專利名稱：一種檢測sars病毒抗體的試劑盒，其制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測SARS病毒抗體的試劑盒，還涉及其制備方法及用途。
根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的不同安排，熒光抗體技術(shù)有下列三種方法。
(一)直接法這是熒光抗體技術(shù)基本的方法。滴加熒光抗體于待檢標(biāo)本上，一定時(shí)間后，用緩沖液充分沖洗，然后在顯微鏡下觀察。若有相應(yīng)的抗原存在。即與熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合，在鏡下可見有熒光的抗原抗體復(fù)合物。本法優(yōu)點(diǎn)是特異性高，受非特異熒光干少。缺點(diǎn)是每檢查一種抗原，必須制備與其相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，且靈敏度較低。
(二)間接法系根據(jù)抗球蛋白試驗(yàn)的原理。用熒光色素標(biāo)記抗球蛋白抗體(或稱抗抗體)。試驗(yàn)過程分為兩部第一步，將未標(biāo)記的抗體加到有抗原的標(biāo)本片上，作用一定時(shí)間后，洗去未結(jié)合的抗體；第二步，加入熒光素標(biāo)記的抗球蛋白抗體，如果第一步中的抗原抗體已發(fā)生結(jié)合，此時(shí)加入的標(biāo)記抗抗體就和已固定在抗原上的抗體分子(已知的未標(biāo)記的)發(fā)生結(jié)合，形成抗原—抗體—標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。本法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高于直接法，而且只需制備一種熒光色素標(biāo)記的抗球蛋白抗體，即可用于檢測同種動(dòng)物的多種抗原抗體系統(tǒng)，可用來檢測抗原和抗體。
(三)補(bǔ)體法這是間接熒光抗體法的一種變型。系利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光色素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體(常用抗豚鼠補(bǔ)體C3的熒光抗體)。試驗(yàn)過程也可分為兩步第一步，將未標(biāo)記的抗體和補(bǔ)體加到抗原標(biāo)本片上，作用一定時(shí)間后，洗去游離的抗體和補(bǔ)體；第二步，加上熒光色素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體，如果在第一步中抗原抗體發(fā)生特異的結(jié)合，則補(bǔ)體被固定，此時(shí)加入標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體，即與補(bǔ)體發(fā)生結(jié)合，形成抗原—抗體—補(bǔ)體—標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體的大分子免疫復(fù)合物。
本發(fā)明中的SARS病毒是指嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)的病原體，它是最近出現(xiàn)的一種新病毒，為冠狀病毒的變種，與已知的冠狀病毒基因序列的同源性約為60％，但在抗原性上二者沒有交叉。所以雖然正常人群中存在已知的冠狀病毒的抗體，但對(duì)此種病毒卻沒有保護(hù)作用，導(dǎo)致人群的普遍易感。此病毒引發(fā)嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病，病死率目前在5％左右，嚴(yán)重危害人類的健康，世界衛(wèi)生組織將其定義為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征，我國稱之為“非典型肺炎”。目前在世界數(shù)十個(gè)國家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了此病，感染人數(shù)達(dá)數(shù)千人，并有繼續(xù)蔓延的趨勢。因此快速檢測SARS病毒感染的方法對(duì)于SARS的診斷，控制疾病的蔓延有重要意義。
到目前為此，尚無間接免疫熒光技術(shù)用于檢測SARS病毒感染的報(bào)道。
