬病病毒是狂犬病毒(Lyssavirus)屬的原型。RV由兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)成分構(gòu)成核衣殼或者核糖核蛋白(RNP)，和圍繞RNP核的雙層膜形式的被膜。所有彈狀病毒的感染性成分是RNP核，由負(fù)鏈RNA基因組組成，所述負(fù)鏈RNA基因組被核蛋白(N)結(jié)合RNA依賴性RNA聚合酶(L)和磷蛋白(P)包裝。環(huán)繞RNP的膜包含兩種蛋白跨膜糖蛋白(G)和基質(zhì)(M)蛋白，位于膜內(nèi)部位置。因此，病毒基因組編碼這5種蛋白R(shí)NP中的3種蛋白(N，L禾卩P)，基質(zhì)蛋白(M)，和糖蛋白(G)。不同狂犬病病毒株致病性的分子決定簇還沒(méi)有被完全闡明。RV致病性歸因于多基因事件(Yamada等人，Microbiol,/mm腳/.50:25-32,2006)。例如，RV基因組中的一些位置如果突變，則影響病毒轉(zhuǎn)錄或者復(fù)制，減輕毒性。N基因磷酸化位點(diǎn)的絲氨酸殘基389處(Wu等人，J.fW.76:4153-4161,2002)或者L基因高度保守的C模體的GDN核心序列(Schnell和Conzelmann，Virol.214:522-530,1995)的突變，顯著降低RV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。G蛋白，還稱為刺突蛋白，參與RV的細(xì)胞粘附和膜融合。已經(jīng)鑒定G蛋白330到340位的氨基酸區(qū)域(稱為抗原部位III)對(duì)RV某些株的毒性重要。數(shù)個(gè)研究支持以下觀點(diǎn)，即固定RV株的致病性由糖蛋白氨基酸殘基333處存在的精氨酸或者賴氨酸決定(Dietzschold等人Proc.」cflc/.CASL480:70-74,1983;Tuffereau#X,K.ra/.172:206-212,1989)。這種現(xiàn)象似乎至少適用于固定的狂犬病病毒例如CVS,ERA,PV，SAD-B19和HEP-Flury株(Anilionis等人，Nature294:275-278，1981;Morimoto等人，Virol.173:465-477，1989)。例如，具有不同于糖蛋白333位Arg的氨基酸的狂犬病疫苗病毒描述于，例如，WO00/32755(描述RV突變體，其中與親代病毒相比，G蛋白八巧333密碼子的所有3種核苷酸都被改變，因此333位Arg被另一種氨基酸取代)；歐洲專利350398(描述無(wú)毒力的RV突變體SAG1，來(lái)自RV的BernSAD株，其中糖蛋白333位的Arg己經(jīng)被替換為Ser);和歐洲專利申請(qǐng)583998(描述減毒的RV突變體，SAG2，其中G蛋白333位的Arg被Glu替換)。其他株，例如RC-HL株，在G的333位具有精氨酸殘基，但在成年小鼠中不造成致命感染(Ito等人，Microl./mmwm/.38:479-482，1994;Ito/K>o/.75:9121-9128,2001)。因此，整個(gè)G可能有助于RV的毒性，盡管決定簇或者區(qū)域之前還沒(méi)有被鑒定。G基因編碼誘導(dǎo)病毒中和抗體的唯一蛋白。已知RV糖蛋白的至少3種狀態(tài)負(fù)責(zé)受體結(jié)合的天然狀態(tài)(N);膜融合過(guò)程初始步驟必需的活性疏水狀態(tài)(A)(Gaudin，J.Ce諸o/.150:601-612,2000)，和融合無(wú)活性構(gòu)象(I)。G的正確折疊和成熟在免疫識(shí)別中起著重要作用。ERAG胞外結(jié)構(gòu)域中3個(gè)潛在糖基化位置分別存在于Asn37,Asn^和Asn，殘基(Wojczyk等人，Glycobiology.8:121-130,1998)。G的非糖基化不僅影響構(gòu)象，而且抑制蛋白在細(xì)胞表面的呈遞。因此，闡明導(dǎo)致狂犬病病毒致病性的分子決定簇提出了一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題。發(fā)明概述此處公開(kāi)了對(duì)應(yīng)于狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)固定疫苗的病毒株的完整序列，以及對(duì)其和狂犬病病毒屬其他株進(jìn)行測(cè)序的方法。還描述了狂犬病病毒的反向遺傳系統(tǒng)，尤其是利用狂犬病病毒株ERA作為示范。T7RNA聚合酶的使用促進(jìn)病毒復(fù)原，所述T7RNA聚合酶在N末端包含一個(gè)八氨基酸核定位信號(hào)(NLS)。除親代ERA病毒株外，還描述了數(shù)種其他衍生病毒，包括ERA-(缺失psi-區(qū)域)，ERAgreenl(在psi-區(qū)域插入綠色熒光蛋白基因)，ERAgreen2(在磷蛋白和基質(zhì)蛋白基因間區(qū)域插入綠色熒光蛋白)，ERA2g(在psi-區(qū)域包含糖蛋白的額外拷貝)，ERAg3(在糖蛋白氨基酸333處有突變)，ERA2g3(在psi-區(qū)域氨基酸333處具有改變的糖蛋白的額外拷貝)，ERA-G(其中已經(jīng)刪除糖蛋白)，ERAgm(M和G基因在基因組中互換)，禾BERAgmg(重排的ERAgm構(gòu)建體中G的兩個(gè)拷貝)。額外轉(zhuǎn)錄單位被整合入ERA病毒基因組用于開(kāi)放閱讀框(ORF)的有效表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化此處描述的繁殖條件，在生物反應(yīng)器或者固定的組織燒瓶中恢復(fù)病毒的滴度達(dá)到超過(guò)109ffu/mL。還公開(kāi)了一種組成性表達(dá)ERA糖蛋白的改造細(xì)胞系。該細(xì)胞系，命名為BSR-G，用于重組的，包括減毒和/或復(fù)制缺陷的，狂犬病病毒的制備。根據(jù)下列詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的上述以及其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將更顯而易見(jiàn)。附圖簡(jiǎn)述圖1A.ERA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的示意圖。錘頭核酶和反基因組ERA基因組的位置如圖解所示。按5'到3'方向顯示N,P,MG和L蛋白的相對(duì)位置。圖1B.構(gòu)建全長(zhǎng)ERA狂犬病病毒基因組cDNA質(zhì)粒pTMF的示意圖。RT-PCR產(chǎn)物F1、F2片段，和限制性酶識(shí)別位點(diǎn)(Nhel，Kpnl,Blpl,Pst和Notl)(未按比例繪制)。左邊的條顯示RdRz-錘頭核酶，右邊的條顯示HDVRz-丁型肝炎病毒核酶。符號(hào)令表示Kpnl或者Pstl位點(diǎn)被刪除，+垂直箭頭表示Nhel或者Notl位點(diǎn)仍是完整的。圖2.通過(guò)pNLST7質(zhì)粒的NLST7RNA聚合酶自身基因作用設(shè)想機(jī)理的示意圖。DNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物通過(guò)胞吞作用攝入細(xì)胞。從溶酶體和內(nèi)體釋放的大部分DNA保留在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。有限量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核1)通過(guò)CMV立即早期啟動(dòng)子，NLST7基因通過(guò)細(xì)胞RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄；2)成熟的NLST7mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)用于NLST7RNA聚合酶合成；3)新合成的NLST7RNA聚合酶轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，而痕量NLST7保留在細(xì)胞質(zhì)中；4)NLST7RNA聚合酶通過(guò)pT7啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。通過(guò)轉(zhuǎn)錄后修飾，產(chǎn)生額外的NLST7mRNA用于蛋白合成，從而提高病毒恢復(fù)效率。圖3.IO種衍生ERA病毒基因組的示意圖。各基因的大小不是按比例繪制。符號(hào)"*"標(biāo)明在Aa333殘基處G的突變，*是Psi-區(qū)域。圖4A.轉(zhuǎn)染細(xì)胞中回收的ERA-G病毒，在BHK-G細(xì)胞系中傳播和生長(zhǎng)的分析。在A中，甚至在以用于病毒恢復(fù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的7天后，ERA-G病毒病灶仍被抑制。在B中，在正常BSR細(xì)胞中傳代后，恢復(fù)的ERA-G病毒不傳播。只有個(gè)別細(xì)胞被DFA染色。在C中，ERA-G病毒在組成型BHK-G細(xì)胞系中生長(zhǎng)良好。圖4B.BHK-G細(xì)胞系中G表達(dá)的分析。通過(guò)間接熒光染色法，ERA狂犬病病毒G在穩(wěn)定的細(xì)胞系BHK-G的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。圖4C.利用G探針，通過(guò)Northern印跡對(duì)ERA-G病毒感染細(xì)胞中GmRNA的分析。第2道顯示在ERA-G病毒感染的BHK-G細(xì)胞中檢測(cè)到G基因mRNA，而未檢測(cè)到病毒基因組RNA。第1道是ERA-狂犬病病毒感染的BHK-G細(xì)胞的總RNA對(duì)照，其中GmRNA和病毒基因組RNA均被檢測(cè)到。圖5.單步病毒生長(zhǎng)曲線所有恢復(fù)狂犬病病毒ERA株生長(zhǎng)到109或者101Gffu/mL，但ERA-G只達(dá)到107ffu/mL。圖6.ERAgreenl/ERAgreen2狂犬病病毒感染的BSR細(xì)胞中的綠色病灶Transl是在Psi和L基因間區(qū)域整合的翻譯單位。Trans2是在P和M基因間區(qū)域的翻譯單位。ERAgreen2和ERAgreenl均在病毒感染的BSR細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)GFP蛋白，而病毒感染后ERAgreen2綠色病灶的出現(xiàn)比在ERAgreenl中早48小時(shí)。圖7.在雙G，和G、M重排的ERA-狂犬病病毒中GmRNA表達(dá)的分析。在利用G探針的Northern印跡中，與ERA-病毒感染的細(xì)胞(第2道)相比，對(duì)ERA2g(第1道)、ERAgm(第3道)和ERA2g3(第4道)中GmRNA光密度的測(cè)量顯示增強(qiáng)的mRNA水平。利用ERA-病毒作為100%，計(jì)算比例。圖8A.通過(guò)體內(nèi)接種重組ERA和衍生物誘導(dǎo)的發(fā)病率。三周齡小鼠肌內(nèi)接種8種恢復(fù)病毒。在接種后10天，在ERA、ERA-和ERAgreenl組中，50%、50%和20%的小鼠分別顯示狂犬病的相應(yīng)臨床癥狀，但沒(méi)有死亡。其他組中沒(méi)有觀察到不良征象。圖8B.接種重組ERA和衍生物的小鼠中攻擊后的存活率。從圖8A中所示的試驗(yàn)中存活的小鼠用Texas犬/山狗(coyote)狂犬病病毒進(jìn)行肌內(nèi)攻擊。在攻擊后5天，在ERA和ERA-組中，40和62%的小鼠分別顯示狂犬病征象并被處安樂(lè)死。在所有其他組中，沒(méi)有觀察到狂犬病征象。圖8C.腦內(nèi)接種重組ERA和ERAg3病毒后的存活。三周齡小鼠分別腦內(nèi)接種ERA和ERAg3病毒株。ERA組中所有小鼠在接種后15天死亡，而在ERAg3組中，所有小鼠都存活，沒(méi)有臨床癥狀。圖8D.乳鼠腦內(nèi)接種后的存活。兩日齡的乳鼠分別腦內(nèi)接種ERAg3和ERA-G病毒構(gòu)建體。ERAg3組中所有小鼠死亡，而ERA-G組中沒(méi)有小鼠死亡。圖8E.接種重組ERA和衍生病毒的小鼠的中和抗體滴度。利用RFFIT測(cè)定小鼠中和抗體滴度，在病毒接種組中范圍從每mll.36到5.61IU。圖9A.感染Albama蝙蝠狂犬病病毒后的存活。倉(cāng)鼠接種活的Albama蝙蝠狂犬病病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應(yīng)的滅活RV疫苗進(jìn)行接觸后處理。在超過(guò)3個(gè)月期間進(jìn)行存活評(píng)定。圖9B.感染ThaiStreet犬狂犬病病毒后的存活。倉(cāng)鼠接種活的Albama蝙蝠狂犬病病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應(yīng)的滅活RV疫苗進(jìn)行接觸后處理。在超過(guò)3個(gè)月期間進(jìn)行存活評(píng)定。圖9C.感染Texas山狗狂犬病病毒后的存活率。倉(cāng)鼠接種活的Albama蝙蝠狂犬病病毒，然后用ERAg3病毒或者狂犬病免疫球蛋白和商品化供應(yīng)的滅活RV疫苗進(jìn)行接觸后處理。在超過(guò)3個(gè)月期間進(jìn)行存活評(píng)定。序列表如37C.F.R.1.822所定義，利用核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸3字母編碼，顯示所附序列表中所列的核酸和氨基酸序列。每個(gè)核酸序列只顯示一條鏈，但應(yīng)當(dāng)理解為通過(guò)任意參考所顯示的鏈，還包括互補(bǔ)鏈，除非上下文明確表示只意在一條鏈。適當(dāng)?shù)脑拺?yīng)理解，通過(guò)用尿嘧啶取代硫胺殘基，表示為DNA的序列可以轉(zhuǎn)換為RNA。SEQIDNO:l.ERACDC野生型病毒，11,931個(gè)核苷酸1-58核苷酸，前導(dǎo)區(qū)71-1420核苷酸，N基因1514-2404核苷酸，P基因2496-3101核苷酸，M基因3317-4888核苷酸，G基因4964-5362核苷酸，Psi-區(qū)域5417-11797核苷酸，L基因11862-11931核苷酸，Trailer區(qū)SEQIDNO:2.ERACDC:71至U1420:450aa,N蛋白.SEQIDNO:3.ERACDC:1514至lj2404:297aa,P蛋白.SEQIDNO:4.ERACDC:2496至U3101:202aa,M蛋白.SEQIDNO:5.ERACDC:3317至lj4888:524aa,G蛋白.SEQIDNO:6.ERACDC:5417to11797:2127aa，L蛋白.SEQIDNO:7.通過(guò)反向遺傳系統(tǒng)恢復(fù)的重組ERA(rERA)有U,930個(gè)核苷酸。在重組ERA反向遺傳系統(tǒng)中，野生型ERA株中G基因和psi-區(qū)之間的特異性poly(A8)tract被突變?yōu)閜oly(A7)tract,作為序列標(biāo)記物。因此，rERA比野生型ERA少一個(gè)核苷酸。所有其他序列信息都是完全相同的。SEQIDNO:8.ERAg3株(11,930個(gè)核苷酸)，G蛋白中的氨基酸(333Aa)已經(jīng)改變；相應(yīng)的核酸在4370到4372位。SEQIDNO:9.ERA-(11，577個(gè)核苷酸)，無(wú)psi(假-基因)區(qū)；額外轉(zhuǎn)錄單位已經(jīng)導(dǎo)入核苷酸4950到5008位。SEQIDNO:10.ERA-2GU3,150個(gè)核苷酸)，該株具有G基因的兩個(gè)拷貝；第二個(gè)拷貝在4988到6559位插入。SEQIDNO:11.ERAgreen(12,266個(gè)核苷酸)，該株在4993到5673位包含GFP的編碼序列；細(xì)胞或者組織感染后在紫外光下顯示綠色。SEQIDNO:12.ERA-G(10,288個(gè)核苷酸)，該株不含G基因。SEQIDNO:13.ERA-2g3(13,150個(gè)核苷酸)；該株具有G基因的兩個(gè)拷貝(其中第二個(gè)在4988到6559位)，兩個(gè)均是在氨基酸333被取代(對(duì)應(yīng)于所示序列中核苷酸位置4370-4372和6041-6043)。SEQIDNO:14.ERA-pt(11,976個(gè)核苷酸，P基因后2469到2521位處具有一個(gè)額外的轉(zhuǎn)錄單位)。SEQIDNO:15.ERA-pt-GFP(12,662個(gè)核苷酸，在P基因后2505到3185位插入GFP基因)。SEQIDNO:16.ERAgm(11,914個(gè)核苷酸)G和M基因的位置分別與G在2505-4076位和M在4122-4727位互換。SEQIDNO:17.ERAg3m(11，914個(gè)核苷酸)G和M基因的位置分別與G在2505-4076位和M在4122-4727位互換。G基因在氨基酸333位突變。SEQIDNO:18.ERAgmg(13,556個(gè)核苷酸)，該株在2505-4076位和4943-6514位具有G基因的兩個(gè)拷貝，在4122-4727位側(cè)翼帶有M基因。SEQIDNO:19.綞頭核酶的前10個(gè)核苷酸對(duì)應(yīng)于狂犬病病毒ERA基因組的5'端。SEQIDNO:20.核苷酸序列編碼SV40T抗原核定位信號(hào)(NLS)。SEQIDNO:21-23.人工Kozak序列。SEQIDNO:24-57.合成寡核苷酸。SEQIDNO:58.在氨基酸333位突變的G蛋白的氨基酸序列(從Arg到Glu)。SEQIDNO:59-65.合成寡核苷酸。具體內(nèi)容/.分薪病毒性人畜共患病很難預(yù)防。一種主要范例是通過(guò)口服免疫控制野生動(dòng)物狂犬病。所有當(dāng)前得到許可的口服狂犬病疫苗基于一個(gè)共同來(lái)源。Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)的固定狂犬病病毒(RV)來(lái)源于Street-Alabama-Dufferin(SAD)株，1935年首先從阿拉巴馬(USA)的一條瘋狗中分離。在小鼠腦、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞和雞胚中進(jìn)行SADRV的多次傳代后，獲得ERA株。ERA在BHK細(xì)胞中的重復(fù)克隆最終獲得B-19克隆，其被命名為SAD-B19，用于疫苗研究。通過(guò)反向遺傳恢復(fù)的第一個(gè)RV株是SAD-B19。盡管SAD-B19和ERARV來(lái)自相同來(lái)源，但是在不同動(dòng)物的口服疫苗研究中觀察到不同的結(jié)果。例如，ERA在臭鼬或者浣熊中口服不誘導(dǎo)明顯的中和抗體，而SAD-B19誘導(dǎo)。為了闡明這兩種RV株之間的潛在差異，需要一種用于ERARV株的反向遺傳系統(tǒng)。反向遺傳學(xué)提出了一種按照指定路線修飾RNA病毒的可行途徑。一種用于狂犬病病毒原始株的反向遺傳系統(tǒng)在1994年成功建立(Schnell等人，TheEMBOJ.13，4195-4203,1994)。在十年間，已經(jīng)對(duì)該系統(tǒng)作出改進(jìn)，導(dǎo)致病毒恢復(fù)的效率增加。這種增加的效率有助于闡明病毒致病性、蛋白-蛋白以及蛋白-RNA相互作用。在狂犬病病毒基因組內(nèi)，已經(jīng)認(rèn)為一些區(qū)域包含重要的信號(hào)，例如病毒遠(yuǎn)端啟動(dòng)子區(qū)，核蛋白包裝，RNA依賴性RNA聚合酶L轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，多腺苷酸化和終止位點(diǎn)。這些信號(hào)對(duì)于確保病毒的有效恢復(fù)和設(shè)計(jì)額外的轉(zhuǎn)錄單位是非常重要的，所述額外轉(zhuǎn)錄單位用于將外源的開(kāi)放閱讀框(ORF)接納到狂犬病病毒基因組中。本公開(kāi)提供一種有效的反向遺傳系統(tǒng)，并描述其產(chǎn)生ERA株病毒的變異體的用途。此處描述的修飾獲得適合用于接納ORF表達(dá)和疫苗開(kāi)發(fā)的候選株。反向遺傳系統(tǒng)由一組質(zhì)粒組成。第一種質(zhì)粒包括ERA病毒cRNA。為了在轉(zhuǎn)錄的病毒cDNA中產(chǎn)生可靠的病毒反基因組末端，ERA基因組在cDNA3'端側(cè)翼為錘頭核酶，5'端側(cè)翼為丁型肝炎病毒核酶。反基因組盒與細(xì)菌噬菌體T7轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)融合，這還任選在巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子的控制下。該系統(tǒng)還包括大量輔助質(zhì)粒，所述輔助質(zhì)粒編碼參與病毒包裝的蛋白。例如，該系統(tǒng)通常包括編碼病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、RNA依賴性聚合酶(L)、和任選的病毒糖蛋白(G)的輔助質(zhì)粒。