專利名稱：一株基因重組的紅平紅球菌及其在脫除原油有害物－硫和氮中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株基因重組菌及其在脫除原油有害物—硫和氮中的應(yīng)用，具體地說，尤其涉及一株經(jīng)過基因改造過的紅平紅球菌及其在脫除原油有害物—硫和氮中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
石油中非烴化合物雖然在數(shù)量上不占主導(dǎo)地位，但其組成與含量決定了石油的品質(zhì)?；剂厦汉褪椭兴械挠袡C(jī)硫和有機(jī)氮是環(huán)境的重要污染源，這些化合物燃燒時(shí)排放出大量的氧化硫、氧化氮等毒性氣體，由此轉(zhuǎn)化成的大面積酸雨嚴(yán)重污染大氣和水源，破壞生態(tài)平衡，危害人類生存。化石燃料中的含氮化合物又是影響煉油工藝、產(chǎn)品性能的重要因素之一。極微量的氮化物就可引起催化裂化、加氫裂化、加氫精制等工藝過程中貴重的催化劑中毒，導(dǎo)致催化劑的使用壽命變短，增加生產(chǎn)成本，據(jù)統(tǒng)計(jì)減少氮含量的90％，能夠使汽油產(chǎn)量提高20％。石油中含氮化合物包括吡啶、喹啉、異喹啉、吡咯、吲哚、咔唑等及其同系物，但主要為咔唑及其烷基衍生物。研究證明，咔唑等含氮化合物對(duì)含硫化合物的加氫脫硫過程有抑制作用，當(dāng)總氮達(dá)到5％時(shí)就表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用；在油品儲(chǔ)藏過程中含氮化合物的存在降低了油品的抗氧化穩(wěn)定性，導(dǎo)致油色變深及產(chǎn)生膠質(zhì)和沉淀。另外，某些含氮化合物屬于環(huán)境污染物，釋放到環(huán)境中對(duì)人體危害較大，例如咔唑，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明咔唑?qū)π凼缶蛹?xì)胞具有致突變性。
常規(guī)的化學(xué)脫有機(jī)硫、脫有機(jī)氮技術(shù)存在著一定的缺陷。高硫、高氮化石燃料必須預(yù)先經(jīng)過處理才能進(jìn)一步使用。物理的和化學(xué)的處理方法成本巨大，而微生物處理工藝由于操作壓力、溫度低，運(yùn)轉(zhuǎn)成本少，具有廣闊的前景?；瘜W(xué)脫硫方法—加氫脫硫(Hydrodesulfurization，HDS)通過催化過程，將有機(jī)硫轉(zhuǎn)化成H2S氣體，反應(yīng)是在1～20Mpa的壓力和290～450℃的溫度下進(jìn)行的。由于對(duì)化石燃料中的硫含量有嚴(yán)格規(guī)定，再加上HDS方法耗費(fèi)比較高，而生物催化法脫硫(Biodesulfurization，BDS)成本低，在常溫下即可進(jìn)行，并且具有高專一性，這使得BDS方法成為一種可供選擇的方法。為了保護(hù)環(huán)境，隨著汽車排放控制新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以及對(duì)燃油質(zhì)量的深入研究，國(guó)際上對(duì)燃料油的硫含量要求越來越嚴(yán)格。隨著汽車工業(yè)的發(fā)展和環(huán)保要求日益嚴(yán)格，國(guó)產(chǎn)燃油質(zhì)量問題越來越引起社會(huì)的關(guān)注。
石油脫氮技術(shù)的研究一直是石油化工行業(yè)的一個(gè)活躍的研究方向，石油脫氮技術(shù)可分為生物脫氮技術(shù)與非生物脫氮技術(shù)，目前非生物脫氮技術(shù)主要有酸洗脫氮、加氫脫氮、吸附脫氮、溶劑絡(luò)合等。酸洗脫氮，如用磷酸處理柴油，可脫除總氮30～40％，堿氮90％以上，但需消耗一定數(shù)量的化學(xué)試劑，并遺留了酸渣處理問題；加氫精制能有效去除油品中非烴化合物及烯烴，全面提高油品質(zhì)量，但加氫脫氮相對(duì)困難，一般輕質(zhì)油脫氮率小于25％，重質(zhì)油則更低；吸附法與溶劑絡(luò)合法脫氮效果較好，可達(dá)到60％以上，但存在成本較高，消耗的化學(xué)品造成二次污染等問題。生物脫氮技術(shù)是近年來國(guó)際上令人關(guān)注的方向之一。石油中含氮化合物的微生物脫氮技術(shù)是一種有潛力的技術(shù)，目前國(guó)外對(duì)微生物脫氮的研究集中在石油中非堿性含氮化合物的降解，尤其是咔唑及其烷基衍生物的降解研究，主要原因一是由于咔唑及其衍生物在石油氮化物中所占比例高，二是由于石油中的堿性含氮化合物較非堿性含氮化合物更易通過有機(jī)溶劑提取等方法去除，較之其他含氮雜環(huán)化合物，咔唑相對(duì)較難被微生物降解。
化石燃料中的有機(jī)硫主要是二苯并噻吩(Dibenzothiophene，DBT)以及含有更多苯環(huán)的含硫化合物等，生物脫有機(jī)硫的研究主要是以較為簡(jiǎn)單的DBT為模式化合物來進(jìn)行?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多微生物能夠沿著硫?qū)Ｒ煌緩浇到釪BT。它們不打開這些含硫化合物的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因而保留了燃料的熱值，具有較大的應(yīng)用前景，成為近年來研究的熱點(diǎn)。同樣咔唑(carbazole)也是生物脫氮研究的模式化合物，近年來也得到了很大的重視。現(xiàn)在報(bào)道篩選得到的咔唑降解菌株都是遵循同樣的代謝途徑即在咔唑降解基因carABC所編碼的酶系的作用下，降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸，然后在其他酶(CarDEF)的作用下降解鄰氨基苯甲酸生成兒茶酚后，裂解開環(huán)生成丁二酸后被菌株完全代謝。該途徑完全代謝咔唑，應(yīng)用該菌株，相比之下會(huì)損失燃燒值，所以也限制了生物脫氮的應(yīng)用。值得注意的是咔唑代謝途徑中的中間產(chǎn)物鄰氨基苯甲酸是一個(gè)很有價(jià)值的產(chǎn)物，可以作為合成L-色氨酸的前體化合物。另一方面，生物脫硫、生物脫氮現(xiàn)在是用不同的菌株來完成，在工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用的時(shí)候必將提高處理的成本，如果能把生物脫硫和生物脫氮過程結(jié)合起來，用一個(gè)菌株來操作就會(huì)大大降低化石燃料生物處理的成本。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有生物處理化石燃料技術(shù)中的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株紅平紅球菌，以及利用紅平紅球菌來同時(shí)降解燃料中有害的含硫含氮化合物，所述應(yīng)用的方法是使用生物法同時(shí)脫除原油中的有機(jī)硫、有機(jī)氮。