本發(fā)明提供的試劑盒包含以下內(nèi)容SARS病毒感染細(xì)胞抗原片SARS病毒抗體陽性對(duì)照正常人血清陰性對(duì)照抗人熒光素標(biāo)記抗體熒光抗體稀釋液標(biāo)本血清稀釋液試劑盒使用說明書本發(fā)明公開的試劑盒系用正常Vero E6細(xì)胞感染SARS病毒經(jīng)培養(yǎng)后，將感染細(xì)胞固定在10孔鍍膜玻片后制成抗原片，采用間接免疫熒光法原理檢測人血清標(biāo)本中SARS病毒抗體。其中SARS病毒為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)的病原體，為一種或多種新的冠狀病毒；抗人熒光素標(biāo)記抗體為抗人IgG抗體或抗人IgMμ鏈抗體；SARS病毒抗體為抗SARS病毒IgG抗體或IgM抗體。
本發(fā)明中各成分的含量可根據(jù)實(shí)際需要加減，檢測一定人份數(shù)的標(biāo)本。如SARS病毒感染細(xì)胞抗原片5張，SARS病毒抗體陽性對(duì)照100μl，正常人血清陰性對(duì)照100μl，抗人熒光素標(biāo)記抗體30μl(抗人IgG抗體)或40μl(抗人IgMμ鏈抗體)，熒光抗體稀釋液1000μl，標(biāo)本血清稀釋液2000μl可檢測20人份的血清標(biāo)本。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該試劑盒的制備方法。
試劑盒中各成分的制備方法如下SARS病毒感染細(xì)胞抗原片將SARS病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋并接種Vero E6細(xì)胞，吸附后加入維持液培養(yǎng)。顯微鏡下觀察CPE，當(dāng)有細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，制成細(xì)胞懸液。
將細(xì)胞懸液滴加在鍍膜玻片上，培養(yǎng)后漂洗去除懸浮細(xì)胞，晾干。-20℃丙酮固定后晾干、密封，-20℃凍存。
SARS病毒抗體陽性對(duì)照血清選用經(jīng)滅活處理后的10份SARS病毒IgG或IgM抗體陽性血清混合，按適當(dāng)?shù)谋壤♂岅栃匝宀⒒靹颍?20℃凍存。
正常人血清陰性對(duì)照選用經(jīng)滅活處理后的10份SARS病毒抗體陰性血清混勻后，按適當(dāng)?shù)谋壤♂岅幮匝澹?20℃凍存。
抗人熒光標(biāo)記抗體FITC熒光素標(biāo)記用抗人IgG或IgMμ鏈抗體經(jīng)檢定合格后，采用直接法進(jìn)行熒光素標(biāo)記，然后將FITC標(biāo)記抗體進(jìn)行純化，并進(jìn)行濃度選擇。
熒光抗體稀釋液采用伊文思蘭，加入蒸餾水配制。
標(biāo)本血清稀釋液為PBS溶液。
SARS病毒抗體免疫熒光檢測試劑盒使用說明書。(詳見實(shí)施例)將上述各成分裝于外包裝盒中，組成整個(gè)試劑盒。
本發(fā)明中的試劑盒的制備按中國《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》要求實(shí)施，具有陽性血清處理、分裝的隔離實(shí)驗(yàn)室。
本發(fā)明公開的原料及輔料符合現(xiàn)行《中國生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》要求，未納入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，不低于分析純。
本發(fā)明還有一個(gè)目的，就是公開該試劑盒在檢測人血清中SARS病毒抗體上的應(yīng)用。通過一百余例的臨床病例檢測，本發(fā)明的試劑盒檢測時(shí)間短，使用方便，靈敏度高、特異性好，易于保存。在SARS病毒的檢測上，具有良好的市場前景和社會(huì)效益。
圖2為SARS病毒感染細(xì)胞間接免疫熒光法染色結(jié)果，圖中的細(xì)胞胞漿內(nèi)形態(tài)特異的白色部分(實(shí)際觀察中為黃綠色)即為熒光素標(biāo)記抗體的特異染色部位。
試劑盒使用說明書 1份外包裝盒 1個(gè)實(shí)施例 SARS病毒抗體免疫熒光檢測試劑盒的制備一、SARS病毒感染細(xì)胞抗原片的制備SARS病毒從廣州非典型肺炎病人尸解肺組織中新分離的SARS病毒GZ1株。