該系統(tǒng)還包括編碼噬菌體T7RNA聚合酶(T7)的質(zhì)粒，其可以通過(guò)添加核定位信號(hào)(NLS)進(jìn)行修飾，以增加轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核中T7聚合酶的表達(dá)。T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒被構(gòu)建為"自身基因"，其在轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中之后轉(zhuǎn)錄全長(zhǎng)的病毒反基因組cRNA用于核蛋白包裝。反向遺傳系統(tǒng)可用于設(shè)計(jì)和制備用于狂犬病病毒治療(接觸前和/或后)的免疫原性組合物，和用于制備表達(dá)外源開(kāi)放閱讀框(ORF)的狂犬病病毒ERA載體。例如，額外轉(zhuǎn)錄單位可以被設(shè)計(jì)、檢測(cè)并在Psi-區(qū)和/或磷蛋白(P)-基質(zhì)(M)蛋白基因間區(qū)域處整合到ERA基因組中?；旧先魏胃信d趣的ORF都可以在ERA載體的環(huán)境中表達(dá)，包括編碼病毒抗原和其他病原體的ORF，例如其他狂犬病病毒屬的抗原，以及用于表達(dá)其他治療感興趣的蛋白。因此，此處公開(kāi)的方法和組合物可用于設(shè)計(jì)和制備狂犬病病毒免疫原性組合物，包括適合作為疫苗的組合物，所述疫苗用于狂犬病病毒接觸前和/或后的治療。II.縮寫ADE抗體依賴性增強(qiáng)Ag-ELISA抗原-捕獲ELISADNA脫氧核糖核酸ERA狂犬病病毒株Evelyn-Rokitnicki-AbelsethELISA酶聯(lián)免疫吸附分析G糖蛋白i.e.腦內(nèi)IFA間接免疫-熒光分析i.m.肌內(nèi)RNA依賴性RNA聚合酶M基質(zhì)蛋白mAb單克隆抗體N核蛋白ORF開(kāi)放閱讀框P磷蛋白PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RACEcDNA末端5'快速擴(kuò)增RNA核糖核酸RNP核糖核蛋白R(shí)T-PCR逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RV狂犬病病毒trans1額外轉(zhuǎn)錄單位1trans2額外轉(zhuǎn)錄單位2瓜術(shù)語(yǔ)除非另有解釋，所有此處使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同。類似地，除非另作注解，技術(shù)術(shù)語(yǔ)根據(jù)常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)的定義可以參見(jiàn)BenjaminLewin，基因V(GenesV),OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等人(編著)，分子生物學(xué)全編(77^￡"wc_yc/oped/flo/Afo/ecw/or，BlackwellScienceLtd.出版,1994(ISBN0-632-02182-9);和RobertA.Meyers(編著)，分子生物學(xué)和生物技術(shù)綜合參考(Mo/ecw/arSio/ogytmcWc^ec/mo/ogyzaCompre/ze,.veZ)e^e/e簡(jiǎn)ce),VCHPublishers,Inc.出版,1995(ISBN1-56081-569-8)。單數(shù)術(shù)語(yǔ)"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文另有明確指示。類似地，單詞"或"意在包括"和"，除非上下文另有明確指示。因此"包括A或者B"意思是包括A，或者B，或者A和B。還應(yīng)了解，對(duì)于核酸或者多肽給出的所有堿基大小或者氨基酸大小，和分子量或者分子質(zhì)量值，都是近似的，提供來(lái)說(shuō)明。為了有助于瀏覽本發(fā)明的不同實(shí)施方式，提供下列專用術(shù)語(yǔ)的解釋佐劑非特異性增強(qiáng)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。Singh等人綜述了在人類中使用的疫苗佐劑的發(fā)展(Nat.Ao,ec/z"o/.17:1075-1081,1999)，在其出版時(shí)公開(kāi)了鋁鹽和MF59微乳劑是僅有的被批準(zhǔn)用于人的疫苗佐劑。擴(kuò)增核酸分子的擴(kuò)增(例如，DNA或者RNA分子)是指一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的使用，該技術(shù)增加樣品中核酸分子的拷貝數(shù)。一個(gè)擴(kuò)增的實(shí)例是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其中在允許引物與樣品中核酸模版雜交的條件下，樣品接觸寡核苷酸引物對(duì)。引物在合適的條件下延伸，從模板解離，再退火，延伸，再解離以擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)。擴(kuò)增產(chǎn)物可以利用電泳、限制性核酸內(nèi)切酶切割模式、寡核苷酸雜交或者連接、和/或核酸測(cè)序這類技術(shù)進(jìn)行表征。擴(kuò)增方法的其他實(shí)例包括鏈置換擴(kuò)增，如美國(guó)專利5,744,311所公開(kāi)；無(wú)轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增，如美國(guó)專利6,033,881所公開(kāi)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如WO90/01069所公開(kāi)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如EP-A-320,308所公開(kāi)；間隙填補(bǔ)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如美國(guó)專利5,427,930所公開(kāi)；和NASBATM無(wú)RNA轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，如美國(guó)專利6,025,134所公開(kāi)。擴(kuò)增方法可以改變，包括例如通過(guò)其他的步驟或者將擴(kuò)增與另一個(gè)方案聯(lián)動(dòng)物活的多細(xì)胞脊椎生物體，包括例如哺乳動(dòng)物和鳥類的范疇。術(shù)語(yǔ)哺乳動(dòng)物包括人和非人哺乳動(dòng)物。類似地，術(shù)語(yǔ)"對(duì)象"包括人類和獸類對(duì)象，例如，人，非人靈長(zhǎng)類，狗，貓，馬，和牛?？贵w一種蛋白(或者蛋白復(fù)合物)，包括基本上由免疫球蛋白基因或者免疫球蛋白基因片段編碼的一種或者多種多肽。識(shí)別的免疫球蛋白基因包括k、人、a、Y、5、s和p恒定區(qū)基因，以及眾多的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分為K或者X。重鏈被分為Y、p、a、5或者s，分別依次定義免疫球蛋白類型，IgG,IgM，IgA,IgD和IgE。基本的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位通常是四聚體。每個(gè)四聚體由多肽鏈的兩個(gè)相同對(duì)組成，每個(gè)對(duì)具有一個(gè)"輕"(大約25kDa)鏈和一個(gè)"重"(大約50-70kDa)鏈。每條鏈的N-末端確定一個(gè)大約100到110或者更多氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語(yǔ)"可變輕鏈"(VL)和"可變重鏈"(VH)分別指代這些輕鏈和重鏈。此處使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整的免疫球蛋白以及許多明確表征的片段。例如，結(jié)合靶蛋白(或者在蛋白或者融合蛋白內(nèi)的表位)的Fabs,Fvs和單鏈Fvs(SCFvs)也是所述蛋白(或者表位)的特異結(jié)合劑。這些抗體片段如下所示(1)Fab，通過(guò)用木瓜蛋白酶消化整個(gè)抗體產(chǎn)生的包含抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，產(chǎn)生完整的輕鏈和一種重鏈的一部分；(2)Fab'，通過(guò)用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體然后還原獲得的抗體分子片段，產(chǎn)生完整的輕鏈和一部分重鏈；每個(gè)抗體分子得到兩個(gè)Fab'片段；(3)(Fab')2，通過(guò)用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體而沒(méi)有后續(xù)的還原得到的抗體片段；(4)F(ab')2，通過(guò)兩個(gè)二硫鍵連接在一起的兩個(gè)Fab'片段的二聚體；(5)Fv，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)、表達(dá)為兩條鏈的遺傳工程片段；和(6)單鏈抗體，一種包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的遺傳工程分子，通過(guò)合適的多肽接頭連接為基因融合的單鏈分子。制備這些片段的方法是常規(guī)的(參見(jiàn),例如，Harlow和Lane，抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1999)。本公開(kāi)方法和組合物中使用的抗體可以是單克隆或者多克隆的。僅僅舉例來(lái)說(shuō)，單克隆抗體可以根據(jù)Kohler禾BMilstein(Nature256:495-97,1975)的傳統(tǒng)方法或者其衍生方法從鼠類雜交瘤制備。單克隆抗體制備的詳細(xì)步驟描述于Harlow和Lane,抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1999?？贵w結(jié)合親合力單一抗體結(jié)合位點(diǎn)和配體(例如，抗原或者表位)之間結(jié)合的強(qiáng)度?？贵w結(jié)合位點(diǎn)x對(duì)配體Y的親合力表示為解離常數(shù)(Kd)，這是占據(jù)溶液中存在的一半X結(jié)合位點(diǎn)所需的Y濃度。較小(Kd)表明X和Y之間較強(qiáng)或者較高的親合力相互作用，并且占據(jù)位點(diǎn)需要的配體濃度較低。通常，抗體結(jié)合親合力受到互補(bǔ)位識(shí)別的表位中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的改變、修飾和/或取代的影響。在一個(gè)實(shí)例中，在Ag-ELISA分析中通過(guò)終點(diǎn)滴定測(cè)量抗體結(jié)合親合力。如果與未改變的表位相比，針對(duì)修飾/取代表位的特異抗體的終點(diǎn)滴度相差至少4倍，例如至少10倍，至少100倍或者更大，則通過(guò)修飾和/或取代互補(bǔ)位識(shí)別的表位中的一個(gè)或者多個(gè)氨基酸，抗體結(jié)合親合力顯著降低(或者可測(cè)量地降低)?？乖軌虼碳?dòng)物抗體產(chǎn)生或者t細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物或者物質(zhì)，包括注射或吸收到動(dòng)物中的組合物?？乖c特異性體液或者細(xì)胞免疫的產(chǎn)物反應(yīng)，包括那些被異源免疫原誘導(dǎo)的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原是病毒抗原。減毒在活病毒的情況下，例如狂犬病病毒，如果病毒感染細(xì)胞或者對(duì)象的能力和/或其致病的能力降低(例如，消除)，則該病毒被減毒。通常，在給具有免疫能力的對(duì)象施用后，減毒病毒至少保留一些引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。在一些情況下，減毒病毒能夠引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答而不引起任何感染的征象或者癥狀。結(jié)合或者穩(wěn)定結(jié)合如果足量的寡核苷酸形成堿基對(duì)或者與其靶核酸雜交，則寡核苷酸與靶核酸結(jié)合或者穩(wěn)定結(jié)合，以允許對(duì)所述結(jié)合的檢測(cè)。通過(guò)靶:寡核苷酸復(fù)合物的物理或者功能特性可以檢測(cè)結(jié)合。靶和寡核苷酸之間的結(jié)合可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行檢測(cè)，包括功能或者物理結(jié)合分析。通過(guò)檢測(cè)結(jié)合是否對(duì)生物合成過(guò)程例如基因表達(dá)、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等等有可觀察到的影響，可以對(duì)結(jié)合進(jìn)行功能檢測(cè)。檢測(cè)DNA或者RNA互補(bǔ)鏈結(jié)合的物理方法是本領(lǐng)域公知的，這類方法包括DNaseI或者化學(xué)足跡法，凝膠遷移和親合力切割分析，Northern印跡，Southern印跡，點(diǎn)印跡，和光吸收檢測(cè)方法。例如，一種廣泛使用的方法，因?yàn)樗绱撕?jiǎn)單并且穩(wěn)定，包括當(dāng)溫度緩慢升高時(shí)，在220到300nm處觀察溶液光吸收的變化，所述溶液包含寡核苷酸(或者類似物)和靶核酸。如果寡核苷酸或者類似物與其靶結(jié)合，當(dāng)寡核苷酸(或者類似物)和靶解離或者熔解時(shí)，在特征溫度處的吸收突然增加。寡聚物和其靶核酸之間的結(jié)合經(jīng)常表征為溫度(Tm)，在該溫度下，50%的寡聚物從其靶熔解。相對(duì)于具有較低Tm的復(fù)合物，較高的Tm表示更強(qiáng)或者更穩(wěn)定的復(fù)合物。cDNA(互補(bǔ)DNA):—段DNA，缺失內(nèi)部、非編碼段(內(nèi)含子)和確定轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列。在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)從細(xì)胞提取的信使RNA逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。電泳電泳是在電場(chǎng)影響下，帶電荷的溶質(zhì)或者顆粒在液體介質(zhì)中的遷移。電泳分離被廣泛用于高分子分析。特別重要的是蛋白和核酸序列的鑒定。這類分離可基于大小或者電荷的差異。核苷酸序列帶有相同的電荷，因此根據(jù)大小差異進(jìn)行分離。電泳可以在無(wú)支持的液體介質(zhì)中進(jìn)行(例如，毛細(xì)管電泳)，但更常見(jiàn)的是液體介質(zhì)穿行過(guò)固相支持介質(zhì)。最廣泛使用的支持介質(zhì)是凝膠，例如，聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠。篩分凝膠(例如，瓊脂糖)阻礙分子的流動(dòng)。凝膠孔徑?jīng)Q定能夠自由流過(guò)凝膠的分子大小。當(dāng)分子大小增加時(shí)，穿過(guò)凝膠的時(shí)間值也增加。結(jié)果，小分子比大分子更快地通過(guò)凝膠，因此在給定時(shí)間段內(nèi)比更大的分子從加樣區(qū)前進(jìn)得更遠(yuǎn)。這類凝膠用于核苷酸序列基于大小的分離。線性DNA片段遷移通過(guò)瓊脂糖凝膠，其遷移率與它們分子量的loglO成反比。通過(guò)利用具有不同瓊脂糖濃度的凝膠，能夠分辨不同大小的DNA片段。較高濃度的瓊脂糖有利于小DNA的分離，而低瓊脂糖濃度能夠分辨更大的DNA。表位抗原決定簇。這些是特定化學(xué)基團(tuán)，例如分子上的連續(xù)或者非連續(xù)的肽序列，所述基團(tuán)是抗原性的，即引發(fā)特異性免疫應(yīng)答。基于抗體的三維結(jié)構(gòu)和匹配(或者同源)的表位三維結(jié)構(gòu)，抗體結(jié)合特定抗原表位。"取代表位"包括在表位中的至少一種結(jié)構(gòu)取代，例如一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)。雜交寡核苷酸和它們的類似物通過(guò)互補(bǔ)堿基之間的氫鍵合雜交，包括Watson-Crick，Hoogsteen或者反向Hoogsteen氫鍵合。通常，核酸由含氮堿基組成，所述含氮堿基是嘧啶(胞嘧啶(C),尿嘧啶(U),和胸腺嘧啶(T))或者嘌呤(腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G))。這些含氮堿基在嘧啶和嘌呤之間形成氫鍵，嘧啶與嘌呤的成鍵稱為"堿基配對(duì)"。更具體地，A與T或者U形成氫鍵，G與C形成鍵。"互補(bǔ)"是指在不同的核酸序列或者相同核酸序列的兩個(gè)不同區(qū)域之間發(fā)生的堿基配對(duì)。"可特異雜交"和"特異互補(bǔ)"是表明互補(bǔ)性的足夠程度使得在寡核苷酸(或者其類似物)和DNA或者RNA靶之間發(fā)生穩(wěn)定和特異結(jié)合的術(shù)語(yǔ)。寡核苷酸或者寡核苷酸類似物無(wú)需與其靶序列100%互補(bǔ)以便可特異雜交。當(dāng)寡核苷酸或者類似物與靶DNA或者RNA分子的結(jié)合干擾耙DNA或者RNA的正常功能時(shí)，寡核苷酸或者類似物是可特異雜交的，在需要特異結(jié)合的情況下，例如在體內(nèi)分析或者系統(tǒng)中的生理?xiàng)l件下，存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免寡核苷酸或者類似物與非靶序列的非特異結(jié)合。這類結(jié)合稱為特異雜交。根據(jù)所選雜交方法和組合物的性質(zhì)和雜交核酸序列的長(zhǎng)度，雜交條件導(dǎo)致的特定嚴(yán)謹(jǐn)程度是不同的。通常，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(尤其是^+和/或^8++濃度)將決定雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，盡管洗滌時(shí)間也影響嚴(yán)謹(jǐn)性。關(guān)于達(dá)到特定嚴(yán)謹(jǐn)程度所需的雜交條件的計(jì)算論述于Sambrook等人(編著)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版1-3冊(cè)(A/o/ecw/arC7om'wgvJZ^fl6oratoryAfawwa/,2nded.,vol.1-3),9禾口11章節(jié)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989,;和Ausubel等人分子生物學(xué)簡(jiǎn)編第四版(Wort7^Woco/""Mo/eciz/flr4thed.),JohnWiley&Sons,Inc.,1999。對(duì)于本公開(kāi)來(lái)說(shuō)，"嚴(yán)謹(jǐn)條件"包括如下條件，即在該條件下雜交只在雜交分子和靶序列之間的錯(cuò)配小于25%的情況下發(fā)生。為了更精確的定義，"嚴(yán)謹(jǐn)條件"可以分解為特定水平的嚴(yán)謹(jǐn)性。因此，此處使用的"適度嚴(yán)謹(jǐn)"條件是指序列錯(cuò)配大于25%的分子不會(huì)雜交的條件；"中等嚴(yán)謹(jǐn)"條件是指錯(cuò)配大于15%的分子不會(huì)雜交的條件，而"高度嚴(yán)謹(jǐn)"條件是指錯(cuò)配大于10%的序列不會(huì)雜交的條件。"非常高度的嚴(yán)謹(jǐn)"條件是指錯(cuò)配大于6%的序列不會(huì)雜交的條件。"特異雜交"是指當(dāng)所述序列存在于復(fù)雜混合物(例如，總細(xì)胞DNA或者RNA)中時(shí)，分子只與或者基本上只與特定核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈或者雜交。特異雜交也可能在不同嚴(yán)謹(jǐn)條件下發(fā)生。免疫刺激組合物此處使用的術(shù)語(yǔ)是指用于刺激或者引發(fā)脊椎動(dòng)物特異性免疫應(yīng)答(或者免疫原性應(yīng)答)的組合物。免疫刺激組合物可以是蛋白抗原或者用于表達(dá)蛋白抗原的質(zhì)粒載體。在一些實(shí)施方式中，免疫原性應(yīng)答是保護(hù)性的或者提供保護(hù)性免疫，從而它使脊椎動(dòng)物能夠更好抵抗來(lái)自免疫刺激組合物針對(duì)的生物體的感染或者疾病進(jìn)展。不希望受到特定理論的約束，認(rèn)為免疫刺激組合物誘導(dǎo)的免疫原性應(yīng)答可能起于抗體的產(chǎn)生，所述抗體對(duì)免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位特異?