專利名稱：產(chǎn)l－谷氨酸細菌和生產(chǎn)l－谷氨酸的方法
本申請是申請日為2001年7月5日，申請?zhí)枮?1121741.3，發(fā)明名稱為“產(chǎn)L-谷氨酸細菌和生產(chǎn)L-谷氨酸的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及L-谷氨酸產(chǎn)生菌和使用該細菌通過發(fā)酵方法生產(chǎn)L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一種重要的食用、醫(yī)用氨基酸。
相關(guān)技術(shù)介紹迄今，L-谷氨酸一直通過發(fā)酵方法生產(chǎn)，主要使用產(chǎn)L-谷氨酸的所謂棒狀細菌，它們屬于短桿菌屬、棒桿菌屬或微桿菌屬或者其突變菌株(氨基酸發(fā)酵，Gakkai Shuppan Center，pp.195-215，1986)。作為這種棒狀細菌，從自然界中分離的野生型菌株和其突變體被用于提高產(chǎn)率。
已知，發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸時，也產(chǎn)生副產(chǎn)物海藻糖。因此，已經(jīng)開發(fā)了降解或代謝產(chǎn)生的海藻糖的技術(shù)。這些技術(shù)包括使用其在海藻糖上的增殖能力已被誘發(fā)的棒狀細菌發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸的方法(日本專利公開(Kokai)5-276935)，以及使用其中編碼海藻糖代謝酶的基因已被擴增的棒狀細菌發(fā)酵審查氨基酸的方法(韓國專利公開(B1)號165836)。但是，在產(chǎn)L-氨基酸的細菌中已知海藻糖的形成的方法是已知的。
在大腸桿菌中，海藻糖的合成是通過海藻糖-6-磷酸合酶催化的。已知該酶由otsA基因編碼。此外，也有otsA基因破壞的大腸桿菌菌株幾乎不在高滲培養(yǎng)基中生長的報導(H.M.Glaver等，細菌學雜志，170(6)，2841-1849(1998))。但是，otsA基因破壞和物質(zhì)產(chǎn)生之間的關(guān)系尚不清楚。
另一方面，盡管在屬于短桿菌屬的細菌中，已知微黃短桿菌有treY基因，但尚未發(fā)現(xiàn)短桿菌中存在otsA基因。對于屬于分支桿菌屬的細菌，已知存在一種由treS基因編碼產(chǎn)物(海藻糖合酶(TreS))催化的反應(yīng)介導的途徑，該基因是一種與otsS基因和treY基因不同的編碼海藻糖生物合成途徑的酶的基因(De Smet K.A.等，微生物學，146(1)，199-208(2000))。但是，該途徑利用麥芽糖作為底物，與一般的利用葡萄糖、果糖或蔗糖作為起始原料的L-谷氨酸發(fā)酵無關(guān)。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是通過抑制副產(chǎn)物海藻糖的生成，提高使用棒狀細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸時L-谷氨酸的生產(chǎn)效率。
發(fā)明人進行了深入的研究以實現(xiàn)上述目的。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)屬于短桿菌屬的細菌同結(jié)核分支桿菌一樣含有otsA基因和treY基因，L-谷氨酸的生產(chǎn)效率通過破壞這些基因的至少一種得到提高。至此，完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了(1)具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌，其中，海藻糖合成能力降低或缺失。
(2)上述(1)中的棒狀細菌，其中，海藻糖合成能力通過向編碼海藻糖合成途徑的酶的染色體基因引入突變或破壞該基因來降低或缺失。
(3)上述(2)中的棒狀細菌，其中，編碼海藻糖合成途徑的酶的基因由編碼海藻糖-6-磷酸合酶、編碼麥芽寡糖基海藻糖(maltooligosyltrehalose)合酶的基因或二者組成。
(4)上述(3)中的棒狀細菌，其中，編碼海藻糖-6-磷酸合酶的基因編碼SEQ ID NO30的氨基酸序列，編碼麥芽寡糖基海藻糖合酶的基因編碼SEQ ID NO32的氨基酸序列。
(5)生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)前述(1)到(4)中任一項的棒狀細菌，以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸，并由培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。
(6)編碼下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO30的氨基酸序列的蛋白，(B)具有包括一個或幾個氨基酸殘基置換、缺失、插入或增加的SEQID NO30氨基酸序列并具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。
(7)上述(6)的DNA，其為以下(a)或(b)限定的DNA(a)含有包括SEQ ID NO29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列的DNA，(b)與包括SEQ ID NO29的核苷酸序列中至少核苷酸484-1938的核苷酸序列在嚴緊條件下可以雜交的DNA，與前述核苷酸序列具有55％或更大的同源性，并編碼具有海藻糖-6-磷酸合酶活性的蛋白。
(8)編碼下述(A)或(B)限定的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO32的氨基酸序列的蛋白，(B)具有包括一個或幾個氨基酸殘基置換、缺失、插入或增加的SEQID NO32氨基酸序列并具有麥芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。
(9)上述(8)的DNA，其為以下(a)或(b)限定的DNA(a)含有包括SEQ ID NO31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列的DNA，(b)與包括SEQ ID NO31的核苷酸序列中至少核苷酸82-2514的核苷酸序列在嚴緊條件下可以雜交的DNA，與前述核苷酸序列具有60％或更大的同源性，并編碼具有麥芽寡糖基海藻糖合酶活性的蛋白。
海藻糖-6-磷酸合酶活性是指催化UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸產(chǎn)生α，α-海藻糖-6-磷酸和UDP的反應(yīng)的活性，麥芽寡糖基海藻糖合酶活性是指催化麥芽戊糖產(chǎn)生麥芽寡糖基海藻糖的反應(yīng)的活性。
根據(jù)本發(fā)明，使用棒狀細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸時L-谷氨酸的生產(chǎn)效率可以通過抑制副產(chǎn)物海藻糖的生成得到提高。
優(yōu)選實施方案以下詳述本發(fā)明。
本發(fā)明的棒狀細菌是具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌，其中海藻糖合成能力降低或缺失。
在本發(fā)明中屬于棒桿菌屬的細菌是伯杰氏鑒定細菌學手冊第8版599頁(1974)中限定的一組微生物。這些細菌是好氣，革蘭氏陽性，不抗酸，不形成芽胞的桿菌，包括曾被分類為短桿菌屬但現(xiàn)在已歸入棒桿菌屬的細菌(國際系統(tǒng)細菌學雜志，41，255(1981))，并包括與棒桿菌屬密切相關(guān)、屬于短桿菌屬或微桿菌屬的細菌。這些棒狀細菌的實例如下。
嗜乙酰乙酸棒桿菌醋谷棒桿菌Corynebacterium alkanolyticum美棒桿菌谷氨酸棒桿菌百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)Corynebacterium melassecolaCorynebacyerium thermoaminogenes力士棒桿菌Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒桿菌)黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)Brevibacterium immariophilum乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)玫瑰色短桿菌解糖短桿菌生硫短桿菌產(chǎn)氨短桿菌(產(chǎn)氨棒桿菌)Brevibacterium albumBrevibacterium cerium嗜氨微桿菌具體而言，可舉出下列菌株嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870醋谷棒桿菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒桿菌ATCC15991谷氨酸棒桿菌ATCC13020，13032，13060百合花棒桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965Corynebacyerium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)力士棒桿菌ATCC13868Brevibacterium divaricatum(谷氨酸棒桿菌)ATCC14020黃色短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13826，ATCC14067Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13655，ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240