SARS病毒鑒定采用細(xì)胞培養(yǎng)和乳鼠接種法，從非典型肺炎病例標(biāo)本中分離致病病原體，通過電鏡形態(tài)學(xué)、血清學(xué)和動(dòng)物致病性觀察及RT-PCR擴(kuò)增、基因序列分析對(duì)分離的病原體進(jìn)行鑒定。
細(xì)胞為Vero E6細(xì)胞，經(jīng)無菌檢測合格后使用。
10孔鍍膜玻片經(jīng)處理并檢定合格后使用。
首先制備SARS病毒感染細(xì)胞懸液將SARS病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋為10-2，取1.0毫升接種Vero E6細(xì)胞37℃吸附1h后加入維持液，37℃培養(yǎng)。顯微鏡下觀察CPE，當(dāng)有25％細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為107個(gè)/ml。
將細(xì)胞懸液滴加在鍍膜玻片上20μl/孔，37℃培養(yǎng)6h，用PBS漂洗去除懸浮細(xì)胞，晾干，-20℃丙酮固定4h后晾干、密封，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 抗原片每孔應(yīng)均有細(xì)胞，無漏空，細(xì)胞分布均勻。二、抗人熒光素標(biāo)記抗體(FITC熒光素標(biāo)記)的制備1.熒光素標(biāo)記用抗人抗體IgG(或IgM μ鏈)經(jīng)檢定合格后用于熒光素標(biāo)記?？谷丝贵w的純度用SDS-PAGE測定，在上樣量為10μg條件下應(yīng)為一條帶。
2.來源FITC(異硫氰酸熒光素)構(gòu)自Sigma公司。
3.標(biāo)記方法采用直接法進(jìn)行熒光素標(biāo)記。
3.1步驟3.1.1以0.01mol/l pH7.1PBS調(diào)整蛋白濃度到20mg/ml，放于稱量瓶中；3.1.2取相當(dāng)于蛋白量1/100的FITC，溶解于相當(dāng)?shù)鞍兹芤?/10體積的0.5mol/l，pH9.5碳酸鹽緩沖液；3.1.3在攪拌條件下將FITC緩慢的加入IgG(或IgMμ鏈)蛋白液內(nèi)，室溫20℃左右。磁力攪拌標(biāo)記4h；3.1.4將標(biāo)記溶液對(duì)10～50倍PBS充分透析2～4h。
4.FITC標(biāo)記抗體的純化4.1步驟4.1.1 Sephadex G-50凝膠過濾去除游離FITC；4.1.1.1層析柱2×30cm玻璃層析柱，柱內(nèi)底部墊尼龍網(wǎng)；4.1.1.2洗脫液0.01mol/l pH 7.1 PBS；4.1.1.3流速0.1～1ml/min；4.1.1.4加樣量凝膠柱床體積的10～15％；4.1.1.5當(dāng)樣品加入到柱中后將在柱中被分為三個(gè)區(qū)帶，柱上部熒光區(qū)帶為結(jié)合FITC較強(qiáng)的蛋白及游離FITC；中部為無色的洗脫液；柱下部為FITC標(biāo)記的抗體，收集這部分即是熒光素標(biāo)記抗體。
4.1.2 DEAE-纖維素柱層析純化標(biāo)記IgG(或IgMμ鏈)4.1.2.1層析柱要求同上，內(nèi)裝充分容漲及平衡的纖維素(根據(jù)需要裝柱床體積)。
4.1.2.2洗脫液0.01mol/l pH 7.1 PBS；4.1.2.3流速1ml/min；4.1.2.4加樣量根據(jù)纖維素的蛋白吸附容量計(jì)算。
4.1.2.5洗脫時(shí)，將柱中第一個(gè)色帶(標(biāo)記抗體)洗脫完畢為止。
4.2保存-20℃。
5.熒光素標(biāo)記抗體的外觀檢定黃綠色、澄清、無混濁、無沉淀。
6.FITC標(biāo)抗體的濃度選擇FITC標(biāo)抗體分別在1∶20～1∶640的范圍進(jìn)行滴定，根據(jù)滴定結(jié)果確定FITC標(biāo)記抗體的濃度，選擇熒光亮度及形態(tài)均好的濃度作為使用濃度。三、熒光抗體稀釋液的制備準(zhǔn)確稱取0.2g伊文思蘭，加入蒸餾水配制成為0.2％儲(chǔ)存液。使用時(shí)稀釋至0.02％，室溫保存?zhèn)溆?。四、?biāo)本血清稀釋液的制備0.005mol/l PBS pH 7.2(配方為NaCl 29.2g，NaH2PO4·2H2O 3.9g，Na2HPO47.1g，加蒸餾水至5000ml)五、陽性對(duì)照血清的制備選用經(jīng)56℃ 30min滅活處理后的10份SARS病人抗體陽性血清混合，按適當(dāng)?shù)谋壤♂岅栃匝寤靹蚝螅?20℃凍存?zhèn)溆?。