本發(fā)明提供的一株能夠?qū)Ｒ恍越到釪BT生成2-羥基聯(lián)苯，同時(shí)可以降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸的菌株，命名為紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN。該菌株于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國(guó)武漢)，保藏中心編號(hào)為CCTCC No.M205141。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141具有如下生物學(xué)特征紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141為革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，不運(yùn)動(dòng)，形態(tài)有桿狀和棒桿狀，菌落平坦，不透明，凸起，有光澤，不產(chǎn)生水溶性色素，邊緣整齊，生長(zhǎng)后期為粉紅色；表面光滑，無氣生菌絲體；含有飽和及不飽和脂肪酸，同時(shí)還含有結(jié)核菌脂酸；胞壁屬于IV型，部分抗酸。部分生化特征如下可以氧化葡萄糖產(chǎn)酸，不發(fā)酵，不產(chǎn)氣，不能水解淀粉，過氧化氫酶陽性，硝酸鹽還原反應(yīng)陰性。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141中含有的咔唑降解基因序列長(zhǎng)度為5070個(gè)堿基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解二苯并噻吩生成2-羥基聯(lián)苯，同時(shí)降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的培養(yǎng)溫度為25～37℃，可以在基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基上以噻吩類化合物作為唯一硫源生長(zhǎng)同時(shí)降解咔唑，也可以在含有100μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
本發(fā)明涉及的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141在原油脫硫、脫氮中的應(yīng)用，其處理方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無菌條件下接種到含有質(zhì)量體積比為0.003～0.008％的二甲基亞砜(DMSO)的液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下，振蕩培養(yǎng)40～60小時(shí)，制得細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)液；(3)收集細(xì)胞取步驟(2)所得的培養(yǎng)液4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心15～20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0的100mM磷酸鉀緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞；(4)休止細(xì)胞制備使用如步驟(3)的磷酸鉀緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到6～25克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑；(5)處理樣品在反應(yīng)體系中(20～50mL)，以步驟(4)所得的細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶8～25，在25～37℃條件下，200轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩48～72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(6)油樣檢測(cè)以12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心8～15分鐘分離步驟(5)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；取0.2～3μL原油樣品，使用硫氮元素分析儀測(cè)定原油中殘留的硫含量和氮含量，然后以未處理的原油樣品的硫含量和氮含量為對(duì)照，得出經(jīng)以紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理的原油中硫化合物和氮化合物的脫除率。
其中，步驟(2)中所述的菌體培養(yǎng)溫度優(yōu)選是28～32℃；二甲基亞砜(DMSO)的濃度優(yōu)選為0.005～0.008％。
其中，步驟(2)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選是36～50小時(shí)。
其中，步驟(2)中細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)額外添加100μg/ml卡那霉素。
其中，步驟(4)中所述的生物催化劑的菌體濃度優(yōu)選是每升8～17克干細(xì)胞重的菌體；其中，步驟(5)所述原油與水相的體積比例優(yōu)選為1∶15～20。
其中，步驟(5)中處理樣品的溫度優(yōu)選為27～34℃，樣品振蕩時(shí)間優(yōu)選為60～72小時(shí)。
在上述利用紅平紅球菌細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫和有機(jī)氮的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2(Basal Salts Medium 2，BSM2)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以質(zhì)量體積比為0.002～0.008％的DMSO作為硫源。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5±0.2，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
利用本發(fā)明所述的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解DBT，生成相應(yīng)的不破壞碳架結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物2-羥基聯(lián)苯，2-羥基聯(lián)苯更加容易溶解于油相，可以返回原油相中，保持原油的燃燒值；同時(shí)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸，生成的鄰氨基苯甲酸可以釋放到水相中作為有價(jià)值的中間體回收利用(如圖1所示)。
本發(fā)明采用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141休止細(xì)胞作為生物催化劑，能夠有效地同時(shí)降解水體系中的DBT和咔唑。經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以在21小時(shí)內(nèi)完全降解掉0.5mM的DBT和200mg/L的咔唑(如圖2所示)。使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141降解模式化合物DBT和咔唑，發(fā)現(xiàn)體系中存在DBT，咔唑，二苯并噻吩砜，2-羥基聯(lián)苯和鄰氨基苯甲酸(三甲基硅烷化的形式)。通過產(chǎn)物的分析確認(rèn)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以專一性的降解DBT生成不損失燃燒值的2-羥基聯(lián)苯同時(shí)降解咔唑生成有價(jià)值的中間體鄰氨基苯甲酸(如圖3所示)。進(jìn)一步使用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的細(xì)胞來處理原油。