專利名稱：與高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，更具體而言，本發(fā)明涉及包含與L-高谷氨酸(或叫做L-2-氨基己二酸或者L-α-氨基己二酸)生產(chǎn)相關(guān)的基因的DNA以及應(yīng)用它來(lái)生產(chǎn)L-高谷氨酸(以下簡(jiǎn)稱為高谷氨酸)的體系。
背景技術(shù)：
高谷氨酸廣泛存在于生物界，如霍亂弧菌(Cholera vibrio)等細(xì)菌、以玉米屬(Zea mays)為代表的植物、蛙胚等中。它是真菌類賴氨酸生物合成中的中間產(chǎn)物，是β-內(nèi)酰胺類抗生素生物合成中的前體物質(zhì)。此外，高谷氨酸作為以氨甲蝶呤(WO 92/09436)為代表的各種藥物合成的中間產(chǎn)物也很有用處。
但是，由于用化學(xué)合成進(jìn)行制備時(shí)有必要進(jìn)行光學(xué)分割和多階段反應(yīng)，所以從消耗上講這并不是有效的手段。另一方面，已知有應(yīng)用土壤桿菌屬(Agrobacterium)、克霉伯桿菌屬(Klebsiella)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligens)、短桿菌屬(Breribacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物來(lái)制備L-賴氨酸的方法。(特開平6-181787號(hào)公報(bào))。另外，本發(fā)明者們中的部分人提出應(yīng)用黃桿菌屬(Flavobacterium)的微生物由L-賴氨酸生產(chǎn)高谷氨酸的方法(WO96/31616)。但是，即便是有應(yīng)用這些微生物的方法，仍殷切希望有更有效地制備高谷氨酸的方法。
因此本發(fā)明者們的目標(biāo)是增強(qiáng)上述任何應(yīng)用微生物的高谷氨酸生產(chǎn)體系，例如通過(guò)基因工程來(lái)達(dá)到增強(qiáng)目的。進(jìn)行這樣的操作時(shí)要依具體情況而論，例如研究頭孢霉素C的生物合成途徑時(shí)要確認(rèn)頭孢霉素生產(chǎn)菌帶小棒鏈霉菌(Streptomyces Clavuligerus)中與從L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為α-氨基己二酸(或高谷氨酸)相關(guān)的賴氨酸-6-氨基轉(zhuǎn)移酶和Δ-1-哌啶-6-羧酸脫氫酶的存在，或者對(duì)于前者要確認(rèn)編碼該酶的基因存在的位置(Fuente等，Biochem.J.(1997)327,59-64)。
已知用于L-賴氨酸生物鑒定的暗褐黃桿菌(由Flavobacteriumfuscum進(jìn)行再鑒定的)IFO 3084中存在催化以下途徑的2-酮或二酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶[或賴氨酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶(以下叫做LAT)](Soda等，Biochemistry 7(1968),4102-4109,同4110-4119)。 L-賴氨酸+2-酮戊→2-氨基己二+L-谷氨酸L-Δ’-哌啶高谷氨酸二酸酸-6-半醛 -6-羧酸上述生物測(cè)定中，用與o-氨基苯甲醛反應(yīng)得到的生成物的吸光度來(lái)測(cè)定哌啶-6-己二酸(以下叫做P6C)。另外，L-賴氨酸其它的生物測(cè)定中利用L-賴氨酸6-脫氫酶活性(Misono等，J.Biochem.(Tokyo)105(1989),1002-1008)。
上述的IFO 3084株在上述L-賴氨酸的每一生物測(cè)定中常用，且已建立了使用方法。因此，除LAT之外該IFO 3084株具有編碼P6C(或者在生物體內(nèi)使量上達(dá)到平衡狀態(tài)的2-氨基己二酸半醛)脫氫酶(以下簡(jiǎn)稱為脫氫酶)活性蛋白的基因。所以本發(fā)明的目的就是提供與高谷氨酸的生產(chǎn)相關(guān)的基因，同時(shí)獲得基因克隆用的候選菌株。
但是出乎意料的是本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)若使用最終選擇地宿主-載體體系，通過(guò)鳥槍法克隆技術(shù)，至少可克隆出與高谷氨酸產(chǎn)生相關(guān)的的基因，更具體而言，可克隆出編碼對(duì)P6C具有脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。另外還發(fā)現(xiàn)與該基因具有一定同源性(或相同性)的變異體具有同樣的功能。
另一方面，上述Soda等，Biochemistry、7(1968)、4110～4119中記載了從液態(tài)無(wú)色桿菌(Achromobactor liquidum)(=Flavobacterium lutescence)獲得分子量為116,000 LAT結(jié)晶體的方法，在Yagi等，J.Biochem.87(1980),1395-1402中記載了從泥色黃桿菌而來(lái)的LAT由A、B1、B2和C4個(gè)非同一性的亞基構(gòu)成。在這些文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用純化的LAT蛋白質(zhì)的氨基酸序列測(cè)定結(jié)果，克隆編碼具有LAT活性的蛋白質(zhì)的基因，初期的研究失敗。但是，應(yīng)用與先前的技術(shù)文獻(xiàn)完全不同的方法從泥色黃桿菌中純化出具有LAT活性的蛋白質(zhì)，測(cè)定所得蛋白質(zhì)的氨基酸序列，利用其測(cè)序結(jié)果來(lái)克隆目的基因時(shí)成功地克隆出編碼LAT的基因(Lat)、本發(fā)明是以上述發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的。
由此，本發(fā)明提供與高谷氨酸的生產(chǎn)相關(guān)的基因，它能從泥色黃桿菌(Flavobacterium lutescens)獲得；或者本發(fā)明提供DNA，在嚴(yán)緊條件下它能與該基因雜交，并且它是從包含具有恢復(fù)缺乏高谷氨酸生產(chǎn)能力的突變體生產(chǎn)能力的突變體中分離純化出的。
更具體而言，上述與高谷氨酸的生產(chǎn)相關(guān)的基因是編碼具有LAT活性蛋白質(zhì)及具有脫氫酶活性的蛋白質(zhì)中至少1種蛋白質(zhì)的一部分或全部的DNA，或其變異體。
本發(fā)明涉及具有上述DNA的自主復(fù)制性或整合復(fù)制性重組質(zhì)粒，以及用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體、以及應(yīng)用該轉(zhuǎn)化體的高谷氨酸的生產(chǎn)方法。
圖2是泥色黃桿菌突變株賴氨酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶(LAT)的活性圖。Wild表示野生型，1st是第一突變侏，2nd是第二突變株，3rd是第三突變株的LAT活性。
圖3是用薄層層析分析質(zhì)粒pCF213對(duì)高谷氨酸生產(chǎn)缺損突變株的高谷氨酸生產(chǎn)能力互補(bǔ)性的結(jié)果。