；蛘?，該應(yīng)答可能包括基于T-輔助細(xì)胞或者細(xì)胞毒性細(xì)胞的應(yīng)答，所述應(yīng)答針對(duì)免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位。所有這3種應(yīng)答可能源于幼稚或者記憶細(xì)胞。這類免疫刺激組合物的一個(gè)特定實(shí)例是疫苗。在一些實(shí)施方式中，免疫刺激組合物的"有效量"或者"免疫-刺激量"是當(dāng)施用于對(duì)象時(shí)足夠引起可檢測(cè)的免疫應(yīng)答的量。這類應(yīng)答可能包括，例如，對(duì)免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位特異的抗體的產(chǎn)生?；蛘?，該應(yīng)答可能包括基于T-輔助細(xì)胞或者CTL的應(yīng)答，所述應(yīng)答針對(duì)免疫刺激組合物提供的一種或者多種表位。所有這3種應(yīng)答可能源于幼稚或者記憶細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，免疫刺激組合物的"保護(hù)有效量"是當(dāng)施用于對(duì)象時(shí)足夠賦予對(duì)象保護(hù)性免疫的量。抑制或者治療疾病例如在處于患病風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象中抑制疾病或者病癥的完全發(fā)展。疾病的一個(gè)特定實(shí)例是狂犬病。"治療"是指疾病或病理狀態(tài)開(kāi)始發(fā)展后，改善其征象或者癥狀或者病理病癥的治療介入。就疾病、病理狀況或者癥狀而言，此處使用的術(shù)語(yǔ)"改善"是指任意可觀察到的治療的有益作用。有益作用可以證明，例如，通過(guò)在易感對(duì)象中疾病臨床癥狀的延遲發(fā)作，疾病的一些或者全部臨床癥狀的嚴(yán)重程度減輕，疾病的進(jìn)展減慢，疾病的復(fù)發(fā)次數(shù)減少，對(duì)象的整體健康或者康復(fù)改善，或者通過(guò)本領(lǐng)域公知的對(duì)特定疾病特異的其他參數(shù)。分離的"分離的"或者"純化的"生物組分(例如核酸，肽，蛋白，蛋白復(fù)合物，或者顆粒)已經(jīng)從組分天然存在的生物體細(xì)胞中的其他生物學(xué)組分中，即其他染色體和染色體外DNA和RNA和蛋白中，被基本上分離、分離產(chǎn)生或者純化。因此"分離的"或者"純化的"核酸、肽和蛋白包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包含在宿主細(xì)胞中利用重組表達(dá)制備的核酸、肽和蛋白，以及化學(xué)合成的核酸或者蛋白。術(shù)語(yǔ)"分離的"或者"純化的"并不需要絕對(duì)的純度；它只是用來(lái)作為一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，例如，分離的生物學(xué)組分是其中生物學(xué)組分比在細(xì)胞內(nèi)其自然環(huán)境或者其他生產(chǎn)容器中的生物學(xué)組分更富集的生物學(xué)組分。優(yōu)選的，制品被純化使生物學(xué)組分代表制品的全部生物學(xué)組分含量的至少50%，例如至少70%，至少90%，至少95%或者更多。標(biāo)記一種可檢測(cè)的化合物或者組合物，其與另一個(gè)分子直接或者間接結(jié)合以促進(jìn)該分子的檢測(cè)。標(biāo)記的特定、非限制實(shí)例包括熒光標(biāo)簽，酶連接物，和放射性同位素。核酸分子核苷酸的多聚形式，包括RNA、cDNA、基因組DNA和上述的合成形成和混合聚合物的有義和反義鏈。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或者任一種類型核苷酸的修飾形式。此處使用的術(shù)語(yǔ)"核酸分子"與"核酸"和"多核苷酸"同義。核酸分子通常至少長(zhǎng)10個(gè)堿基，除非另作說(shuō)明。該術(shù)語(yǔ)包括DNA的單鏈和雙鏈形式。多核苷酸可以包括連接在一起天然存在的或者修飾的核苷酸的任一種或者兩者，通過(guò)天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接進(jìn)行連接。寡核苷酸一種核酸分子，通常包括300個(gè)堿基或者以下的長(zhǎng)度。尤其是，該術(shù)語(yǔ)經(jīng)常是指單鏈脫氧核糖核苷酸，但它也可以指單鏈或者雙鏈核糖核苷酸，RNA:DNA雜交和雙鏈DNA。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"還包括寡聚核苷(oligonucleosides)(也就是說(shuō)，去除磷酸鹽的寡核苷酸)和任何其他的有機(jī)堿基聚合物。一些實(shí)例中，寡核苷酸長(zhǎng)度為大約IO到大約90個(gè)堿基，例如，長(zhǎng)度為12,13,14,15,16,17,18,19或20個(gè)堿基。其它寡核苷酸長(zhǎng)度為大約25，大約30，約35，大約40，大約45，大約50，大約55，大約60個(gè)堿基，大約65個(gè)堿基，大約70個(gè)堿基，大約75個(gè)堿基或者大約80個(gè)堿基。寡核苷酸可以是單鏈的，例如，用作探針或引物，或者可以是雙鏈的，例如，用于突變體基因的構(gòu)建。寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可以按照上述關(guān)于核酸分子的論述來(lái)修飾。寡核苷酸能夠從現(xiàn)有的核酸來(lái)源(例如，基因組或CDNA)獲得，但是也能夠是合成的(例如，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室或者體外寡核苷酸合成來(lái)生產(chǎn))。開(kāi)放閱讀框(ORF):編碼氨基酸的一系列核苷酸三聯(lián)體(密碼子)，沒(méi)有任何內(nèi)部終止密碼子。這些序列通?？煞g為肽/多肽/蛋白/多蛋白。本領(lǐng)域已識(shí)別下列密碼子(顯示為RNA)可以互換地用于編碼各特定氨基酸或者終止丙氨酸(Ala或者A)GCU,GCG,GCA,或者GCG;精氨酸(Arg或者R)CGU,CGC,CGA,CGG,AGA,或者AGG;天門冬酰胺(Asn或者N)AAU或者AAC;天冬氨酸(Asp或者D)GAU或者GAC;半胱氨酸(Cys或者C)UGU或者UGC;谷氨酸(Glu或者E)GAA或者GAG;谷氨酰胺(Gin或者Q)CAA或者CAG;甘氨酸(Gly或者G)GGU，GGC,GGA,或者GGG;組氨酸(His或者H)CAU或者CAC;異亮氨酸(lie或者I)AUU,AUC,或者AUA;亮氨酸(Leu或者UUA,UUG,CUU,CUC,CUA，或者CUG;賴氨酸(Lys或者K)AAA或者AAG;甲硫氨酸(Met或者M(jìn))AUG;苯丙氨酸(Phe或者F)UUU或者UUC;脯氨酸(Pro或者P)CCU，CCC,CCA,或者CCG;絲氨酸(Ser或者S)UCU,UCC，UCA,UCG,AGU,或者AGC;終止密碼子UAA(赭石)或者UAG(琥珀)或者UGA(蛋白石)；蘇氨酸(Thr或者T)ACU,ACC,ACA,或者ACG;酪氨酸(Tyr或者Y)UAU或者UAC;色氨酸(Trp或者W)UGG;和纈氨酸(Val或者V)GUU,GUC，GUA，或者GUG。在每種情況下對(duì)于DNA的相應(yīng)密碼子用T取代U?？刹僮鞯剡B接當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄兄糜谂c第二核酸序列的功能關(guān)系時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，啟動(dòng)子可操作地連接到編碼序列表示啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或者表達(dá)。通常，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的，并且必要時(shí)在相同閱讀框內(nèi)連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)域。如果存在內(nèi)含子，可操作連接的DNA序列可能不是連續(xù)的。互補(bǔ)位抗體的一部分，負(fù)責(zé)抗體與抗原上的抗原決定簇(表位)的結(jié)合。藥學(xué)上可接受的載體用于本公開(kāi)的藥學(xué)上可接受的載體是常規(guī)的。E.W.Martin的雷氏藥物科學(xué)(iem/"g""iP/^rmacew"ca/Sc/e"c^)第15版(1975),,MackPublishingCo.,Easton,，描述了適于一種或者多種治療化合物或者分子的藥物輸送的組合物和制劑，例如一種或者多種SARS-CoV核酸分子，蛋白或者結(jié)合這些蛋白的抗體，和其他藥劑。通常，載體的性質(zhì)將取決于所使用的特定給藥方式。例如，腸胃外制劑通常包括注射液，所述注射液包括藥學(xué)上和生理上可接受的液體，例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、水性右旋糖、甘油等作為介質(zhì)。對(duì)于固體組合物(例如，粉劑，丸劑，片劑，或者膠囊形式)，常規(guī)的無(wú)毒固相載體可以包括，例如，藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，或者硬脂酸鎂。除生物中性載體外，要給藥的藥物組合物可以包含少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)或者乳化劑，防腐劑，和pH緩沖劑等等，例如乙酸鈉或者脫水山梨醇單月桂酸酯。多肽一種聚合物，其中單體是通過(guò)酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基。當(dāng)氨基酸是a-氨基酸時(shí)，可以使用L-光學(xué)異構(gòu)體或者D-光學(xué)異構(gòu)體，對(duì)許多生物用途來(lái)說(shuō)L-異構(gòu)體是優(yōu)選的。此處使用的術(shù)語(yǔ)"多肽"或者"蛋白"旨在包括任意氨基酸分子并包括修飾的氨基酸分子。術(shù)語(yǔ)"多肽"特別旨在涵蓋天然存在的蛋白，以及重組或者合成產(chǎn)生的那些蛋白。保守氨基酸取代是指當(dāng)進(jìn)行取代時(shí)，最少干擾最初蛋白的性質(zhì)，也就是說(shuō)，蛋白的結(jié)構(gòu)、尤其功能是保守的，不會(huì)被這種取代顯著改變。保守取代的實(shí)例如下所示。原始?xì)埢Ｊ厝〈鶤laSerArgLysAsnGin,HisAspGluCysSerGinAsnGluAspHisAsn;GinlieLeu,ValLeulie;ValLysArg;Gin;GluMetLeu;liePheMet;Leu;TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp;PheVallie;Leu保守取代通常保持(a)取代區(qū)域內(nèi)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，片層或者螺旋構(gòu)象，(b)分子在靶位點(diǎn)的電荷或者疏水性，或者(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)它們的側(cè)鏈，通常將氨基酸分類為一種或者多種類型，包括極性，疏水性，酸性，堿性和芳香族的。極性氨基酸的實(shí)例包括那些具有側(cè)鏈功能基團(tuán)例如羥基、巰基和酰胺的氨基酸，以及酸性和堿性氨基酸。極性氨基酸包括，不限于，天門冬酰胺，半胱氨酸，谷氨酰胺，組氨酸，硒代半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸和酪氨酸。疏水性或者非極性氨基酸的實(shí)例包括那些具有非極性脂肪族側(cè)鏈的殘基的氨基酸，例如，不限于，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，甲硫氨酸和苯丙氨酸。堿性氨基酸殘基的實(shí)例包括那些堿性側(cè)鏈的殘基，例如氨基或者胍基基團(tuán)。堿性氨基酸殘基包括，不限于，精氨酸，同聚賴氨酸和賴氨酸。酸性氨基酸殘基的實(shí)例包括那些具有酸性側(cè)鏈功能基團(tuán)的殘基，例如羧基。酸性氨基酸殘基包括，不限于，天冬氨酸和谷氨酸。芳香族氨基酸包括那些具有芳香族側(cè)鏈基團(tuán)的氨基酸。芳香族氨基酸的實(shí)例包括，不限于，聯(lián)苯基丙氨酸，組氨酸，2-萘基丙氨酸(napthylalananine)，五氟苯丙氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。注意到一些氨基酸被分到多于一個(gè)組，例如，組氨酸，色氨酸和酪氨酸被分類為極性和芳香族氨基酸。被分類到上述各組的其他氨基酸是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。通常預(yù)期產(chǎn)生蛋白性質(zhì)最大變化的取代將是非保守性的，例如在以下方面的變化(a)親水性殘基，例如，絲氨?；蛘咛K氨酰取代(或者被取代)疏水性殘基，例如，亮氨酰，異亮氨酰，苯丙氨酰，纈氨?；蛘弑滨?；(b)半胱氨酸或者脯氨酸取代(或者被取代)任意其他殘基；(c)具有正電性側(cè)鏈的殘基，例如，賴氨酰，精氨酰，或者組胺酰(histadyl)，取代(或者被取代)負(fù)電性的殘基，例如，谷氨?；蛘咛於滨；?；或者(d)具有龐大側(cè)鏈的殘基，例如，苯丙氨酸，取代(或者被取代)沒(méi)有側(cè)鏈的殘基，例如，甘氨酸。探針和引物探針包括連接于可檢測(cè)的標(biāo)記物或者其他報(bào)告分子的分離核酸分子。典型標(biāo)記物包括放射性同位素，酶底物，輔因子，配體，化學(xué)發(fā)光或者熒光劑，半抗原和酶。標(biāo)記方法和選擇適合于不同目的的標(biāo)記物的指導(dǎo)論述于，例如Sambrook等人編著)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版1-3冊(cè)(Mo/ecw/wC/o"/"g:^丄Wor^oo;Mawwa/,2nded.，vol.1-3)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989和Ausubd等人的分子生物學(xué)簡(jiǎn)編第四版(57ioWiVc^oco/si"Afo/ecw/ar5Zo/ogy,4thed.),JohnWiley&Sons,Inc.,1999。引物是短的核酸分子，例如6個(gè)核苷酸以上長(zhǎng)度的DNA寡核苷酸，例如與連續(xù)互補(bǔ)核苷酸或者待擴(kuò)增的序列雜交的寡核苷酸。更長(zhǎng)的DNA寡核苷酸可以是大約10，12，15，20，25，30或者50個(gè)核苷酸以上的長(zhǎng)度。引物可以通過(guò)核酸雜交與互補(bǔ)靶DNA鏈退火，在引物和耙DNA鏈之間形成雜交，然后引物通過(guò)DNA聚合酶沿著靶DNA鏈延伸。引物對(duì)可以用于核酸序列的擴(kuò)增，例如，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或者本領(lǐng)域已知的其他核酸擴(kuò)增方法。擴(kuò)增的其他實(shí)例包括鏈替代擴(kuò)增，如美國(guó)專利5,744,311所公開(kāi)；無(wú)轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增，如美國(guó)專利6,033,881所公開(kāi)；修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如WO90/01069所公開(kāi)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如EP-A-320308所公開(kāi)；間隙填補(bǔ)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，如5,427,930所公開(kāi)；和NASBA1^無(wú)RNA轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，如美國(guó)專利6,025,134所公開(kāi)。制備和使用核酸探針和引物的方法描述于例如Sambrook等人(編著)的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版1-3冊(cè)(Afo/eoJwC/om'"g.'爿ZaZora組jMa肌a/,2nded.,vol.1-3),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989;Ausubel等人的分子生物學(xué)簡(jiǎn)編第四版(iSTzoWiVoZoco/sAfo/ecw/ar4thed).,JohnWiley&Sons,Inc.,1999;和Innis等人的PCR教程-方法和應(yīng)用指導(dǎo)(jFVotoco/s,爿GwzWeMeAoAawdy4/p/z'ca"'ows),AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA,1990。擴(kuò)增引物對(duì)可以來(lái)源于已知序列，例如，通過(guò)利用用于該目的的計(jì)算機(jī)程序例如Primer(Version0.5,1991,WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解特定探針或者引物的特異性隨其長(zhǎng)度而增加。因此，為了獲得更高的特異性，可以選擇探針和引物包括靶核苷酸序列的至少20，25，30，35，40，45，50或者更多個(gè)連續(xù)核苷酸。蛋白一種生物分子，尤其是多肽，由基因表達(dá)并由氨基酸組成。純化的術(shù)語(yǔ)"純化的"并不需要絕對(duì)的純度；它用作一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，例如，純化的蛋白制品是其中目標(biāo)蛋白比其在細(xì)胞內(nèi)自然環(huán)境中更純的蛋白制品。通常，純化蛋白制品使得所述蛋白占制品總蛋白含量的至少50%。重組核酸一種核酸分子，其不是天然存在的或者具有一個(gè)由序列的兩個(gè)本來(lái)分離的片段人工組合制備的序列。這種人工組合通過(guò)化學(xué)合成或者，更常見(jiàn)的，通過(guò)核酸分離片段的人工處理實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)遺傳工程技術(shù)，例如描述于Sambrook等人(編著)的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版1-3冊(cè)(Mo/ec"/arC7om'"g:JA/a,fl/,2nded.,vol.1-3),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NY,1989。術(shù)語(yǔ)重組包括只是通過(guò)天然核酸分子一部分的添加、取代或者缺失改變的核酸。調(diào)控序列或者元件這些術(shù)語(yǔ)通常是指影響或者控制基因表達(dá)的一類DNA序列。該術(shù)語(yǔ)包括的是啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，基因座控制區(qū)(LCR)，絕緣子/臨界元件，沉默子，基質(zhì)結(jié)合區(qū)(MAR，還稱為支架附著區(qū))，阻遏子，翻譯終止子，復(fù)制起點(diǎn)，著絲粒，和減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)。啟動(dòng)子是鄰近基因5'端的DNA序列，作為DNA依賴性RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，從這里起始轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是提高從啟動(dòng)子起始的轉(zhuǎn)錄水平的控制元件，通常與增強(qiáng)子方向或者與啟動(dòng)子的距離無(wú)關(guān)。對(duì)與它們連接的基因的表達(dá)，LCRs提供組織特異的和短暫的調(diào)節(jié)。LCR功能和它們與基因的相對(duì)位置無(wú)關(guān)，但取決于拷貝數(shù)。據(jù)認(rèn)為它們作用于打開(kāi)核小體結(jié)構(gòu)，從而其他因子可以結(jié)合DNA。LCR還可能影響復(fù)制時(shí)間和起點(diǎn)的使用。絕緣子(亦稱臨界元件)是通過(guò)阻斷周圍染色質(zhì)的作用，阻止基因轉(zhuǎn)錄活化(或者滅活)的DNA序列。