使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國(guó)，Antek公司產(chǎn)品)測(cè)定原油的初始含硫量為3,022ppm；初始含氮量為4,656ppm。經(jīng)過紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的作用，硫含量降低至2,508ppm，達(dá)到17％的脫硫率；同時(shí)氮含量降低至3,220ppm，達(dá)到30％的脫氮率。使用GC-PFPD(氣相色譜-脈沖式火焰光度檢測(cè)器)測(cè)定休止細(xì)胞處理前后的原油中的含硫化合物的變化。圖4所示的是經(jīng)過休止細(xì)胞處理之后，GC-PFPD測(cè)定原油中的含硫化合物的分布情況，此時(shí)總硫含量為2,508ppm。處理前后含硫化合物的比較，可以明顯看出經(jīng)過休止細(xì)胞處理之后，原油中的大部分可檢測(cè)到的含硫化合物，如噻吩類，二苯并噻吩類及更加復(fù)雜的含硫化合物都基本脫除，起到了很好的脫硫效果。同時(shí)使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)XPDN CCTCC No.M205141作用原油前后里面的咔唑類化合物的含量變化。如表1所示，經(jīng)過紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理，原油中大部分的咔唑類化合物得到了降解，說明菌株可以同時(shí)降解原油中的含硫化合物和咔唑類含氮化合物。例如在30℃條件下，使用本發(fā)明所述的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141細(xì)胞可將硫含量為3,022ppm的原油中的硫，降低到2,508ppm，脫除率達(dá)到了17％；同時(shí)可將氮含量從4,656ppm降低到3,220ppm，脫氮率達(dá)到了30％。
表1紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理原油前后咔唑類化合物的含量

根據(jù)文獻(xiàn)和專利檢索，F(xiàn)edorak等人在1984年采用混合菌處理原油，也造成了烷烴的損失。Setti等人1992年報(bào)道采用一株能降解烷烴的假單胞菌降解重油中的硫化合物，但是脫硫的過程也造成了烷烴的損失。Kilbane等人2000年報(bào)道使用一株假單胞菌脫除頁巖油(shale oil)中的氮化合物，僅得到了5％的脫除率。同樣Kilbane等人在2002年報(bào)道利用一株篩選到的咔唑降解菌處理頁巖油，該菌只能降解原油中的咔唑和帶有一個(gè)甲基的咔唑，而對(duì)二甲基的咔唑無降解能力。利用專一性脫硫的紅平紅球菌同時(shí)降解原油中的含硫含氮化合物還未見有文獻(xiàn)和專利報(bào)道。
紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141對(duì)原油的總硫含量達(dá)到17％的脫除率，同時(shí)對(duì)總氮的脫除率為30％；而在同樣條件下紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8 ATCC No.53968對(duì)相同原油中的總硫有15.3％的脫除率，但是對(duì)總氮脫除沒有任何效果。說明本發(fā)明的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141具有更好的處理效果，在實(shí)際應(yīng)用中比紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968具有更大的價(jià)值。
本發(fā)明的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141是一個(gè)專一性降解含硫化合物并同時(shí)可以降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸的菌。處理原油結(jié)果發(fā)現(xiàn)有明顯的同時(shí)脫硫脫氮效果，本菌株具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。


本發(fā)明提供的一株紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏中心，保藏地址中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵政編碼430072，其保藏編號(hào)為CCTCC No.M205141。
圖1使用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理原油的示意圖。
圖中示菌體細(xì)胞可以降解DBT生成2-羥基聯(lián)苯返回油相，不損失燃燒值，同時(shí)降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸釋放到水相中，可以回收利用。
圖2紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141同時(shí)降解水體系中的DBT和咔唑的降解曲線。
圖3使用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141降解DBT和咔唑的途徑。
其中A2-羥基聯(lián)苯；B二苯并噻吩；C咔唑；D二苯并噻吩砜；E鄰氨基苯甲酸(三甲基硅烷化的鄰氨基苯甲酸)圖4使用GC-PFPD檢測(cè)休止細(xì)胞處理前后，原油中的含硫化合物的變化。
其中圖對(duì)照是處理之前的原油含硫化合物的色譜圖，圖處理后是紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理之后的原油含硫化合物的色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141菌株的構(gòu)建。
使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的手段，使用引物P15’-gCCgACTAgTAAggAgATggACgTggCg-3’和引物P25’-gACgAgTACTgCAgCgCCgTCATACgTTgC-3’從咔唑降解菌株假單胞菌(Pseudomonas sp.)XLDN4-9的基因組中獲得咔唑降解基因carABC，該基因片段編碼的酶系負(fù)責(zé)降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸。將該基因片斷使用SpeI和ScaI雙酶切后連接到使用SpeI和SnaBI雙酶切處理過的質(zhì)粒載體pRESQ上，其中ScaI和SnaBI酶切位點(diǎn)都是平末端，可以在連接酶的作用下連接起來，利用上述方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCarABC，該質(zhì)?？梢允筩arABC基因在紅平紅球菌中表達(dá)。使用電穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)將重組質(zhì)粒pCarABC導(dǎo)入紅平紅球菌XP中，該菌株可以降解DBT生成2-羥基聯(lián)苯。上述的電穿孔轉(zhuǎn)化技術(shù)條件如下在細(xì)胞生長(zhǎng)至OD600＝0.9～1.2時(shí)收集菌體，4000轉(zhuǎn)每分鐘離心收集菌體，使用無菌蒸餾水洗滌菌體兩遍，同樣離心條件收集菌體，最后使用含有質(zhì)量體積比為10％的甘油重懸菌體，制備濃度為1011個(gè)細(xì)胞/mL的感受態(tài)細(xì)胞，在4℃條件下將0.1mL上述的感受態(tài)細(xì)胞加入內(nèi)壁間隔為0.1厘米的電轉(zhuǎn)化杯(美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品)，電擊電壓1500伏/厘米，電擊結(jié)束后立即加入0.4mL的LB培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)，然后涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固體平板，通過篩選獲得了紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN。
將紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN接種于含有質(zhì)量體積比為0.005％的DMSO的固體斜面基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基，30℃條件下靜止培養(yǎng)40小時(shí)；然后將斜面上的菌轉(zhuǎn)接到25mL的液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2中，30℃，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/每分鐘條件下，震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，制得種子液；以10％的體積比的接種量，將種子液接種于100mL含有質(zhì)量體積比為0.005％的DMSO液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)30小時(shí)。將獲得的菌體4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心15分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0的100mM磷酸鉀緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；使用上述磷酸鉀緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到8克干細(xì)胞/升，將此收集得到的細(xì)胞取25ml加入質(zhì)量體積比為0.005％的DBT和質(zhì)量體積比為0.02％的咔唑，30℃，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/每分鐘條件下，震蕩培養(yǎng)24小時(shí)。測(cè)定剩余的DBT和咔唑含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN處理后，DBT和咔唑完全被降解掉，同時(shí)生成了質(zhì)量體積比為0.012％的鄰氨基苯甲酸，證實(shí)了獲得紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN具有同時(shí)降解DBT和咔唑的能力。
上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏中心，保藏地址中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵政編碼430072，其保藏編號(hào)為CCTCC No.M205141。
上述菌株培養(yǎng)使用液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2(Basal Salts Medium 2，BSM2)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
上述固體斜面基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基為上述液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
上面所述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol/L。
上面所述的維生素混合物的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
上述LB培養(yǎng)基配方如下，1升蒸餾水中含10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，用4N的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到7.5左右，固體LB培養(yǎng)基在上述配方的基礎(chǔ)上加入質(zhì)量體積比為1.6％的瓊脂粉，121℃條件下滅菌20分鐘。
上述的LB固體平板為上述LB培養(yǎng)基成分添加質(zhì)量體積百分比濃度為1.6％的瓊脂粉。
實(shí)施例2上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141中含有的咔唑降解基因的提取。
使用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)5ml的細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.5ml培養(yǎng)物，5000轉(zhuǎn)/每分鐘離心5分鐘；沉淀物加入567μl的TE緩沖液，TE緩沖液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用鹽酸調(diào)整pH為8.0，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，加入30μl質(zhì)量體積比為10％的十二烷基磺酸鈉(SDS)和3μl 20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育2小時(shí)；加入100μl，5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，所述CTAB/NaCl溶液配方如下質(zhì)量體積比為10％的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中，混勻，于65℃溫育10分鐘；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻，12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一支新管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻直到DNA沉淀下來，用一個(gè)封口的離心管將沉淀轉(zhuǎn)移至1ml的70％乙醇中洗滌；12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心20分鐘，棄上清，用凍干機(jī)稍加干燥，重溶于100μl的TE緩沖液。