專利名稱：核酸等溫擴增方法和使用核酸和信號探針同時等溫擴增的核酸檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種核酸等溫擴增方法和一種核酸檢測方法，其包括用于檢測擴增產物的同時核酸和信號探針等溫擴增，更具體地說，涉及一種使用外部引物對和RNA/DNA雜交引物對的目標核酸等溫擴增方法，以及一種通過使用外 部引物對、RNA-DNA雜交引物對和DNA-RNA-DNA雜交探針來同時擴增核 酸和信號探針的擴增產物檢測方法。
背景技術：
核酸擴增技術對于檢測和分析少量的核酸非常有用。核酸擴增對目標核酸 的高敏感性促成了根據基因分離來檢測特異核酸的技術的發(fā)展，這些技術可用 于傳染性疾病和遺傳性疾病以及法醫(yī)學方面的診斷和分析?；谶@樣的核酸檢 測方法，人們開發(fā)了各種能夠執(zhí)行實質性的敏感診斷和分析的方法(Belkum， Current Opinion in Pharmacology, 3:497， 2003年)。 ，
促成核酸檢測的因素是DNA鏈的互補性和在體外從單鏈核酸形成雙鏈 雜交分子的能力。由于這種能力，可以檢測樣本中的特異核酸(Barry等人， Current Opinion in Biotechnology, 12:21， 2001年)。
核酸檢測中使用的探針由能夠與核酸樣本中存在的目標序列雜交的特異 序列組成。探針由化學材料、免疫化學材料、熒光材料或放射同位素讀取。一 般來說，探針的構成包括能夠讀取DNA雜交的熒光材料和具有目標核酸的互 補序列的核酸片段，或者諸如生物素和地高辛等標記或報告分子。
然而，上述方法的問題在于，無法檢測染色體DNA上的短序列，具有很 低的拷貝數，并且難于解決野生型基因的改良等位基因的拷貝數有限的問題。 上述方法的另一個問題與體外或原位的環(huán)境條件相關，從而限制了目標序列、 化學材料、探針和另一種分子或結構之間的物理相互作用。
目標核酸檢測方法劃分為三個類別，即(1)目標序列擴增，其擴增目標核 酸，(2)探針擴增，其本身是探針分子，以及(3)由每個探針通過復雜的探針 或探針耦合方法顯示的信號擴增信號。
體外核酸擴增技術一直用作檢測和分析少量核酸的主要方法。在這些技術中，PCR(聚合酶鏈反應) 一直最廣泛地用作核酸擴增技術，其中，將每個互 補序列鏈用作模板，在通過引物重復進行核酸合成時，對每個互補序列鏈的一 個拷貝進行合成。為了實施PCR，需要預編程的熱循環(huán)儀器。因此，PCR技 術具有以下缺點其成本非常高；具有相對較低的特異性；需要極端的性能標 準才能重新執(zhí)行結果。
LCR (連接酶鏈反應)是另一種核酸擴增技術，其中將兩個相鄰寡核苷酸 與目標核酸雜交，然后與連接酶進行連接。通過這種方法形成的探針連同互補 核苷酸一起通過溫度循環(huán)進行擴增。
由于LCR的鑒別能力比引物延伸高，它在基因分型點突變方面表現出比 PCR更高的等位基因特異性。在截止目前已開發(fā)的核酸擴增技術中，LCR具 有最高的特異性，并且是最容易使用的方法，因為所有的鑒別機制都經過了優(yōu) 化。然而，其缺點在于，這種技術的反應速度是最低的，并且需要許多改良的 探針。[10]在使用諸如LCR等連接的方法中，可以通過使用RCA技術進行擴增來 執(zhí)行基因分型，該技術主要通過LCR或RCA(滾環(huán)復制)過程中伴隨的DNA 連接來使用環(huán)化鎖式探針，而不進行目標擴增PCR (Qi等人，Nucleic Acids Res.， 29:ell6， 2001年)。[11] SDA (鏈置換擴增)擴增方法使用內切核酸酶，通過鏈置換對樣本中的目 標核酸序列及其互補鏈進行擴增。此方法使用一種混合物，其中包含核酸聚合 酶、至少一種目標片段第3'端的互補引物，以及至少包含一種替代dNTP(脫 氧核苷三磷酸)的dNTP。每種引物在第5'端中具有一個序列，限制性內切 核酸酶可以識別該序列(Walker等人，Nucleic Acids Res. ， 29:1691， 1992年)。[12]作為與SDA類似的方法，還存在使用5'-RNA/DNA-3'引物的SPIA (單 引物等溫擴增)技術(美國專利第6,251,639號)、使用5'-DNA/RNA-3'引物 的ICAN(引物引起的等溫嵌合核酸擴增)技術(美國專利申請第2005/0123950 號)和使用RNA引物的Riboprimer技術(美國專利申請第2004/0180361號) 等等，其中在使用NA/DNA雜交引物或RNA引物進行引物延伸以后，引物 和模板DNA由(其消化與模板DNA雜交的RNA引物)所消化，然后通 過鏈置換延伸新的引物。[13] TMA (轉錄介導的擴增)是一種目標核酸擴增技術，其僅使用一種恒溫、 恒定離子強度和恒定pH值的啟動子引物(Kwoh等人，Proc. Nat. Acad. ScL USA, 86:1173， 1989)。 TMA包括組合由目標核酸和啟動子引物組成的混合物的步驟，其中啟動子引物是目標序列的第3'端的互補寡核苷酸，用于與目標 核酸的第3'端或其鄰近區(qū)域雜交。啟動子引物包括RNA聚合酶的啟動子區(qū) 域序列，其位于絡合序列的第5'端中。啟動子引物和目標序列形成引物/目標 序列雜交以延伸DNA。[14]在TMA技術的DNA延伸過程中，假設目標序列的第3'端從靠近絡合 物的位置開始延伸，啟動子引物在該位置中在絡合序列和目標序列之間雜交。 啟動子序列產生第一個DNA延伸產物，以在形成雙鏈啟動子序列的延伸過程 中用作模板。