專利名稱：：生物絮凝劑xm-11的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物絮凝劑，尤其是涉及一種生物絮凝劑XM-ll的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法。技術(shù)背景20世紀(jì)80年代末，日本在微生物絮凝劑開發(fā)上取得了引人注目的成果，通產(chǎn)省工業(yè)技術(shù)研究所的倉根一郎等人已從土壤中分離出紅平紅球菌的S—l菌株，并獲得了由其產(chǎn)生的第一種生物絮凝劑^N0C-1，該絮凝劑仍是目前發(fā)現(xiàn)的效果最好的生物絮凝劑。Kurane對其進(jìn)行了深入透徹的研究，包括其產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、分離純化、分子結(jié)構(gòu)的剖析以及應(yīng)用(KuraneR，ToedaK，TakedaK,SuzukiT.CultureconditionforproductionofmicrobialflocculantbyA/jodococcmeW/wo^oto.AgricBiolChem.，1986,50:2309-2313;KuraneR,HatamochiK,KakunoT,et.al.PurificationandcharacterizationoflipidbioflocculantproducedbyiAoflbcocc^ye^^rapofc.BiosciBiotechnolBiochem，1994,58:1977-1982)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種微生物絮凝劑產(chǎn)生菌，其中研究較深入的還有擬青霉(尸^"70附3^^sp.)、醬油曲霉04^wgz7/Msq/"e)等。2004年，Kumar等從韓國仁川附近被污染的灘涂中篩選出一株新的絮凝劑高產(chǎn)菌株^^z7/^sp.1-450?？傊?，關(guān)于生物絮凝劑，目前已有的理論研究主要集中在鑒別絮凝物質(zhì)，測定絮凝物質(zhì)的性質(zhì)(KuraneR,HatamochiK,KakunoT，etal.Chemicalstructureoflipidbioflocculantproducedbyi.eo^rapofc.AgricBiolChem.，1995,59:1652-1656)，觀測絮凝效果(KuraneR,TakedaK,SuzukiT.Screeningandcharacteristicsofmicrobialflocculants.AgricBiolChem.，1986,50:2301-2307),以及通過遺傳基因工程尋找具有絮凝功能的遺傳因子以用于組建工程菌(MikiBL，PoonNH，JamesAP,andSeligyVL.PossiblemechanismforflocculationinteractionsgovernedbygeneFLOlinSaccharomycescerevisiae.J.Bacteriol，1982,150:878-889)。絮凝劑作為微生物的代謝產(chǎn)物，其合成受到許多因素的影響，包括培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度、通氣狀況等。研究這些影響因素對于提高絮凝劑產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本進(jìn)而推動生物絮凝劑的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的意義。目前的研究大都集中在營養(yǎng)條件對絮凝劑合成的影響方面。i.eo^rapofc要求以葡萄糖，果糖為碳源，以尿素和硫酸銨為無機(jī)氮源，有機(jī)氮源酵母膏和酪蛋白水解物能刺激絮凝齊U的產(chǎn)生(KuraneR，ToedaK,TakedaK，SuzukiT.Cultureconditionforproductionofmicrobialflocculantby及/cwtocoa;i^eo^rapo/^.AgricBiolChem1986,50:2309-2313)。KN03作為細(xì)菌菌株S-4K'發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳氮源，是絮凝劑終產(chǎn)量的最重要的影響因素之一，而尿素不利于該菌合成絮凝齊U(HuangSL.StudiesoncultureconditionforproductionofflocculantbybacterialstrainS-4K.TaiwanTangyeYanjiusuoYanjiuHuibao1990,129:11-19)。