沉默子和阻遏子是抑制基因表達(dá)的控制元件；它們對(duì)基因的作用與它們的方向或者與基因的距離無(wú)關(guān)。MAR是結(jié)合核支架的DNA內(nèi)序列；它們能夠通過(guò)將染色體分離成調(diào)控結(jié)構(gòu)域影響轉(zhuǎn)錄。據(jù)認(rèn)為MAR介導(dǎo)染色體內(nèi)高級(jí)的環(huán)結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄終止子是基因鄰近區(qū)域，在此RNA聚合酶從模板釋放。復(fù)制起點(diǎn)是在DNA合成或者細(xì)胞分裂的復(fù)制期基因組開(kāi)始DNA復(fù)制過(guò)程的區(qū)域。減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)是基因組比減數(shù)分裂期間平均值更頻繁重組的區(qū)域。復(fù)制子體內(nèi)作為DNA復(fù)制的自主、自我復(fù)制單位的任意遺傳元件(例如，質(zhì)粒，染色體，病毒)。樣品代表整體的一部分、一塊或者片段。該術(shù)語(yǔ)包括任意物質(zhì)，包括例如從動(dòng)物、植物或者環(huán)境獲得的樣品。"環(huán)境樣品"包括從室內(nèi)或者室外環(huán)境中無(wú)生命的物體或者儲(chǔ)庫(kù)(reservoir)中獲得的樣品。環(huán)境樣品包括，但不限于土壤，水，灰塵和空氣樣品；大體積樣品，包括建筑材料，家具和垃圾填埋物；和其他儲(chǔ)庫(kù)樣品，例如動(dòng)物垃圾，收獲的谷物和食品。"生物樣品"是從植物或者動(dòng)物對(duì)象獲得的樣品。此處使用的生物樣品包括可用于檢測(cè)對(duì)象病毒感染的所有樣品，包括但不限于細(xì)胞，組織和體液，例如血液；血液的衍生物和部分(例如血清)；提取的膽汁；活組織切片或者手術(shù)去除的組織，包括例如，未固定的、冷凍的、福爾馬林固定的和/或埋入石蠟的組織；淚液；乳汁；皮膚刮擦物；表面沖洗物；尿液；痰液；腦脊液；前列腺液；膿；骨髓抽吸物；BAL;唾液；子宮頸拭子；陰道拭子；和口咽洗滌物。序列同一性兩個(gè)核酸序列或者兩個(gè)氨基酸序列之間的相似性，根據(jù)序列之間的相似性表達(dá)，還稱為序列同一性。序列同一性經(jīng)常根據(jù)百分比同一性(或者相似性或者同源性)來(lái)測(cè)量；百分比越高，兩個(gè)序列越相似。用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域公知的。不同的程序和比對(duì)算法描述于Smith和Waterman(Adv.Appl.Math"2:482,1981);Needleman禾口Wunsch(J.Mol.Biol"48:443，1970);Pearson禾口Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.,85:2444,1988);Higgins禾口Sharp(Gene,73:237-44,1988);Higgins和Sharp(CABIOS,5:151-53,1989);Corpet等人(Nuc.AcidsRes"16:10881-90,1988);Huang等人(Comp.Appls.Biosci"8:155-65,1992);和Pearson等人(Meth.Mol.Biol"24:307-31,1994)。Altschul等人(NatureGenet.,6:119-29，1994)提出了序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)考慮因素。比對(duì)工具ALIGN(Myers和Miller,CABIOS4:11-17,1989)或者LFASTA(Pearson禾口Lipman,1988)可用于進(jìn)行序列比較(InternetProgram1996,W.R.PearsonandtheUniversityofVirginia,"fasta20u63，，version2.0u63,出廠日期1996年12月)。ALIGN比較彼此的完整序列，而LFASTA比較局部相似的區(qū)域。在因特網(wǎng)的NCSA站點(diǎn)上現(xiàn)有這些比對(duì)工具和它們各自的教學(xué)軟件?；蛘撸瑸榱吮容^大于大約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列，可以使用"Blast2sequences"功能，用默認(rèn)BLOSUM62矩陣設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)，(空位開(kāi)放罰分ll，每個(gè)殘基空位罰分l)。當(dāng)比對(duì)短肽(少于約30個(gè)氨基酸)時(shí)，應(yīng)使用"Blast2sequences"功能進(jìn)行比對(duì)，采用PAM30矩陣設(shè)為默認(rèn)參數(shù)(開(kāi)放空位9，延伸空位1罰分)。BLAST序列比較系統(tǒng)是可用的，例如，來(lái)自NCBI站點(diǎn)；還可參見(jiàn)Altschul等人，J.Mo/.215:403-10,1990;Gish禾卩States,7Va^re3:266-72,1993;Madden等人，Meth.Enzymol.，266:131-41，1996;Altschul等人，NucleicAcidsRes.,25:3389-402，1997;和Zhang和Madden,Ge"o/we,7:649-56,1997.在一些情況下蛋白的直向同源物(等同于其他種類的蛋白)表征為具有超過(guò)75%的序列同一性，所述序列同一性利用設(shè)置到默認(rèn)參數(shù)的ALIGN,與特定蛋白的氨基酸序列進(jìn)行全長(zhǎng)比對(duì)算出。當(dāng)利用這種方法評(píng)估時(shí)，與參照序列具有更高相似性的蛋白將顯示同一性的百分比增加，例如至少80%，至少85%，至少90%，至少92%，至少95%，或者至少98%的序列同一性。此外，可以對(duì)已公開(kāi)的融合蛋白的一個(gè)或者兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)比較序列同一性。當(dāng)顯著小于完整序列進(jìn)行序列同一性比較時(shí)，同源序列在10-20短窗口(shortwindows)上將通常具有至少80%的序列同一性，可能具有至少85%，至少90%，至少95%，或者至少99%的序列同一性，取決于它們與參照序列的相似性?？梢允褂肔FASTA確定這類短窗口上的序列同一性；方法描述于NCSA站點(diǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚這些序列同一性范圍只提供指導(dǎo)；完全有可能獲得超出所提供范圍的非常顯著的同系物。與對(duì)蛋白描述的相同，相似的同源性概念適用于核酸。兩個(gè)核酸分子緊密相關(guān)的另一種表示是兩個(gè)分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下彼此雜交。因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，不顯示高度同一性的核酸序列仍可能編碼相似的氨基酸序列。應(yīng)了解利用這種簡(jiǎn)并性可以造成核酸序列的變化以產(chǎn)生多重核酸序列，所述多重核酸序列各編碼基本上相同的蛋白。特異結(jié)合劑一種基本上只結(jié)合指定靶的試劑。因此蛋白特異結(jié)合劑基本上只結(jié)合指定蛋白，或者蛋白內(nèi)的特定區(qū)域。此處使用的蛋白特異結(jié)合劑包括基本上結(jié)合特定多肽的抗體和其他試劑?？贵w可以是對(duì)多肽特異的單克隆或者多克隆抗體，以及其免疫有效部分("片段")。通過(guò)使用或者調(diào)節(jié)常規(guī)步驟，可以輕易地確定特異試劑基本上只結(jié)合特異多肽。利用Western印跡步驟的合適的體外分析實(shí)例包括IFA和Ag-ELISA，在許多標(biāo)準(zhǔn)文本中有描述，包括Harlow和Lane,抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(UsingAntibodies:ALaboratoryManual),CSHL,NewYork,1999。轉(zhuǎn)化"轉(zhuǎn)化"細(xì)胞是其中通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)導(dǎo)入核酸分子的細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)包括可以將核酸分子導(dǎo)入這類細(xì)胞的所有技術(shù)，包括利用病毒載體轉(zhuǎn)染，利用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化，和通過(guò)電穿孔導(dǎo)入裸DNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和粒子槍加速。載體作為導(dǎo)入宿主細(xì)胞的核酸分子，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。載體可以包括允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點(diǎn)(參與啟動(dòng)DNA合成的DNA序列)。載體還可以包括一種或者多種選擇性標(biāo)志基因和其他本領(lǐng)域已知的遺傳元件。病毒在活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的微小感染性生物體。病毒通?；旧嫌梢粋€(gè)蛋白被膜包圍的單核酸核組成，具有只在活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的能力。"病毒復(fù)制"是通過(guò)至少一個(gè)病毒生活周期發(fā)生的其它病毒的產(chǎn)生。病毒可以摧毀宿主細(xì)胞的正常功能，造成細(xì)胞表現(xiàn)為病毒決定的方式。例如，病毒感染可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，或者對(duì)細(xì)胞因子應(yīng)答，而未感染的細(xì)胞通常不會(huì)這樣。盡管與此處描述的相似或者等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或者檢驗(yàn)，但合適的方法和材料在下面描述。所有此處提及的出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)在此完整引入作為參考。在不一致的情況下，以本說(shuō)明書為準(zhǔn)，包括術(shù)語(yǔ)的解釋。此外，材料、方法和實(shí)例只是說(shuō)明性的，而不是為了限制。教個(gè)實(shí)嚴(yán)方式游撒迷此處第一個(gè)實(shí)施方式提供的是重組狂犬病病毒基因組，包括SEQIDNO:l(全長(zhǎng)ERA序列)所示的核酸。還提供該基因組編碼的分離的狂犬病病毒蛋白，包括包含下列序列所示的氨基酸序列的特定蛋白SEQIDNO:2(N蛋白)；SEQIDNO:3(P蛋白)；SEQIDNO:4(M蛋白)；SEQIDNO:5(G蛋白)；或者SEQIDNO:6(L蛋白)；和編碼這類蛋白的分離核酸分子。舉例來(lái)說(shuō)，這類分離的核酸分子包括下列所示的核苷酸序列SEQIDNO:l的核苷酸71-1423(N蛋白)；SEQIDNO:l的核苷酸1511-2407(P蛋白)；SEQIDNO:l的核苷酸2491-3104(M蛋白)；SEQIDNO:l的核苷酸3318-4892(G蛋白)；或者SEQIDNO:l(L蛋白)的核苷酸5418-11,801。還提供具有SEQIDNO:7所示核酸序列的重組病毒基因組，其不同于SEQIDNO:l，因?yàn)樵贕基因和psi-區(qū)之間的polyAtract上缺失一個(gè)腺苷殘基。SEQIDNO:7還編碼如SEQIDNO:2-6所示的蛋白。還提供ERA病毒株衍生物的基因組，如SEQIDNO:8-18所示。在某些實(shí)施方式中，基因組存在于載體中，例如質(zhì)粒。另一個(gè)描述的實(shí)施方式是使用此處描述的方法測(cè)序全長(zhǎng)狂犬病病毒基因組的系統(tǒng)。還描述了用于異源蛋白表達(dá)的病毒載體系統(tǒng)。另一個(gè)實(shí)施方式提供包括此處提供的一種或者多種核酸分子，或者一種或者多種蛋白的組合物。任選的，這類組合物包含藥學(xué)上可接受的載體，佐劑，或者其兩種或更多種的組合。還提供在對(duì)象中引發(fā)針對(duì)抗原表位的免疫應(yīng)答的方法，包括給對(duì)象導(dǎo)入包括此處描述的核苷酸、肽或者多肽的組合物，從而在對(duì)象中引發(fā)免疫應(yīng)答。本公開(kāi)的另一個(gè)方面涉及用于產(chǎn)生重組狂犬病病毒的載體系統(tǒng)。該載體系統(tǒng)包括第一載體(轉(zhuǎn)錄載體)，包含全長(zhǎng)狂犬病病毒反基因組DNA(或者其衍生物)，和一組輔助載體，包含編碼至少一種狂犬病病毒株ERA蛋白的核酸。轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞中載體的表達(dá)引起活的重組狂犬病病毒的產(chǎn)生。在某些實(shí)施方式中，反基因組DNA是ERA株(例如，SEQIDNO:l或者SEQIDNO:7)或者其衍生物，例如SEQIDNO:8-18中的一種。在某些實(shí)施例中，載體是質(zhì)粒。為了促進(jìn)全長(zhǎng)病毒RNA的恢復(fù)，轉(zhuǎn)錄載體可以包括，按5'到3'方向錘頭核酶；狂犬病病毒反基因組cDNA;和丁型肝炎病毒核酶。選擇錘頭核酶的核苷酸與狂犬病病毒的反義基因組序列互補(bǔ)。反基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄受至少一個(gè)CMV啟動(dòng)子和噬菌體T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通常是在這兩個(gè)啟動(dòng)子的控制下。輔助載體通常包括包含編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的載體；包含編碼狂犬病病毒P蛋白的多核苷酸序列的載體；包含編碼狂犬病病毒M蛋白的多核苷酸序列的載體；包含編碼狂犬病病毒L蛋白的多核苷酸序列的載體；和包含編碼噬菌體T7RNA聚合酶的多核苷酸序列的載體。在一個(gè)實(shí)施方式中，T7RNA聚合酶包括核定位信號(hào)(NLS)。任選的，載體系統(tǒng)還包括包含編碼狂犬病病毒G蛋白的多核苷酸序列的載體。編碼狂犬病病毒P、M、L或G蛋白或者T7聚合酶的一種或者多種多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受CMV啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子二者的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。相反，編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且轉(zhuǎn)錄是帽-非依賴性的(cap-independent)。另外一種實(shí)施方式是活狂犬病疫苗，每種都包括此處提供的重組狂犬病病毒基因組。這類重組狂犬病基因組的實(shí)例包括ERAG333(SEQIDN0:13)所示序列；ERA2G(SEQIDNO:8)所示序列；和此處ERA2G333(SEQIDNO:IO)所示序列。任選的，狂犬病疫苗是減毒的。還提供一種產(chǎn)生活狂犬病病毒(例如，用于免疫原性組合物，例如疫苗)的方法，通過(guò)將載體系統(tǒng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中后，活的和任選減毒的病毒被恢復(fù)。通過(guò)這類方法產(chǎn)生的活狂犬病疫苗的制備和給藥也是本文所預(yù)期的。還公開(kāi)了一種接種對(duì)象抗狂犬病的方法，該方法包括向?qū)ο笫┯糜行Я康母鶕?jù)提供的說(shuō)明所述的活狂犬病疫苗，使對(duì)象的細(xì)胞感染狂犬病疫苗，其中在對(duì)象中產(chǎn)生抗-狂犬病免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象是人。在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)象是非人動(dòng)物。例如，在有些情況下非人動(dòng)物是貓，狗，大鼠，小鼠，蝙蝠，狐貍，浣熊，松鼠，負(fù)鼠，山狗或者狼。在某些實(shí)施方式中，狂犬病疫苗腸道給藥。例如，在一些情況下腸道給藥包括口服給藥?？诜o藥包括例如通過(guò)為接種野生動(dòng)物群接種而設(shè)計(jì)的食物誘餌進(jìn)行給藥。還提供包括所述活狂犬病疫苗(例如，減毒的活狂犬病疫苗)和藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑的藥物組合物。K游完微犬諒癆毒虜翻歸旅為了便利全長(zhǎng)ERA基因組的測(cè)序，開(kāi)發(fā)了一種對(duì)全長(zhǎng)負(fù)鏈RNA病毒進(jìn)行測(cè)序的方法。該方法適合于狂犬病病毒屬的測(cè)序，例如狂犬病病毒，以及其他負(fù)鏈RNA病毒?？袢〔《臼菃呜?fù)鏈RNA病毒，具有大約12kb的基因組，范圍在11,918(澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒屬)和11,940(Mokola病毒)個(gè)堿基之間。GENBANK中提供的狂犬病病毒核酸序列主要集中于編碼下述蛋白的序列--核衣殼蛋白(N)，糖蛋白(G)，磷蛋白(P)和基質(zhì)蛋白(M)基因，它們接近基因組的3'端?，F(xiàn)有的種系發(fā)生分析主要基于N和G基因。但是，對(duì)于關(guān)系較遠(yuǎn)的狂犬病病毒株，RNA依賴性RNA聚合酶(L)基因是用于種系發(fā)生分析的最合適候選者。令人遺憾地，公共基因數(shù)據(jù)庫(kù)中很少提供L基因序列。此外，據(jù)認(rèn)為狂犬病病毒末端的前導(dǎo)區(qū)和trailer區(qū)對(duì)病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制(的調(diào)節(jié))非常重要。這些可能是例如用于核蛋白包裝的保守區(qū)域或者L/P蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。在前導(dǎo)-N，N-P,P-M，M-G,假-基因區(qū)和G-L中的基因間區(qū)域還作為病毒轉(zhuǎn)錄啟始的信號(hào)。因此，不僅編碼區(qū)域，而且病毒基因組內(nèi)的非編碼區(qū)域，都可以用于種系發(fā)生分析或者進(jìn)化研究。利用此處提供的全基因組測(cè)序方法，這些序列都可以更容易地進(jìn)行分析。該方法包括單步逆轉(zhuǎn)錄和二步克隆進(jìn)合適的載體。該方法在載體中產(chǎn)生容易測(cè)序的基因組，無(wú)需進(jìn)行易出錯(cuò)的反復(fù)RT-PCR反應(yīng)。利用在狂犬病基因組末端發(fā)現(xiàn)的反向重復(fù)(和其他狂犬病病毒屬的基因組)，已經(jīng)設(shè)計(jì)出通用引物，并在此處描述用于此處所述的快速全基因組測(cè)序步驟?？袢〔《镜那皩?dǎo)和trailer區(qū)包含用于病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的信號(hào)?；趯?duì)GenBank提供的基因組序列的分析，在狂犬病病毒或者狂犬病相關(guān)病毒包括Mokola病毒中，末端11個(gè)核苷酸是嚴(yán)格保守的。此處提供的測(cè)序方法原理基于末端11個(gè)互補(bǔ)核苷酸。因?yàn)檫@兩種11個(gè)核苷酸的序列是互補(bǔ)的，它們不能用于后續(xù)PCR反應(yīng)。應(yīng)了解，具有反向重復(fù)的其他病毒利用對(duì)應(yīng)于所述重復(fù)的引物能夠類似地進(jìn)行擴(kuò)增。該11個(gè)反基因組有義核苷酸被設(shè)計(jì)為用于純化的ERA基因組的逆轉(zhuǎn)錄引物，其完整性通過(guò)大小比較和Northern印跡進(jìn)行驗(yàn)證。利用N,P，M，G，L基因探針和11個(gè)核苷酸作為寡核苷酸探針，其只結(jié)合基因組RNA而不是病毒mRNA，通過(guò)Northern印跡確認(rèn)全基因組cDNA。利用精心設(shè)計(jì)的保守末端序列對(duì)應(yīng)引物，完全可以在一個(gè)反應(yīng)中逆轉(zhuǎn)錄狂犬病病毒全基因組，條件是病毒基因組制備物的質(zhì)量要高。ERA序列與SAD序列密切相關(guān)，SAD序列是其衍生物。