產(chǎn)氨棒桿菌(產(chǎn)氨短桿菌)ATCC6871Brevibacterium album ATCC15111Brevibacterium cerinum ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354這些棒狀細菌海藻糖合成能力的上述缺失或活性降低可以通過使用誘變處理或遺傳重組技術(shù)突變或破壞編碼海藻糖合成途徑的酶的基因來實現(xiàn)。這種突變可以是抑制編碼海藻糖合成途徑的酶的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的突變，或引起海藻糖合成途徑的酶消除或減少的突變。海藻糖合成途徑的酶的實例如海藻糖-6-磷酸合酶、麥芽寡糖基海藻糖合酶或兩者。
編碼海藻糖合成途徑的酶的基因可以通過利用同源重組進行基因置換來破壞。棒狀細菌染色體上的基因可以通過以下方法來破壞用含有編碼修飾的海藻糖合成途徑的酶的基因(缺失型基因)的DNA轉(zhuǎn)化棒狀細菌，使缺失型基因和染色體上的正常基因之間發(fā)生重組，修飾酶中一部分序列缺失，因而功能不正常。這種利用同源重組的基因破壞技術(shù)是成熟的技術(shù)?？删唧w提及的有，利用在棒狀細菌中不復制的線性DNA或環(huán)狀DNA的方法，利用含有溫度敏感型復制起點的質(zhì)粒的方法。但優(yōu)選利用在棒狀細菌中不復制的環(huán)狀DNA或含有溫度敏感型復制起點的質(zhì)粒的方法。
編碼海藻糖合成途徑的酶的基因的實例如otsA基因或treY基因，或者可以包括兩者。由于本發(fā)明已經(jīng)闡明了乳發(fā)酵短桿菌otsA基因和treY基因的核苷酸序列及其側(cè)翼區(qū)，這些基因可以通過制備基于這些序列的引物并使用這些引物和作為模板的乳發(fā)酵短桿菌染色體DNA進行PCR(聚合酶鏈反應(yīng)，見White，T.J.等，遺傳學趨勢，5，185(1989))方便地獲得。
包括下文實施例中獲得的乳發(fā)酵短桿菌的otsA基因的核苷酸序列和包括treY基因的核苷酸序列分別示于SEQ ID NO29和31中。并且，由這些核苷酸序列編碼的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO30和32。
otsA基因和treY基因也可以編碼在一個或多個位置上有一個或幾個氨基酸置換、缺失、插入或增加的蛋白，只要由其編碼的海藻糖-6-磷酸合酶或麥芽寡糖基海藻糖合酶未被破壞即可。盡管“幾個”氨基酸的數(shù)目取決于氨基酸殘基在蛋白三維結(jié)構(gòu)中的位置和類型，優(yōu)選1-40個，更優(yōu)選1-20個，更優(yōu)選1-10個。
上述編碼與海藻糖-6-磷酸合酶或麥芽寡糖基海藻糖合酶基本相同的蛋白的DNA可以通過以下方法獲得利用定點突變方法修飾核苷酸序列，使得一個或多個氨基酸殘基包括置換、缺失、插入、增加或倒轉(zhuǎn)。如上所述修飾的DNA也可以通過常規(guī)的已知突變處理得到。突變處理包括體外用諸如羥胺處理編碼海藻糖-6-磷酸合酶或麥芽寡糖基海藻糖的DNA的方法，和用紫外線或常用于誘變處理的誘變劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處理屬于埃希氏菌屬、攜帶編碼海藻糖-6-磷酸合酶或麥芽寡糖基海藻糖的DNA的細菌的方法。
如上所述的核苷酸置換、缺失、插入、增加或倒轉(zhuǎn)也包括天然存在的突變體或變異體，它們是基于具有海藻糖-6-磷酸合酶或麥芽寡糖基海藻糖的微生物的種或?qū)匍g差異或個體差異。
上述編碼與海藻糖-6-磷酸合酶或麥芽寡糖基海藻糖基本相同蛋白的DNA可以通過在合適的細胞中表達具有上述突變的DNA并檢查表達產(chǎn)物的海藻糖-6-磷酸合酶活性或麥芽寡糖基海藻糖活性得到。
編碼與海藻糖-6-磷酸合酶基本相同的蛋白的DNA也可以通過以下方法獲得分離在嚴緊條件下可以與具有相應(yīng)于SEQ ID NO29所示核苷酸序列的484-1938號核苷酸的核苷酸序列的DNA雜交的DNA，或可以與由與前述核苷酸序列具有55％或更高、優(yōu)選65％或更高、更優(yōu)選75％或更高同源性的核苷酸序列制備的探針雜交的DNA，所述DNA具有來自編碼海藻糖-6-磷酸合酶、具有一個突變的DNA或來自攜帶有該DNA的細胞的海藻糖-6-磷酸合酶活性。類似的，編碼與麥芽寡糖基海藻糖合酶基本相同的蛋白的DNA也可以通過以下方法獲得分離在嚴緊條件下可以與具有相應(yīng)于SEQ ID NO29所示核苷酸序列的82-2514號核苷酸的核苷酸序列的DNA雜交的DNA，或可以與由與前述核苷酸序列具有60％或更高、優(yōu)選70％或更高、更優(yōu)選80％或更高同源性的核苷酸序列制備的探針雜交的DNA，所述DNA具有來自編碼麥芽寡糖基海藻糖合酶、具有一個突變的DNA或來自攜帶有該DNA的細胞的海藻糖-6-磷酸合酶活性。
在本文中，“嚴緊條件”是指形成特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條件。要使用任何數(shù)值明確地表示該條件是困難的。但是，嚴緊條件包括具有高同源性的DNA如不低于55％的同源性優(yōu)選不低于60％的同源性的DNA彼此雜交，而低于上述水平的同源性彼此不雜交的條件?；蛘?，嚴緊條件可以是DNA在相當于DNA雜交的普通洗滌條件的鹽濃度下彼此雜交的條件，即1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS，60℃。
至于探針，也可使用各個基因的部分序列。這種探針也可以使用基于各個基因的核苷酸序列產(chǎn)生的寡核苷酸作為引物，含有各個基因的DNA片段作為模板，進行PCR制備。當長度約300bp的DNA片段用作探針時，雜交洗滌條件可以包括50℃，2×SSC和0.1％SDS。
如上所述在上述條件下可雜交的基因包括在基因編碼區(qū)具有終止密碼子的基因，由于活性中心突變沒有活性的基因。但是，這些突變也可以將各個基因與可商購的表達載體連接并測定海藻糖-6-磷酸合酶活性或麥芽寡糖基海藻糖合酶活性來除去。
當otsA基因或treY基因被用來破壞棒狀細菌染色體上的這些基因時，編碼的海藻糖-6-磷酸合酶或麥芽寡糖基海藻糖合酶無需具有活性。另外，用于基因破壞的otsA基因或treY基因可以是來自其它微生物的基因，只要它們可以與棒狀細菌的這些基因發(fā)生同源重組即可。例如，屬于埃希氏菌屬或分支桿菌屬細菌的otsA基因或?qū)儆诠?jié)桿菌屬的細菌、微黃短桿菌或?qū)儆诟鼍鷮俚募毦膖reY基因均為實例。
缺失型otsA基因或treY基因可以通過用限制酶切除含有這些基因之一的DNA片段或其部分的一定區(qū)域，以缺失編碼區(qū)或啟動子等表達調(diào)控序列的一部分。
而且，缺失型基因可以通過使用特別設(shè)計的引物進行PCR以缺失基因的一部分來獲得。此外，缺失型基因也可通過單核苷酸突變?nèi)缫拼a突變獲得。
以下敘述otsA基因的基因破壞。treY基因的基因破壞類似進行。
宿主染色體上的otsA基因可以如下所述用缺失型otsA基因取代。即，將缺失型otsA基因和卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素和鏈霉素等藥物抗性標記基因插入在棒狀細菌中不能自主復制的質(zhì)粒，以制備重組DNA。棒狀細菌可以用重組DNA轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化菌株在含有藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以獲得重組DNA被導入染色體DNA的轉(zhuǎn)化菌株。或者，可以使用穩(wěn)定敏感型質(zhì)粒作為質(zhì)粒，在溫度敏感型質(zhì)粒不能復制的溫度培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，從而獲得轉(zhuǎn)化菌株。
在如上所述重組DNA被整合進入染色體的菌株中，重組DNA引起與原來存在于染色體上的otsA基因序列的重組，將包括染色體otsA基因和缺失型otsA基因的兩個融合基因插入染色體，使得染色體DNA的其它部分(載體部分和藥物抗性基因)位于它們中間。
然后，為了在染色體DNA上僅留下缺失型otsA基因，通過兩個otsA基因的重組，從染色體DNA上消除一個拷貝的otsA基因和載體部分(包括藥物抗性基因)。這樣，正常otsA基因留在染色體DNA上，缺失型otsA基因被切除，或者相反，缺失型otsA基因留在染色體DNA上，而正常otsA基因被切除。通過PCR、雜交等檢查染色體DNA上的otsA基因的結(jié)構(gòu)，確認染色體DNA上留下的基因類型。
用于本發(fā)明的棒狀細菌除了海藻糖合成活性缺失或降低之外，也可以具有較高的催化L-谷氨酸生物合成的酶活性。催化L-谷氨酸生物合成的酶的實例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合酶、谷氨酸合酶、異檸檬酸脫氫酶、順烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸異構(gòu)酶等。
并且，在用于本發(fā)明的棒狀細菌中，通過從L-谷氨酸生物合成途徑分支催化產(chǎn)生非L-谷氨酸化合物的反應(yīng)的酶可以減少或缺失。這種酶的實例包括α-酮戊二酸脫氫酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乙酸激酶、乙酰羥肟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、L-谷氨酸脫羧酶、1-吡咯啉脫氫酶等。