六、陰性?duì)照血清的制備選用經(jīng)56℃ 30min滅活處理后的10份SARS病毒抗體陰性血清混勻后，按適當(dāng)?shù)谋壤♂岅幮匝澹?20℃凍存?zhèn)溆?。七、反?yīng)時(shí)間的確定選用三份SARS病人抗體陽性血清和一份陰性血清，分別在不同的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)檢測待檢樣品IgG時(shí)，37℃孵育30min，病人血清中IgG抗體與病毒抗原達(dá)最大結(jié)合狀態(tài)，故確定30min為最佳反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)檢測待檢樣品IgM時(shí)，病人血清中IgM抗體與病毒抗原37℃孵育2h達(dá)最大結(jié)合狀態(tài)，故確定2h為最佳反應(yīng)時(shí)間。八、陰性參考品符合率10份陰性參考品不得出現(xiàn)假陽性。九、陽性參考品符合率
10份陽性參考品不得出現(xiàn)假陰性。十、無菌試驗(yàn)液體組分在加入防腐劑前，抽樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)。十一、穩(wěn)定性試驗(yàn)試劑各組在-20℃放置24個(gè)月。十二、分裝各組分檢定合格后進(jìn)行分裝，貼簽。十三、組裝按試劑盒組成成分組裝。
實(shí)施例三 SARS病毒抗體免疫熒光檢測試劑盒使用說明書本發(fā)明的SARS病毒抗體免疫熒光檢測試劑盒其使用說明書包括以下內(nèi)容一、用途與原理用于病人血清中SARS病毒特異IgG(或IgM)抗體檢測，為非典型肺炎的臨床診斷提供參考。
本試劑盒利用免疫熒光抗體技術(shù)，通過熒光顯微鏡進(jìn)行結(jié)果判斷。
二、試劑盒內(nèi)容SARS病毒感染細(xì)胞抗原片5張SARS病毒抗體陽性對(duì)照 100μl正常人血清陰性對(duì)照100μl抗人IgG(或IgMμ鏈)熒光素標(biāo)記抗體 30μl(40μl)熒光抗體稀釋液1000μl標(biāo)本血清稀釋液2000μl試劑盒使用說明書 1份
SARS病毒感染細(xì)胞抗原片示意圖見附

圖1。
三、操作步驟1.首先將待檢病人血清標(biāo)本用血清標(biāo)本稀釋液進(jìn)行1∶10稀釋，然后，56℃ 30min滅活。
2.將SARS病毒抗原片取出，室溫放置5min，使抗原片溫度與室溫平衡。
3.將滅活后的待檢病人血清再倍比稀釋，使之成為1∶20。每份標(biāo)本血清取1∶10和1∶20兩個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度取10μl，分別滴加在抗原片的不同孔上(如圖1所示)。
4.置玻片于濕盒中37℃作用30min(檢測IgM時(shí)作用2h)。將玻片取出，自來水沖洗，晾干。
5.用熒光抗體稀釋液將標(biāo)記的抗人IgG熒光抗體進(jìn)行1∶40(檢測IgM時(shí)作用1∶20)稀釋，然后滴加到抗原片上，每孔10μl。
6.置玻片于濕盒中37℃作用30min。沖洗同前，晾干。
7.熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。根據(jù)胞漿或胞膜部位有無特異熒光染色來判斷結(jié)果，如圖2所示。
8.檢測要同時(shí)設(shè)陽性血清和陰性血清對(duì)照。
9.結(jié)果判斷胞漿或胞膜部位有特異熒光染色為陽性，無特異熒光為陰性。陽性可依據(jù)熒光亮度和陽性細(xì)胞的多少綜合判定分別記為“+～++++”，陰性記為“-”。
四、注意事項(xiàng)1.要自備2-20μl和20-200μl移液器各一支。
2.熒光抗體要根據(jù)每次需要量現(xiàn)稀釋。
3.染色操作中，在往抗原片上滴加標(biāo)本血清和標(biāo)記抗體時(shí)，注意不要?jiǎng)澋舨Ｆ系募?xì)胞。
4.染色過程中，滴加樣品時(shí)應(yīng)防止液體外溢和干燥，沖洗要徹底。
5.熒光顯微鏡下觀察時(shí)要仔細(xì)，防止漏掉弱陽性，同時(shí)要注意區(qū)別非特異熒光顆粒與特異熒光染色。
五、規(guī)格20人份六、儲(chǔ)藏-20℃保存七、有效期2年八、制造單位軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所實(shí)施例四 SARS病毒抗體免疫熒光檢測試劑盒臨床使用效果將各醫(yī)院臨床診斷為非典型肺炎病人的血清標(biāo)本采用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行IgG/IgM檢測，結(jié)果如下表。