啟動子引物的第3'端可以在第二個延伸過程中用作引物。在該 延伸過程中，雙鏈核酸絡合物通過將目標序列用作模板而形成。當使用RNA 目標序列時，絡合物為DNA/RNA絡合物；當使用DNA目標序列時，絡合 物為DNA/DNA絡合物。接著，識別啟動子引物的啟動子的RNA聚合酶使 用第一個DNA延伸產物來合成RNA，以便產生目標序列的各個RNA拷貝。[15] NASBA (基于核酸序列的擴增)技術包括單鏈RNA、單鏈DNA和雙鏈 DNA的合成(Compton， Nature, 350:91， 1991年)。單鏈RNA成為第一個 引物的第一個模板，單鏈DNA成為第二個引物的第二個模板，雙鏈DNA成 為第一個模板的拷貝合成中的第三個模板。[16]存在的問題在于，使用諸如PCR等熱循環(huán)過程的擴增方法需要加熱塊以 達到每個循環(huán)的"目標"溫度，并且需要在加熱塊達到目標溫度之前的延遲時間， 因此要花很長的時間才能完成擴增反應。[17]由于諸如SDA、 NASBA和TMA等目標核酸等溫擴增方法是在恒溫下 執(zhí)行的，因此不需要單獨的熱循環(huán)裝置，從而很容易處理。[18]然而，截止目前己公開的目標核酸等溫擴增方法具有幾個缺點。根據SDA 的方法需要給定的限制性內切酶的某個特定區(qū)域，因此其應用受到限制。諸如 NASBA和TMA等基于轉錄的擴增方法需要通過引物實現聚合酶啟動子序列 和擴增產物之間的結合，并且該過程往往帶來非特異性的擴增。由于這些缺點， 通過基于轉錄的擴增方法的DNA目標擴增機制還沒有很好地建立起來。[19]此外，目前使用的擴增方法的不利之處在于，測試樣本可能被先前的擴增 反應產物所污染，從而導致無目標特異性的擴增。為了防止這種情況發(fā)生，人 們研究了樣本溶液的污染檢測方法，這些方法在擴增反應的最后一步中或在目 標核酸擴增開始之前，采用各種手段和物理裝置來凈化樣本。擴增探針是另一 種檢測核酸的方法，作為一種擴增探針的方法，還存在一種在上述核酸擴增方 法中使用的LCR方法。[20]作為另一種檢測核酸的方法，還存在一種用于擴增信號而不擴增目標核酸 和探針的方法。在這些方法中，存在一種使用四組探針來捕獲目標核酸的擴增 方法(Ross等人，J. Virol. Method., 101 :159， 2002年)。使用信號擴增的雜 交捕獲方法的敏感性不亞于直接檢測和擴增目標核酸的方法，并使用抗體和化 學發(fā)光材料來進行信號檢測(VanDerPol等人，J. Clinical Microbiol, 40:3564， 2002年；Nelson等人，Nucleic Acids Reserch， 24:4998， 1996年)。[21]此外，還有一種CPT (環(huán)狀探針技術)方法，并用作擴增信號探針的方 法(Duck等人，BioTechniques, 9:142, 1990年)。該方法使用DNA/RNA/DNA 雜交探針，此探針具有目標核酸的互補堿基序列，當探針與目標核酸雜交時， 雜交探針的RNA區(qū)域被RNaseH消化，從而與目標核酸分離，然后另一個 DNA/RNA/DNA雜交探針再次與目標核酸雜交，以生成消化探針，從而循環(huán)地 擴增信號探針。[22]然而，CPT方法的缺點在于，其擴增效率為103~106，這是相對較低的， 因此很難在診斷中單獨使用，其用法也很復雜，因為信號探針是在通過諸如 PCR等傳統(tǒng)核酸擴增來增加目標核酸的特殊區(qū)域數量之后單獨進行擴增的，并 且需要很高的成本和很長的時間。[23]相應地，為了克服上述問題，本發(fā)明人付出了大量的努力，開發(fā)了一種快 速和準確地擴增目標核酸的方法，同時，還開發(fā)了一種檢測擴增產物的方法， 結果發(fā)現，當使用具有目標核酸的互補堿基序列的外部引物對和具有目標核酸 的部分互補堿基序列的RNA/DNA雜交內部引物對時，可以在等溫下快速擴增 目標核酸。此外，本發(fā)明人還確認，如果使用具有上述方法產生的擴增產物的 互補堿基序列的DNA/RNA/DNA雜交探針，則還可以在等溫下同時擴增目標 核酸和探針信號，從而圓滿完成了本發(fā)明。發(fā)明內容[24]本發(fā)明的一個目的是提供一種在等溫下快速和準確地擴增目標核酸的方 法。[25]本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測核酸的方法，其包括執(zhí)行核酸和探針 信號的同時等溫擴增。[26]為了實現上述目的，本發(fā)明提供了一種核酸等溫擴增方法，該方法包括以 下步驟(a)對反應混合物進行變性，該混合物包含(i)目標核酸，(ii)具有目 標核酸的互補堿基序列的外部引物對，以及(iii)具有目標核酸的部分互補堿基 序列的RNA/DNA雜交內部引物對；以及(b)添加酶促反應混合物溶液，包含能夠對步驟(a)中變性的反應混合物進行鏈置換的和DNA聚合酶，以 在等溫下擴增上述目標核酸。[27]本發(fā)明還提供一種用于檢測核酸的方法，該方法包括以下步驟(a)對反 應混合物進行變性，該混合物包含(i)用于檢測目標核酸的核酸樣本，(ii)具 有目標核酸的互補堿基序列的外部引物對，以及(iii)具有目標核酸的部分互補 堿基序列的RNA/DNA雜交內部引物對；(b)添加酶促反應混合物溶液，其包 含能夠對步驟(a)中變性的反應混合物進行鏈置換的和DNA聚合酶，以及 DNA/RNA/DNA雜交探針，其具有通過外部引物和內部引物對產生的擴增產物 的互補堿基序列，以在等溫下同時擴增上述目標核酸和上述探針信號；以及(c) 使用擴增的探針信號來檢測目標核酸。