此外，通過向具有L-谷氨酸生成能力的棒狀細菌中引入生物素活性抑制物如表面活性劑的溫度敏感型突變，該細菌在不存在生物素活性抑制物時在含有過量生物素的培養(yǎng)基中可以產(chǎn)生L-谷氨酸(參見WO96/06180)。作為這種棒狀細菌，可以提到WO 96/06180中公開的乳發(fā)酵短桿菌AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在工業(yè)技術(shù)院生命工學工業(yè)技術(shù)研究所(目前為獨立管理法人，國立先進工業(yè)科技研究所，國際專利生物材料保藏機構(gòu)，chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japen，郵政編碼305-5466)，保藏號為FERMP-14501。其后在1995年8月1日根據(jù)布達佩斯條約轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號為FERM BP-5189。
當具有L-谷氨酸生成能力海藻糖合成能力缺失或降低的棒狀細菌在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中可以積累L-谷氨酸。
用來生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)基是普通培養(yǎng)基，含有所需的碳源、氮源、無機鹽以及其他痕量有機營養(yǎng)。碳源可以是糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、blackstrap糖蜜和淀粉水解物；醇，如乙醇、肌醇；或有機酸，如乙酸、延胡索酸、檸檬酸和琥珀酸。
氮源可以是無機銨鹽，如硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨，氨，有機氮，如胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿和大豆水解物，氨氣，氨水等。
加入的無機離子(或其來源)是少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。至于微量有機營養(yǎng)，最好以合適的量加入所需的物質(zhì)如維生素B1、酵母提取物等。
優(yōu)選通過振蕩、攪拌通氣在好氣條件下培養(yǎng)16到72小時。培養(yǎng)溫度控制在30℃到45℃，pH控制在5到9?？梢约尤霟o機或有機酸性或堿性物質(zhì)、氨氣等調(diào)節(jié)pH。
從培養(yǎng)液中收集L-谷氨酸可以通過例如使用離子交換樹脂的方法、結(jié)晶等實現(xiàn)。具體來說，L-谷氨酸可以通過陰離子交換樹脂吸附或分離，或通過中和結(jié)晶。
實施例以下將參照具體實施例更具體地闡明本發(fā)明。
實施例1.乳發(fā)酵短桿菌otsA基因破壞菌株的構(gòu)建(1)otsA基因的克隆由于乳發(fā)酵短桿菌的otsA基因是未知的，通過利用其它微生物otsA基因的核苷酸序列為參考獲得該基因。埃希氏菌和分支桿菌的otsA基因已經(jīng)獲得了完整的核苷酸序列(Kassen I.等，基因，145(1)，9-15(1994)；DeSmet K.A.等，微生物學，146(1)，199-208(2000))。因此，參考由這些核苷酸序列推導的氨基酸序列，首先合成PCR引物P1(SEQ ID NO1)和P2(SEQ ID NO2)。DNA引物P1和P2分別相應(yīng)于大腸桿菌otsA基因核苷酸序列(GenBank入藏號X69160)的核苷酸1894-1913和2531-2549。它們也分別相應(yīng)于結(jié)核分支桿菌otsA基因(GenBank入藏號Z95390)的核苷酸40499-40518和41166-41184。
然后，使用引物P1和P2以及作為模板的乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA進行PCR，反應(yīng)循環(huán)條件為94℃0.5分鐘，50℃0.5分鐘和72℃4分鐘，重復30個循環(huán)。這樣，獲得了約0.6kbp的單一種類的擴增片段。該擴增片段使用Invitrogen生產(chǎn)的“原始TA克隆試劑盒”克隆進質(zhì)粒載體pCR2.1，得到pCotsA。然后，確定克隆片段的核苷酸序列。
根據(jù)以上獲得的otsA基因的部分片段的核苷酸序列，新合成DNA引物P10(SEQ ID NO8)和P12(SEQ ID NO10)，該部分片段側(cè)翼的未知區(qū)域使用“反向PCR”擴增(Triglia，T等，核酸研究，16，81-86(1988)；Ochman H.等，遺傳學，120，621-623(1988))。乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA用限制酶BamHI，BglII，ClaI，HindIII，KpnI，MluI，MunL，SalI或XhoI消化，使用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)自身連接。使用所得的DNA作為模板以及引物P10和P12進行PCR，反應(yīng)循環(huán)條件為94℃0.5分鐘，55℃1分鐘和72℃4分鐘，重復30個循環(huán)。然后，使用ClaI或BglII作為限制酶，每種情況下均獲得4kbp的擴增片段。這些擴增片段的核苷酸序列使用DNA引物P5到P9(SEQ IDNO3-7)和P11到P15(SEQ ID NO9-13)直接確定。這樣，確定了乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869 otsA基因的完整核苷酸序列，如SEQ IDNO29所示。該核苷酸序列編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO29和30。
上述otsA基因相對于大腸桿菌otsA基因(GenBank入藏號X69160)和結(jié)核分支桿菌otsA基因(GenBank入藏號Z95390)的序列同源性被分別確定，核苷酸序列的同源性分別為46.3％和55.9％，氨基酸序列的同源性分別為30.9％和51.7％。同源性使用“GENETIX-WIN”(SoftwareDevelopment)軟件根據(jù)Lipman-Person方法(Science，227，1435-1441(1985))計算。
(2)otsA基因破壞質(zhì)粒的制備為了通過破壞棒狀細菌中編碼海藻糖生物合成途徑的酶的基因檢查L-谷氨酸產(chǎn)率的改進效應(yīng)是否存在，制備otsA基因破壞質(zhì)粒。otsA基因破壞質(zhì)粒按如下所述制備。使用otsA基因克隆中構(gòu)建的質(zhì)粒pCotsA作為模板以及包括ClaI位點的引物P29(SEQ ID NO33)和P30(SEQID NO34)進行PCR，反應(yīng)循環(huán)為94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘和72℃8分鐘，重復30個循環(huán)。擴增的片段用ClaI消化，用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)自身連接，以構(gòu)建含有在大約中間部位有一個移碼突變(SEQ ID NO29的1259-1300核苷酸缺失)的otsA基因的pCotsAC質(zhì)粒。
(3)制備otsA基因破壞菌株使用基因破壞質(zhì)粒pCotsAC，通過電脈沖法轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)生菌乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869，選擇可以在含有20mg/L卡那霉素的CM2B培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化子。由于otsA基因破壞的質(zhì)粒pCotsAC沒有在乳發(fā)酵短桿菌中有功能的復制起點，所得的轉(zhuǎn)化子是使用經(jīng)歷了乳發(fā)酵短桿菌染色體和基因破壞質(zhì)粒pCotsAC上的otsA基因之間的同源重組的質(zhì)粒得到的。由如上所述獲得的同源重組菌株中，根據(jù)獲得的卡那霉素敏感性作為標記，選擇出由于再次發(fā)生的同源重組消除了基因破壞質(zhì)粒pCotsAC的載體部分的菌株。
由如上所述獲得的菌株中，選擇出引入了所需的移碼突變的菌株。選擇過程如下使用由卡那霉素敏感性菌株提取的染色體DNA作為模板以及引物P8(SEQ ID NO14)和P13(SEQ ID NO11)進行PCR，反應(yīng)循環(huán)為94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘和72℃1分鐘，重復30個循環(huán)，使用DNA引物對獲得的擴增片段測序，以確證otsA基因的無功能是由于引入了移碼突變。如上所述獲得的菌株被稱為ΔOA菌株。