HG表示高谷氨酸的移動(dòng)位置，Lys表示L-賴氨酸的移動(dòng)位置，St是高谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的TLC分析結(jié)果，1st是pCF213、2nd pCF213及3rd pCF213分別表示有pCF213的第一、第二和第三突變株培養(yǎng)物的TLC分析結(jié)果，Wild pCF213及Wild pCF704是分別具有pCF213和pCF704的野生型株培養(yǎng)物的TLC分析結(jié)果，1st pCF704及2ndpCF704是分別具有pCF704的第一和第二突變株培養(yǎng)物的TLC分析結(jié)果，1st pCF111是具有pCH111的第一突變株培養(yǎng)物的TLC結(jié)果。
圖4表示泥色黃桿菌IFO 3084(pCH213)(圖中以pCF213表示)和泥色黃桿菌IFO 3084(pCF704)(圖中以pCF704表示)隨時(shí)間變化時(shí)高谷氨酸的生產(chǎn)能力。
圖5是以pCF213插入?yún)^(qū)域的堿基序列為基礎(chǔ)找到的ORF的存在位置。
圖6表示在實(shí)施例2的3(6)中用MonoQ HR5/5柱處理時(shí)洗脫級(jí)分與相對(duì)應(yīng)的LAT活性間的關(guān)系。
圖7是在實(shí)施例2的3(7)中，用雙層膠4/20及10/20對(duì)LAT活性級(jí)分進(jìn)行非變性PAGE(A)和SDS-PAGE(B)時(shí)的照片。圖中M是分子量標(biāo)志物，C是在實(shí)施例2的3(5)中得到的過(guò)濾液，數(shù)字分別表示各級(jí)分編號(hào)。
圖8表示各種質(zhì)粒在高谷氨酸生產(chǎn)缺損性變株及野生型株中相對(duì)應(yīng)的LAT活性。
圖9是用各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的泥色黃桿菌IFO 3084株隨時(shí)間變化時(shí)其高谷氨酸的生產(chǎn)能力。
本發(fā)明中所講的與高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)的基因是指關(guān)系從L-賴氨酸到P6C(LAT活性)或者經(jīng)過(guò)與P6C有化學(xué)平衡關(guān)系的α-氨基己二酸-6-半醛到高谷氨酸(脫氫酶活性)2階段轉(zhuǎn)換關(guān)系中任一階段的基因。首先介紹最初獲得編碼后面轉(zhuǎn)換關(guān)系中有脫氫酶活性的蛋白質(zhì)基因的具體情況，它是本發(fā)明者們應(yīng)用以下列條件為基礎(chǔ)確立的宿主-載體體系而得到的。
為了進(jìn)行泥色黃桿菌的基因操作，必須確立泥色黃桿菌的適當(dāng)宿主-載體體系，也必須解決以下3個(gè)問(wèn)題。
(1)得到在泥色黃桿菌內(nèi)能自主復(fù)制的復(fù)制子。
(2)得到在泥色黃桿菌內(nèi)能表達(dá)、且發(fā)揮功能的耐藥標(biāo)志。
(3)確立泥色黃桿菌的DNA導(dǎo)入方法。
幸運(yùn)地是上述問(wèn)題(1)和(2)由最近Mo Bi Tec公司出售的pBBR122得到解決，它在廣范圍內(nèi)的革蘭氏陰性菌中自主復(fù)制，有卡那霉素、氯霉素耐性。上述問(wèn)題(3)的解決首先以確立質(zhì)粒pBBR 122的泥色黃桿菌導(dǎo)入方法為前提。可是用電穿孔法將DNA導(dǎo)入大腸埃希氏菌的方法進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)將泥色黃桿菌的集落生長(zhǎng)在含卡那霉素20μg/ml的L板上，將之液態(tài)培養(yǎng)，用堿性SDS法抽提質(zhì)粒后可確定pBBR 122穩(wěn)定保持在泥色黃桿菌中。于是上述問(wèn)題(3)也得到解決。該宿主-載體系統(tǒng)在以其它菌株作宿主時(shí)可以(a)轉(zhuǎn)化效率非常高，(b)將適當(dāng)大小的DNA片段插入pBBR 122(J.Bac.178(1996),1053-1060)，但已闡明泥色黃桿菌也具有上述(a)、(b)的性能，獲得的基因不僅可以在泥色黃桿菌內(nèi)擴(kuò)增，而且可通過(guò)鳥槍法克隆技術(shù)獲得編碼對(duì)P6C具有脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。取代所有的pBBR122的氯霉素耐藥基因，導(dǎo)入pUC19的多克隆位點(diǎn)，制成pCF704，用它作為以后的載體。
然后建立所得基因或擴(kuò)增基因的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，即用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)誘發(fā)泥色黃桿菌IFO 3084的突變，用含有伊紅Y的MEM培養(yǎng)板(pH7.0)進(jìn)行篩選。
如此獲得一點(diǎn)也不生產(chǎn)高谷氨酸的第一突變株和只稍微生產(chǎn)一點(diǎn)的第二、第三突變株?？梢源_認(rèn)完全不生產(chǎn)高谷氨酸的第一突變株和野生型株具有相同的lat活性，只生產(chǎn)一點(diǎn)的第二、第三突變株只稍微有l(wèi)at活性。也就是說(shuō)第一突變株有可能是lat以外的與高谷氨酸的產(chǎn)生相關(guān)的基因受到一定損害，而第二和第三突變株可能是至少lat受到一定程度的損傷。
然后，用Sau Ⅲ AI部分消化野生型菌株的基因組DNA，將其6-8Kbp片段插入pCF704的BamHⅠ部位，制作DNA文庫(kù)。將之分別導(dǎo)入上述第一、第二和第三突變株中，篩選恢復(fù)了高谷氨酸生產(chǎn)能力的菌株。此時(shí)，挑選在篩選突變株應(yīng)用的含伊紅Y的MEM平板(pH7.0)中變成黑色的克隆，應(yīng)用TLC驗(yàn)證高谷氨酸的生產(chǎn)能力。作為這些突變株的代表，第二突變株(Flavobacterium lutescens 2nd mutant)于平成10年7月6日保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM P-16874；第1突變株(Flavobacterium lutescens1st mutant)于平成11年6月10日保藏于同一研究所，保藏號(hào)為FERM P-17419。按布達(dá)佩斯條約該FERM P-16874株和FERM P-17419株于平成11年7月26日移交到同一研究所的國(guó)際保藏部，保藏號(hào)分別為FERM BP-6798和FERM BP-6799。
結(jié)果獲得有補(bǔ)充第一突變株高谷氨酸生產(chǎn)能力的質(zhì)粒的菌株以及有部分補(bǔ)充第二突變株高谷氨酸生產(chǎn)能力的質(zhì)粒的菌株。但是這些菌株，尤其是補(bǔ)充第二突變株的菌株的質(zhì)粒容易缺失，所以為了獲得穩(wěn)定的質(zhì)粒有必要進(jìn)行再篩選。用限制性酶處理而得到的DNA片段分析的結(jié)果是所得補(bǔ)充第一突變株、部分補(bǔ)充第二突變株的命名為pCF111的質(zhì)粒與命名為pCF213的質(zhì)粒看上去是同一質(zhì)粒。