培養(yǎng)基中的離子種類與濃度對絮凝劑的產(chǎn)生也有較大的影響。PaecZ/off^t^sp.1-1在10mg/mLCaO下，菌體生長和絮凝劑產(chǎn)量均有較大幅度的提高(TakagiH，KadowakiK.Flocculantproductionby■Paeci'/omycessp.Taxonomicstudiesandcultureconditionsforproduction.AgricBiolChem1985,49(11):3151-3157)。但某些菌株只有在低離子濃度下才能提高絮凝活性，高離子濃度則抑制絮凝劑的產(chǎn)生。絮凝劑合成的最佳pH—般為中性到偏堿性，過酸或過堿均不利于絮凝劑的產(chǎn)生(王鎮(zhèn)，王孔星，謝裕敏，姚茵麗。幾株絮凝劑產(chǎn)生菌的特性研究，微生物學(xué)報，1995，35(2):121-129)。此外，作為最基本的發(fā)酵條件之一，發(fā)酵體系中溶氧濃度(DOT)的改變會引起微生物胞內(nèi)代謝流的重新分配，因此，對于好氧微生物的代謝產(chǎn)物，DOT作為通風(fēng)發(fā)酵控制中的關(guān)鍵參數(shù)之一，直接影響著生物絮凝劑的生產(chǎn)過程和生產(chǎn)成本。優(yōu)化控制發(fā)酵過程溶氧水平可以實現(xiàn)生物絮凝劑產(chǎn)量的大幅度提高。然而，近年來這一點卻一直被國內(nèi)外生物絮凝劑研究學(xué)者忽略。Kurane(KuraneR,ToedaK，TakedaK，SuzukiT.Cultureconditionforproductionofmicrobialflocculantbyi/oifococci^eo^/zra/wto.AgricBiolChem1986，50:2309-2313)曾經(jīng)對i.eo^ra/wfcS-l合成生物絮凝劑NOC-l的溶氧條件進(jìn)行探討。發(fā)現(xiàn)，通氣量過大，NOC-1產(chǎn)量出現(xiàn)顯著下降；當(dāng)停止通氣，僅僅維持500r/min的攪拌轉(zhuǎn)速時，NOC-1活性達(dá)到最大。而通氣量的變化對細(xì)胞生長影響不大。王鎮(zhèn)(王鎮(zhèn)，王孔星.微生物絮凝劑的研究概況，微生物學(xué)通報，1993，20(6):362-367;王鎮(zhèn)，王孔星，謝裕敏，姚茵麗.幾株絮凝劑產(chǎn)生菌的特性研究，微生物學(xué)報，1995，35(2):121-129)則發(fā)現(xiàn)，通氣量加大會刺激細(xì)菌產(chǎn)生絮凝劑。雖然這些研究者都發(fā)現(xiàn)發(fā)酵體系中的溶氧濃度直接影響生物絮凝劑的合成，但是他們均未對產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因進(jìn)行分析，亦未對此做更加深入系統(tǒng)的研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種生物絮凝劑XM-11的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是以諾卡氏菌為出發(fā)菌株，以葡萄糖、酵母膏、尿素作為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要原料，采用分階段供氧控制模式發(fā)酵合成生物絮凝劑XM—11。本發(fā)明采用的菌種為諾卡氏菌(A^caW&sp.)XM-Bll，于2007年08月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2135。本發(fā)明包括以下步驟1)將菌種在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2)種子培養(yǎng)時間為816h，接種量為8%15%;3)液體發(fā)酵條件為253(TC;4)液體發(fā)酵分階段供氧控制模式為發(fā)酵初期020h維持?jǐn)嚢柁D(zhuǎn)速100150r/min，至第3056h結(jié)束發(fā)酵。液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成可采用葡萄糖、尿素、酵母膏、KH2P04、NaCl和MgS(V7H20。液體發(fā)酵培養(yǎng)基各成份的含量最好為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖1520g、尿素0.51g、酵母膏0.51g、KH2PO40.2g、NaCl0.2g和MgS04'7H200.4g。液體發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH最好為4.010.0。