這并不奇怪，因?yàn)樵?970年代ERA從CDC送到瑞士，在其被寄到德國(guó)前，在那里研究人員對(duì)它進(jìn)行改造以便在細(xì)胞中生長(zhǎng)，在德國(guó)它進(jìn)一步衍生，并且衍生物在1990年左右被完全測(cè)序。迄今為止，根據(jù)血清交叉保護(hù)和遺傳研究，已經(jīng)將狂犬病和狂犬病相關(guān)病毒分為7種不同類型典型狂犬病病毒1型(包括ERA)，2型(Lagos蝙蝠)，3型(Mokola)，4型(Duvenhage)，5型(歐洲蝙蝠狂犬病病毒屬[EBL]I)，6型(EBLII)和7型(澳大利亞蝙蝠病毒)。序列分析在下列領(lǐng)域起著重要作用系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、進(jìn)化研究、基因功能預(yù)測(cè)研究和其他相關(guān)領(lǐng)域，包括定位病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制調(diào)控區(qū)域，因此生物信息學(xué)趨向于潛在的治療藥物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已經(jīng)知道，隨著逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在在一個(gè)反應(yīng)中多達(dá)12kb以上的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA是相對(duì)容易的。在優(yōu)化條件下，PCR可以在一個(gè)反應(yīng)中擴(kuò)增大于30kb的靶。利用此處提供的產(chǎn)生全長(zhǎng)病毒基因組序列的方法，尤其是狂犬病基因組序列，分析不同病毒株現(xiàn)在已成為現(xiàn)實(shí)。利用得到的全長(zhǎng)基因組還能夠有效設(shè)計(jì)減毒病毒，例如用于免疫刺激組合物和疫苗的免疫作用或者生產(chǎn)。不存在"通用"狂犬病病毒基因組，但這些基因組是相關(guān)的。在不同類型中相似性從60%到100%。一些區(qū)域，例如L基因，似乎更保守，而其他區(qū)域，例如不編碼多肽的psi區(qū)，是更可變化的。不僅狂犬病和狂犬病相關(guān)病毒漂變，而且任意RNA病毒也將隨時(shí)間變化。病毒如何改變和出現(xiàn)仍是未解決的問(wèn)題。因此，全基因組序列分析對(duì)于進(jìn)化、致病性和基因功能研究是重要的。就涉及全基因組測(cè)序而言，此處描述的該系統(tǒng)是用于狂犬病病毒的第一個(gè)。相信其適合其他RNA病毒，尤其在狂犬病病毒屬中。目前，對(duì)于狂犬病病毒種系發(fā)生研究，科學(xué)家只利用N，P或者G基因，它們?cè)诒桓腥镜募?xì)胞或者組織中是最豐富的。已知對(duì)于關(guān)系較遠(yuǎn)的株的比較，包括大半基因組的L基因可能是一個(gè)理想的候選位點(diǎn)，應(yīng)該被使用。令人遺憾地，由于只有非常有限的資料可以利用，這類進(jìn)化比較是不可能的，更不用說(shuō)全基因組序列了。還是對(duì)于病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制研究來(lái)說(shuō)，據(jù)推測(cè)位于基因組3'和5'末端的前導(dǎo)和trailer區(qū)起著重要作用?；蜷g區(qū)域還是病毒反式和順式研究的信號(hào)。所有這些數(shù)據(jù)是相當(dāng)有限的，因?yàn)樗鼈儾话ㄔ趍RNA內(nèi)。只有全基因組序列可以提供這個(gè)水平的必要信息。全基因組測(cè)序不僅可用于疫苗開(kāi)發(fā)，它還適用于基本的病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制研究。它還可應(yīng)用于開(kāi)發(fā)siRNA和基因治療。扁基鵬游利用此處描述的方法，已經(jīng)產(chǎn)生ERA狂犬病病毒基因組的唯一序列。該序列顯示于SEQIDNO:l。在基因組下列位置編碼ERA狂犬病病毒的5種蛋白(SEQIDNO:2-6):N,71-1423;P,1511-2407;M,2491-3104;G,3318-4892;和L,5418-11801。ERA和SAD-B19之間的同源性分別是:N99.56%，P98.65%，M96.53%，G99.05%和L99.20%。ERA和SAD-B19之間的一個(gè)特定差異是G和假基因之間的基因間區(qū)域，SAD-B19G轉(zhuǎn)錄終止/多腺苷酸化信號(hào)被破壞。ERA狂犬病病毒全基因組序列是利用反向遺傳學(xué)進(jìn)行疫苗開(kāi)發(fā)和致病性研究的先決條件。F//.^f產(chǎn)f瘋毒游汰眾,統(tǒng)實(shí)施例6和7提供了用于產(chǎn)生ERA病毒的一組優(yōu)化條件，其中滴度高達(dá)每mll01Qffu。在生物反應(yīng)器中，恢復(fù)的病毒可以生長(zhǎng)到109到101Qffu/ml。這種高生產(chǎn)水平對(duì)于口服疫苗開(kāi)發(fā)是最為重要的，這樣可以在合理時(shí)間段內(nèi)利用合理的資源分配產(chǎn)生足夠的疫苗材料。對(duì)于親代和重組ERA株來(lái)說(shuō)，提供的生長(zhǎng)條件可以穩(wěn)定產(chǎn)生這種高病毒滴度。這些生產(chǎn)數(shù)據(jù)對(duì)于潛在的狂犬病口服疫苗開(kāi)發(fā)非常重要。F///.^f產(chǎn)全G-靂毒游557-G激應(yīng)系盡管先前已經(jīng)從BHK細(xì)胞拯救了缺失G蛋白的RV株，但用缺失G蛋白的ERA株病毒仍然是不可能的。在小鼠腦內(nèi)或者肌內(nèi)接種ERA-G后，沒(méi)有小鼠死亡或者顯示任何狂犬病癥狀。只有補(bǔ)充糖蛋白，ERA-G(不含糖蛋白)才能在細(xì)胞中生長(zhǎng)。另外，突變的病毒不能傳播。為了幫助ERA-G生長(zhǎng)，建立了BSR-G細(xì)胞系，其組成性表達(dá)ERA糖蛋白。在下面的實(shí)施例中描述該細(xì)胞系的產(chǎn)生。該細(xì)胞系用于RV株的恢復(fù)，例如在缺乏G下難以恢復(fù)的ERA-G，以及用于優(yōu)化其他株的恢復(fù)。/X工薦眾汪犬瘋諒毒疫度浙#薪歪^表達(dá)游及/^遺傳系統(tǒng)直接通過(guò)分子生物學(xué)方法不易操縱RNA。傳統(tǒng)的RNA病毒疫苗來(lái)自天然減毒的分離物，其難以控制并造成不可預(yù)測(cè)的結(jié)果。反向遺傳技術(shù)使操縱RNA病毒成為DNA成為可能，其可以根據(jù)精心設(shè)計(jì)被突變、切除或者重建。每個(gè)基因功能都可以仔細(xì)、獨(dú)立和一致地研究，這有利于疫苗開(kāi)發(fā)。反向遺傳學(xué)涉及將RNA病毒基因組逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并且克隆入載體，例如質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，載體被轉(zhuǎn)錄成RNA，被結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)包裝，所述結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)還可以由質(zhì)粒提供。包裝的RNA形成核糖核蛋白復(fù)合物，這導(dǎo)致可以被恢復(fù)的病毒顆粒。盡管已經(jīng)公開(kāi)了用于狂犬病病毒(RV)反向遺傳學(xué)的3個(gè)系統(tǒng)(Schnell等人，TheEMBOJ.13,4195-4203,1994;Inoue箏乂，P7ro/.M"W,107,229-236,2003;Ito等乂，MZc威o/./mm,/.47,613-617,2003)，但這些系統(tǒng)不易適應(yīng)其他株。目前，即使當(dāng)病毒株之間是緊密相關(guān)的，也沒(méi)有狂犬病病毒株借助不同病毒株的輔助質(zhì)粒而恢復(fù)。因此，對(duì)于任意特異病毒株突變或者疫苗開(kāi)發(fā)來(lái)說(shuō)，必須開(kāi)發(fā)一種特定處理系統(tǒng)。ERA株是用于狂犬病口服疫苗開(kāi)發(fā)的合適候選物，但其殘余致病性是明顯的。在1970年代間，對(duì)ERARV進(jìn)行了廣泛的疫苗開(kāi)發(fā)(Black和Lawson，Can.Com/.M/.44:169-176，1980;Charlton，禾卩Casey,Ca".b.20:168-172,1978;Lawson,禾口C麗ley，C肌版36:339-344,1972)。ERA和SAD-B19均起源于SAD。在初期口服疫苗試驗(yàn)中，SAD-B19在浣熊和臭鼬中均是有效的，而ERA不是。此外，在動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)，ERA殺死腦內(nèi)(i.e.)給藥的兩周齡小鼠。這些觀察引起這兩種RV株之間關(guān)系和微細(xì)改變的潛在影響的疑問(wèn)。根據(jù)全病毒基因組序列比較，ERA和SAD-B19共享極高的核苷酸同一性和氨基酸同源性。為了闡明狂犬病病毒這些高度相關(guān)株的免疫原性和致病性的遺傳基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)ERA的有效反向遺傳系統(tǒng)，其不同于先前報(bào)道的針對(duì)狂犬病病毒的反向遺傳系統(tǒng)。此處公開(kāi)的狂犬病反向遺傳系統(tǒng)可用于各種目的，包括(1)以指定方式減毒ERA病毒用于疫苗開(kāi)發(fā)；(2)產(chǎn)生ERA病毒載體用于表達(dá)異源ORF(例如，在治療組合物的情況下，例如疫苗和基因治療)；(3)確定ERARV發(fā)病機(jī)理的遺傳基礎(chǔ)；和(4)確定ERA和SAD病毒之間遺傳差異的生物學(xué)影響。反向遺傳系統(tǒng)具有下列特征中的一些或者全部，利用示范性ERA株反基因組cDNA，示意性圖示于圖1A。該系統(tǒng)基于一個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒外加多個(gè)輔助質(zhì)粒(例如，5個(gè)輔助質(zhì)粒)。輔助質(zhì)粒編碼N、P、L蛋白，和任選的G蛋白，以及T7聚合酶。盡管G蛋白不是病毒拯救必需的，但當(dāng)包括在轉(zhuǎn)染中時(shí)，它改善病毒恢復(fù)效率或者病毒出芽。轉(zhuǎn)錄涉及細(xì)胞RNA依賴性RNA聚合酶II，其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中現(xiàn)有的，和T7RNA聚合酶，其由pNLST7質(zhì)粒提供。這兩種聚合酶使病毒恢復(fù)率又高又穩(wěn)定。在轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒中，錘頭和丁型肝炎病毒核酶在狂犬病病毒(例如，ERA株)反基因組cDNA的側(cè)翼，通過(guò)轉(zhuǎn)錄能夠產(chǎn)生可靠的反基因組vRNA的5'和3'末端。將錘頭序列的前10個(gè)核苷酸設(shè)計(jì)成與反義基因組序列的前IO個(gè)核苷酸互補(bǔ)。例如，對(duì)于ERA反基因cDNA來(lái)說(shuō)，錘頭序列的前IO個(gè)核苷酸是TGTTAAGCGT(SEQIDNO:19)。己經(jīng)建立兩種修飾的T7RNA聚合酶構(gòu)建體，它們比先前應(yīng)用的野生型T7RNA聚合酶更有效地支持病毒恢復(fù)。一種T7RNA聚合酶已經(jīng)從第一個(gè)ATG突變到AT。第二種T7RNA聚合酶具有源自SV40病毒大T抗原的八氨基酸核定位信號(hào)(NLS)，融合在親代T7的第一個(gè)ATG后ATGCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGAA(SEQIDNO:20)。NLS有下劃線。NLS的添加導(dǎo)致T7RNA聚合酶主要存在于細(xì)胞核中。按照NLS修飾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染機(jī)理，DNA/轉(zhuǎn)染劑復(fù)合物與細(xì)胞表面結(jié)合。通過(guò)胞吞作用，復(fù)合物被攝入內(nèi)體/溶酶體，DNA被釋放入胞漿。在沒(méi)有NLS的情況下，大多數(shù)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒保留在胞漿中，只有小百分比釋放的DNA到達(dá)細(xì)胞核，在那里其轉(zhuǎn)錄成RNA。在蛋白合成后，NLST7RNA聚合酶被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞核，細(xì)胞核中的輔助質(zhì)粒(含T7/CMV啟動(dòng)子)將通過(guò)NLST7和細(xì)胞聚合酶II轉(zhuǎn)錄。因此，更多輔助質(zhì)粒的mRNA和全長(zhǎng)pTMF的cRNA或者其衍生物被合成，引起高效的病毒恢復(fù)。在NLST7通過(guò)CMV啟動(dòng)子的初始表達(dá)后，NLST7聚合酶結(jié)合pT7進(jìn)行NLST7基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)在細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄物的修飾，更多NLST7mRNA被合成，引起NLST7聚合酶的更多表達(dá)。NLST7聚合酶以及全長(zhǎng)反基因組轉(zhuǎn)錄單位的pT7受NLST7聚合酶的控制，其充當(dāng)"自身基因"。NLST7RNA聚合酶的自身基因機(jī)理圖示于圖2。在T7RNA聚合酶在細(xì)胞核中表達(dá)后，轉(zhuǎn)染的T7構(gòu)建體繼續(xù)轉(zhuǎn)錄全長(zhǎng)RNA模板用于N蛋白包裝和/或L蛋白結(jié)合，增強(qiáng)病毒恢復(fù)效率。T7聚合酶，和所有其他質(zhì)粒，除了編碼N蛋白的質(zhì)粒pTN夕卜，都處于CMV和T7轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件二者的控制之下。編碼N蛋白的核酸受T7啟動(dòng)子控制，并基于IRES(InternalRibosomeEntrySite,內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))按照帽-非依賴性的方式被翻譯。如果所有質(zhì)粒在CMV啟動(dòng)子(19)的控制下克隆，則細(xì)胞RNA聚合酶II獨(dú)自就可以輔助RV的恢復(fù)。在此處公開(kāi)的ERA反向遺傳系統(tǒng)中，只有pTN受T7啟動(dòng)子控制并以帽-非依賴性的方式翻譯。所有其他構(gòu)建體受CMV和T7轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件二者的控制。通常，在RV中，N合成是豐富的，N、P和L之間的比例是大約50:25:1。為了在RV反向遺傳中模擬野生型病毒轉(zhuǎn)錄和組裝，N表達(dá)應(yīng)該是最高的。借助于NLST7聚合酶和IRES翻譯模式，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后N蛋白被有效表達(dá)。這減少了與宿主細(xì)胞中持家基因?qū)D(zhuǎn)錄的競(jìng)爭(zhēng)，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中不存在T7轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)，并導(dǎo)致T7轉(zhuǎn)錄效率的增加。為了增強(qiáng)病毒蛋白的產(chǎn)生，可以構(gòu)建輔助質(zhì)粒以摻入Kozak序列，為了每種蛋白編碼序列的翻譯效率，所述Kozak序列己經(jīng)優(yōu)化。示范性的優(yōu)化Kozak序列顯示于表2。表2:優(yōu)化的Kozak序列.<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>CMV/T7表示CMV啟動(dòng)子在pT7啟動(dòng)子之前。HdRz代表錘頭核酶，而HDVRz是丁型肝炎病毒核酶。pTMF是全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，pTN、pMP、pMG、pML和pNLST7是輔助質(zhì)粒。在ERA反向遺傳系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染5天后，拯救的病毒可靠和可重復(fù)地(repatably)生長(zhǎng)到107ffu/ml，無(wú)需進(jìn)一步擴(kuò)增。Z穀諒毒狂犬病病毒致病性的完整機(jī)理還沒(méi)有被完全表征，使得合理的疫苗設(shè)計(jì)成問(wèn)題。例如，RV糖蛋白看來(lái)在狂犬病病毒的致病性和免疫原性中起作用。突變(例如在糖蛋白的333位)產(chǎn)生在成年小鼠中不造成致命感染的病毒(Ito等人，Microl./m聽(tīng)"o/.38，479-482,1994;Ito等乂，J.F/ra/.75,9121-9128,2001)。但是，已經(jīng)顯示RV糖蛋白的過(guò)表達(dá)引起凋亡和抗病毒免疫應(yīng)答的增強(qiáng)(Faber等人，J.F/ra/.76,3374-3381,2002)。因此具有修飾(例如，去除，氨基酸取代)的G蛋白的ERA病毒株可以是用于疫苗開(kāi)發(fā)的特定毒株。利用此處公開(kāi)的反向遺傳系統(tǒng)，可以設(shè)計(jì)出具有有利性質(zhì)的重組狂犬病病毒。在親代ERA株以外，此處公開(kāi)的示范性重組病毒還包括，無(wú)Psi-區(qū)的ERA(ERA-)，ERAgreenl(在Psi-區(qū)插入的綠色熒光基因)，ERAgreen2(在P-M基因間區(qū)域克隆的綠色熒光基因)，ERA2g(在Psi-區(qū)包含G的額外拷貝)，ERAg3(G在333位氨基酸處突變)，ERA2g3(在Psi-區(qū)包含突變G的額外拷貝)，ERAgm(在基因組中M和G基因互換)，和ERAgmg(在重排的ERAgm構(gòu)建體中G的兩個(gè)拷貝)。這些示范性株示意性圖解于圖3。具有去除和/或突變的糖蛋白的修飾株特別適合用作免疫原性組合物，用于狂犬病病毒的接觸前和后的治療，因?yàn)檫@類病毒不能在細(xì)胞之間傳播和造成疾病。此外，修飾的病毒例如ERA2g3，其因?yàn)榫幋a突變糖蛋白的序列的加倍而過(guò)表達(dá)G蛋白，被預(yù)測(cè)增強(qiáng)凋亡并引發(fā)增強(qiáng)的抗病毒免疫應(yīng)答。例如，小鼠腦內(nèi)和肌內(nèi)接種G缺失(ERA-G)后，沒(méi)有觀察到不良事件。此外，ERA-G保護(hù)小鼠免受RV街毒株的致命攻擊。因此，ERA-G看起來(lái)是用于疫苗開(kāi)發(fā)的ERA的更安全的株。此外，ERAG氨基酸333位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼?從核苷酸AGA到GAG，和在ERAg3和ERA2g3株中一樣)，產(chǎn)生一種減毒病毒。減毒作用通過(guò)動(dòng)物接種試驗(yàn)得到證實(shí)。因?yàn)镽VG的過(guò)表達(dá)引起凋亡和抗病毒免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，減毒病毒例如具有多拷貝G的ERA2g3作為疫苗候選物特別有利。此處描述的用于狂犬病疫苗開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)不限于G基因的修飾，而是可類似地應(yīng)用于每種病毒蛋白。為了促進(jìn)修飾不同蛋白組分的系統(tǒng)化方法，根據(jù)此處提供的序列數(shù)據(jù)，通過(guò)反向遺傳學(xué)可以解決致病性的詳細(xì)定位。此處描述的反向遺傳系統(tǒng)還使狂犬病病毒載體系統(tǒng)能夠用于外源(異源)的基因表達(dá)。所述的非限制性實(shí)施方式是基于ERA病毒。在整合到ERARV基因組后，此處顯示的額外轉(zhuǎn)錄單位是在兩個(gè)不同位置起作用的。在一個(gè)實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄單位整合到psi區(qū)的位置(trans1)中。在另一個(gè)實(shí)施方式中，額外轉(zhuǎn)錄單位被插入RVP-M基因間區(qū)域。在單鏈負(fù)性RNA病毒中，基因組3'末端序列主要作為轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，而基因組5'末端序列作為復(fù)制啟動(dòng)子(Conzelmann禾BSchnell，J.R>o/.68:713-719,1994;Finke箏乂，K^o/.71:7281-7288,1997)。