另一方面，用pCF111和pCF213再分別轉(zhuǎn)化第一、第二和第三突變株，用TLC檢測(cè)其高谷氨酸的生產(chǎn)能力。結(jié)果是這兩種質(zhì)粒均補(bǔ)充第一突變株，而部分補(bǔ)充第二和第三突變株。
以該互補(bǔ)試驗(yàn)為基礎(chǔ)，能充分恢復(fù)高谷氨酸生產(chǎn)能力缺損的突變株高谷氨酸生產(chǎn)能力的質(zhì)粒中至少存在本發(fā)明中與高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)的基因，更具體而言，存在lat以外的任何基因。
因此，雖沒有限定，但作為本發(fā)明中講的“L-高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)基因中的一個(gè)，推選包含在質(zhì)粒pCF213插入部分、編碼有脫氫酶活性蛋白質(zhì)的基因。例如，該基因存在于序列號(hào)2所示的序列中。
另一方面，與前者的轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因，即本發(fā)明的編碼有LAT活性蛋白質(zhì)的基因，如下克隆。
在一定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)泥色黃桿菌，將所得菌體破碎后，將破碎液離心，除去菌體破碎物，得到細(xì)胞抽提液，然后經(jīng)過(guò)超速離心、硫酸銨沉淀、脫鹽、離子交換色譜、親和色譜、超濾、電泳等分離純化目的蛋白質(zhì)。
分析純化的蛋白質(zhì)N末端氨基酸序列，根據(jù)其結(jié)果設(shè)計(jì)DNA引物，對(duì)泥色黃桿菌(IFO 3084)株的基因組DNA進(jìn)行PCR。以PCR擴(kuò)增的DNA片段為模板再進(jìn)行PCR，獲得該DNA片段兩外側(cè)的周區(qū)域。如此獲得編碼本發(fā)明目的蛋白質(zhì)的DNA。
因此可提供作為L(zhǎng)-高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)基因之一的、編碼有LAT活性蛋白質(zhì)的DNA。也就是說(shuō)作為本發(fā)明的另一基因包括，例如有構(gòu)成序列號(hào)1所示堿基序列中編碼區(qū)域的序列的基因。可以認(rèn)為所對(duì)應(yīng)的純化蛋白質(zhì)的N末端是序列號(hào)1中的Ser，其上游基因編碼的到Met的氨基酸序列是經(jīng)翻譯后加工而去除的。
再者，包含本發(fā)明中所講高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)基因的DNA包括包含編碼有上述脫氫酶活性蛋白質(zhì)的基因和編碼有LAT活性蛋白質(zhì)的基因各1個(gè)以上的DNA。
加之，本發(fā)明中所講的基因有上述二基因的變異體，在一定的雜交條件下它們能分別與二基因進(jìn)行雜交，例如在60℃ 2×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液)中，優(yōu)選60℃、0.5×SSC中，特別優(yōu)選60℃、0.2×SSC中這樣嚴(yán)緊條件下有雜交的堿基序列，且缺乏高谷氨酸的生產(chǎn)能力。也包含能恢復(fù)泥色黃桿菌突變體該生產(chǎn)能力的變異體。
更具體而言，編碼具有脫氫酶活性蛋白質(zhì)的基因的變異體與序列號(hào)2中2855～4387的堿基序列至少有70％的同一性。編碼具有LAT活性蛋白質(zhì)的基因的變異體與序列號(hào)1中545～2658的堿基序列(編碼區(qū))至少有50％、優(yōu)選70％、更優(yōu)選93％的同一性。
該變異體是上述兩序列中5’末端或3’末端或其中的堿基發(fā)生了去除或添加，或者堿基的一部分被其它的堿基所替換。堿基中一部分被其它堿基所轉(zhuǎn)換的變異體雖能編碼同一蛋白質(zhì)，但伴隨遺傳密碼的縮合，也包含與上述二基因不同的堿基序列。
伴隨遺傳密碼縮合之外的堿基置換，分別參照上述二基因編碼的推算的氨基酸序列，以疏水性、親水性、電荷、大小等為基準(zhǔn)觀測(cè)各氨基酸由來(lái)的側(cè)鏈的類似性，它們與蛋白質(zhì)整體有類似的性狀。因此，變異體具有與上述二基因同等的功能，即它們能恢復(fù)高谷氨酸生產(chǎn)能力缺損的泥色黃桿菌突變株的這種生產(chǎn)能力，有相當(dāng)高的準(zhǔn)確率。
本發(fā)明的變異體可參考上述二基因的堿基序列或參照它們編碼的推算的氨基酸序列，用核酸合成儀合成，或者通過(guò)誘導(dǎo)自身已知的點(diǎn)突變或部位特異性突變來(lái)制作。
本發(fā)明可提供持有上述基因或變異體的重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒除含有上述基因或變異體以外，包含自主復(fù)制序列、啟動(dòng)子序列、終止序列、耐藥基因等，能進(jìn)行自主復(fù)制。并且質(zhì)?？墒前c預(yù)使用的宿主基因組的一定區(qū)域序列相同的、整合型質(zhì)粒。例如含有編碼具有脫氫酶活性蛋白質(zhì)的基因的具有自主復(fù)制性的重組質(zhì)粒是將多克隆位點(diǎn)插入到質(zhì)粒pBBR122和pBBR122的特定位點(diǎn)，或者用多克隆位點(diǎn)置換該部位或區(qū)域，通過(guò)多克隆位點(diǎn)來(lái)插入上述基因和變異體。該質(zhì)粒的具體例是本說(shuō)明書中叫做質(zhì)粒pCF111和pCF213的質(zhì)粒。pCF213于平成10年3月11日保藏于工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM9-16699，其后，如上所述按布達(dá)佩斯條約移交到國(guó)際保藏所，保藏號(hào)為FERM BP-6797，從Flavobacterium lutescens IFO3084(pCF213)，用其自身已知的質(zhì)粒分離法可獲得其質(zhì)粒。含有編碼具有LAT活性蛋白質(zhì)的基因的DNA的重組質(zhì)粒以及含有兩基因的DNA的重組質(zhì)粒制作與上述pCF213的制作相同。
本發(fā)明還提供用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化作為宿主的黃桿菌屬的細(xì)菌而得到的轉(zhuǎn)化體。根據(jù)本發(fā)明的目的，屬于黃桿菌屬的宿主細(xì)菌可以是任何種的任何菌株，但優(yōu)選泥色黃桿菌IFO 3084和泥色黃桿菌SP.7-1(FERM BP-5457)。
上述轉(zhuǎn)化體的具體例是用pCF213轉(zhuǎn)化泥色黃桿菌IFO 3084和泥色黃桿菌SP.7-1，泥色黃桿菌IFO 3084(pCF213)，上述FERMBP-6797，保藏于生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所的國(guó)際保藏單位。