實施例2treY基因破壞菌株的構(gòu)建(1)treY基因的克隆由于乳發(fā)酵短桿菌的treY基因是未知的，通過利用其它微生物treY基因的核苷酸序列為參考獲得該基因。節(jié)桿菌、短桿菌和根瘤菌屬的treY基因已經(jīng)獲得了完整的核苷酸序列(Maruta K.等，生物化學生物物理通報，1289(1)，10-13(1996)；Genbank入藏號AF039919；Maruta K.等，生物科學、生物技術(shù)與生物化學，60(4)，717-720(1996))。因此，參考由這些核苷酸序列推導的氨基酸序列，首先合成PCR引物P3(SEQ ID NO14)和P4(SEQ ID NO15)。DNA引物P3和P4分別相應(yīng)于節(jié)桿菌屬種treY基因核苷酸序列(GenBank入藏號D63343)的核苷酸975-992和2565-2584。它們也分別相應(yīng)于微黃短桿菌treY基因(GenBank入藏號AF039919)的核苷酸893-910和2486-2505。此外，它們也分別相應(yīng)于根瘤菌屬種treY基因(GenBank入藏號D78001)的核苷酸862-879和2452-2471。
然后，使用引物P3和P4以及作為模板的乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869染色體DNA進行PCR，反應(yīng)循環(huán)條件為94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘和72℃4分鐘，重復30個循環(huán)。這樣，獲得了約1.6kbp的單一種類的擴增片段。該擴增片段使用Invitrogen生產(chǎn)的“原始TA克隆試劑盒”克隆進質(zhì)粒載體pCR2.1。然后，確定該核苷酸序列為約0.6kb。
根據(jù)以上獲得的treY基因的部分片段的核苷酸序列，新合成DNA引物P16(SEQ ID NO16)和P26(SEQ ID NO26)，該部分片段側(cè)翼的未知區(qū)域使用“反向PCR”擴增(Triglia，T等，核酸研究，16，81-86(1988)；Ochman H.等，遺傳學，120，621-623(1988))。乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869的染色體DNA用限制酶BamHI，HindIII，SalI或XhoI消化，使用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)自身連接。使用所得的DNA作為模板以及引物P16和P26進行PCR，反應(yīng)循環(huán)條件為94℃0.5分鐘，55℃1分鐘和72℃4分鐘，重復30個循環(huán)。然后，使用HindIII或SalI作為限制酶，分別獲得0.6或1.5kbp的擴增片段。這些擴增片段的核苷酸序列使用DNA引物P16到P28(SEQ ID NO16-28)直接確定。這樣，確定了乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869 treY基因的完整核苷酸序列，如SEQ ID NO31所示。該核苷酸序列編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO31和32。
上述treY基因相對于節(jié)桿菌屬種treY基因(GenBank入藏號D63343)、微黃短桿菌treY基因(GenBank入藏號AF039919)和根瘤菌屬種treY基因(GenBank入藏號D78001)的序列同源性被分別確定，核苷酸序列的同源性分別為52.0％、52.3％和51.9％，氨基酸序列的同源性分別為40.9％、38.5％和39.8％。同源性使用“GENETIX-WIN”(SoftwareDevelopment)軟件根據(jù)Lipman-Person方法(Science，227，1435-1441(1985))計算。
(2)treY基因破壞質(zhì)粒的制備為了通過破壞棒狀細菌中編碼海藻糖生物合成途徑的酶的基因檢查L-谷氨酸產(chǎn)率的改進效應(yīng)是否存在，制備treY基因破壞質(zhì)粒。首先，使用引物P17(SEQ ID NO17)和P25(SEQ ID NO25)以及作為模板的ATCC 13869染色體DNA進行PCR，反應(yīng)循環(huán)為94℃0.5分鐘，60℃0.5分鐘和72℃2分鐘，重復30個循環(huán)。擴增的片段用EcoRI消化，用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)連接至EcoRI消化的pHSG299(TakaraShuzo)，獲得質(zhì)粒pHtreY。然后，該pHtreY用AflII(Takara Shuzo)消化，用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)平端化，用T4連接酶(TakaraShuzo)自身連接，以構(gòu)建含有在大約中間部位有一個移碼突變(SEQ IDNO31序列中1145核苷酸后插入4個核苷酸)的treY基因的pHtreYA質(zhì)粒。
(3)制備treY基因破壞菌株使用基因破壞質(zhì)粒pCtreYA，通過電脈沖法轉(zhuǎn)化L-谷氨酸產(chǎn)生菌乳發(fā)酵短桿菌ATCC 13869，選擇可以在含有20mg/L卡那霉素的CM2B培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化子。由于treY基因破壞質(zhì)粒pCtreYA沒有在乳發(fā)酵短桿菌中有功能的復制起點，所得的轉(zhuǎn)化子是使用經(jīng)歷了乳發(fā)酵短桿菌染色體和基因破壞質(zhì)粒pHtreYA上的treY基因之間的同源重組的質(zhì)粒得到的。由如上所述獲得的同源重組菌株中，根據(jù)獲得的卡那霉素敏感性作為標記，選擇出由于再次發(fā)生的同源重組消除了基因破壞質(zhì)粒pCtreYA的載體部分的菌株。
由如上所述獲得的菌株中，選擇出引入了所需的移碼突變的菌株。選擇過程如下使用DNA引物P19(SEQ ID NO19)和P25(SEQ ID NO25)進行PCR，反應(yīng)循環(huán)為94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘和72℃1.5分鐘，重復30個循環(huán)，使用DNA引物P21或P23對獲得的擴增片段測序，以確證treY基因的無功能是由于引入了移碼突變。如上所述獲得的菌株被稱為ΔTA菌株。
實施例3ΔOA菌株和ΔTA菌株產(chǎn)生L-谷氨酸能力的評價ATCC13869菌株、ΔOA菌株和ΔTA菌株各自如下培養(yǎng)以產(chǎn)生L-谷氨酸。這些菌株均通過培養(yǎng)在CM2B平板培養(yǎng)基上而更新，更新的菌株于31.5℃培養(yǎng)在每升純水中含有80克葡萄糖、1克磷酸二氫鉀、0.4克硫酸鎂、30克硫酸銨、0.01克七水硫酸亞鐵、0.01克七水硫酸錳、15毫升大豆水解物溶液、200微克鹽酸硫胺素、3微克生物素和50克碳酸鈣的培養(yǎng)基(用KOH調(diào)節(jié)pH為8.0)中。培養(yǎng)后，測定培養(yǎng)基中積累的L-谷氨酸的量和培養(yǎng)液稀釋51倍后在620納米的吸收值。結(jié)果示于表1。
otsA或treY基因破壞的乳發(fā)酵短桿菌菌株與親本菌株的生長情況類似，但與親本菌株相比，L-谷氨酸產(chǎn)生增加。
表1
序列表說明SEQ ID NO1otsA擴增引物P1SEQ ID NO2otsA擴增引物P2SEQ ID NO3引物P5SEQ ID NO4引物P6SEQ ID NO5引物P7SEQ ID NO6引物P8SEQ ID NO7引物P9SEQ ID NO8引物P10SEQ ID NO9引物P11SEQ ID NO10引物P12SEQ ID NO11引物P13SEQ ID NO12引物P14SEQ ID NO13引物P15SEQ ID NO14treY擴增引物P3SEQ ID NO15treY擴增引物P4SEQ ID NO16引物P16SEQ ID NO17引物P17
SEQ ID NO18引物P18SEQ ID NO19引物P19SEQ ID NO20引物P20SEQ ID NO21引物P21SEQ ID NO22引物P22SEQ ID NO23引物P23SEQ ID NO24引物P24SEQ ID NO25引物P25SEQ ID NO26引物P26SEQ ID NO27引物P27SEQ ID NO28引物P28SEQ ID NO29otsA基因核苷酸序列SEQ ID NO30OtsA氨基酸序列SEQ ID NO31TreY基因核苷酸序列SEQ ID NO32treY氨基酸序列SEQ ID NO33引物P29SEQ ID NO34引物P30
序列表<110>味之素株式會社<120>產(chǎn)L-谷氨酸細菌和生產(chǎn)L-谷氨酸的方法<130>OP1195<140>
<141>2000-07-<150>JP 2000-204256<151>2000-07-05<160>34<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<220>
<221>misc_特征<222>(3，9，18)<223>n＝a或g或c或t<400>1canathggnt tyttyytnca 20<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<220>
<221>misc_特征