[28]優(yōu)選地，在本發(fā)明中，外部引物系由下列各物質組成的群組中選擇的任何 一種物質oligoDNA、oligoRNA和雜交oligoRNA/DNA;并且在RNA/DNA雜 交內部引物中，其RNA區(qū)域優(yōu)選地具有目標核酸的非互補堿基序列，其DNA 區(qū)域優(yōu)選地具有目標核酸的互補堿基序列。[29]在本發(fā)明中，DNA/RNA/DNA雜交探針優(yōu)選地由25~45個堿基組成，外 部DNA的長度優(yōu)選地由10-20個堿基組成，內部RNA的長度優(yōu)選地由 4~6堿基組成。[30]在本發(fā)明中，DNA/RNA/DNA雜交探針的端優(yōu)選地使用標記來進行標注， 其中標記(標簽)優(yōu)選地為選擇性地結合了諸如生物素、熒光素、地高辛和2,4-二硝基乙酰苯胺等特異抗體的材料。[31]在本發(fā)明中，DNA/RNA/DNA雜交探針的3'端優(yōu)選地使用磷酸鹽材料進 行標記，以防止在擴增過程中發(fā)生探針延伸。[32]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，DNA聚合酶為熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，并且該熱 穩(wěn)定的DNA聚合酶系由下各種聚合酶組成的群組中選擇的任何一種聚合酶 BstDNA聚合酶、exo(-) vent DNA聚合酶和BcaDNA聚合酶。[33]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，Rnase為RNaseH。在本發(fā)明中，優(yōu)選地，目標核 酸和探針信號的擴增在50~65'C實施。[34]下面的"具體實施方式
"和所附的"權利要求"將更清楚地闡明本發(fā)明的其他 功能和實施例。


[35]圖1是根據本發(fā)明的核酸等溫擴增方法的示意圖；[36]圖2是根據本發(fā)明的核酸等溫擴增方法的順序示意圖；[37]圖3是根據本發(fā)明的核酸和信號探針同時擴增的示意圖；[38]圖4是根據本發(fā)明的核酸等溫擴增方法產生的擴增產物的電泳圖譜(M: 標記，泳道1:未添加XDNA的樣本；泳道2:未添加內部和外部引物的樣 本；泳道3:未添加內部引物的樣本；泳道4:未添加外部引物的樣本；泳道5: 添加了 XDNA 、內部和外部引物的樣本)；[39]圖5是根據本發(fā)明的擴增方法產生的檢測信號探針(使用金納米探針聚 合)的示意圖；[40]圖6是根據本發(fā)明的擴增方法產生的檢測信號探針(使用金納米探針聚 合)的分析結果；[41]圖7是根據本發(fā)明的擴增方法產生的檢測信號探針(使用HRP [辣根過 氧化物酶P的示意圖；[42]圖8是根據本發(fā)明的擴增方法產生的檢測信號探針(使用HRP [辣根過 氧化物酶P的分析結果。
具體實施方式
[43]本發(fā)明的一方面涉及到一種核酸等溫擴增方法。[44]根據本發(fā)明的核酸等溫擴增使用以下過程來實施，如圖1中所示。[45]首先對將要擴增以在擴增中用作模板的目標核酸、外部引物對和 RNA/DNA雜交內部引物對的混合物進行變性，以使其中每種物質成為單鏈的。 將變性的混合物冷卻到等溫擴增溫度，并向其添加包含Rnase和DNA聚合 酶的酶促反應混合物溶液。然后將外部引物對和RNA/DNA雜交內部引物對與 冷卻到擴增溫度的反應溶液中的目標核酸一起退火。[46]優(yōu)選地，外部引物對包含比內部引物對更靠近目標核酸兩端的序列的互補 序列，并且內部引物對包含比外部引物對更靠近目標核酸中間的序列。在此情 況下，與外部引物相比，內部引物對沿DNA鏈延伸的正方向退火。退火后的 外部引物和內部引物使用能夠進行鏈置換的DNA聚合酶進行延伸。當外部引 物沿著模板(目標核酸)延伸時，位于延伸正方向的內部引物和從內部引物延 伸的DNA鏈與模板(目標核酸)分離，從而導致鏈置換。最后，將獲得分別 通過內部引物和外部引物延伸的單鏈DNA擴增產物。[47]使用單鏈DNA作為模板以形成雙鏈DNA，從而延伸外部引物，通過鏈 置換將延伸的RNA/DNA雜交內部引物分離以獲得單鏈DNA，同時通過RNaseH將雙鏈DNA的RNA區(qū)域分離，并對RNA/DNA雜交內部引物退 火，然后通過鏈置換對其進行延伸。重復上述過程以擴增目標DNA (圖2)。[48]本發(fā)明的另一方面是一種檢測核酸的方法，該方法包括同時擴增核酸和信 號探針以便檢測擴增產物。[49]首先對用于檢測目標核酸的核酸樣本、外部引物對和RNA/DNA雜交內 部引物對的混合物進行變性，以分別產生單鏈DNA。將變性后的混合物冷卻 到等溫溫度，并添加包含DNA聚合酶、Rnase和DNA/RNA/DNA雜交探針 的酶促反應混合物溶液。然后，將外部引物對和RNA/DNA雜交內部引物對與 冷卻到擴增溫度的反應溶液中的目標核酸一起退火。[50]優(yōu)選地，外部引物對包含更靠近目標核酸兩端的序列的互補序列，并且內 部引物對包含更靠近目標核酸中間的序列。在此情況下，與外部引物相比，內 部引物對沿DNA鏈延伸的正方向退火。使用能夠進行鏈置換的DNA聚合酶 延伸退火后的外部引物和內部引物，并在外部引物沿著模板(目標核酸)延伸 時，位于延伸正方向的內部引物和從內部引物延伸的DNA鏈與模板(目標核 酸)分離，從而導致鏈置換。