本發(fā)明還提供用上述轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)高谷氨酸的方法。該方法中，將用培養(yǎng)基培養(yǎng)中增殖了的轉(zhuǎn)化體與原始物質(zhì)、L-賴氨酸或根據(jù)情況與P6C(或者2-氨基己二酸-6-半醛)接觸，或者與增殖了的轉(zhuǎn)化體或其處理菌體(例如有機(jī)溶劑處理物、菌體提取物、固化處理物)相接觸，原始物質(zhì)轉(zhuǎn)換為高谷氨酸。
作為培養(yǎng)基中的碳源，只要是轉(zhuǎn)化體可利用的、任何物均行，應(yīng)用泥色黃桿菌作宿主時(shí)可應(yīng)用，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、葡聚糖等糖類、甘油、山犁糖醇等糖醇類，蘋果酸、檸檬酸等有機(jī)酸，這些碳源向培養(yǎng)基中的添加量通常希望在0.1～10％(重量百分比)(以下略作％)左右。
作為培養(yǎng)基中的氮源可應(yīng)用，例如氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸銨鹽和蘋果酸銨、檸檬酸銨等有機(jī)酸銨鹽，肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物等天然氮源，這些氮源向培養(yǎng)基中的添加量通常希望是1-10％左右。
另外，作為無(wú)機(jī)鹽類可應(yīng)用，例如磷酸鈣、磷酸鈉等磷酸堿金屬鹽和氯化鈣、氯化鈉等堿金屬鹽酸鹽，硫酸鎂、硫酸鐵等硫酸金屬鹽，這些無(wú)機(jī)鹽向培養(yǎng)基中的添加量通常希望為0.001～1％左右。
這其中優(yōu)選通常培養(yǎng)細(xì)菌用的液態(tài)培養(yǎng)基。碳源應(yīng)用葡萄糖、甘露糖、淀粉等、氮源應(yīng)用硫酸銨、蛋白胨、酵母提取物、大豆粉等。其它，無(wú)機(jī)鹽通常應(yīng)用磷酸鈣、磷酸鎂、食鹽等。
微生物的培養(yǎng)是用上述培養(yǎng)基，在20-40℃、優(yōu)選28-37℃，pH5～9、優(yōu)選6～8，在通氣的條件下實(shí)施。
培養(yǎng)過(guò)程中，上面增殖了的轉(zhuǎn)化體與原始物質(zhì)的接觸可通過(guò)預(yù)先向培養(yǎng)基中加入原始物質(zhì)，或在培養(yǎng)過(guò)程中適時(shí)添加原始物質(zhì)進(jìn)行。培養(yǎng)終止后，將形成集落的菌體或處理過(guò)的菌體與原始物質(zhì)加入培養(yǎng)基或適當(dāng)?shù)木彌_液中，必要時(shí)加入適當(dāng)?shù)妮o酶，在反應(yīng)器中攪拌或振蕩，讓含有原始物質(zhì)的液體在固定的菌體上流動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)上述的接觸。
以培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)化體與L-賴氨酸的接觸為例，再如下進(jìn)行具體說(shuō)明。將轉(zhuǎn)化體接種到培養(yǎng)基之后進(jìn)行培養(yǎng)，例如在20～40℃培養(yǎng)12-120個(gè)小時(shí)，獲得1ml中含106～1010個(gè)菌株的培養(yǎng)液，向該培養(yǎng)液中加入底場(chǎng)L-賴氨酸，通常其終濃度為0.5～30mg/ml，溶于水或助溶劑中，或者不溶解直接加入，通常在20～40℃反應(yīng)門小時(shí)～7日，優(yōu)選18小時(shí)-5日，應(yīng)用陽(yáng)離子交換樹脂、陰離子交換樹脂等各種離子交換色譜、HP20等吸附色譜、利用溶劑和溫度的沉淀和結(jié)晶等常用的純化手段獲得高谷氨酸。
所添加的L-賴氨酸的性狀和添加時(shí)期沒有特殊限制，但從溶解性這一點(diǎn)來(lái)看優(yōu)選鹽酸鹽，可以在培養(yǎng)開始時(shí)添加，也可在培養(yǎng)過(guò)程中的第1～5日添加。
本發(fā)明提供包括能將L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為高谷氨酸的與高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)的基因的DNA。該DNA在高谷氨酸的微生物學(xué)生產(chǎn)方法中有用。另外本發(fā)明提供高效生產(chǎn)高谷氨酸的轉(zhuǎn)化體，以及應(yīng)用該轉(zhuǎn)化體的高谷氨酸的生產(chǎn)方法。
以下通過(guò)具體的例子對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。提供這些具體例的目的是容易理解本發(fā)明，而并非將本發(fā)明限制于此。實(shí)施例1編碼具有脫氫酶活性蛋白質(zhì)的基因的克隆等1．獲得高谷氨酸的非生產(chǎn)株將泥色黃桿菌IFO 3084菌株種植到3mlL培養(yǎng)基(1.0％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.3％NaCl、0.1％葡萄糖、pH7.2)中，32℃振蕩培養(yǎng)一晚。將之作為種菌，取100μl加到50ml L培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)4.5小時(shí)。然后5000×g離心10分鐘，收集細(xì)菌，用0.2M磷酸緩沖液(pH-6.0)洗滌一次，懸浮到0.2M磷酸緩沖液(pH6.0)6ml中。向該菌體懸浮液中加入50μl 80mg/ml的NTG,32℃、振蕩培養(yǎng)20分鐘。從該培養(yǎng)液中收集的細(xì)菌用0.2M磷酸緩沖(pH6.0)洗一次，全部種植到50ml L培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)一晚。將該培養(yǎng)液每500μl分成一份，向其中加入60％甘油500μl，混合，-70℃凍存，將之作為突變株保存液。
將該突變株保存液用0.85％NaCl 106倍稀釋，每100μl涂到8cmツヤ-レ的MEM瓊脂培養(yǎng)基pH7.2上(多聚蛋白胨0.5％、酵母提取物0.2％、賴氨酸-HCl 1.0％、亞甲藍(lán)0.006％、伊紅Y0.04％、瓊脂1.5％,pH7.2),32℃培養(yǎng)3天。挑選所生集落中呈白色的種植到篩選培養(yǎng)基(多聚蛋白胨1.0％、酵母提取物0.2％、賴氨酸-HCl 1.0％,pH7.2)1ml中，32℃振蕩培養(yǎng)2天。將3μl該培養(yǎng)液滴到硅膠TLC板的各道中，使之干燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)構(gòu)成的溶媒將板展開，用水合茚三酮發(fā)色，檢測(cè)各道有無(wú)高谷氨酸。如此分離出一點(diǎn)也不生產(chǎn)高谷氨酸的第一突變株(FERM BP-6799)和僅稍微生產(chǎn)一點(diǎn)的第二突變株(FERM BP-6798)和第三突變株。用TLC分析所檢測(cè)的由L-賴氨酸轉(zhuǎn)換為高谷氨酸的能力(或者高谷氨酸的生產(chǎn)性)的結(jié)果如