<222>(3，11，19)<223>n＝a或g或c或t<400>2canarrttca tnccrtcnc19<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>3gaatcatcca tataagatcc ggc 23<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>4tagctttgta gttgttgcta accg 24<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>5agcgaacttg aggtttactt cccg 24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>6tgctggttcc tggcattttg cgcc 24<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>7tcgaacaatc tcttcacgcc 20<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>8gaatcccacc aaatctgcgc c 21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>9tgatgttgaa atgtttgggg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物
<400>10gatgtcatgc tggttacgcc 20<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>11caaagcacca gtgccgtcgc gg22<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>12tgttcgtttt cattcgcgtt gccg 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>13atagtttcct ggattgtttg gcgc 24<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物
<220>
<221>misc_特征<222>(9)<223>n＝a或g或c或t<400>14caraayccnt ggtggtgg 18<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<220>
<221>misc_特征<222>(3，6，15)<223>n＝a或g或c或t<400>15ggncgncgrt trtcnggrtc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>16cgagctcttc attgatggcg 20<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>17
gcagctacac acgagttggg 20<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>18gcaacaccta aatggttggg 20<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>19gcaagaagtc tacaagcgcc 20<210>20<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>20gccaacgtat tcacgg 16<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>21
tgatgaacca ctcgatcccc 20<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>22aagacaccac cttctaccgc 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>23caagtggaat tctgcagcgg 20<210>24<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>24cctcctacaa aacctgctgg g21<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>25
tcgcggatag cttttagggc 20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>26tgagttttta gaagactccc 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>27cgcttcagtg gtgttgtccc 20<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>28cgtaccactc cacggaaatt cccg 24<210>29<211>2369<212>DNA<213>Brevibacterium lactofermentum<220>
<221>CDS<222>(484)..(1938)
<400>29acagaatcag cgccggcaga gaaacgtcca aagactaatc agagattcgg tataaaggta 60aaaatcaacc tgcttaggcg tctttcgctt aaatagcgta gaatatcggg tcgatcgctt 120ttaaacactc aggaggatcc ttgccggcca aaatcacgga cactcgtccc accccagaat 180cccttcacgc tgttgaagag gaaaccgcag ccggtgcccg caggattgtt gccacctatt 240ctaaggactt cttcgacggc gtcactttga tgtgcatgct cggcgttgaa cctcagggcc 300tgcgttacac caaggtcgct tctgaacacg aggaagctca gccaaagaag gctacaaagc 360ggactcgtaa ggctaccagc taagaaggct gctgctaaga aaacgaccaa gaagaccact 420aagaaaacta ctaaaaagac caccgcaaag aagaccacaa agaagtctta agccggatct 480tat atg gat gat tcc aat agc ttt gta gtt gtt gct aac cgt ctg cca528Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro1 5 10 15gtg gat atg act gtc cac cca gat ggt agc tat agc atc tcc ccc agc576Val Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser20 25 30ccc ggt ggc ctt gtc acg ggg ctt tcc ccc gtt ctg gaa caa cat cgt624Pro Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg35 40 45gga tgt tgg gtc gga tgg cct gga act gta gat gtt gca ccc gaa cca672Gly Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro50 55 60ttt cga aca gat acg ggt gtt ttg ctg cac cct gtt gtc ctc act gca720Phe Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala65 70 75agt gac tat gaa ggc ttc tac gag ggc ttt tca aac gca acg ctg tgg768Ser Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp80 85 90 95cct ctt ttc cac gat ctg att gtt act ccg gtg tac aac acc gat tgg816Pro Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp100 105 110tgg cat gcg ttt cgg gaa gta aac ctc aag ttc gct gaa gcc gtg agc864Trp His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser115 120 125caa gtg gcg gca cac ggt gcc act gtg tgg gtg cag gac tat cag ctg912Gln Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu130 135 140ttg ctg gtt cct ggc att ttg cgc cag atg cgc ctt gat ttg aag atc960Leu Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile145 150 155ggt ttc ttc ctc cac att ccc ttc cct tcc cct gat ctg ttc cgt cag 1008Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln160 165 170 175ctg ccg tgg cgt gaa gag att gtt cga ggc atg ctg ggc gca gat ttg 1056Leu Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu
180 185 190gtg gga ttc cat ttg gtt caa aac gca gaa aac ttc ctt gcg tta acc 1104Val Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr195 200 205cag cag gtt gcc ggc act gcc ggg tct cat gtg ggt cag ccg gac acc 1152Gln Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr210 215 220ttg cag gtc agt ggt gaa gca ttg gtg cgt gag att ggc gct cat gtt 1200Leu Gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val225 230 235gaa acc gct gac gga agg cga gtt agc gtc ggg gcg ttc ccg atc tcg 1248Glu Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser240 245 250 255att gat gtt gaa atg ttt ggg gag gcg tcg aaa agc gcc gtt ctt gat 1296Ile Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp260 265 270ctt tta aaa acg ctc gac gag ccg gaa acc gta ttc ctg ggc gtt gac 1344Leu Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp275 280 285cga ctg gac tac acc aag ggc att ttg cag cgc ctg ctt gcg ttt gag 1392Arg Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu290 295 300gaa ctg ctg gaa tcc ggc gcg ttg gag gcc gac aaa gct gtg ttg ctg 1440Glu Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu305 310 315cag gtc gcg acg cct tcg cgt gag cgc att gat cac tat cgt gtg tcg 1488Gln Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser320 325 330 335cgt tcg cag gtc gag gaa gcc gtc ggc cgt atc aat ggt cgt ttc ggt 1536Arg Ser Gln Val Glu Glu Ala Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly340 345 350cgc atg ggg cgt ccc gtg gtg cat tat cta cac agg tca ttg agc aaa 1584Arg Met Gly Arg Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Ser Leu Ser Lys355 360 365aat gat ctc cag gtg ctg tat acc gca gcc gat gtc atg ctg gtt acg 1632Asn Asp Leu Gln Val Leu Tyr Thr Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr370 375 380cct ttt aaa gac ggt atg aac ttg gtg gct aaa gaa ttc gtg gcc aac 1680Pro Phe Lys Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Phe Val Ala Asn385 390 395cac cgc gac ggc act ggt gct ttg gtg ctg tcc gaa ttt gcc ggc gcg 1728His Arg Asp Gly Thr Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala400 405 410 415gcc act gag ctg acc ggt gcg tat tta tgc aac cca ttt gat gtg gaa 1776
Ala Thr Glu Leu Thr Gly Ala Tyr Leu Cys Asn Pro Phe Asp Val Glu420 425 430tcc atc aaa cgg caa atg gtg gca gct gtc cat gat ttg aag cac aat 1824Ser Ile Lys Arg Gln Met Val Ala Ala Val His Asp Leu Lys His Asn435 440 445ccg gaa tct gcg gca acg cga atg aaa acg aac agc gag cag gtc tat 1872Pro Glu Ser Ala Ala Thr Arg Met Lys Thr Asn Ser Glu Gln Val Tyr450 455 460acc cac gac gtc aac gtg tgg gct aat agt ttc ctg gat tgt ttg gcg 1920Thr His Asp Val Asn Val Trp Ala Asn Ser Phe Leu Asp Cys Leu Ala465 470 475cag tcg gga gaa aac tca tgaaccgcgc acgaatcgcg accataggcg 1968Gln Ser Gly Glu Asn Ser480 485ttcttccgct tgctttactg ctggcgtcct gtggttcaga caccgtggaa atgacagatt 2028ccacctggtt ggtgaccaat atttacaccg atccagatga gtcgaattcg atcagtaatc 2088ttgtcatttc ccagcccagc ttagattttg gcaattcttc cctgtctggt ttcactggct 2148gtgtgccttt tacggggcgt gcggaattct tccaaaatgg tgagcaaagc tctgttctgg 2208atgccgatta tgtgaccttg tcttccctgg atttcgataa acttcccgat gattgccaag 2268gacaagaact caaagttcat aacgagctgg ttgatcttct gcctggttct tttgaaatct 2328ccaggacttc tggttcagaa atcttgctga ctagcgatgt c 2369<210>30<211>485<212>PRT<213>Brevibacterium lactofermentum<400>30Met Asp Asp Ser Asn Ser Phe Val Val Val Ala Asn Arg Leu Pro Val1 5 10 15Asp Met Thr Val His Pro Asp Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Pro Ser Pro20 25 30Gly Gly Leu Val Thr Gly Leu Ser Pro Val Leu Glu Gln His Arg Gly35 40 45Cys Trp Val Gly Trp Pro Gly Thr Val Asp Val Ala Pro Glu Pro Phe50 55 60Arg Thr Asp Thr Gly Val Leu Leu His Pro Val Val Leu Thr Ala Ser65 70 75 80Asp Tyr Glu Gly Phe Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Ala Thr Leu Trp Pro85 90 95Leu Phe His Asp Leu Ile Val Thr Pro Val Tyr Asn Thr Asp Trp Trp100 105 110His Ala Phe Arg Glu Val Asn Leu Lys Phe Ala Glu Ala Val Ser Gln115 120 125