以提取的基因組DNA為模板，利用上海博亞生物技術(shù)有限公司合成的引物P1和P2(與實(shí)施例1中給出的引物P1和P2相同)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在100μl反應(yīng)體系依次混勻下列試劑63μl H2O，10μl 10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液，10倍濃度的PCR反應(yīng)緩沖液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)、100mmol/L的用鹽酸調(diào)整pH為8.8的Tris緩沖液、1mg/ml的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl2，8μl 25mmol/LMgCl2，16μl 4種dNTP的混合物，1μl引物P1，1μl引物P2，1μl模板DNA即上述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的基因組DNA，1μl LA Taq DNA聚合酶，混勻后離心5秒鐘。將混合物在94℃加熱5分鐘。94℃變性1分鐘，55℃退火0.5分鐘，72℃延伸6分鐘，總共30個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)后，于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)混合物擴(kuò)增充分，得到紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)CCTCCM205141的咔唑降解基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將產(chǎn)物測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141菌株含有的咔唑降解基因序列長(zhǎng)度為5070bp，與實(shí)施例1所述的咔唑降解基因序列完全一致，說明導(dǎo)入紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141的基因?yàn)檎_的基因，核苷酸序列如下gccgactagt aaggagatgg acgtggcgaa cgttgatgag gcaattttaa aaagagtaaa 60aggctgggcg ccctacgtgg atgcgaagct aggctttcgc aatcattggt acccggtgat 120gttttcgaaa gagatcgacg agggcgagcc gaagacacta aaactgctcg gtgagaactt 180gctcgtcaat cgtatcgatg ggaagctgta ttgcctcaag gaccgctgcc tacatcgcgg 240cgtccagttg tcggtcaaag tcgagtgcaa aacgaagtcg acgatcacat gctggtacca 300cgcgtggacc tatcgctggg aagacggcgt tctgtgcgac atcttgacga atccgacaag 360cgcacagatc ggtcgacaaa agctgaaaac ttacccagtg caggaagcca agggctgcgt 420cttcatttat cttggcgatg gcgaccctcc tcccttggcc cgcgatacgc cacccaattt 480ccttgacgat gacatggaaa tcctcgggaa gaaccaaatc atcaagtcta actggcgcct 540cgctgtggaa aacggtttcg atccgagcca catttatatt cacaaagact caattctggt 600caaggacaac gatcttgcct tgccactagg tttcgcgcca ggaggggatc gaaagcaaca 660aactcgtgtg gttgacgatg acgtcgtcgg acgcaagggt gtttacgatc ttattggcga 720acatggggtc ccagtgtttg agggaactat cgggggcgaa gtggtccgcg aaggtgccta 780cggcgaaaaa attgtagcga acgatatctc catttggctc ccgggtgttc tcaaggtcaa 840tccgttcccc aatccggaca tgatgcagtt cgagtggtac gtgccgattg acgaaaacac 900acactattac ttccaaactc ttggcaaacc atgtgccaat gacgaggaac ggaagaatta 960cgaacaagag ttcgaaagca agtggaaacc gatggcgctc gaagaattca acaacgatga 1020catctgggct cgcgaagcta tggtggattt ctacgccgat gataaaggct gggtcaacga 1080gattttgttc gaggtggacg aggctatcgt ggcatggcgc aagctggcga gcgaacacaa 1140tcagggtatt cagacccaag cgcacgtttc gggctgaaag aatttgtcgg tagtcgtgcc 1200actcaccaat ggcacgaaca acgaggagaa cgcaatggct cgatatgaag tcgatcgcct 1260Aattcaggac atgtcgaaaa aagaagggct cattgggcgc gtgatcgaca caccatcgga 1320tgtctttgag gagtacggtt taacgcctcc tgaacgcact gcgctgctcg agggtactcc 1380gcaagcacta gcttcgattg gtgtgcatcc gattctgcag atgcactact tgatgtacaa 1440aaatcctgaa atggctactc acgtttctat taaggattat tccgatatgt tgaaaggagg 1500
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實(shí)施例3利用紅平紅球菌細(xì)胞同時(shí)降解水體系中的咔唑和二苯并噻吩方法，處理溫度為30℃。
本發(fā)明利用紅平紅球菌在同時(shí)降解水體系中的DBT和咔唑的應(yīng)用，其方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)菌種培養(yǎng)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接種于100mL含有質(zhì)量體積比為0.008％的DMSO液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；(3)收集細(xì)胞取步驟(2)所得的培養(yǎng)液4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(4)休止細(xì)胞制備使用如步驟(3)的磷酸緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到8克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑；(5)處理樣品在20mL的反應(yīng)體系中，以步驟(4)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入質(zhì)量體積比為0.01％的DBT和質(zhì)量體積比為0.02％的咔唑，在30℃條件下，250轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩21小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(6)檢測(cè)將步驟(5)所處理的樣品，加入20mL的乙酸乙酯，30℃條件下，250轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩1小時(shí)，以萃取水相中殘余的DBT和咔唑，然后將該體系以10,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心5分鐘，得到上層乙酸乙酯相，該乙酸乙酯相體系中應(yīng)該含有要檢測(cè)的DBT和咔唑；取1μL乙酸乙酯樣品，使用氣相-氫火焰檢測(cè)器(GC-FID)測(cè)定乙酸乙酯中殘留的DBT和咔唑，然后以未加入紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDNCCTCC No.M205141處理的樣品中的DBT和咔唑含量為對(duì)照，得出經(jīng)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理后，水體系中的DBT和咔唑得到100％的降解，說明紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141就是目的菌株；在上述利用紅平紅球菌細(xì)胞脫除水體系中的DBT和咔唑的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2(Basal Salts Medium，BSM2)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.005％的DMSO作為硫源。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例4利用紅平紅球菌休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫和有機(jī)氮的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶15，處理溫度為27℃。
本發(fā)明利用紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其脫硫脫氮方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)菌種培養(yǎng)將紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接種于50mL含有質(zhì)量體積比為0.005％的DMSO液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，28℃條件下，振蕩培養(yǎng)36小時(shí)；(3)收集細(xì)胞取步驟(2)所得的培養(yǎng)液4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(4)休止細(xì)胞制備使用如步驟(3)的磷酸緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到12克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑；(5)處理樣品在30mL的反應(yīng)體系中，以步驟(4)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶15，在27℃條件下，250轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩60小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(6)油樣檢測(cè)以12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘分離步驟(5)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；取0.2μL步驟原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國(guó)，Antek公司產(chǎn)品)測(cè)定原油中殘留的硫含量和氮含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量和氮含量，得出經(jīng)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理的原油的脫硫率為7.3％，脫氮率為15％；在上述利用紅平紅球菌細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫、有機(jī)氮的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方為甘油4克/升，KH2P042.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.005％的DMSO作為硫源。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例5利用紅平紅球菌細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫和有機(jī)氮的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶20，處理溫度為30℃。
本發(fā)明利用紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其脫硫脫氮方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；
(2)菌種培養(yǎng)將紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接種于50mL含有質(zhì)量體積比為0.008％的DMSO液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)；(3)收集細(xì)胞取步驟(2)所得的培養(yǎng)液4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(4)休止細(xì)胞制備使用如步驟(3)的磷酸緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到16克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑；(5)處理樣品在30mL的反應(yīng)體系中，以步驟(4)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶20，在30℃條件下，250轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(6)油樣檢測(cè)以12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘分離步驟(5)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；取0.2μL原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國(guó)，Antek公司產(chǎn)品)測(cè)定原油中殘留的硫含量和氮含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量和氮含量，得出經(jīng)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理的原油的脫硫率為17％，脫氮率為30％；在上述利用紅平紅球菌細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫、有機(jī)氮的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.008％的DMSO作為硫源。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例6利用紅平紅球菌休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫和有機(jī)氮的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶18，處理溫度為34℃。