最后，將獲得分別通過內部引物和外部引物延伸 的單鏈DNA的擴增產物。[51]根據本發(fā)明，探針信號的擴增與核酸等溫擴增同時執(zhí)行。在將使用核酸等 溫擴增來擴增的目標DNA與DNA/RNA/DNA雜交探針一起退火以形成 RNA/DNA雜交雙鏈以后，DNA/RNA/DNA雜交探針的RNA區(qū)域被RnaseH 的活動所消化。然后，RNA消化的探針的信號被激活，以將探針與目標DNA 分離，然后結合要使用RNaseH來消化和分離的新DNA/RNA/DNA雜交探 針。重復上述循環(huán)以擴增探針信號(圖3)。[52]在本發(fā)明中，外部引物與目標核酸的序列互補，并優(yōu)選地具有15~30個 堿基，與外部引物互補的目標核酸序列優(yōu)選地為與內部引物互補的目標核酸序 列的相鄰序列(堿基差為1~60個堿基對)，并且與外部引物互補的目標核酸序 列優(yōu)選地為比與內部引物互補的目標核酸序列更靠近目標核酸的第3'端的序 列。[53]在本發(fā)明中，RNA/DNA雜交內部引物是其中的oligoRNA與oligoDNA 結合在一起的引物，其第5'端優(yōu)選地與目標核酸的堿基序列不互補，并且其 第3'端與目標核酸的堿基序列互補。優(yōu)選地，RNA/DNA雜交內部引物由 20-45個堿基組成，其中oligoRNA為15 25個堿基，oligoDNA為5 20個堿基。/DNA雜交內部引物中的oligoRNA與目標核酸的堿基序 列不互補，并且oligoDNA與目標核酸的堿基序列互補。[55]在本發(fā)明中，與RNA/DNA雜交內部引物互補的目標核酸序列優(yōu)選地包 括比與外部引物互補的目標核酸序列更靠近第5'端的序列，并且與內部引物 互補的目標核酸序列優(yōu)選地為與外部引物互補的目標核酸序列的相鄰序列(堿 基差為1~60個堿基對)。[56]優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的DNA/RNA/DNA雜交探針為寡核苷酸，其具有 與通過外部引物或RNA/DNA雜交內部引物擴增獲得的核酸擴增產物互補的 序列，并且DNA/RNA/DNA雜交探針的第5'端和第3'端由oligoDNA組 成，其中間由oligoRNA組成。[57]優(yōu)選地，DNA/RNA/DNA雜交探針由25~45個堿基組成，第5'端和第 3'端的oligoDNA區(qū)域分別由10~20個堿基組成，并且位于中間的oligoRNA 由4~6個堿基組成。[58]使用通過低聚金納米探針雜交實現的交聯凝集，可以通過溶液中的吸收度 變化來檢測根據本發(fā)明擴增的信號探針(Mirkin等人，Nature, 382:607-609， 1996年)。在此情況下，優(yōu)選地使用標記了第3'端的探針，以便防止 DNA/RNA/DNA雜交探針被DNA聚合酶延伸，使用標記有磷酸鹽的探針則 更佳。[59]其第3'端和第5'端與金納米微粒共軛的低聚金納米探針在水溶液中在 530納米表現出最大的吸收度，但是當具有與低聚金納米探針互補的序列的信 號探針存在時，金納米探針通過雜交進行交聯以引起金納米探針凝集，從而產 生最大的吸收度變化。通過測量530納米和700納米的吸收度變化比率，可 以確認探針的存在。[60]根據本發(fā)明的方法擴增的信號探針可以使用微孔板中的辣根過氧化物酶 進行檢測(Bekkaoui等人，Diagn. Microbiol Infect. Dis.， 34:83-93， 1999年)。 DNA/RNA/DNA雜交探針的端優(yōu)選地使用熒光材料和生物素進行標記。在使用 微孔將探針與熒光材料和生物素結合——其中微孔使用與生物素選擇性地綁定 的鏈霉卵白素和與選擇性地綁定到熒光材料的抗熒光材料共軛的HRP(辣根過 氧化物酶)進行表面處理——之后，清洗得到的混合物，然后執(zhí)行TMB (四 硝基聯苯胺，是HRP的基質)反應以測量465納米的吸收度變化比，從而可 以確認探針的存在性，但不僅限于此。除了熒光材料和生物素外，還可以使用 標記，該標記與使用2,4-二硝基乙酰苯胺或地高辛選擇性地與上述物質結合的抗體共軛。[61]本發(fā)明中使用的DNA聚合酶是能夠沿著DNA模板延伸核酸引物的酶， 并且應該能夠將多核苷酸鍵中的核酸鏈替換為替代鏈。本發(fā)明中可以使用的 DNA多聚酶優(yōu)選地為已知能夠進行鏈置換的BstDNA多聚酶、Bca DNA多 聚酶、exo(-) vent DNA多聚酶、exo(-) Deep vent DNA多聚酶、exo(-)PfuDNA 多聚酶或pi29DNA多聚酶等等，并優(yōu)選使用熱穩(wěn)定的DNA多聚酶以實現快 速和高效的反應。[62]本發(fā)明中使用的Rnase —般消化5'RNA區(qū)域，并特異地消化RNA/DNA 雜交的RNA鏈，不降級單鏈RNA并使用RNaseH則更佳。[63]在本發(fā)明中，優(yōu)選地，擴增反應在能夠對本發(fā)明的引物和模板DNA退火 并且不會實質性抑制所使用的酶活動的溫度下執(zhí)行。優(yōu)選地，執(zhí)行擴增的溫度 為30~75°C， 37~70°C更佳，最佳的是50~65°C。[64]本發(fā)明的核酸熱擴增具有高度的特異性，因為它使用附加的外部引物，而 傳統(tǒng)方法則使用單個RNA/DNA雜交引物(美國專利第6,251,639號)。