Val Ala Ala His Gly Ala Thr Val Trp Val Gln Asp Tyr Gln Leu Leu130 135 140Leu Val Pro Gly Ile Leu Arg Gln Met Arg Leu Asp Leu Lys Ile Gly145 150 155 160Phe Phe Leu His Ile Pro Phe Pro Ser Pro Asp Leu Phe Arg Gln Leu165 170 175Pro Trp Arg Glu Glu Ile Val Arg Gly Met Leu Gly Ala Asp Leu Val180 185 190Gly Phe His Leu Val Gln Asn Ala Glu Asn Phe Leu Ala Leu Thr Gln195 200 205Gln Val Ala Gly Thr Ala Gly Ser His Val Gly Gln Pro Asp Thr Leu210 215 220Gln Val Ser Gly Glu Ala Leu Val Arg Glu Ile Gly Ala His Val Glu225 230 235 240Thr Ala Asp Gly Arg Arg Val Ser Val Gly Ala Phe Pro Ile Ser Ile245 250 255Asp Val Glu Met Phe Gly Glu Ala Ser Lys Ser Ala Val Leu Asp Leu260 265 270Leu Lys Thr Leu Asp Glu Pro Glu Thr Val Phe Leu Gly Val Asp Arg275 280 285Leu Asp Tyr Thr Lys Gly Ile Leu Gln Arg Leu Leu Ala Phe Glu Glu290 295 300Leu Leu Glu Ser Gly Ala Leu Glu Ala Asp Lys Ala Val Leu Leu Gln305 310 315 320Val Ala Thr Pro Ser Arg Glu Arg Ile Asp His Tyr Arg Val Ser Arg325 330 335Ser Gln Val Glu Glu Ala Val Gly Arg Ile Asn Gly Arg Phe Gly Arg340 345 350Met Gly Arg Pro Val Val His Tyr Leu His Arg Ser Leu Ser Lys Asn355 360 365Asp Leu Gln Val Leu Tyr Thr Ala Ala Asp Val Met Leu Val Thr Pro370 375 380Phe Lys Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Phe Val Ala Asn His385 390 395 400Arg Asp Gly Thr Gly Ala Leu Val Leu Ser Glu Phe Ala Gly Ala Ala405 410 415Thr Glu Leu Thr Gly Ala Tyr Leu Cys Asn Pro Phe Asp Val Glu Ser420 425 430Ile Lys Arg Gln Met Val Ala Ala Val His Asp Leu Lys His Asn Pro435 440 445Glu Ser Ala Ala Thr Arg Met Lys Thr Asn Ser Glu Gln Val Tyr Thr450 455 460His Asp Val Asn Val Trp Ala Asn Ser Phe Leu Asp Cys Leu Ala Gln465 470 475 480
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<221>misc_特征<222>(2953)<223>n＝a或g或c或t<400>31ttttcccacg cagggaaggc gtgaacacta agatcgagga cgtaccgcac gattttgcct 60aacttttaag ggtgtttcat c atg gca cgt cca att tcc gca acg tac agg 111Met Ala Arg Pro Ile Ser Ala Thr Tyr Arg1 5 10ctt caa atg cga gga cct caa gca gat agc gcc ggg cgt ttc ttt ggt 159Leu Gln Met Arg Gly Pro Gln Ala Asp Ser Ala Gly Arg Phe Phe Gly15 20 25ttt gcg cag gcc aaa gcc cag ctt ccc tat ctg aag aag cta ggc atc 207Phe Ala Gln Ala Lys Ala Gln Leu Pro Tyr Leu Lys Lys Leu Gly Ile30 35 40agc cac ctg tac ctc tcc cct att ttt acg gcc atg cca gat tcc aat 255Ser His Leu Tyr Leu Ser Pro Ile Phe Thr Ala Met Pro Asp Ser Asn45 50 55cat ggc tac gat gtc att gat ccc acc gcc atc aat gaa gag ctc ggt 303His Gly Tyr Asp Val Ile Asp Pro Thr Ala Ile Asn Glu Glu Leu Gly60 65 70ggc atg gag ggt ctt cga gat ctt gct gca gct aca cac gag ttg ggc 351Gly Met Glu Gly Leu Arg Asp Leu Ala Ala Ala Thr His Glu Leu Gly75 80 85 90atg ggc atc atc att gat att gtt ccc aac cat tta ggt gtt gcc gtt 399Met Gly Ile Ile Ile Asp Ile Val Pro Asn His Leu Gly Val Ala Val95 100 105cca cat ttg aat cct tgg tgg tgg gat gtt cta aaa aac ggc aaa gat 447Pro His Leu Asn Pro Trp Trp Trp Asp Val Leu Lys Asn Gly Lys Asp110 115 120tcc gct ttt gag ttc tat ttc gat att gac tgg cac gaa gac aac ggt 495
Ser Ala Phe Glu Phe Tyr Phe Asp Ile Asp Trp His Glu Asp Asn Gly125 130 135tct ggt ggc aag ctg ggc atg ccg att ctg ggt gct gaa ggc gat gaa543Ser Gly Gly Lys Leu Gly Met Pro Ile Leu Gly Ala Glu Gly Asp Glu140 145 150gac aag ctg gaa ttc gcg gag ctt gat gga gag aaa gtg ctc aaa tat591Asp Lys Leu Glu Phe Ala Glu Leu Asp Gly Glu Lys Val Leu Lys Tyr155 160 165 170ttt gac cac ctc ttc cca atc gcg cct ggt acc gaa gaa ggg aca ccg639Phe Asp His Leu Phe Pro Ile Ala Pro Gly Thr Glu Glu Gly Thr Pro175 180 185caa gaa gtc tac aag cgc cag cat tac cgc ctg cag ttc tgg cgc gac687Gln Glu Val Tyr Lys Arg Gln His Tyr Arg Leu Gln Phe Trp Arg Asp190 195 200ggc gtg atc aac ttc cgt cgc ttc ttt tcc gtg aat acg ttg gct ggc735Gly Val Ile Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser Val Asn Thr Leu Ala Gly205 210 215atc agg caa gaa gat ccc ttg gtg ttt gaa cat act cat cgt ctg ctg783Ile Arg Gln Glu Asp Pro Leu Val Phe Glu His Thr His Arg Leu Leu220 225 230cgc gaa ttg gtg gcg gaa gac ctc att gac ggc gtg cgc gtc gat cac831Arg Glu Leu Val Ala Glu Asp Leu Ile Asp Gly Val Arg Val Asp His235 240 245 250ccc gac ggg ctt tcc gat cct ttt gga tat ctg cac aga ctc cgc gac879Pro Asp Gly Leu Ser Asp Pro Phe Gly Tyr Leu His Arg Leu Arg Asp255 260 265ctc att gga cct gac cgc tgg ctg atc atc gaa aag atc ttg agc gtt927Leu Ile Gly Pro Asp Arg Trp Leu Ile Ile Glu Lys Ile Leu Ser Val270 275 280gat gaa cca ctc gat ccc cgc ctg gcc gtt gat ggc acc act ggc tac975Asp Glu Pro Leu Asp Pro Arg Leu Ala Val Asp Gly Thr Thr Gly Tyr285 290 295gac ccc ctc cgt gaa ctc gac ggc gtg ttt atc tcc cga gaa tct gag 1023Asp Pro Leu Arg Glu Leu Asp Gly Val Phe Ile Ser Arg Glu Ser Glu300 305 310gac aaa ttc tcc atg ttg gcg ctg acc cac agt gga tcc acc tgg gat 1071Asp Lys Phe Ser Met Leu Ala Leu Thr His Ser Gly Ser Thr Trp Asp315 320 325 330gaa cgc gcc cta aaa tcc acg gag gaa agc ctc aaa cga gtc gtc gcg 1119Glu Arg Ala Leu Lys Ser Thr Glu Glu Ser Leu Lys Arg Val Val Ala335 340 345caa caa gaa ctc gca gcc gaa atc tta agg ctc gcc cgc gcc atg cgc 1167Gln Gln Glu Leu Ala Ala Glu Ile Leu Arg Leu Ala Arg Ala Met Arg350 355 360