圖1所示。圖1中高谷氨酸以HG表示(其它圖中相同)。另外這些轉(zhuǎn)換株中Lat活性的測(cè)定結(jié)果如圖2所示。2．宿主-載體體系、轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建將泥色黃桿菌IFO 3084株種植到3mlL培養(yǎng)基上，32℃振蕩培養(yǎng)一晚。將之作為菌種。取其100μl種植到50ml L培養(yǎng)基上，32℃、振蕩培養(yǎng)4.5h。將培養(yǎng)液5000×g離心10分鐘，收集菌體，用10％甘油溶液洗滌一次，懸浮到3ml 10％甘油溶液中。將該懸浮液每200μl分為一份，-70℃凍存，作為電轉(zhuǎn)細(xì)胞保存液。冰上融解該保存液，加入Broad Host Range Vector pBBR122(Mo Bi Tec公司)200μg/mlTE溶液1μl。將之加入到0.2cm的(BIORAD)中，應(yīng)用基因脈沖儀(Gene Pulser Ⅱ(BIORAD)在2.4kV、200Ω、25μF的條件下進(jìn)行一次電沖。將細(xì)胞加入Falcon管中，加入預(yù)冷的L培養(yǎng)基1ml,32℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。將該培養(yǎng)液涂到含有卡那霉素20μg/ml的L瓊脂培養(yǎng)基(多聚蛋白胨1.0％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、葡萄糖0.1％、瓊脂1.5％,pH7.2),32℃培養(yǎng)3天。得到2.4×105個(gè)轉(zhuǎn)化體。3．質(zhì)粒pCF704的構(gòu)建合成末端附加EcoRⅠ位點(diǎn)和NcoⅠ位點(diǎn)的引物(ファルマツア社)，應(yīng)用Taq聚合酶(Taq polymerase)(ファルレマツア社)和PCR熱循環(huán)儀(Thermal Cycler)PERSONAL(TaKaRa)擴(kuò)增pUC18的多克隆位點(diǎn)及其周圍區(qū)域95bp。用限制性酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化該DNA片段，應(yīng)用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)連結(jié)到pBBR122的EcoRⅠ、NcoⅠ位點(diǎn)。用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM 109(TaKaRa)，應(yīng)用QIAGEN Plasmid Midi Kit從轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒pCF 704。4．質(zhì)粒pCF 213的構(gòu)建按照GIAGEN Blood and Cell Culture DNA Kit提取純化泥色黃桿菌IFO 3084株的基因組DNA。用限制性酶SauⅢAI部分分解該基因組DNA，從瓊脂糖膠中切出其6～8Kbp的片段，應(yīng)用0.4μm的超濾-C3單元(ミリポア)回收純化DNA，溶解到TE溶液中，作為插入DNA溶液。另一方面，用限制性酶BamHⅠ消化pCF704，用堿性磷酸酶脫磷酸化。應(yīng)用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)將之與插入DNA溶液相連接，作為DNA文庫(kù)。
將該DNA庫(kù)加入到第二突變株的電動(dòng)細(xì)胞保存液中，進(jìn)行電脈沖。將該細(xì)胞加入到Falcon管中，加入預(yù)冷的L培養(yǎng)基1ml,32℃振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。將該培養(yǎng)液全部種植到含卡那霉素20μg/ml的50mlL培養(yǎng)基上，32℃、振蕩培養(yǎng)2天。將培養(yǎng)液每500μl分份，每份加入500μl 60％的甘油溶液，混合，-70℃凍存，作為互補(bǔ)株保存液。
用0.85％NaCl將該互補(bǔ)株保存液稀釋103倍，每100μl涂到8cmツヤ-レ的MEM瓊脂培養(yǎng)板pH7.0(多聚蛋白胨0.5％、酵母提取物0.2％、賴氨酸-HCl 1.0％、亞甲藍(lán)0.006％、伊紅Y0.04％、瓊脂1.5％,pH7.0)上，32℃培養(yǎng)3天。將所生長(zhǎng)的菌株中呈現(xiàn)黑色的部分作為互補(bǔ)株混合菌體。將該互補(bǔ)株混合菌體種植到3ml的篩選培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)2天。將該培養(yǎng)液3μl滴到硅膠TLC板的各道中使之干燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)構(gòu)成的溶媒系統(tǒng)將板展開，通過(guò)水合茚三酮發(fā)色來(lái)檢測(cè)各道有無(wú)高谷氨酸。如此選擇能恢復(fù)高谷氨酸生產(chǎn)能力的互補(bǔ)株混合菌體，再分離單菌落，選擇恢復(fù)高谷氨酸生產(chǎn)能力的菌株，將之作為互補(bǔ)株，應(yīng)用QIAGEN Plasmid MidiKit從這些互補(bǔ)株中制備的一個(gè)質(zhì)粒叫做pCF213。將大約6.5Kbp的插入DNA插入到pCF213中。與從其它途徑獲得的質(zhì)粒pCF111的各突變一起，檢測(cè)上述pCF213的互補(bǔ)性，其結(jié)果如圖3所示。5．pCF213對(duì)高谷氨酸生產(chǎn)能力的上調(diào)用pCF704轉(zhuǎn)化野生型泥色黃桿菌IFO 3084株得到的轉(zhuǎn)化體命為Wild pCF704株，用pCF213轉(zhuǎn)化的菌株命為Wild pCF213株。將二者種植到含20μg/ml卡那霉素的篩選培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)一晚，作為菌種。取其100μl種到25ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(多聚蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 2.0％、未調(diào)整pH)中，32℃分別振蕩培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)。用HPLC測(cè)定各培養(yǎng)液上清中的高谷氨酸量。即用蒸餾水將培養(yǎng)液稀釋到氨基酸總濃度達(dá)1000mg/L的程度，取50μl移到試管中減壓干燥。向其中加入異氰酸苯酯、和三乙胺和乙醇及蒸餾水以1∶1∶7∶2混合的溶液50μl，攪拌溶解，室溫放置10分鐘后減壓干燥。然后將之溶解到500μl HPLC移動(dòng)相A溶液中，注入5μl。HPLC的條件如下所示。
柱TSK-GEL Super-ODS 4.6 ID×50mm移動(dòng)相A溶液140mM醋酸鈉0.05％、用冰醋酸將pH調(diào)整為6.2的Tris溶液1000乙腈40B溶液70％ 乙腈流速2.0ml/min洗脫條件流速一定的梯度0-7分B溶液2％～40％的線性梯度，7分以后B溶液100％檢測(cè)UV254nm溫度40℃該條件下高谷氨酸的保留時(shí)間為1.3min，賴氨酸為7.7min。