因此，tmns2占據(jù)了導(dǎo)致比transl更強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的位置，所述轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)ORF表達(dá)。因此，此處公開(kāi)的載體可用于調(diào)節(jié)異源ORF的表達(dá)到所需水平，只需通過(guò)選擇ORF插入載體的位置。例如，當(dāng)需要蛋白的高水平表達(dá)時(shí)，trans2通常是異源ORF插入的理想位置。類似地，如果需要更適中水平的表達(dá)，異源ORF可以插入trans1。無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就能確定對(duì)于每個(gè)ORF和特定應(yīng)用來(lái)說(shuō)的最適表達(dá)水平。因此，此處提供的病毒載體是用于外源基因插入和表達(dá)的優(yōu)異構(gòu)建體，正如此處根據(jù)綠色熒光蛋白基因的表達(dá)所證實(shí)的那樣。盡管所公開(kāi)的載體的功用和效果是針對(duì)GFP進(jìn)行證實(shí)的，但是應(yīng)注意到該載200680038314.4說(shuō)明書第43/63頁(yè)體同樣適用于表達(dá)感興趣的任何基因或者ORF。如所述，此處提供的基于狂犬病的異源表達(dá)系統(tǒng)可用于表達(dá)任何外源(異源)蛋白。尤其預(yù)期，舉例來(lái)說(shuō)，這類異源基因來(lái)自于另一種病原生物，例如其他致病性病毒，例如SARS病毒，Nipah病毒，等等。此外，公開(kāi)的載體可以用于輸送其他治療基因，包括例如，編碼具有治療價(jià)值的蛋白或者功能RNA分子，例如siRNAs。丑藥激浙競(jìng)i^W激資合激及其I遂藥物組合物包括減毒的或者固定的拯救病毒，包括至少一個(gè)病毒表位的病毒核酸序列或者病毒多肽也包括在本公開(kāi)中。這些藥物組合物包括治療有效量的一種或者多種活性化合物，例如減毒或者固定病毒，包含至少一個(gè)病毒表位的病毒多肽，或者一種或者多種編碼這些多肽的核酸分子，與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。預(yù)期在某些實(shí)施方式中，包括多個(gè)病毒表位的病毒核酸序列或者病毒多肽將用于制備本公開(kāi)的藥物組合物。此處公開(kāi)的是適合用作免疫刺激組合物的物質(zhì)，所述組合物用于病毒感染的抑制或者治療(接觸前或者接觸后)，例如，狂犬病病毒感染。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫刺激組合物包含減毒的或者固定的拯救(重組)病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包含分離的或者重組的病毒多肽，所述多肽包括至少一種病毒表位(例如狂犬病病毒G蛋白)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫刺激組合物包含一種核酸載體，所述載體包括至少一種此處描述的病毒核酸分子，或者包括編碼至少一種病毒表位的核酸序列。在一個(gè)特定的、非限制性實(shí)施例中，編碼至少一種病毒表位的核酸序列在一個(gè)翻譯單位中表達(dá)，例如那些描述于公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/US99/12298和PCT/US02/10764(兩篇均在此完整引入)。免疫刺激病毒、病毒多肽、編碼這類多肽的構(gòu)建體或者載體，與藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑組合，用于作為免疫刺激組合物施用于人或者動(dòng)物對(duì)象。免疫原性制劑可以方便地作為單位劑型，并利用常規(guī)藥物技術(shù)制備。這類技術(shù)包括將活性成分和藥物載體或者賦形劑結(jié)合的步驟。通常，通過(guò)將活性成分與液體載體均勻和緊密地結(jié)合來(lái)制備制劑。適于腸胃外給藥的制劑包括含水和不含水的無(wú)菌的注射溶液，其可以包括抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和溶質(zhì)，所述溶質(zhì)使制劑與目標(biāo)接受者的血液等滲；以及含水和不含水的無(wú)菌懸浮液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。制劑可以是單位劑量或者多劑量容器，例如，密封的安瓿和小瓶，并可以保存于冷凍干燥(凍干)條件，只需使用前即刻添加無(wú)菌液體載體，例如，注射用水。從本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常使用的無(wú)菌粉劑、顆粒和片劑可以制備即用注射溶液和懸浮液。在某些實(shí)施方式中，單位劑量制劑是包括給藥成分的劑量或單位，或者其合適的部分的制劑。應(yīng)了解除了上面特別提及的成分外，此處包括的制劑還可以包含本領(lǐng)域普通技術(shù)人員經(jīng)常使用的其他藥劑。此處提供的組合物，包括那些用作免疫剌激組合物的，可以通過(guò)不同的途徑給藥，例如口服，包括頰和舌下，直腸的，腸胃外，氣霧劑，鼻，肌內(nèi)，皮下，真皮內(nèi)和局部。它們可以不同形式給藥，包括但不限于溶液，乳液和懸浮液，微球，顆粒，微粒，納米顆粒和脂質(zhì)體。根據(jù)給藥途徑，給藥的體積將不同。舉例來(lái)說(shuō)，肌肉注射可以為大約O.lml到大約1.0ml。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將了解不同給藥途徑的合適體積。免疫刺激化合物(例如，疫苗)領(lǐng)域的較為近期的發(fā)展是直接注射編碼肽抗原的核酸分子(概述于Janeway&Travers,Immunobiology:TheImmuneSystemInHealthandDisease,13.25頁(yè),GarlandPublishing,Inc.,NewYork,1997;禾卩McDonnell&Askari,五"g/.丄Med334:42-45，1996)。包括此處所述核酸分子的載體或者包括編碼病毒多肽的核酸序列的載體可以在這類DNA免疫方法中使用，所述病毒多肽包括至少一個(gè)病毒表位。因此，此處使用的術(shù)語(yǔ)"免疫刺激組合物"還包括核酸疫苗，其中編碼病毒多肽的核酸分子在藥物組合物中施用于對(duì)象，所述病毒多肽包括至少一個(gè)病毒表位。對(duì)于基因免疫來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適輸送方法包括直接肌肉注射質(zhì)粒DNA(Wolff等人，Hum.Mo/.1:363,1992)，輸送與特定蛋白載體復(fù)合的DNA(Wu等人，J.腸/.C/zem.264:16985,1989)，DNA與磷酸鈣的共沉淀(Benvenisty和Reshef,Proc.Wa".JcfldSc/.83:9551,1986)，DNA在脂質(zhì)體中的包裹(Kaneda等人，Science243:375，1989),粒子轟擊(Tang等人，Nature356:152,1992;Eisenbraun等人，DNACellBiol.12:791,1993)，和利用克隆逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行體內(nèi)感染(Seeger等人，Proc.Wfl"cac/.<SW.81:5849,1984)。類似地，核酸疫苗制品可以通過(guò)病毒載體給藥。選擇各劑量免疫刺激組合物中免疫刺激化合物的量為誘導(dǎo)免疫刺激或者免疫保護(hù)應(yīng)答，而沒(méi)有顯著的不良副作用。這種量將根據(jù)所使用的特異免疫原以及它如何呈遞而不同。初始注射可以從大約1到大約lmg，一些實(shí)施方式從大約10wg到大約800yg，其他實(shí)施方式從大約25"g到大約500ug。在免疫刺激組合物的初始給藥后，對(duì)象可以接受一次或者數(shù)次加強(qiáng)給藥，充分間隔開(kāi)。加強(qiáng)給藥可以從大約1ug到大約lmg，其他實(shí)施方式從大約10yg到大約750yg，還有的其他從大約50Pg到大約500iig。間隔l-5年的周期性加強(qiáng)，例如3年，可以是合乎需要的，以保持所需水平的保護(hù)性免疫。還預(yù)期提供的免疫刺激分子和組合物可以間接施用于對(duì)象，通過(guò)體外首先刺激細(xì)胞，然后受刺激的細(xì)胞施用于對(duì)象以引發(fā)免疫應(yīng)答。此外，藥物或者免疫刺激組合物或者治療方法可以與其他療法聯(lián)合給藥。含有免疫刺激組合物的食物-誘餌的制備也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。例如，含有活RV疫苗的食物誘餌的制備公開(kāi)于Wandder等人(Rev.版10(suppl.4):649-653,1988),Aubert等乂(pp.219-243,inLvsssvimses(Rupprecht#Vl，編著),Springer-Verlag,NewYork,1994)，和Fu等乂(pp.607-617,inNewGenerationVaccines(2ndEdit.)(Levine箏乂，編著)，MarcelDekker，Inc.,NewYork,1997)，各文獻(xiàn)的完整公開(kāi)均在此引入作為參考。此處還提供用于病毒感染檢測(cè)和/或診斷的試劑盒，例如感染狂犬病病毒或者其他狂犬病病毒屬。此處提供的分析試劑盒的實(shí)例是作為抗原的重組病毒多肽(或者其片段)和作為第二抗體的酶聯(lián)抗人抗體。這類試劑盒的實(shí)例還可以包括一種或者多種酶底物。如果來(lái)自對(duì)象的樣品包含抗病毒特異性蛋白的抗體，則這類試劑盒可用于檢測(cè)。在這類試劑盒中，合適量的病毒多肽(或者其片段)提供于一個(gè)或者多個(gè)容器中，或者附著在底物上。例如，病毒多肽可以提供在水溶液中或者作為冷凍干燥的或者凍干的粉劑。提供病毒多肽的容器可以是任何常規(guī)容器，即能夠保持供給形式，例如，微量離心管，安瓿或者瓶子。試劑盒提供的各多肽的量可以是任何合適的量，并可以取決于該產(chǎn)品針對(duì)的市場(chǎng)。例如，如果試劑盒適合于研究或者臨床用途，提供的各多肽的量將可能是足以進(jìn)行數(shù)次分析的量。確定合適量的一般性指導(dǎo)可以參見(jiàn)，例如，Ausubel等人(編著)，分子生物學(xué)簡(jiǎn)編(Wow/Vofoco/s!'wMo/ecw/ar5io/ogy),JohnWileyandSons,NewYork,NY，1999和Harlow和Lane，抗體應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)("/"gJ"WoAwJ丄aZ固^yMo7zwa/),CSHL,NewYork,1999。提供下列實(shí)施例以說(shuō)明某些特定特征和/或?qū)嵤┓绞?。這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為將本發(fā)明限制于所述的特定特征或者實(shí)施方式上。實(shí)施例實(shí)施例1:ERARV的測(cè)序本實(shí)施例提供用于測(cè)序彈狀病毒全長(zhǎng)基因組方法的說(shuō)明，在該情況下尤其是狂犬病病毒。狂犬病病毒株ERA從CDC保藏獲得，并在幼倉(cāng)鼠腎(BHK-21)細(xì)胞中繁殖。在37'C、5。/。C02孵箱中感染4天后，收集病毒并進(jìn)行純化。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，收集細(xì)胞上清，在2,000rpm離心15分鐘以去除細(xì)胞碎片。澄清的上清進(jìn)一步在18,000rpm離心1小時(shí)。沉淀團(tuán)在PBS中重懸浮，進(jìn)行狂犬病基因組RNA提取。按照制造商推薦的方案，利用Trizol試劑(GIBCOInvitrogen)從ERA感染的BHK-21細(xì)胞提取總RNA。利用Roche的高純度病毒RNA試劑盒，從濃縮的ERA病毒上清純化ERA基因組RNA。通過(guò)凝膠電泳和利用N、P、G和M雜交探針的Northern印跡，確認(rèn)純化的ERA基因組RNA的完整性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，5Pg基因組RNA加樣到變性RNA凝膠中，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜用于雜交。按照制造商的說(shuō)明書，利用Roche的DigDNA標(biāo)記試劑盒對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記?？袢〔《?'反基因組的11個(gè)保守核苷酸被設(shè)計(jì)為逆轉(zhuǎn)錄引物。利用Invitrogen的第一鏈cDNA合成試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)。通過(guò)Northern印跡，利用N，P，M，和G探針雜交，以及11個(gè)保守寡核苷酸作為地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針，確認(rèn)來(lái)自ERA基因組的完整cDNA。選擇兩組引物用于PCR反應(yīng)，其在兩個(gè)連續(xù)片段中擴(kuò)增全ERA基因組。一組引物由5'反基因組末端的11個(gè)核苷酸組成，Le5:ACGCTTAACAA(SEQIDNO:24)禾卩BLp3:GTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTA(SEQIDNO:25)。另一組包含5'基因組末端的11個(gè)互補(bǔ)核苷酸，Le3:TGCGAATTGTT(SEQIDNO:26)和BLp5:GAGTGCTTAGCAAGCGACCT(SEQIDNO:27)。Blp3禾口Blp5引物位于狂犬病病毒基因組的相對(duì)保守區(qū)域。純化PCR片段并克隆入TOPO載體，所述載體購(gòu)自Invitrogen。在ABI310測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，利用Accelrys的BioEdit軟件或者SeqMerge軟件在GCG環(huán)境中對(duì)序列進(jìn)行裝配。ERA基因組完整比對(duì)的序列如SEQIDNO:l所示。參照SEQIDNO:l，表3提供個(gè)體蛋白編碼序列的位置。N，P，M，G和L蛋白的氨基酸序列分別在SEQIDNO:2到6中提供。表3:狂犬病病毒ERA株的蛋白編碼序列的位置<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>該方法可用于狂犬病和狂犬病相關(guān)病毒?？袢『涂袢∠嚓P(guān)病毒至少有7種推斷的類型。提供的序列方法還可以用于其他負(fù)鏈RNA病毒。這是因?yàn)閹缀跛械呢?fù)鏈RNA病毒基因組在兩個(gè)末端均具有大約12個(gè)保守核苷酸，它們類似地可以用作RT-PCR的引物。對(duì)于不同的病毒種類引物當(dāng)然會(huì)不同，普通技術(shù)人員根據(jù)此處的教導(dǎo)能夠確定特異引物的序列。實(shí)施例2:用于狂犬病病毒反向遺傳系統(tǒng)的質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例描述用于狂犬病病毒的反向遺傳系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和發(fā)展?？袢〔《局闑RA從ATCC獲得，按描述的(Wu等人，J.KVo/.76,4153-4161，2002)進(jìn)行制備。為了獲得病毒基因組全長(zhǎng)病毒cDNA，BSR細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎，BHK，細(xì)胞的克隆)感染ERA株病毒，在補(bǔ)充10%胎牛血清的Dulbecco最低限必需培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。收集上清，在22,000g離心1小時(shí)。收集病毒沉淀團(tuán)利用購(gòu)自Qiagen(Valencia,CA)的RNA病毒提取試劑盒，按照制造商的說(shuō)明書，用于病毒基因組RNA純化。通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)病毒基因組RNA的完整性。利用Invitrogen(Carlsbad,CA)的第一鏈cDNA合成試劑盒轉(zhuǎn)錄病毒基因組cDNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)混合物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，分別用于全長(zhǎng)病毒基因組cDNA、N、P、G和L基因的合成。為了組裝全長(zhǎng)病毒基因組cDNA，按照?qǐng)DIB示意性圖解的4個(gè)連續(xù)步驟構(gòu)建pTMF質(zhì)粒。SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶和高保真platinumpfx聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,Ca)用于cDNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成和連續(xù)PCR擴(kuò)增。對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在RT反應(yīng)混合物中使用1ug純化的基因組RNA，在5(TC孵育80分鐘，然后在85"加熱5分鐘以滅活SuperscriptIII。在RT反應(yīng)后，添加1單位RNaseH以消化cDNA-RNA雜交物中的模板RNA。為了產(chǎn)生全長(zhǎng)病毒基因組cDNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增的兩個(gè)重疊片段如下片段1(Fl)利用下列引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增Le5-Kpn(CCGGGTACCACGCTTAACAACCAGATCAAAGA;SEQIDNO:28,下劃線為Kpnl識(shí)別位點(diǎn))和Le3-Blp(TAGGTCGCTTGCTAAGCACTCCTGGTAGGAC;SEQIDNO:29,下劃線為Blpl識(shí)別位點(diǎn))。片段2(F2)利用下列引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增Tr5-Blp(GTCCTACCAGGAGTGCTTAGCAAGCGACCTA:SEQIDNO:30，下劃線為Blpl識(shí)另U位點(diǎn))禾卩Tr3-PstN0:31，下劃線為Pstl識(shí)別位點(diǎn))。在成功合成上述兩個(gè)片段后，對(duì)Kpnl和Blpl限制性酶消化的Fl進(jìn)行凝膠純化，并克隆到pBluescriptlISK(+)噬菌粒(Stratagene，LaJolla，Ca)，以形成pSKFl質(zhì)粒。凝膠純化的F2片段，通過(guò)Blpl和Pstl切割，被連續(xù)克隆到pSKFl質(zhì)粒以形成全長(zhǎng)病毒反基因組cDNA。合成錘頭核酶(oligol,TATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCGGTACCACGCT:SEQIDNO:32,下戈U線為Nhel和Kpnl識(shí)別位點(diǎn)；01igo2,ACGGACTCATCAGACGCTTAACAGCTAGCCTTG:SEQIDNO:33,下劃線為Kpnl和Nhel識(shí)別位點(diǎn))，在5'端包含Nhel識(shí)別位點(diǎn)，在3'端包含Kpnl位點(diǎn)。這融合在F1片段5'端的前面。合成丁型肝炎病毒核酶(oligo3,GGAGGGCGCGGCCGCACTC;SEQIDNO:34,下劃線為Pstl和Notl識(shí)別位點(diǎn)；01igo4，ATGCCGACCCCTGCAGGTC:SEQIDNO:35,下劃線為Notl和Pstl識(shí)別位點(diǎn))(Symons，iev.61:641-671,1992)，在其5，端具有Pstl位點(diǎn)，其3，端具有Notl位點(diǎn)，融合到F2片段的3，端。錘頭核酶和Fl片段之間的連接性Kpnl識(shí)別位點(diǎn)，和F2片段和丁型肝炎病毒核酶之間的Pstl位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)突變被去除。全長(zhǎng)病毒反基因組cDNA被夾在錘頭和丁型肝炎病毒核酶之間。其被移出并克隆到pBluescriptlISK(+)噬菌粒以制備pSKF構(gòu)建體。