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590 595 600ctt ttc gac gga ccc tcc acc tca tta atc acc gaa ttt gtc tcc cac 1935Leu Phe Asp Gly Pro Ser Thr Ser Leu Ile Thr Glu Phe Val Ser His605 610 615atc aac cgt ggc tct gtg aat atc tcc tta ggt agg aaa ctg ctg caa 1983Ile Asn Arg Gly Ser Val Asn Ile Ser Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln620 625 630atg gtg ggc gct gga atc ccc gac act tac caa gga act gag ttt tta 2031Met Val Gly Ala Gly Ile Pro Asp Thr Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Leu635 640 645 650gaa gac tcc ctg gta gat ccc gat aac cga cgc ttt gtt gat tac acc 2079Glu Asp Ser Leu Val Asp Pro Asp Asn Arg Arg Phe Val Asp Tyr Thr655 660 665gcc aga gaa caa gtc ctg gag cgc ctg caa acc tgg gat tgg acg cag 2127Ala Arg Glu Gln Val Leu Glu Arg Leu Gln Thr Trp Asp Trp Thr Gln670 675 680gtt aat tcg gta gaa gac ttg gtg gat aac gcc gac atc gcc aaa atg 2175Val Asn Ser Val Glu Asp Leu Val Asp Asn Ala Asp Ile Ala Lys Met685 690 695gcc gtg gtc cat aaa tcc ctc gag ttg cgt gct gaa ttt cgt gca agc 2223Ala Val Val His Lys Ser Leu Glu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Ala Ser700 705 710ttt gtt ggt gga gat cat cag gca gta ttt ggc gaa ggt cgc gca gaa 2271Phe Val Gly Gly Asp His Gln Ala Val Phe Gly Glu Gly Arg Ala Glu715 720 725 730tcc cac atc atg ggc atc gcc cgc ggt aca gac cga aac cac ctc aac 2319Ser His Ile Met Gly Ile Ala Arg Gly Thr Asp Arg Asn His Leu Asn735 740 745atc att gct ctt gct acc cgt cga cca ctg atc ttg gaa gac cgt ggc 2367Ile Ile Ala Leu Ala Thr Arg Arg Pro Leu Ile Leu Glu Asp Arg Gly750 755 760gga tgg tat gac acc acc gtc acg ctt cct ggt gga caa tgg gaa gac 2415Gly Trp Tyr Asp Thr Thr Val Thr Leu Pro Gly Gly Gln Trp Glu Asp765 770 775agg ctc acc ggg caa cgc ttc agt ggt gtt gtc cca gcc acc gat ttg 2463Arg Leu Thc Gly Gln Arg Phe Ser Gly Val Val Pro Ala Thr Asp Leu780 785 790ttc tca cat tta ccc gta tct ttg ttg gtt tta gta ccc gat agt gag 2511Phe Ser His Leu Pro Val Ser Leu Leu Val Leu Val Pro Asp Ser Glu795 800 805 810ttt tgatccctgc acaggaaagt tagcggcgct actatgaacg atcgatatgt2564Phectgacaacac tctctcccaa tttggcagtt actaccacga attccgacgt gcccatccca 2624tggccgacgt cgaattcctc ctagcaattg aagaattact cacagacggt ggtgtcacct 2684
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Thr Ser Leu Ile Thr Glu Phe Val Ser His Ile Asn Arg Gly Ser Val610 615 620Asn Ile Ser Leu Gly Arg Lys Leu Leu Gln Met Val Gly Ala Gly Ile625 630 635 640Pro Asp Thr Tyr Gln Gly Thr Glu Phe Leu Glu Asp Ser Leu Val Asp645 650 655Pro Asp Asn Arg Arg Phe Val Asp Tyr Thr Ala Arg Glu Gln Val Leu660 665 670Glu Arg Leu Gln Thr Trp Asp Trp Thr Gln Val Asn Ser Val Glu Asp675 680 685Leu Val Asp Asn Ala Asp Ile Ala Lys Met Ala Val Val His Lys Ser690 695 700Leu Glu Leu Arg Ala Glu Phe Arg Ala Ser Phe Val Gly Gly Asp His705 710 715 720Gln Ala Val Phe Gly Glu Gly Arg Ala Glu Ser His Ile Met Gly Ile725 730 735Ala Arg Gly Thr Asp Arg Asn His Leu Asn Ile Ile Ala Leu Ala Thr740 745 750Arg Arg Pro Leu Ile Leu Glu Asp Arg Gly Gly Trp Tyr Asp Thr Thr755 760 765Val Thr Leu Pro Gly Gly Gln Trp Glu Asp Arg Leu Thr Gly Gln Arg770 775 780Phe Ser Gly Val Val Pro Ala Thr Asp Leu Phe Ser His Leu Pro Val785 790 795 800Ser Leu Leu Val Leu Val Pro Asp Ser Glu Phe805 810<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>33ccaaaatcga taacatcaat cgagatcggg30<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明PCR引物<400>34cttgatcgat taaaaacgct cgacgagccg30
權(quán)利要求
1.具有L-谷氨酸生成能力的細菌，所述細菌是乳發(fā)酵短桿菌或谷氨酸棒桿菌，其中，通過破壞編碼海藻糖-6-磷酸合酶的otsA基因或編碼麥芽寡糖基海藻糖合酶的treY基因，細菌的海藻糖合成能力降低或缺失。
2.權(quán)利要求1的細菌，其中，編碼海藻糖-6-磷酸合酶的otsA基因編碼SEQ ID NO30的氨基酸序列，編碼麥芽寡糖基海藻糖合酶的treY基因編碼SEQ ID NO32的氨基酸序列。
3.生產(chǎn)L-谷氨酸的方法，包括以下步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1或2的細菌，以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-谷氨酸，并由培養(yǎng)基中收集L-谷氨酸。
全文摘要
L－谷氨酸可以通過培養(yǎng)具有L－谷氨酸生成能力的棒狀細菌以在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L－谷氨酸并由培養(yǎng)基中收集L－谷氨酸來生產(chǎn)，其中，所述細菌中編碼海藻糖－6－磷酸合酶的基因、編碼麥芽寡糖基海藻糖合酶的基因或二者被破壞，因而海藻糖合成能力降低或缺失。
文檔編號C12N15/52GK1935983SQ20061013737
公開日2007年3月28日 申請日期2001年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月5日
發(fā)明者大瀧博美, 中村純, 泉井裕, 中松亙 申請人:味之素株式會社