結(jié)果如圖4所示，野生型pCF213株的高谷氨酸的生產(chǎn)能力是野生型pCF704株的1.5倍。6．pCF213插入?yún)^(qū)域基因堿基序列的測(cè)定應(yīng)用ABIPRISM 377×L DNA Sequencer(Perkin Elmer)，通過(guò)引物游移法測(cè)定pCF213插入?yún)^(qū)域的堿基序列。其堿基序列如序列號(hào)2所示。
以測(cè)定的堿基序列為基礎(chǔ)，參照Bibb等的方法(Gene,30,157(1984))確定其開放讀碼框(ORF)。其ORF顯示于圖5中。7．pCF213插入?yún)^(qū)域中NotⅠ部位約2.5Kbp的分析對(duì)pCF213插入?yún)^(qū)域中限制性酶NotⅠ部件約2.5Kbp(序列號(hào)2的堿基序列中2077-4578位)進(jìn)行解析。從瓊脂糖膠中切出約2.5kbp的該NotⅠ部位，用0.45的超濾C3單元(ミ リポア)回收純化DNA，溶解到TE溶液中，用DNA Blunting Kit(TaKaRa)使之末端平滑化，作為嵌入DNA溶液。另外，用限制性酶HincⅡ消化pCF704，用堿性磷酸酶脫磷酸。用Ligation Kit Version 1(TaKaRa)將之與嵌入DNA溶液連結(jié)。用該反應(yīng)液轉(zhuǎn)化泥色黃桿菌IFO 3084株，用QIAGENPlasmid Midi Kit從轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒pCF235。
將用pCF235轉(zhuǎn)化的第一突變株接種到3ml篩選培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)2天。將培養(yǎng)液3μl滴到硅膠TLC板的各道中，使之干燥。用正丁醇∶醋酸∶水(3∶1∶1)構(gòu)成的溶媒系統(tǒng)展開，通過(guò)水合茚三酮發(fā)色來(lái)檢測(cè)各道中有無(wú)高谷氨酸。其結(jié)果是用pCF235轉(zhuǎn)化的第一突變株能恢復(fù)高谷氨酸的生產(chǎn)能力。
嵌入pCF235的約2.5Kbp的DNA序列中存在編碼510個(gè)氨基酸的ORF，它從序列號(hào)2的堿基序列中第2855位的ATG開始到4387位的TAA結(jié)束。將該氨基酸序列在BLAST中進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與多種醛脫氫酶有高同源性，且與最近在database中登錄的Streptomyces dlavuligerus的哌啶-6-羧酸脫氫酶的氨基酸序列(J.Bac.,Vol.180,No.17,4753-4756(1998))整個(gè)區(qū)域有高的同源性?？紤]到用pCF235轉(zhuǎn)化的第一突變株能恢復(fù)高谷氨酸的生產(chǎn)能力，以及野生型pCF213株高谷氨酸生產(chǎn)能力的上調(diào)，可以看到該ORF編碼的蛋白質(zhì)具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性。實(shí)施例2編碼具有LAT活性蛋白質(zhì)的基因的克隆等1．LAT活性測(cè)定將賴氨酸-HCl 73mg,2-酮戊二酸59m溶解到含0.5mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸緩沖液(pH7.3)1ml中，作為反應(yīng)溶液。向酶溶液260μl中加入28.75μl反應(yīng)溶液，32℃放置1小時(shí)。加入151.8μl溶于乙醇的5％三氯醋酸終止反應(yīng)，離心，向60μl上清中加入含4mMO-氨基苯甲醛的0.2M磷酸緩沖液(pH7.3)90μl,37℃放置1小時(shí)。在A465處測(cè)定，將相對(duì)來(lái)說(shuō)A465高的部分作為L(zhǎng)AT活性級(jí)分。2．菌株的培養(yǎng)將泥色黃桿菌IFO 3084在32℃振蕩培養(yǎng)一晚，將之作為菌種。將其50ml接種到30l缸中的10 L flaro-M9培養(yǎng)基(Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、NH4Cl 0.1％、NaCl 0.2％、多聚蛋白胨1.0％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 0.5％、硅KM75 0.005％、MgSO40.025％、CaCl20.0015％,pH7.2)中，通氣攪拌培養(yǎng)17小時(shí)。將所得培養(yǎng)液5L離心(1000×g,10分鐘)，收集菌體，在0.01M磷酸緩沖液(pH7.2)中洗2次。將之懸浮到同種緩沖液中，用超聲波破碎菌體。通過(guò)離心(1000×g,10分鐘)去除菌體破碎物，獲得細(xì)胞提取液。將之進(jìn)行高速離心(16,000×g,90分鐘)。其上清部分按以下所述進(jìn)行純化。3．酶的純化如下所示進(jìn)行純化，若無(wú)特殊說(shuō)明均在4℃進(jìn)行。(1)硫酸銨分級(jí)將實(shí)施例1中的上清部分600ml通過(guò)硫酸銨沉淀進(jìn)行純化。將用30％-80％硫酸銨沉淀的部分進(jìn)行離心(1000×g,30分)，收集沉淀，溶解到0.01M磷酸緩沖液(pH7.2)中，用同種緩沖液進(jìn)行透析。(2)脫鹽將透析的酶溶液10ml上到4根PD10柱(Amasham Pharmacra)上，用含0.5mM磷酸吡哆醛的0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫，脫鹽。(3)QAE-TOYOPEAL550C柱層析將脫鹽了的酶溶液加到預(yù)先用含0.5mM磷酸吡哆醛的0.1MTris-HCl緩沖液(pH7.4)平衡過(guò)的QAE-TOYOPEAL550C(TOSOH)柱(φ5.5×6.0cm)上。用同種緩沖液洗滌后，用同種緩沖液配制的2L氯化鈉線性梯度(0～1.0M洗脫)，收集LAT活性部分。(4)Phenyl-TOYOPERL 650S柱層析向LAT活性部分中加入1M硫酸銨，將之加到預(yù)先用含0.5mM磷酸吡哆醛和1M硫酸銨的0.01M磷酸緩沖液(pH7.2)平衡過(guò)的Phenyl-TOYOPERL 650S(TOSOH)柱(φ5.5×3.0cm)上。用應(yīng)用同種緩沖液的1200ml硫酸銨梯度(0.8-0M)洗脫，收集LAT活性部分。(5)超濾用ADVANTEC UP-20超濾150ml的LAT活性部分，縮到15ml。將該濃縮液2.5ml加到PD10柱(Amasham Pharmacia)柱上，用0.1MTris-HCl緩沖液(pH7.4)洗脫，脫鹽。(6)AKTA MonoQ HR5/5柱層析將脫鹽了的酶溶液3.5ml加到預(yù)先用0.1M Tris-HCl緩沖液(pH7.4)平衡過(guò)的AKTAexplorer 10S系統(tǒng)的MonoQ HR5/5柱(Amasham Pharmacia)上。用同種緩沖液洗滌后，用40ml應(yīng)用同種緩沖液的氯化鈉線性梯度(0～0.4M)洗脫，收集LAT活性部分。再用PD10柱將LAT活性部分5ml脫鹽，再次加到AKTAexplorer 10S系統(tǒng)的MonoQ HR5/5柱上，收集LAT活性部分。各級(jí)分相對(duì)應(yīng)的LAT活性關(guān)系如圖6所示。