具有兩個(gè)核酶的完整病毒反基因組cDNA被融合到T7轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，受pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒(Invitrogen,Carlsbad,CA)中CMV立即早期啟動(dòng)子的控制。這最后一個(gè)步驟完成pTMF質(zhì)粒的構(gòu)建。野生型ERA病毒基因組在G和Psi區(qū)之間的基因間區(qū)域包括8個(gè)殘基(polyAs)的polyAtract。為了從親代株區(qū)分拯救的ERA(rERA)病毒，通過(guò)去除一個(gè)A，將一段7A(polyA7)導(dǎo)入pTMF構(gòu)建體，而不是原始的polyA8。在回收rERA病毒后，進(jìn)行RT-PCR，隨后的序列數(shù)據(jù)證實(shí)導(dǎo)入的polyA7序列標(biāo)記物的存在。pTN質(zhì)粒利用引物(5N:ACCACdGGATGCCGACAAGATTG:SEQIDNO:36，下劃線為Ncol識(shí)別位點(diǎn)和起始密碼子；和3N:GGCCCATGG77MTGAGTCACTCGAATATGTCTT:SEQIDNO:37,下劃線為Ncol識(shí)別位點(diǎn)和終止密碼子)，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增N基因，克隆至ljpCITE-2a(+)(帽-非依賴性翻譯增強(qiáng)子，G叩-IndependentIranslation旦nhancer)質(zhì)粒(Novagen，MadisonWI)。pMP質(zhì)粒利用引物(5P:TTGGTACCACC4rGAGCAAGATCTTTGTCAATC:SEQIDNO:38,下劃線為Kpnl識(shí)別位點(diǎn)和起始密碼子；和3P:GGAGAGGAATTCrTMGCAAGATGTATAGCGATTC:SEQIDNO:39,下劃線為EcoRl識(shí)別位點(diǎn)和終止密碼子)，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增P基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒。pMG質(zhì)粒利用引物(5G:TTGGTACCACC4r(GTTCCTCAGGCTCTCCTG:SEQIDNO:40，下劃線為Kpnl識(shí)別位點(diǎn)和起始密碼子；和3G:AAAACTGCAGrC4CAGTCTGGTCTCACCCCCAC:SEQIDNO:41,下劃線為Pstl識(shí)別位點(diǎn)和終止密碼子)，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增G基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒。pML質(zhì)粒利用引物(5L:ACCGCTAGCACCACC4rGCTCGATCCTGGAGAGGTC;SEQIDNO:42,下劃線為Nhel識(shí)別位點(diǎn)和起始密碼子；禾B3L:AAAACTGCAGrC4CAGGCAACTGTAGTCTAGTAG;SEQIDNO:43,下劃線為Pstl識(shí)別位點(diǎn)和終止密碼子)，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增L基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒。pT7質(zhì)粒按照制造商的說(shuō)明書，利用Dneasy組織試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)，從細(xì)菌BL-21(Novagene,Madison，WI)提取基因組DNA。利用弓|物(5T7:TCGCTAGCACCACCK7AACACGATTAACATCGCTAAG;SEQIDNO:44,下劃線為Nhel識(shí)別位點(diǎn)和起始密碼子；和3T7:GATGAATTCr度GCGAACGCGAAGTCCGACTC:SEQIDNO:45,下劃線為EcoRl識(shí)別位點(diǎn)和終止密碼子)，通過(guò)PCR從純化的基因組DNA擴(kuò)增T7RNA聚合酶基因并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒。pNLST7質(zhì)粒源自SV40大T抗原的8氨基酸核定位信(NLS)，利用pT7質(zhì)粒作為模版，和引物(5T7NLS:GATTAACATCGCTAAGAAC;SEQIDNO:46,下劃線為NLS，禾口3T7引物)，通過(guò)PCR擴(kuò)增添加到T7RNA聚合酶的N端。擴(kuò)增的片段命名為NLST7，被克隆到pcDNA3.1/Neo(+)，形成pNLST7構(gòu)建體。pGFP質(zhì)粒Monster綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒phMGFP購(gòu)自Promega(Madison,WI)。禾U用引物(GFP5:AAAACTGCAGGCCACC4rGGGCGTGATCAAG:SEQIDNO:47,下劃線為Pstl識(shí)別位點(diǎn)和起始密碼子；和GFP3:CCGCTCGGTACCTA77MGCCGGCCTGGCGGG:SEQIDNO:48,下劃線為Kpnl識(shí)別位點(diǎn)和終止密碼子)，通過(guò)PCR擴(kuò)增GFP基因，并克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒。對(duì)所有質(zhì)粒構(gòu)建體至少測(cè)序3次，以證實(shí)不存在克隆后預(yù)料不到的突變或者缺失、定點(diǎn)突變或者基因缺失。此外，證實(shí)了糖蛋白和Psi區(qū)之間存在由polyAtract組成的標(biāo)記序列，而不是野生型ERA基因組中觀察到的8個(gè)殘基，所述polyAtmct具有7個(gè)腺苷殘基。實(shí)施例3:BSR細(xì)胞中的T7RNA聚合酶表達(dá)本實(shí)施例證明，向噬菌體T7RNA聚合酶添加核定位信號(hào)，指導(dǎo)聚合酶在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)。按照Wu,等人(J.Virol.76,4153-4161,2002)的描述進(jìn)行BSR細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，6孔板中接近80%匯合的BSR細(xì)胞每孔分別用0.5gpT7或者pNLST7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞用80%冷丙酮固定1小時(shí)，并在室溫下干燥。依次添加抗T7RNA聚合酶的小鼠單克隆抗體和山羊抗小鼠的IgG-FITC偶聯(lián)物，并在兩步驟間接熒光染色法程序中洗滌。在UV顯微鏡檢查后記錄結(jié)果。觀察到pT7表達(dá)的無(wú)核定位信號(hào)的T7RNA聚合酶主要在胞漿中，而包含核定位信號(hào)的NLST7聚合酶主要存在于細(xì)胞的細(xì)胞核中。這些結(jié)果表明NLS的添加有效地將T7RNA聚合酶耙定到轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞核。實(shí)施例4:組成性表達(dá)ERA糖蛋白的BSR細(xì)胞系的建立本實(shí)施例描述組成性表達(dá)ERA糖蛋白的BHK細(xì)胞系的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生。利用Flp-InTM系統(tǒng)(Invitrogen，Carlsbad,CA)構(gòu)建表達(dá)ERA糖蛋白的BHK細(xì)胞系。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染前，F(xiàn)lp-InTM-BHK細(xì)胞(含有單一整合的Flp重組靶位點(diǎn))在一個(gè)6孔板中生長(zhǎng)到大約20%匯合，并在補(bǔ)充100yg/mlZeocin的普通DMEM培養(yǎng)基中維持。利用pMG質(zhì)粒作為模版，用引物EF5G5(CACCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG;SEQIDNO:49)和EF5G3(TCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC;SEQIDNO:50)通過(guò)PCR擴(kuò)增ERAG基因，并克隆到pEF5/FRT/V5-D-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以產(chǎn)生pEFG構(gòu)建體。表達(dá)Flp重組酶的pOG44質(zhì)粒和pEFG—起，以10:1的比例共轉(zhuǎn)染Flp-InTM-BHK細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在無(wú)Zeocin、但含有400wg/ml潮霉素B的DMEM中維持。48小時(shí)后，劃開(kāi)細(xì)胞使次日發(fā)生的匯合不超過(guò)20%。細(xì)胞在潮霉素B選擇性培養(yǎng)基中在37'C生長(zhǎng)大約1周。利用人抗-G單克隆抗體和山羊抗人IgG-FITC偶聯(lián)物，通過(guò)間接熒光染色法檢測(cè)靶ERAG的表達(dá)。組成性表達(dá)G的細(xì)胞系被命名為BHK-G，用于生長(zhǎng)ERA-G病毒。實(shí)施例5:狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)株的限定修飾除了上述的親代ERA病毒株外，利用此處公開(kāi)的反向遺傳系統(tǒng)開(kāi)發(fā)了衍生病毒株。產(chǎn)生了數(shù)個(gè)示范性的修飾病毒，即ERA-(完整psi-區(qū)的缺失)，ERAgreenl(綠色熒光蛋白基因插入ERA病毒基因組psi區(qū))，ERAgreen2(綠色熒光蛋白基因插入磷蛋白和基質(zhì)蛋白的基因間區(qū)域)，ERA2g(在psi-區(qū)包括糖蛋白的額外拷貝)，ERAg3(在糖蛋白氨基酸333位具有突變)，ERA2g3(在psi-區(qū)Aa333具有突變糖蛋白的額外拷貝)，ERA-G(去除糖蛋白)，ERAgm(基因組中M和G基因互換)，和ERAgmg(重排ERAgm構(gòu)建體中G的兩個(gè)拷貝)。這些衍生物示意性圖解于圖3。通過(guò)優(yōu)化所述的生長(zhǎng)條件，在組織培養(yǎng)瓶和生物反應(yīng)器中，所有的拯救病毒都可以達(dá)到109到1(Tffu/ml的病毒滴度。反向遺傳系統(tǒng)中的基因缺失和定點(diǎn)突變ff犬瘋瘃毒^^基歷蘊(yùn)i^',游欽關(guān)狂犬病病毒ERA基因組的完整Psi-區(qū)如下被刪除利用pTMF作為模板，用引物(5Axj/:AG;SEQIDNO:51，下劃線為Pstl和Kpnl識(shí)別位點(diǎn)；和Le3-Blp引物)，通過(guò)PCR擴(kuò)增3，A\|/片段，并克隆到pCR-Bluntll-TOPO載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)，用于pPA5v(/質(zhì)粒的構(gòu)建。利用相同的模板，用引物(SnaB5:ATGAACTTTCTACGTAAGATAGTG:SEQIDNO:52,下劃線為SnaBl識(shí)別位點(diǎn)；和3Av|/:G;SEQIDNO:53,下劃線為Pstl識(shí)別位點(diǎn))，通過(guò)PCR擴(kuò)增5'A\|/片段，連續(xù)克隆到上述pPA5v質(zhì)粒，完成pPAy質(zhì)粒的構(gòu)建。通過(guò)SnaBl和Pstl限制性酶消化pP△W質(zhì)?；厥盏钠?，取代pSKF構(gòu)建體中的對(duì)應(yīng)物以制備pSKFAnr質(zhì)粒。通過(guò)用Nhel和Notl消化pSKF△V質(zhì)粒得到的包含ERA基因組cDNA的全DNA片段，被重新克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒，完成pTMFAv的構(gòu)建。為了驗(yàn)證缺失Psi的拯救株，命名為ERA-，在用ERA-感染BSR細(xì)胞總RNA的RT-PCR中，使用覆蓋Psi-區(qū)的引物。只有從rERA病毒擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)于Psi區(qū)的400bp片段，而非ERA。序列數(shù)據(jù)證實(shí)Psi-區(qū)的完全缺失。發(fā)犬諒諒毒五iM基尿邀^瀞歪^基厲游凝關(guān).'利用pSKF作為模板，用引物(SnaB5引物，禾卩3Ag:SEQIDNO:54)通過(guò)PCR擴(kuò)增5，gA\|/片段。在SnaBl和Pstl限制性酶消化后，該回收的片段被克隆，以取代其在pSKFAv構(gòu)建體中的對(duì)應(yīng)物。利用相同模板，用引物(5Ag:SEQIDNO:55,和Le3-Blp引物)通過(guò)PCR擴(kuò)增3，gA\|/片段，并被連續(xù)克隆到修飾的pSKFAV，以取代其對(duì)應(yīng)物。最終片段，通過(guò)SnaBl和Blpl限制性酶從不含G基因的pSKFAv上切割回收，被重新克隆到pcDNA3.1/Neo(+)質(zhì)粒，以形成pTMFAg構(gòu)建體用于病毒恢復(fù)。J^歪A基房定^突變；按照先前描述的(Wu等人，J.KZro/.76:4153-4161,2002)進(jìn)行定點(diǎn)突變，在糖蛋白的333位氨基酸處引入從AGA到GAG的3個(gè)核苷酸改變。誘變反應(yīng)中的引物是M5G引物CTCACTACAAGTCAGTCGAGACTTGGAATGAGATC(SEQIDNO:56,黑體為3個(gè)突變的核苷酸)和M3G引物GACTGACTTTGAGTGAGCATCGGCTTCCATCAAGG(SEQIDNO:57)。對(duì)于恢復(fù)株(ERAg3)，在利用引物5G和3G進(jìn)行RT-PCR后，通過(guò)測(cè)序證實(shí)氨基酸333位(aa333)AGA到GAG的3個(gè)核苷酸變化。通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)后，突變的G被克隆回pTMF質(zhì)粒，以制備pTMFg3構(gòu)建體用于病毒恢復(fù)。該突變的G基因編碼的糖蛋白如SEQIDNO:58所示。外源ORF整合入ERA狂犬病病毒基因組為了在RV中表達(dá)外源ORF，制備含Pstl和Kpnl識(shí)別位點(diǎn)的額外轉(zhuǎn)錄單位，分別整合在Psi或者P-M基因的基因間區(qū)域。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，為了在Psi-區(qū)制備額外的轉(zhuǎn)錄單位，遵循相同的步驟，除了5'Av片段擴(kuò)增步驟，3△V引物變?yōu)?△Vcis:CCCCCCAAGGGGAGG(SEQIDNO:59)。不含Psi-區(qū)、但具有額外轉(zhuǎn)錄單位的最終構(gòu)建體被命名為pMTFAvcis。GFP，ERAG,或者氨基酸殘基333位突變的G分別被克隆到該翻譯單位中，以形成pMTFgfpl，pMTF2g，pMTFg3，pMTF2g3構(gòu)建體，用于病毒拯救。為了將額外轉(zhuǎn)錄單位整合到P-M基因間區(qū)域，利用pMTF作為模板，用引物cis55擴(kuò)增cisp5片段GACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCTGTTAAG(SEQIDNO:60)，cis53:TTTAGGACATCTCGG(SEQIDNO:61)，并被克隆以取代其在pMTF質(zhì)粒中的對(duì)應(yīng)物。禾'J用引物cis35:CCACTGATAAAATGAAC(SEQIDNO:62)禾卩cis33:CCTCCCCTTCAAGAGGGCCCCTGGAATCAG(SEQIDNO:63),以相似的方法擴(kuò)增和克隆cisp3片段。在cisp5和cisp3片段組裝到一起后，最終構(gòu)建體被命名為pMTFcisp，用于接受ORF。包含GFP基因的重組構(gòu)建體被命名為pTMFgfp2，用于病毒恢復(fù)。為了產(chǎn)生ERA衍生物，命名為ERAgm，其中糖蛋白編碼序列與基質(zhì)蛋白編碼序列的順序相反，按如上所述刪除糖蛋白基因。然后將G基因(按上面公開(kāi)的進(jìn)行擴(kuò)增)插入P和M基因之間，按照N-P-G-M-L的順序獲得狂犬病病毒基因組。類似地，使用相同策略產(chǎn)生ERAg3m衍生物，其中糖蛋白通過(guò)取代由上述定點(diǎn)突變產(chǎn)生的G基因，在333位氨基酸殘基具有3個(gè)核苷酸突變(從AGA到GAG)。為了產(chǎn)生ERAgmg構(gòu)建體，將糖蛋白基因的額外拷貝插入P和M基因之間，按照N-P-G-M-G-L的順序制備狂犬病病毒基因組。額外轉(zhuǎn)錄單位被修飾和整合入ERA基因組的兩個(gè)不同區(qū)域，即psi-區(qū)和P-M基因間區(qū)域。當(dāng)異源ORF被整合入這些轉(zhuǎn)錄單位時(shí)，分別稱為trans1和trans2，導(dǎo)致有效產(chǎn)生編碼的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄單位的序列是A(SEQIDNO:64,下劃線是Pstl和Kpnl)。實(shí)施例6:親代和衍生病毒的恢復(fù)本實(shí)施例描述利用此處公開(kāi)的反向遺傳系統(tǒng)對(duì)親代ERA病毒和示范性衍生物的恢復(fù)。按照制造商推薦的方案，BSR細(xì)胞在6孔板中接近80%融合時(shí)，用3ug/孔的病毒全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pTMF(分別是pTMFAV,pTMFg3,pTMF2g，pTMF2g3,pTMFgfpl,pTMFgfp2,pTMF△g，pTMFgm或者pTMFgmg)禾卩5種輔助質(zhì)粒pTN(1ug/孔)，pMP(0.5ng/孔)，pML(0.5ug/孔)，pMG(0.5ug/孔)和pNLST7(1ug/孔)，通過(guò)TransIT-LTl試齊U(Mirus,Madison,WI)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4天，每孔添加1ml新鮮BSR細(xì)胞懸液(大約5X1()5細(xì)胞)。細(xì)胞在37°C，5%C02中孵育3天。收集細(xì)胞上清用于病毒滴定。為了滴定恢復(fù)的病毒，LAB-TEK8孔板(N叩erville，IL)中的單層BSR細(xì)胞用IO倍系列稀釋的病毒上清感染，在37。C、0.5%<:02中孵育48小時(shí)。室溫下細(xì)胞在80%冷丙酮中固定1小時(shí)，在37'C用FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒N單克隆抗體染色30分鐘。用PBS洗板3次后，利用直接熒光顯微鏡計(jì)數(shù)染色灶。在萬(wàn)維網(wǎng)(worldwideweb)cdc.gov/ncidod/dvrd/rabies/professional/publications/DFA-diagnosis/DFA_protocol.htm可以找到直接RV熒光分析(DFA)的詳情。如表3所示，除ERA-G外的所有病毒都從培養(yǎng)的BSR細(xì)胞中高滴度地恢復(fù)。令人驚訝的是，G基因與M基因的重排和轉(zhuǎn)換沒(méi)有妨礙重組衍生ERA病毒的恢復(fù)。先前認(rèn)為RV基因組中G基因的重排是不可行的，因?yàn)镚蛋白的過(guò)表達(dá)造成細(xì)胞死亡(Faber等人，J.K>o/.76:3374-3381，2002)。但是，這些結(jié)果證明，在ERA株中重排是可能的。因此，有可能不僅對(duì)于G基因，而且對(duì)于其他基因來(lái)說(shuō)，RV基因改組也是可能的。按照與其他病毒構(gòu)建體拯救相同的步驟進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，ERA-G(不含G)病毒被,復(fù)，但在第一輪轉(zhuǎn)染后，病毒灶是非常有限的，并限制于局部區(qū)域。即使在37"C、5%(302中孵育1周后，拯救的病毒也不能進(jìn)一步傳播到鄰近的正常BSR細(xì)胞(圖4A)。利用上述轉(zhuǎn)染上清感染的正常BSR細(xì)胞在DFA試驗(yàn)中呈現(xiàn)單細(xì)胞染色，這表明恢復(fù)的病毒不能傳播。為了擴(kuò)增ERA-G病毒，按照實(shí)施例4所述，建立組成性表達(dá)ERAG的BHK細(xì)胞系(命名為BHK-G)。