此外， 由于將替代外部引物的內部引物用作新模板，可以通過以指數的方式擴增來顯 著提高擴增效率。[65]此外，傳統(tǒng)方法在使用單一 RNA/DNA雜交引物來擴增目標堿基序列時， 使用阻止擴增的單獨阻斷劑或模板切換寡核苷酸(TSO)來擴增特定的區(qū)域， 相反，本發(fā)明方法的優(yōu)點在于，可以使用一對正引物和反引物來僅擴增所需的 區(qū)域，而無需使用單獨的阻斷劑或TSO。[66]在一方面，本發(fā)明方法的優(yōu)點在于，可以同時執(zhí)行核酸的擴增和檢測，因 為通過將擴增的DNA作為模板來擴增信號探針，從而重復執(zhí)行結合和分離 DNA/RNA/DNA雜交探針的循環(huán)，這樣核酸和信號探針的擴增可以在單管中同 時完成。[67]在一方面，本發(fā)明方法的優(yōu)點在于，當Rnase的反應活動高于DNA聚 合酶的引物延伸活動時，不需要考慮傳統(tǒng)方法中出現的問題，因為本發(fā)明中使 用的RNA/DNA雜交內部引物的RNA區(qū)域具有與模板不互補的序列。[68]本發(fā)明的核酸等溫擴增的另一個方面在于，當在第一次引物延伸和鏈置換 反應之后將新合成的擴增產物用作新模板時，與模板不互補的RNA區(qū)域充當 與引物互補的模板，以提高引物的退火溫度，從而提高擴增效率，以及防止形 成引物二聚物以提高擴增產物的純度。[69]本發(fā)明的核酸等溫擴增方法和檢測方法可以簡單快速地實現擴增，因為采用了在恒溫下實施反應的一步式方法，并且由于目標核酸和信號探針的等溫擴 增，因此不需要單獨的傳熱器。此外，與傳統(tǒng)方法相比，通過使用兩對引物和 探針，該方法準確地僅擴增目標核酸，以及擴增信號探針，從而具有優(yōu)異的效 率。[70]再一方面，本發(fā)明的核酸等溫擴增方法和檢測方法在單管中實施，從而可 以大批量地處理以實現實時的核酸檢測。此類優(yōu)點可以最小化污染所致的附加 反應的風險，該風險會限制擴增技術的廣泛使用。[71]從樣本中的DNA提取開始，根據本發(fā)明的核酸等溫擴增方法需要大約1 小時來完成擴增，如果DNA提取已經完成，則需要大約40分鐘，從而產生 執(zhí)行快速擴增反應的優(yōu)點。示例[72]下面將通過示例更加詳細地說明本發(fā)明。然而，本領域中的技術人員不難 看出，這些示例僅用于說明目的，不應將其視為對本發(fā)明范圍的限制。[73]示例1:核酸等溫擴增[74]使用XDNA (TaKaRaBioInc.， 3010， 0.3微克/毫升)作為目標核酸，外 部引物和RNA/DNA雜交內部引物通過參照入DNA (GenBank NoJ02459)的 整個堿基序列和傳統(tǒng)方法制備而成(Biochem. Biophy. Res. Comm., 289:150， 2001年)。[75]外部引物的設計方式為包含與XDNA互補的序列，并且這些序列為SEQ ID NO: 1或2，如下所示SEQ ID NO: 1: 5'-GGACGTCAGAAAACCAGAA國3'SEQ ID NO: 2: 5'陽GGCAGTGAAGCCCAGAT-3'[76] RNA/DNA雜交內部引物的設計方式為其oligoRNA區(qū)域具有與X DNA 不互補的序列，其oligoDNA區(qū)域具有與XDNA互補的序列，并且這些序列 為SEQ ID NO: 3和4，如下所示(oligoRNA區(qū)域帶有下劃線)SEQ ID NO: 3:5'-UAAGAGAUCGCCCGUCAGCCGCTCCGATCACCCTCGCAAAC-3' SEQ IDNO:4:5'誦CAACAUGACCGACGCUUGCCCGCGCCACGCTCCTTAATCTG-3'制備包含外部引物對、內部引物對和目標核酸的反應混合物。將10 mM的 (NH4)2S04、 10 mM的MgS04、4mM的氯化鉀、分別0.5 mM的每種dNTP (Fermentas生產)、0.5 mM的DTT、 0.1微克的BSA、 0.1 ^iM的外部引物 對、0.5^iM的內部引物對和10毫微克的XDNA添加到20 mM的Tris-Hcl (pH8.5)緩沖液，以制備反應混合物。將該反應混合物在95°C下變性5分鐘， 在63°C下冷卻5分鐘，并添加酶促反應混合物溶液以達到最終用于DNA 擴增的20微升體積，然后在63°C下實施1小時的等溫擴增。[78]酶促反應混合物溶液的成分如下0.3微克的T4基因32蛋白(USB生 產)、6個單位的Rnase抑制劑(Inrton生產)、0.5個單位的RNaseH(Epicentre 生產)和30個單位的BstDNA聚合酶(NEBM0275M)。[79]另一方面，作為對照，使用了無目標核酸(入DNA)的酶促反應混合物溶 液和無外部引物和/或內部引物的反應混合物。[80]將擴增反應后取得的6微升反應溶液與負載緩沖液混合，并在包含溴化 乙錠的1.8%的瓊脂糖膠上進行電泳，然后使用紫外透射儀上的條帶確定擴增 效率。[81]如圖4所示，結果確認了與未添加XDNA的樣本和未添加內部引物和/ 或外部引物的樣本相比，添加了 XDNA、外部引物和內部引物的樣本中的目標 核酸的擴增產物顯著增加。[82]示例2:核酸與E.coli0157:H7的分離[83]在需氧條件下、在37 。C下、在適當培養(yǎng)基(胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)液)中 培養(yǎng)E.coli0157:H7(KCCM 40406)，并且每小時從中取一次細胞培養(yǎng)液，以測 量吸收度和細胞數量。