(7)電泳將LAT活性部分加到雙層膠4/20及10/20第一化學(xué)藥品公司，進(jìn)行Natire-PAGE及SDS-PAGE，結(jié)果如圖7所示。在Natire-PAGE中，分子量100000附近可看到LAT活性部分的帶；SDS-PAGE中，分子量55000附近可看到LAT活性部分的帶。用Phast Transfer(Amasham Pharmacia)將SDS-PAGE中分子量55000附近的帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上。4．N末端氨基酸序列分析應(yīng)用HP G1005A Protein Sequencing System(HEWLETTPACKARD)對(duì)點(diǎn)到膜上的帶進(jìn)行N末端氨基酸序列分析，應(yīng)用Edman分析法進(jìn)行。結(jié)果表明N末端的氨基酸序列為SLLAPLAPLRAHAGTRLTQG。以此為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)DNA引物NmaRout CCYTGIGTIARICKIGTICCIGCRTGIGCICGNmaRin CCIGCRTGIGCICGIARIGGIGCIARIGGIGC應(yīng)用LA PCR in vitro cloning kit(TaKaRa)對(duì)泥色黃桿菌IFO3084株的基因組DNA進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件是94℃30秒→55℃2分→72℃1分，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。結(jié)果得到400bp的包含上述末端及其上游區(qū)域的PCR擴(kuò)增片段。以該序列為模板再應(yīng)用PCR擴(kuò)增出其周圍的區(qū)域。即分別用限制性酶PstⅠ和SalⅠ消化泥色黃桿菌IFO 3084株的基因組DNA，用Ligation Kit Version 2(TaKaRa)各自進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物作為模板DNA。設(shè)計(jì)針對(duì)該模板DNA的DNA引物NIFout ttgatttgag cagattcgca ctgccattt(序列號(hào)3)NIRout aaggttttcg acaaagtgac catttccca(序列號(hào)4)應(yīng)用LA Taq(TaKaRa)進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件是98℃ 20秒→68℃6分，30個(gè)循環(huán)。結(jié)果從PstⅠ模板得到約2Kbp的PCR擴(kuò)增片段，從SalⅠ模板得到大約8Kbp的PCR擴(kuò)增片段。應(yīng)用ABIPRISM 377XL DNASequencer(PerKin Elmer)，通過(guò)引物游走法測(cè)定這些PCR擴(kuò)增片段的堿基序列。其堿基序列如序列號(hào)1所示。5．質(zhì)粒pCF301、pCF335的構(gòu)建設(shè)計(jì)DNA引物ctggtaccgc tcgatccggc tctgcaccgt(序列號(hào)5)ctggagctca ggcaggtgcg ggccacgtgt(序列號(hào)6)使序列表1中545位堿基和2658位堿基間的PstⅠ位點(diǎn)分別改變成KpnⅠ、SacⅠ位點(diǎn)，應(yīng)用這些引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增Lat基因區(qū)域。用KpnⅠ、SacⅠ消化該約2.1Kbp的擴(kuò)增片段，作為嵌入DNA溶液。另外，用限制性酶KpnⅠ、SacⅠ消化pCF704，應(yīng)用Ligation Kitversion 2(TaKaRa)將之與嵌入DNA溶液連接，作為質(zhì)粒pCF301。再用KpnⅠ、SacⅠ消化pCF301，從瓊脂糖膠中切出大約2.1Kbp的片段，將之與用KpnⅠ、SacⅠ消化的pCF235的片段進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pCF335。6．質(zhì)粒pCF301對(duì)lat活性的互補(bǔ)用pCF704轉(zhuǎn)化第二突變株得到的轉(zhuǎn)化株為2nd pCF704株，用pCF301轉(zhuǎn)化第二突變株得到的轉(zhuǎn)化體為2nd pCF301株。將這二種菌株32℃振蕩培養(yǎng)一晚，作為菌種。取其30μl接種到離心管中的3ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(多聚蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 2.0％,pH未調(diào))中，通氣攪拌培養(yǎng)17小時(shí)。將所得培養(yǎng)液1ml離心(1000×g,10分鐘)，收集菌體，用10ml含0.5mM磷酸吡哆醛的0.2M磷酸緩沖液(pH7.3)洗滌。懸浮到同種緩沖液中，用超聲波破碎菌體。通過(guò)離心(1000×g,10分)去除菌體破碎物，得到細(xì)胞提取液。測(cè)定該提取液的lat活性。結(jié)果如圖8所示。pCF301彌補(bǔ)第二突變株的lat突變。7．pCF335對(duì)高谷氨酸生產(chǎn)能力的上調(diào)用pCF704轉(zhuǎn)化野生型泥色黃桿菌IFO 3084株，得到的轉(zhuǎn)化體為野生型pCF704株，用質(zhì)粒pCF301、pCF335轉(zhuǎn)化形成的轉(zhuǎn)化體為野生型pCF301株、pCF335株。將這些菌株接種到3ml含卡那霉素20μg/ml的篩選培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)一晚。將之作為菌種。取其100μl接種到25ml生產(chǎn)培養(yǎng)基中(多聚蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、賴氨酸-HCl 2.0％,pH未調(diào)整)，32℃分別振蕩培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)。用HPLC測(cè)定培養(yǎng)液上清中高谷氨酸的含量。即用蒸餾水將培養(yǎng)液稀釋到氨基酸總濃度為1000mg/L的程度，取50μl到試管中，減壓干燥。向其中加入50μl異氰酸苯酯與三乙胺、乙醇、蒸餾水以1∶1∶7∶2混合的溶液，攪拌溶解，室溫放置10分鐘，然后減壓干燥。將之溶解到500μl HPLC移動(dòng)相的A溶液中，注入5μl。HPLC的條件如實(shí)施例1的5中所述。
結(jié)果如圖9所示，野生型pCF335株高谷氨酸的生產(chǎn)能力大約是野生型pCF704株的2倍。