本發(fā)明利用紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其脫硫脫氮方法涉及的步驟順序如下
(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)菌種培養(yǎng)將紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141接種于50mL含有質(zhì)量體積比為0.005％的DMSO液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，32℃條件下，振蕩培養(yǎng)36小時(shí)；(3)收集細(xì)胞取步驟(2)所得的培養(yǎng)液4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(4)休止細(xì)胞制備使用如步驟(3)的磷酸緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到15克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑；(5)處理樣品在30mL的反應(yīng)體系中，以步驟(4)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶18，在34℃條件下，250轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩68小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(6)油樣檢測(cè)以12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘分離步驟(5)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；取0.2μL原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國(guó)，Antek公司產(chǎn)品)測(cè)定原油中殘留的硫含量和氮含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量和氮含量，得出經(jīng)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理的原油的脫硫率為10％，脫氮率為12％；在上述利用紅平紅球菌細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫、有機(jī)氮的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.008％的DMSO作為硫源。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
實(shí)施例7利用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968休止細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫的方法，其中加入的原油與水相的體積比為1∶20，處理溫度為30℃。
本發(fā)明利用紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其脫硫脫氮方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968〖該菌株保藏于美國(guó)典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Md.20852)〗；(2)菌種培養(yǎng)將紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968接種于50mL含有質(zhì)量體積比為0.005％的DMSO液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，30℃條件下，振蕩培養(yǎng)36小時(shí)；(3)收集細(xì)胞取步驟(2)所得的培養(yǎng)液4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞；(4)休止細(xì)胞制備使用如步驟(3)的磷酸緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到17克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌休止細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑；(5)處理樣品在30mL的反應(yīng)體系中，以步驟(4)所得的休止細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶20，在30℃條件下，250轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(6)油樣檢測(cè)以12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心10分鐘分離步驟(5)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；取0.2μL原油樣品，使用Antek7000硫氮元素分析儀(美國(guó)，Antek公司產(chǎn)品)測(cè)定原油中殘留的硫含量和氮含量，然后對(duì)照未處理的樣品硫含量和氮含量，得出經(jīng)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968處理的原油的脫硫率為15％，脫氮率為0％；在上述利用紅平紅球菌細(xì)胞脫除原油中有機(jī)硫、有機(jī)氮的方法中，菌株培養(yǎng)使用液體基本無機(jī)鹽培養(yǎng)基2(Basal Salts Medium 2，BSM 2)，配方為甘油4克/升，KH2PO42.44克/升，Na2HPO414.04克/升，NH4Cl 1克/升，質(zhì)量百分比為1％的CaCl2100微升/升，質(zhì)量百分比為10％的MgCl2·6H2O 2毫升/升，質(zhì)量百分比為1％的FeCl3100微升/升，維生素混合液200毫升/升的，離子混合液5毫升/升。121℃條件下滅菌20分鐘。
以0.005％的DMSO作為硫源。
上述的離子混合液的配方為，每升蒸餾水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol/L。
上述的維生素混合液的配方為，每升蒸餾水含有400mg泛酸鈣(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/煙酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg對(duì)氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB 12(Cyanocobalamin)。