間接免疫熒光法(IFA)對(duì)臨床診斷非典病人血清抗體(IgG/IgM))檢測結(jié)果臨床診斷IFA合計(jì)非典病人 其它病人陽性 991 100陰性 1468 82合計(jì) 113 69 182從表中數(shù)據(jù)可以得出靈敏度＝(99/113)×100％＝87.6％特異性＝(68/69)×100％＝98.6％符合率＝[(99+68)/182]×100％＝91.8％陽性預(yù)測值＝[99/(99+1)]×100％＝99.0％陰性預(yù)測值＝[68/(14+68)]×100％＝82.9％可以看出，本發(fā)明的試劑盒具有較好的靈敏度和特異性，符合率較高。
權(quán)利要求
1.一種檢測SARS病毒抗體的試劑盒，包括以下部分SARS病毒感染細(xì)胞抗原片SARS病毒抗體陽性對(duì)照血清正常人血清陰性對(duì)照抗人熒光素標(biāo)記抗體熒光抗體稀釋液標(biāo)本血清稀釋液
2.制備權(quán)利要求1所述的試劑盒的方法包括以下步驟SARS病毒感染細(xì)胞抗原片的制備；SARS病毒抗體陽性對(duì)照血清的制備；正常人血清陰性對(duì)照的制備；抗人熒光素標(biāo)記抗體的制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的所述的SARS病毒為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(SARS)的病原體，為一種或多種新的冠狀病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中的所述的抗人熒光素標(biāo)記抗體為抗人IgG抗體或抗人IgMμ鏈抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的SARS病毒抗體為抗SARS病毒IgG抗體或IgM抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中SARS病毒感染細(xì)胞抗原片的制備包括以下步驟(1)制備SARS病毒感染細(xì)胞懸液；(2)將細(xì)胞懸液滴加在鍍膜玻片上培養(yǎng)；(3)洗去懸浮細(xì)胞，晾干；(4)固定、晾干、密封后-20℃凍存。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中SARS病毒抗體陽性對(duì)照血清的制備包括以下步驟選用經(jīng)滅活處理后的SARS病毒IgG或IgM抗體陽性血清，按適當(dāng)?shù)谋壤♂尰靹颉?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中正常人血清陰性對(duì)照的制備包括以下步驟選用經(jīng)滅活處理后的SARS病毒抗體陰性血清，按適當(dāng)?shù)谋壤♂尅?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中抗人熒光素標(biāo)記抗體的制備包括以下步驟(1)抗人熒光素標(biāo)記抗體的制備；(2)抗人熒光素標(biāo)記抗體的純化。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒在檢測人血清標(biāo)本中SARS病毒抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測SARS病毒抗體的試劑盒，其制備方法及用途。本發(fā)明將感染SARS病毒的細(xì)胞固定在玻片上制成抗原片，采用間接免疫熒光法原理檢測人血清標(biāo)本中SARS病毒抗體，為非典型肺炎的臨床診斷提供參考。本發(fā)明的試劑盒具有使用簡便，快捷，靈敏度和特異性高，穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，有著廣闊的市場前景。
文檔編號(hào)G01N33/533GK1445549SQ03124299
公開日2003年10月1日 申請日期2003年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者祝慶余, 秦鄂德, 楊保安, 司炳銀, 于曼, 劉洪 , 呂富雙 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所