在液體培養(yǎng)基中連續(xù)實施細胞培養(yǎng)液稀釋技術之后，使 用Helber細胞計數器來根據吸收度枚舉細胞數。使用Intron Inc生產的 G-spin Genomic DNA分離系統(tǒng)(產品編號:17121)執(zhí)行E. coli 0157:H7中的核酸分離。該分離過程如下在對數生長期取走1.0毫升細菌培養(yǎng)液，以調整到107個細胞/毫升的濃度，向通過在13,000g下離心過濾2分鐘獲得的細 胞添加300毫升的G緩沖液以重懸，然后在65 。C下保持15分鐘，并向 其添加250毫升的結合緩沖液以順利懸浮。結合緩沖液包含Rnase溶液和蛋 白酶K溶液。將所得到的混合物移至離心柱，并在13,000g下離心1分鐘。 然后將500毫升的洗滌液A添加到離心柱，并在13,000 rpm下離心1分鐘 以進行洗滌。然后，將500毫升的洗滌液B添加到離心柱，并在13，000g下 離心1分鐘。將該柱移至新的管，并在100毫升的洗脫液均勻浸濕柱膜，然后在室溫下保持3分鐘，接著在13,000g下離心2分鐘，從而獲得核酸。在 -80°C下保存所獲得的核酸以待用。[84]示例3:金納米膠體的制備[直徑42納米][85]使用本領域中已知的傳統(tǒng)方法執(zhí)行金納米顆粒的合成(Liu等人，J. Am.Chem. Soc, 126:12299， 2004年)。該方法如下將200毫升的0.3 nM四 氯金酸(美國Aldrich公司生產)添加到燒瓶中，并加熱攪拌，然后快速逐滴 滴入1.8毫升的38.8 mM檸檬酸鈉(美國Aldrich公司生產)。將顏色從淺黃 變?yōu)樯钭仙姆磻旌衔锛訜?0分鐘并攪拌15分鐘，同時將其冷卻至室溫 并變?yōu)闇\紅色，從而獲得直徑為42納米的金納米顆粒溶液，其在520納米表 現出最大的紫外吸收度。[86]示例4:信號探針的制備(3'-和5'-硫醇寡核苷酸修飾的金納米顆粒)[87]通過參照本領域中已知的傳統(tǒng)方法來制備信號探針(Nucleic Acids Res.， 33:el68， 2005年；J. Biotechnol， 119:111， 2005年)。分別將SEQIDNO:5和 6的硫醇寡核苷酸添加到先前在示例3中制備的42納米金納米顆粒至 3mM的濃度，并用箔包覆，然后在室溫下保持16小時。將pH7.0的0.1 M 磷酸(KH2P04/K2HP04)添加到金納米顆粒溶液以制備10 mM的磷酸溶液， 并向該溶液添加2M的氯化鈉以制備0.05M的氯化鈉，最后在24小時以后 制備0.3M的氯化鈉。緩慢地將鹽溶液逐滴滴入該溶液中。在24小時以后， 通過在8,000 rpm下離心15分鐘除去上清液，以便消除過量的硫醇DNA。 使用10mM的磷酸(pH7.0)和0.1M的氯化鈉將所獲得的混合物洗滌兩次， 最后將其溶解在相同的10mM磷酸(pH7.0)和0.1M的氯化鈉中，以獲得使 用金納米顆粒標記的探針。SEQ ID NO: 5: 5 '畫HS-(CH2)6- AGTGAC AAAACGC AG-3'SEQ ID NO: 6: 5'-AACTGCTCTGGATGC-(CH2)3 -SH-3'[88]示例5:用于檢測金納米探針的目標核酸和信號探針的擴增[89]參照E.coli0157:H7(KCCM 40406)的整個堿基序列，制備用于選擇性地 擴增特定基因區(qū)域的引物(SEQIDNOs:7-10)和探針(SEQ ID NO: 11)。SEQIDNO: 7: 5'-CGTTCCGGAATGCAAATC國3'SEQ ID NO: 8: 5'-CATCGTATACACAGGAGC-3'SEQ ID NO: 9:5'曙TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT-SEQIDNO: 10:5'-CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATT CT國3，SEQIDNO: 11:[卯]引物SEQ ID NO: 7和8是具有與Eascherichia. coli 0157:H7互補的序 列的外部引物，引物SEQIDNO:9和10是具有與Eascherichia. coli 0157:H7互補的序列和非特異序列的內部引物。SEQIDNO:ll是用于執(zhí)行信號探針擴 增的探針，該信號探針是DNA/RNA/DNA雜交探針，其第3'端使用磷酸組 來標記以便防止DNA延伸反應。在上述序列中，帶下劃線的部分是RNA堿 基序列。[91]為了將引物與所需的核酸一起退火，將包含外部引物((SEQIDNO:7和 8)、內部引物(SEQIDNO:9和10)的反應混合物在95 。C下變性5分鐘， 并在63 °C下冷卻5分鐘。[92]反應混合物由以下成分組成5mM的Tris-Hcl (pH 8.5)、 10mM的 (NH4)2S04、 10mM的MgS04、 4mM的氯化鉀、分別0.5 mM的每種dNTP(Fermentas生產)、2.9 mM的DTT、 0.1毫克的BSA、 10mM的EGTA、 50mM的精胺、0.08mM的外部引物、0.126 mM的內部引物和1毫微克的E. coli0157:H7DNA。[93]然后，在將酶促反應混合物溶液添加到已冷卻的反應混合物以達到最終的 20微升體積后，在63 °C下實施40分鐘的等溫擴增，直到達到對數生長期。 