通過實(shí)施例7與實(shí)施例5的對(duì)比可以看到，紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141對(duì)原油的總硫含量達(dá)到17％的脫除率，同時(shí)對(duì)總氮的脫除率為30％；而在同樣條件下紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968對(duì)相同原油中的總硫有15.3％的脫除率，但是對(duì)總氮脫除沒有任何效果，說明上述的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141具有更好的處理效果，在實(shí)際應(yīng)用比紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)IGTS8ATCC No.53968具有更大的價(jià)值。
序列表SEQ ID N0.1<110>山東大學(xué)<120>一株基因重組的紅平紅球菌及其在脫除原油有害物--硫和氮中的應(yīng)用<141>2006-2-15<211>5070<212>DNA<213>紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)<221>紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141咔唑降解基因<222>(1)…(5070)<400>
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權(quán)利要求
1.一株紅平紅球菌，其特征在于該菌名為紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，已于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型微生物菌種保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC No.M205141。
2.如權(quán)利要求1所述的紅平紅球菌，其特征是，紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141為革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，形態(tài)有桿狀和棒桿狀，菌落平坦，不透明，凸起，有光澤，不產(chǎn)生水溶性色素，邊緣整齊，生長(zhǎng)后期為粉紅色；表面光滑，無氣生菌絲體；含有飽和及不飽和脂肪酸，同時(shí)還含有結(jié)核菌脂酸；胞壁屬于IV型，部分抗酸；所述的紅平紅球菌中含有的咔唑降解基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1；所述紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141可以降解二苯并噻吩生成2-羥基聯(lián)苯，同時(shí)降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸。
3.權(quán)利要求1所述的紅平紅球菌在脫除原油有害物—硫和氮中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的紅平紅球菌在脫除原油有害物—硫和氮中的應(yīng)用，其方法涉及的步驟順序如下(1)菌種選擇選用紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141；(2)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)用步驟(1)的菌株，在無菌條件下接種到含有質(zhì)量體積比為0.003～0.008％的二甲基亞砜的液體無機(jī)鹽基本培養(yǎng)基中，25℃～37℃條件下，振蕩培養(yǎng)40～60小時(shí)，制得細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)液；(3)收集細(xì)胞取步驟(2)所得的培養(yǎng)液4,500轉(zhuǎn)/每分鐘離心15～20分鐘，收集沉淀細(xì)胞，使用pH7.0的100mM磷酸鉀緩沖液重懸細(xì)胞，再以相同的條件離心，重復(fù)2～3次，收集沉淀細(xì)胞；(4)休止細(xì)胞制備使用如步驟(3)的磷酸鉀緩沖液重懸沉淀細(xì)胞，使菌體濃度達(dá)到6～25克干細(xì)胞/升，此細(xì)胞懸濁液即為制備好的紅平紅球菌細(xì)胞懸濁液，也稱生物催化劑；(5)處理樣品在反應(yīng)體系中，以步驟(4)所得的細(xì)胞懸濁液作為水相，加入原油，使原油與水相的體積比為1∶8～25，在25～37℃條件下，200轉(zhuǎn)/每分鐘振蕩48～72小時(shí)，進(jìn)行樣品處理；(6)油樣檢測(cè)以12,000轉(zhuǎn)/每分鐘離心8～15分鐘分離步驟(5)中處理后的樣品，得到上層原油樣品；取0.2～3μL原油樣品，使用硫氮元素分析儀測(cè)定原油中殘留的硫含量和氮含量，然后以未處理的原油樣品的硫含量和氮含量為對(duì)照，得出經(jīng)以紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN CCTCC No.M205141處理的原油中硫化合物和氮化合物的脫除率。
5.如權(quán)利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)、(3)中所述的菌體培養(yǎng)溫度是28～32℃；二甲基亞砜的濃度為0.005～0.008％。
6.如權(quán)利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中所述的菌體培養(yǎng)時(shí)間是36～50小時(shí)。
7.如權(quán)利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(3)、(4)中所述的生物催化劑的菌體濃度是每升8～17克干細(xì)胞重的菌體。
8.如權(quán)利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)中所述的原油與水相的體積比例為1∶15～20。
9.如權(quán)利要求4所述的紅平紅球菌在原油脫硫脫氮中的應(yīng)用，其特征在于，步驟(5)中處理樣品的溫度為27～34℃，樣品振蕩時(shí)間為60～72小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株基因重組的紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)XPDN，該菌株于2005年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，中國(guó)武漢)，保藏中心編號(hào)為M205141。本發(fā)明還公開了所述的紅平紅球菌及其在脫除原油有害物一硫和氮中的應(yīng)用，其脫硫脫氮方法包括菌體培養(yǎng)；收集菌體；制備休止細(xì)胞；處理原油樣品；油樣檢測(cè)等步驟；該方法操作簡(jiǎn)單，具有在處理原油時(shí)一次脫除原油有害物—硫和氮的能力，降解二苯并噻吩生成2－羥基聯(lián)苯并降解咔唑生成鄰氨基苯甲酸等特點(diǎn)，在污染治理方面具有很大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12S1/02GK1834229SQ200610042259
公開日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日
發(fā)明者許平, 于波, 馬翠卿, 李福利, 馮進(jìn)輝, 周文娟, 陶飛, 王穎, 蔡曉鳳 申請(qǐng)人:山東大學(xué)