序列表<110>Mercian Corporation<120>與高谷氨酸的生產(chǎn)相關(guān)的基因及其應(yīng)用<130>K-38Mercian<150>JP10/232382<151>1998-08-05<150>JP11/182362<151>1999-06-28<160>6<210>1<211>2663<212>DNA<213>泥色黃桿菌<220><221>CDS<222>(801)---(2276)<400>1cccgggtgtc attgaatacc agcaggtcgc caggttgcag cagctggtcc agatcgcgca60cctggcgatc ctccagcgca gccggtgccg gcggcaccag cagcaggcgg ctggccgaac 120gctccggcag cggcgcctgg gcaatcagtt cgggaggcag gtggtaggca aaatcggact 180tcttcaacgc cggcagctcg atacaacggg ggcgtcagtt tacgcccctg taccgcctgt 240gccctcaccg ctcgaacttg gtgcccagga tcaccgccgt ggtggtgcgc tcgaccccat 300cagtggcgcc gatggcatcg gtcagctcgt ccatcgccgc cacgccatcg acggcggcca 360tcgccaccag gtcatgcgcg ccactgaccg aatgcaggct gcgcaccgca gcaatggcct 420gcagcgcccg cacgaccgcc ggcattttct tcggcatcac ggtgatggag atatgcgcgc 480ggacctgctg gcgctccatc gcctggccaa ggcgcacggt gtagccggcg attattccgc 540tgtgctgcag ccgctcgatc cggctctgca ccgtggtccg cgacaccccg agccggcgcg 600ccagcgccgc ggtcgaggcg cgcgcatcct cacgcaacag gtcaagcaac tgtgcatccg 660cctgggaaat ggtcactttg 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權(quán)利要求
1．一種分離、純化的DNA，它包括從泥色黃桿菌細(xì)菌可獲得的L-高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)基因，或者其變異體，其中，該突變體在嚴(yán)緊條件下與該基因進(jìn)行雜交，且具有恢復(fù)L-高谷氨酸生產(chǎn)能力缺損的泥色黃桿菌突變株的這種生產(chǎn)能力的功能。
2．權(quán)利要求1的DNA，其中L-高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)基因是編碼選自具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白質(zhì)及具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質(zhì)中至少1種蛋白質(zhì)的一部分或全部的DNA。
3．權(quán)利要求2的DNA，其中編碼具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白質(zhì)的DNA包含序列號(hào)1中801～2276的連續(xù)堿基序列。
4．權(quán)利要求3的DNA，它含有序列號(hào)1的堿基序列或者序列號(hào)1中545～2658位的連續(xù)堿基序列。
5．權(quán)利要求2的DNA，其中編碼具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質(zhì)的DNA包含序列號(hào)2中2855～4387的連續(xù)堿基序列。
6．權(quán)利要求5的DNA，它含有序列號(hào)2中的堿基序列或序列號(hào)2中2077～4578的連續(xù)堿基序列。
7．重組質(zhì)粒，它載有權(quán)利要求1中的DNA，具有自主復(fù)制性或整合復(fù)制性。
8．權(quán)利要求7中的重組質(zhì)粒，其中DNA具有序列號(hào)1中545～2658的連續(xù)堿基序列和/或序列號(hào)2中2077～4578的連續(xù)堿基序列。
9．權(quán)利要求7的重組質(zhì)粒，它能從泥色黃桿菌IFO 3084(pCF213)(FERM BP-6797)獲得。
10．轉(zhuǎn)化體，它是用權(quán)利要求7中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化屬于黃桿菌屬的宿主菌而得到的。
11．L-高谷氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，用載有分離、純化DNA的自主復(fù)制性或整合復(fù)制性重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)過(guò)程中或培養(yǎng)后，使增殖的轉(zhuǎn)化體與L-賴氨酸或L-哌啶-6-羧酸接觸，轉(zhuǎn)換成L-高谷氨酸，然后回收如此產(chǎn)生的高谷氨酸，其中的DNA包含從泥色黃桿菌細(xì)菌可獲得的L-高谷氨酸生產(chǎn)相關(guān)基因，或其變異體，其中該變異體在嚴(yán)緊條件下與該基因進(jìn)行雜交，且具有恢復(fù)泥色黃桿菌突變株生產(chǎn)能力的功能。
12．權(quán)利要求11的L-高谷氨酸的生產(chǎn)方法，其中L-高谷氨酸相關(guān)基因是編碼選自具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白質(zhì)及具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質(zhì)中至少一種蛋白質(zhì)的一部分或全部的DNA。
13．權(quán)利要求12的L-高谷氨酸的生產(chǎn)方法，其中編碼具有L-賴氨酸2-酮戊二酸6-氨基轉(zhuǎn)移酶活性蛋白質(zhì)的DNA包含序列號(hào)1中801～2276的連續(xù)堿基序列。
14．權(quán)利要求12的L-高谷氨酸的生產(chǎn)方法，其中編碼具有哌啶-6-羧酸脫氫酶活性蛋白質(zhì)的DNA包含序列號(hào)2中2855～4387的連續(xù)堿基序列。
15．權(quán)利要求11的L-高谷氨酸的生產(chǎn)方法，其中轉(zhuǎn)化體是用從泥色黃桿菌IFO 3084(pCF213)(FERM BP-6797)可獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化黃桿菌屬的宿主菌而獲得的。
全文摘要
一種參與L－高谷氨酸生產(chǎn)的分離的基因,以及應(yīng)用該基因的L－高谷氨酸生產(chǎn)體系。該基因來(lái)自泥色黃桿菌的基因組。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1311821SQ9980934
公開日2001年9月5日 申請(qǐng)日期1999年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月5日
發(fā)明者藤井匡, 成田隆夫, 仲田邦穗, 上松仁, 恒川博, 一色邦夫, 吉岡武男 申請(qǐng)人:美露香株式會(huì)社