酶促反應混合物溶液由以下成分組成0.3毫克的T4基因32蛋白(USB生 產)、6個單位的Rnase抑制劑(Inrton生產)、0.5個單位的RNaseH(Epicentre 生產)、20個單位的Bst DNA聚合酶(NEBM0275M)和 1納米的 DNA-RNA-DNA雜交探針。作為示例的對照物，使用了無目標核酸的核酸。[94]示例6:金納米探針聚合的檢測[95]將使用示例4中制備的金納米顆粒來標記探針(SEQIDNO:5和6)和 10mM的磷酸添加到示例5中獲得的1毫升擴增產物中，然后添加0.5M的 氯化鈉以形成最終的50毫升反應溶液。測量530納米和700納米的吸收度 值，以計算OD530/OD700比率，從而將試驗樣本與對照樣本做比較。值之間的差越大，結果就越有效(圖5和圖6)。[96]如圖5和圖6所示，結果確認，在存在信號探針(其具有與金納米探針 互補的堿基序列)的試驗樣本中，金納米探針通過雜交交聯引起金納米探針聚 合，從而改變了最大吸收度。[97]示例7:用于HRP檢測的目標核酸和信號探針擴增[98]參照E.coli0157:H7(KCCM 40406)的整個堿基序列，制備用于選擇性地 擴增特定基因區(qū)域的引物(SEQIDNOs:7-10)和探針(SEQIDNO: 12)。SEQ ID NO: 7: 5'醫(yī)CGTTCCGGAATGCAAATC-3'SEQ ID NO: 8: 5'誦CATCGTATACACAGGAGC-3'SEQIDNO: 9:5'-TACCTTAAGGCATGGGCTGACTACTACTCACTGGTTTCATCATATCT-S,SEQIDNO: 10:5'畫CTGCTACGCGTGTGAAGATGACCCTGAACAGTGCCTGACGAAATT CT-3'SEQIDNO: 12:5 '-熒光素-TGTGAC AGTGACAAAACGCAGAACT-GCT-生物素畫3，[99]引物SEQIDNO: 7和8是具有與Eascherichia. coli 0157:H7互補的序 列的外部引物，引物SEQIDNO:9和10是具有與Eascherichia. coli 0157:H7 互補的序列和非特異序列的內部引物。SEQIDNO: 12是用于執(zhí)行信號探針擴 增的DNA/RNA/DNA雜交探針，其第3 '端使用生物素來標記，第5 '端使 用熒光素來標記。帶下劃線的部分是RNA堿基序列。[100]為了將引物與所需的核酸一起退火，將包含外部引物((SEQIDNO:7和 8)、內部引物(SEQIDNO:9和10)的反應混合物在95°C下變性5分鐘， 并在63 °C下冷卻5分鐘。[101]反應混合物由以下成分組成5mM的Tris-Hcl (pH 8.5)、 10mM的 (NH4)2S04、 10mM的MgS04、 4mM的氯化鉀、分別0.5 mM的每種dNTP(Fermentas生產)、2.9 mM的DTT、 0.1毫克的BSA、 10mM的EGTA、 50mM的精胺、0.08mM的外部引物、0.126mM的內部引物和1毫微克的E. coli0157:H7DNA。[102]然后，在將酶促反應混合物溶液添加到已冷卻的反應混合物以達到最終的 20微升體積后，在63°C下實施40分鐘的等溫擴增，直到達到對數生長期。 酶促反應混合物溶液由以下成分組成0.3毫克的T4基因32蛋白(USB生 產)、6個單位的Rnase抑制劑(Inrton生產)、0.5個單位的RNaseH(Epicentre 生產)、20個單位的Bst DNA聚合酶(NEBM0275M)和1納米的 DNA-RNA-DNA雜交探針。作為示例的對照物，使用了無目標核酸的核酸。[103]示例8:通過HRP進行檢測[104]將170毫升的PBST結合緩沖液添加到示例7中獲得的擴增產物以制 備由下列成分組成的反應混合物135mM的氯化鈉、2.7mM的氯化鉀、8.1mM 的磷酸二氫鈉、1.5mM的磷酸二氫鉀、0.05%的吐溫20、 1/1000稀釋的 anti-F-HRP (PerkinElmer生產，辣根過氧化酶共軛抗熒光素抗體)。[105]將該反應混合物移入抗生蛋白鏈菌素涂層微孔板(Roche公司生產)，并 使其在37°C和200rpm下反應10分鐘。去除孔中的上清液，并添加300毫 升的PBST洗滌緩沖液進行洗滌，其中PBST洗滌緩沖液具有與上述結合緩 沖液相同的成分，只不過去除了抗體。向洗滌后的孔添加200毫升的HRP基 質3,3'，5，5'-四甲基聯苯胺(Bio-Rad生產，TMB)，在暗處進行顯色，然后添加 100毫升的1NH2S04以停止反應。[106]為了確定樣本和對照品的有效性，使用酶標儀(Zenuth生產，340rt)對465 納米的吸收度值進行比較?？梢源_定值之間的差越大，有效性越高。[107]如圖7和圖8所示，結果確認使用熒光素標記的探針的熒光沒有被與存 在擴增產物的試驗樣本中的抗熒光素共軛的HRP (辣根過氧化物酶)顯色。工業(yè)適用性[108]本發(fā)明提供一種在等溫下快速和準確地擴增目標核酸的方法，以及一種檢 測核酸的方法，其包括同時執(zhí)行核酸和信號探針的擴增。與傳統(tǒng)方法相比，根 據本發(fā)明的方法非常方便，可以快速和準確地擴增目標核酸而沒有污染風險， 并且可以同時擴增信號探針，使其可應用于各種基因組項目，例如病原體的檢 測和鑒別、導致預定表現型的基因改造的檢測、遺傳性疾病的檢測或致病敏感 性的確定、基因表達的評價，并適用于基因組項目，從而對于分子生物學研究 和疾病診斷非常有用。