通過(guò)間接熒光分析篩選，對(duì)表達(dá)G的BHK細(xì)胞庫(kù)進(jìn)行篩選，并維持用于ERA-G病毒的擴(kuò)增(圖4B)。借助BHK-G細(xì)胞系，ERA-G病毒生長(zhǎng)到107ffu/ml。從感染ERA-G病毒的BHK-G細(xì)胞提取總RNA，利用G基因探針進(jìn)行Northern印跡分析(圖4C)。病毒基因組RNA中不存在G基因，但是檢測(cè)到GmRNA，其來(lái)自感染的支持性BHK-G細(xì)胞。在純化的ERA-G病毒基因組RNA中，利用G探針沒(méi)有檢測(cè)到雜交信號(hào)，表明ERA基因組中G基因的缺失。實(shí)施例7:在生物反應(yīng)器中拯救的ERA病毒和其衍生物生長(zhǎng)到高滴度在口服疫苗開(kāi)發(fā)中，通常需要高病毒滴度以便在給藥后引發(fā)可靠的免疫。本實(shí)施例證明，ERA病毒和衍生物可以在適合商品化規(guī)模放大的體積的生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)到高滴度。所有10種拯救的ERA病毒在生物反應(yīng)器CELLineADlOOO(IBSIntegraBioscience,Chur，瑞士)中擴(kuò)增到滴度從107到101Qffu/ml。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，如上所述，用示范性的反基因組轉(zhuǎn)錄載體和輔助載體轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞。在十分之一生物反應(yīng)器容積中，以106細(xì)胞/1111濃度，每細(xì)胞1個(gè)病毒粒子的感染復(fù)數(shù)接種細(xì)胞。37°C、5%C02條件下，轉(zhuǎn)染細(xì)胞在添加10%胎牛血清的DMEM中生長(zhǎng)。每3到5天收集上清，收集2到3次。與其他病毒相比，缺陷型ERA-G生長(zhǎng)較差，對(duì)于ERA-G來(lái)說(shuō)只有1()8ffii/niK表3和圖5)。表3.全長(zhǎng)質(zhì)粒構(gòu)建體和對(duì)應(yīng)的拯救病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>實(shí)施例8:狂犬病病毒中來(lái)自額外翻譯單位的外源蛋白的表達(dá)本實(shí)施例證明了來(lái)自異源ORF的重組蛋白的表達(dá)，所述ORF插入狂犬病病毒載體。在本實(shí)施例中，ERA病毒載體被用作原型狂犬病病毒載體。為了構(gòu)建ERA病毒作為接受ORF的載體，N和P基因之間的保守RV轉(zhuǎn)錄單位被修飾，并在兩個(gè)不同位置導(dǎo)入ERA基因組1)在psi區(qū)(trans1)，和2)在P-M基因間區(qū)域(trans2)。將轉(zhuǎn)錄單位設(shè)計(jì)成具有兩個(gè)獨(dú)特的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，以便異源多核苷酸序列的導(dǎo)入:TCTTTTTTT:SEQIDNO:65,下劃線為Pstl和Kpnl位點(diǎn))。在第一個(gè)實(shí)施例中，為了病毒恢復(fù)，GFP基因被克隆入該單位，因?yàn)楫?dāng)轉(zhuǎn)染的BSR細(xì)胞仍在孵育時(shí)，可以直接在UV顯微鏡下觀察GFP表達(dá)。利用470±20nm的激發(fā)濾波器，通過(guò)熒光顯微鏡檢查直接可見(jiàn)GFP蛋白的表達(dá)。ERAgreen2(在RV基因組中P基因后插入的GFP基因-trans2)-感染的細(xì)胞在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3天后，顯示清晰的綠色灶，而ERAgreenl(在"傳統(tǒng)"W區(qū)G基因后插入的GFP基因-trans1)直到轉(zhuǎn)染后5天才顯示明顯的綠色灶(圖6)。導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄單位在RV基因組兩個(gè)位置都是有功能的，盡管當(dāng)GFP從tmns2表達(dá)時(shí)，表達(dá)和積聚顯然更快。因此，這些結(jié)果還表明，通過(guò)選擇其中克隆ORF的轉(zhuǎn)錄單位，可以調(diào)節(jié)異源ORF的表達(dá)水平。在其他實(shí)施例中，l)ERAG的額外拷貝；或者2)在333位具有氨基酸取代的ERAG的額外拷貝，被整合到ERA病毒基因組中。成功拯救的病毒分別被命名為ERA2g和ER2g3。因?yàn)槎坎《綠的表達(dá)是不現(xiàn)實(shí)的，所以利用G探針通過(guò)Northern印跡來(lái)證實(shí)ERA2g和ERA2g3-感染的細(xì)胞中G表達(dá)水平的相對(duì)增加。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，利用DigDNA標(biāo)記試劑盒(Roche，Indianapolis,IN)標(biāo)記ERAG基因探針，用Dig核酸檢測(cè)試劑盒(Roche，Indianapolis,IN)進(jìn)行成像，通過(guò)密度分光光度法測(cè)量(圖7)。利用5G和3G引物通過(guò)RT-PCR還證實(shí)了恢復(fù)病毒中串聯(lián)連接的G基因。觀察到表示單一G拷貝的主要條帶位于1.5kb。此外，在大約3.0kb處觀察到第二條較弱的條帶，指示串聯(lián)排列的兩個(gè)G。這些結(jié)果證明，轉(zhuǎn)錄單位導(dǎo)入ERA基因組可用于從導(dǎo)入的ORF表達(dá)各種異源蛋白。此外，通過(guò)ORF插入的位置，調(diào)節(jié)異源ORF編碼蛋白的表達(dá)。因此，ERA病毒是一個(gè)用于重組蛋白表達(dá)的可廣泛適用的載體。實(shí)施例9:針對(duì)工程化病毒的體內(nèi)免疫應(yīng)答本實(shí)施例證實(shí)接種工程化ERA病毒和示范性衍生物的體內(nèi)影響。所有動(dòng)物管理和實(shí)驗(yàn)步驟均遵循CDC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指導(dǎo)(CDCInstitutionalAnimalCareandUseGuidelines)。80只3周齡小鼠被分成8組，每組10只，肌內(nèi)(i.m)使用恢復(fù)病毒(每只小鼠1()Sffu病毒)。10只健康小鼠留作未感染的模擬對(duì)照。對(duì)于ERA和ERAg3構(gòu)建體，對(duì)另一組10只3周齡小鼠進(jìn)行相同劑量病毒的額外腦內(nèi)(i.c)注射。在2日齡乳鼠中，只進(jìn)行相同劑量的ERAg3和ERA-G病毒腦內(nèi)接種。每天檢査動(dòng)物的患病情況。所有動(dòng)物利用C02中毒安樂(lè)死，取出大腦用于狂犬病病毒診斷。感染后10天，通過(guò)眶后途徑取血，獲得血清用于中和抗體分析，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)(Smith等人，BulletinoftheWorldHealthOrganization.48:535-541,1973)。感染后1個(gè)月，存活的動(dòng)物用致死量的狂犬病街病毒(狗/山狗唾液腺勻漿)攻擊(Orciari等人，Vaccine.19:4511-4518,2001)?？箍袢〔《綠的小鼠單克隆抗體(Mab52311)保存在CDC(Hamir等人，VetRec.136,295-296，1995)，F(xiàn)ITC-偶聯(lián)抗-N單克隆抗體購(gòu)自Centocor(Horsham,PA)。T7RNA聚合酶單克隆抗體來(lái)自Novagen(Madison,WI)。山羊抗-小鼠IgG-FITC偶聯(lián)物購(gòu)自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。抗狂犬病病毒G單克隆抗體(Mab1-909)保存在CDC，山羊抗人IgG-FITC偶聯(lián)物購(gòu)自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。在肌內(nèi)接種8種不同病毒構(gòu)建體的3周齡小鼠中，50%接種ERA(rERA)或者ERA-的小鼠，和20%接種ERAgreenl的小鼠在接種后19天顯示輕度神經(jīng)征象。其他組都未顯示提示狂犬病病毒感染的任何征象(圖8A)。在攻擊前收集血清用于中和抗體滴定。ERA2g(5.60IU)和ERA2g3(5.61IU)比單拷貝的G病毒構(gòu)建體引發(fā)更高的滴度(圖8E)。接種后1個(gè)月存活的小鼠接受致命的狗/山狗街病毒(0.05ml，保存在CDC用于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物攻擊試驗(yàn))的攻擊。在ERA和ERA-組中，40到62%的小鼠分別顯示輕度狂犬病征象，然后處以安樂(lè)死。所有其他組都存活，沒(méi)有狂犬病的任何征象(圖8B)。在i.c組中，3周齡小鼠在接種ERAg3后存活，但在注射ERA后死亡(圖8C)。ERA-G構(gòu)建體不殺死2日齡乳鼠，但是ERAg3具有足以殺死所有感染乳鼠的毒力(圖8D)。示例性的抗體滴度顯示于表4。表4:狂犬病特異抗體的制備組平均滴度ERA433G3334682G5602G333561-PSI490GFP437Ggreen833Gminus136Controls<1/5這些數(shù)據(jù)證明，所有基于ERA的病毒都能夠在接種后引發(fā)免疫應(yīng)答。與預(yù)期一致，親代ERA病毒是有毒力的，在感染動(dòng)物中造成顯著的發(fā)病和死亡。相反，各種示范性衍生物當(dāng)在攻擊前接種小鼠時(shí)，引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。除了如上所述的接觸前評(píng)價(jià)外，還檢測(cè)了在用毒性狂犬病病毒感染后，ERA病毒衍生物引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，倉(cāng)鼠組用3種不同狂犬病病毒株中的一種感染(每組n-9)，并且接受重組疫苗(ERA-g333)或者狂犬病免疫球蛋白加滅活的商業(yè)狂犬病疫苗。如圖9A-C所示，大約80-100%的對(duì)照動(dòng)物死亡，而大約60-100%的接種動(dòng)物存活。這些結(jié)果證明，衍生的狂犬病病毒的接觸后給藥基本上可以防護(hù)不同的狂犬病病毒株。鑒于本發(fā)明公開(kāi)的原理可以應(yīng)用到許多可能的實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，舉例說(shuō)明的實(shí)施方式只是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例，不應(yīng)被用于限制本發(fā)明的范圍。而是，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求確定。因此要求所有在這些權(quán)利要求的范圍和精神內(nèi)的都作為我們的發(fā)明。權(quán)利要求1.一種載體系統(tǒng)，包括含有全長(zhǎng)狂犬病病毒反基因組DNA的第一載體，其中全長(zhǎng)反基因組DNA選自全長(zhǎng)狂犬病病毒反基因組DNA或者其衍生物；和，含含有編碼至少一種狂犬病病毒株ERA蛋白的核酸的多個(gè)輔助載體，其中轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞中多個(gè)載體的表達(dá)引起重組狂犬病病毒的產(chǎn)生。2.權(quán)利要求l的載體系統(tǒng)，其中全長(zhǎng)反基因組DNA包括ERA株反基因組DNA或者其衍生物。3.權(quán)利要求2的載體系統(tǒng)，其中全長(zhǎng)反基因組DNA選自SEQIDNO:8,SEQIDN0:9，SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13，SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17或者SEQIDNO:18。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的載體系統(tǒng)，其中的載體是質(zhì)粒。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的載體系統(tǒng)，其中第一載體按5'到3'方向包括錘頭核酶；狂犬病病毒反基因組cDNA;和丁型肝炎病毒核酶，其中錘頭核酶的多個(gè)核苷酸與狂犬病病毒的反義基因組序列互補(bǔ)。6.權(quán)利要求5的載體系統(tǒng)，其中反基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄受CMV啟動(dòng)子和噬菌體T7RNA聚合酶啟動(dòng)子中至少一種的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。7.權(quán)利要求6的載體系統(tǒng)，其中反基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄受CMV啟動(dòng)子和噬菌體T7RNA聚合酶啟動(dòng)子兩者的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。8.權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)的載體系統(tǒng)，其中多個(gè)輔助載體包括含有編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的載體；含有編碼狂犬病病毒P蛋白的多核苷酸序列的載體；含有編碼狂犬病病毒M蛋白的多核苷酸序列的載體；含有編碼狂犬病病毒L蛋白的多核苷酸序列的載體；和含有編碼噬菌體T7RNA聚合酶的多核苷酸序列的載體。9.權(quán)利要求8的載體系統(tǒng)，還包括一種載體，所述載體含有編碼狂犬病病毒G蛋白的多核苷酸序列。10.權(quán)利要求8或者9的載體系統(tǒng)，其中T7RNA聚合酶包括核定位信號(hào)(NLS)。11.權(quán)利要求10的載體系統(tǒng)，其中編碼狂犬病病毒N蛋白的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且其中轉(zhuǎn)錄是獨(dú)立于帽的。12.權(quán)利要求8-11中任一項(xiàng)的載體系統(tǒng)，其中編碼狂犬病病毒P、M、L或者G蛋白或者T7聚合酶的一種或者多種多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受CMV啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子兩者的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。13.—種重組病毒基因組，包括如SEQIDNO:l所示的核酸。14.一種重組病毒基因組，或者其衍生物，包括如SEQIDNO:7所示的核酸。15.權(quán)利要求14的重組病毒基因組，其中衍生病毒基因組包括SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10,SEQIDNO:11,SEQIDNO:12,SEQIDNO:13，SEQIDNO:14,SEQIDNO:15,SEQIDNO:16,SEQIDNO:17或者SEQIDNO:18。16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)的重組病毒基因組，還包括載體。17.權(quán)利要求16的重組病毒基因組，其中的載體是質(zhì)粒。18.—種重組病毒，包括權(quán)利要求14或者15所述的基因組。19.權(quán)利要求18的重組病毒，其中的病毒是減毒病毒。20.—種包括至少一種重組狂犬病病毒基因組的活狂犬病疫苗，其中至少一種重組狂犬病基因組包括SEQIDNO:8所示的序列；SEQIDNO:10所示的序列；或者SEQIDNO:13所示的序列。21.權(quán)利要求20的狂犬病疫苗，其是減毒的。22.—種分離蛋白，包括如下列所示的氨基酸序列SEQIDNO:2(N蛋白)；SEQIDNO:3(P蛋白)；SEQIDNO:4(M蛋白)；SEQIDNO:5(G蛋白)；SEQIDNO:6(L蛋白)；或者SEQIDNO:58(G蛋白Aa333)。23.—種分離核酸分子，編碼根據(jù)權(quán)利要求22的任一種蛋白。24.權(quán)利要求23的分離核酸分子，包括如下所示的核苷酸序列a)SEQIDNO:1的核苷酸71-1423(N蛋白)；b)SEQIDNO:1的核苷酸1511-2407(P蛋白)；c)SEQIDNO:1的核苷酸2491-3104(M蛋白)；d)SEQIDNO:1的核苷酸3318-4892(G蛋白);e)SEQIDNO:1的核苷酸5418-11,801(L蛋白)，或者f)只是由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而不同于a)到e)之一的核苷酸序列。25.權(quán)利要求23的分離核酸分子，包括SEQIDNO:8的核苷酸3317-4888所示的核苷酸序列，或者只是由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與其不同的核苷酸序列。26.—種組合物，包括至少一種權(quán)利要求22的分離蛋白。27.權(quán)利要求26的組合物，還包括藥學(xué)上可接受的載體，佐劑，或者其兩種或更多種的組合。28.—種在對(duì)象中引發(fā)針對(duì)抗原表位的免疫應(yīng)答的方法，包括給對(duì)象導(dǎo)入權(quán)利要求26的組合物，從而在對(duì)象中引發(fā)免疫應(yīng)答。29.—種用于全長(zhǎng)狂犬病病毒基因組測(cè)序的方法，包括逆轉(zhuǎn)錄狂犬病病毒基因組以產(chǎn)生互補(bǔ)DNA鏈；擴(kuò)增互補(bǔ)DNA鏈的第一部分和第二部分以產(chǎn)生第一和第二擴(kuò)增的狂犬病病毒基因組片段；克隆第一和第二擴(kuò)增的狂犬病病毒基因組片段到載體中以產(chǎn)生連續(xù)的狂犬病病毒反基因組；和對(duì)全長(zhǎng)狂犬病病毒反基因組進(jìn)行測(cè)序。30.—種制備活狂犬病病毒疫苗的方法，包括將權(quán)利要求8-19中任一項(xiàng)的載體系統(tǒng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并恢復(fù)活的重組狂犬病病毒。31.權(quán)利要求30的方法，其中恢復(fù)的活重組狂犬病病毒適于用作活狂犬病病毒疫苗。32.—種活狂犬病病毒疫苗，由權(quán)利要求31的方法制備。33.—種對(duì)對(duì)象接種抗狂犬病的方法，包括給藥對(duì)象有效量的權(quán)利要求20或者權(quán)利要求32的活狂犬病疫苗，使對(duì)象的細(xì)胞感染狂犬病疫苗，其中在對(duì)象中產(chǎn)生抗-狂犬病免疫應(yīng)答。34.權(quán)利要求33的方法，其中對(duì)象是人。35.權(quán)利要求33的方法，其中對(duì)象是非人動(dòng)物。36.權(quán)利要求35的方法，其中非人動(dòng)物是貓，狗，大鼠，小鼠，蝙蝠，狐貍，淙熊，松鼠，負(fù)鼠，山狗或者狼。37.權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)的方法，其中的給藥包括口服給藥。38.權(quán)利要求37的方法，其中口服給藥包括通過(guò)設(shè)計(jì)成接種野生動(dòng)物群體的食物-誘餌給藥。39.—種藥物組合物，包括權(quán)利要求20或者權(quán)利要求32的活狂犬病疫苗和藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑。40.權(quán)利要求39的藥物組合物，其中狂犬病疫苗是減毒的。全文摘要提供了狂犬病病毒組合物和方法。公開(kāi)了狂犬病病毒株Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)的全長(zhǎng)序列。提供一種用于產(chǎn)生重組ERA病毒和其衍生物的反向遺傳系統(tǒng)，以及包括ERA和/或ERA衍生病毒株、核酸和/或蛋白的組合物。在一些情況下，組合物是可用于狂犬病病毒接觸前或者接觸后治療的免疫原性組合物。文檔編號(hào)C12N15/867GK101287838SQ200680038314公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2006年10月13日優(yōu)先權(quán)日2005年10月14日發(fā)明者吳賢福,查爾斯·E·盧普里希申請(qǐng)人:美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部，疾病控制和預(yù)防中心