權利要求
1. 一種目標核酸等溫擴增方法，該方法包括(a)對反應混合物變性，該混合物包含(i)目標核酸，(ii)具有與目標核酸互補的堿基序列的外部引物對，以及(iii)具有與目標核酸部分互補的堿基序列的RNA/DNA雜交內部引物對；以及(b)在將酶促反應混合物溶液添加到步驟(a)中變性的反應混合物以后，在等溫下擴增所述目標核酸，其中酶促反應混合物溶液包含能夠進行鏈置換的和DNA聚合酶。
2. 如權利要求1所述的目標核酸等溫擴增方法，其中外部引物對系由下 列各物組成的群組中選擇的任何一種物質oligoDNA、oligoRNA和雜交oligo RNA/DNA。
3. 如權利要求1所述目標核酸等溫擴增方法，其中RNA/DNA雜交內部 引物對的設計方式為其RNA區(qū)域具有與目標核酸不互補的堿基序列，其 DNA區(qū)域具有與目標核酸互補的堿基序列。
4. 如權利要求1所述的目標核酸等溫擴增方法，其中DNA聚合酶為熱 穩(wěn)定的DNA聚合酶。
5. 如權利要求4所述的目標核酸等溫擴增方法，其中熱穩(wěn)定的DNA聚 合酶系由下列各物組成的群組中選擇的任何一種物質BstDNA聚合酶、exo(-) vent DNA聚合酶、exo(-) Deep vent DNA聚合酶、exo(-) Pfu DNA聚合酶和 BcaDNA聚合酶。
6. 如權利要求1所述的目標核酸等溫擴增方法，其中Rnase為 RNaseH。
7. 如權利要求1所述的目標核酸等溫擴增方法，其中等溫擴增在 50~65°C下實施。
8. —種檢測核酸的方法，該方法包括-(a) 對反應混合物變性，該混合物包含(i)用于檢測目標核酸的核酸樣本， (ii)具有與目標核酸互補的堿基序列的外部引物對，以及(iii)具有與目標核酸 部分互補的堿基序列的RNA/DNA雜交內部引物對；(b) 在將酶促反應混合物溶液添加到步驟(a)中變性的反應混合物以后， 在等溫下擴增所述目標核酸和所述探針信號，其中酶促反應混合物溶液包含能 夠進行鏈置換的Rnase和DNA聚合酶，并且NA/RNA/DNA雜交探針具有 與通過外部引物和內部引物對產生的擴增產物互補的堿基序列；以及(C)使用擴增的探針信號來檢測目標核酸。
9. 如權利要求8所述的核酸檢測方法，其中外部引物對系由下列各物質 組成的群組中選擇的任何一種物質oligo DNA、 oligo RNA和雜交oligo RNA/DNA。
10. 如權利要求8所述核酸檢測方法，其中RNA/DNA雜交內部引物對 的設計方式為其RNA區(qū)域具有與目標核酸不互補的堿基序列，其DNA區(qū)域 具有與目標核酸互補的堿基序列。
11. 如權利要求8所述的核酸檢測方法，其中RNA/DNA雜交內部引物 對的設計方式為DNA/RNA/DNA雜交探針由25~45個堿基組成。
12. 如權利要求11所述的核酸檢測方法，其中DNA/RNA/DNA雜交探 針的設計方式為其外部DNA區(qū)域的長度由10 20個堿基組成，其內部RNA 區(qū)域的長度由4~6個堿基組成。
13. 如權利要求8所述的核酸檢測方法，其中DNA/RNA/DNA雜交探針 的兩端使用標記來進行標注。
14. 如權利要求13所述的核酸檢測方法，其中標記系由下列各物質組成 的群組中選擇的任何一種物質生物素、熒光素、地高辛或二硝基乙酰苯胺。
15. 如權利要求13所述的核酸檢測方法，其中DNA/RNA/DNA雜交探 針具有粘附到其第3'端的磷酸鹽組。
16. 如權利要求8所述的核酸檢測方法，其中DNA聚合酶為熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶。
17. 如權利要求16所述的核酸檢測方法，其中熱穩(wěn)定的DNA聚合酶系 由下列各物質組成的群組中選擇的任何一種物質BstDNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶和BcaDNA聚合酶。
18. 如權利要求8所述的核酸檢測方法，其中Rnase為核RNaseH。
19. 如權利要求8所述的核酸檢測方法，其中目標核酸和探針信號的擴增 在50~65°C下實施。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸等溫擴增方法和一種核酸檢測方法，其特征在于同時等溫擴增核酸和信號探針，具體地說，涉及一種使用外部引物和RNA/DNA雜交引物對的目標核酸等溫擴增方法，以及一種通過使用外部引物對、RNA-DNA雜交引物對和DNA-RNA-DNA雜交探針來同時擴增核酸和信號探針的擴增產物檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比，根據本發(fā)明的方法非常方便，可以快速和準確地擴增目標核酸而沒有污染風險，并且可以同時擴增信號探針，使得此方法可應用于各種基因組項目，例如病原體的檢測和鑒別、導致預定表現型的基因改造的檢測、遺傳性疾病的檢測或致病敏感性的確定、基因表達的評價，并適用于基因組項目，從而對于分子生物學研究和疾病診斷非常有用。
文檔編號C12Q1/68GK101283107SQ200680037747
公開日2008年10月8日 申請日期2006年9月8日 優(yōu)先權日2005年10月14日
發(fā)明者鄭芝媛, 金云玉, 金珉煥 申請人:瑞寶基因有限公司