液體發(fā)酵的整個發(fā)酵過程通氣量最好為l3L/L/min。由于本發(fā)明采用分階段供氧控制模式發(fā)酵合成生物絮凝劑，既保證菌種在發(fā)酵初期階段生長良好，又使發(fā)酵后期生物絮凝劑處于最佳的合成狀態(tài)，同時大大減少了生物絮凝劑的生產(chǎn)能耗，降低生產(chǎn)成本，促進(jìn)了生物絮凝劑在工業(yè)生產(chǎn)中的實際應(yīng)用進(jìn)程。根據(jù)實驗，采用該分階段供氧控制模式，諾卡氏菌在菌體量保持較高水平的情況下，生物絮凝劑產(chǎn)量較單一攪拌轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵過程提高了近65%，發(fā)酵周期亦大大縮短。圖1為本發(fā)明實施例不同單一攪拌轉(zhuǎn)速下菌體生長量隨時間的變化曲線。在圖1中，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間(h)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞干重(g/L)。,Or/min，▲100r/min，200r/minx300r/min。圖2為本發(fā)明實施例不同單一攪拌轉(zhuǎn)速對絮凝活性的影響。在圖2中，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間(h)，縱坐標(biāo)為生物絮凝劑XM-ll的絮凝活性(U/mL)。0r/min，▲100r/min，200r/minx300r/min。圖3為本發(fā)明實施例不同單一攪拌轉(zhuǎn)速下XM-ll濃度及產(chǎn)率系數(shù)的變化。在圖3中，橫坐標(biāo)為攪拌轉(zhuǎn)速(r/min)，左縱坐標(biāo)為生物絮凝劑XM-ll的產(chǎn)量(ng/mL)，右縱坐標(biāo)為生物絮凝劑的產(chǎn)率系數(shù)(Yp/s，g/g)。A生物絮凝劑XM—11的產(chǎn)量，■生物絮凝劑XM—ll的產(chǎn)率系數(shù)。圖4為本發(fā)明實施例分階段供氧控制的分批發(fā)酵過程曲線。在圖4中，橫坐標(biāo)為時間培養(yǎng)時間(h)，左縱坐標(biāo)為生物絮凝劑XM-ll的絮凝活性(U/mL)，右縱坐標(biāo)為殘?zhí)橇?g/L)和細(xì)胞干重(g/L)。絮凝活性，△細(xì)胞干重，■殘?zhí)菨舛?。具體實施方式以下實施例主要詳細(xì)地解釋本發(fā)明中的某些關(guān)鍵點，以便更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容。實施例1采用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖15g/L，尿素0.5g/L，酵母膏0.5g/L;種子培養(yǎng)時間為8h，接種量8%;發(fā)酵溫度25'C，培養(yǎng)基初始pH4.0。發(fā)酵過程維持單一攪拌轉(zhuǎn)速，考察不同攪拌轉(zhuǎn)速對菌體生長的影響。圖1為不同攪拌轉(zhuǎn)速下生物絮凝劑合成菌株菌體量隨時間的變化曲線。由圖1可見，菌體生長量存在一最佳攪拌轉(zhuǎn)速——100r/min，攪拌轉(zhuǎn)速過高或過低都會引起菌體生長量降低；但在較高的攪拌轉(zhuǎn)速下，菌體比生長速率較高，這樣可以縮短菌體達(dá)到最高生長量的時間。如在300r/min條件下發(fā)酵時，菌體生長達(dá)到最大值的時間可比100r/min時提前4~5h。在搖瓶發(fā)酵過程中還發(fā)現(xiàn)，裝液量較少時(15~50mL/250mL錐形瓶)，發(fā)酵后期會出現(xiàn)菌體自絮凝現(xiàn)象。這是菌體細(xì)胞本身對轉(zhuǎn)速過高而引發(fā)的毒害作用的一種抵御和自我保護(hù)措施?？梢姡D(zhuǎn)速增加雖然能夠加快細(xì)胞代謝速率，縮短細(xì)胞生長周期，但同時也會對細(xì)胞生長造成毒害作用，從而影響最終菌體細(xì)胞生長量。實施例2采用如實施例1所述發(fā)酵條件，考察攪拌轉(zhuǎn)速對菌體生長的影響。其區(qū)別在于所使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖20g/L，尿素lg/L，酵母膏l(xiāng)g/L;種子培養(yǎng)時間為16h，接種量15%;發(fā)酵溫度30。C，培養(yǎng)基初始pH10.0。實施例3采用如實施例1所述發(fā)酵條件，考察攪拌轉(zhuǎn)速對菌體生長的影響。其區(qū)別在于所使用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖18g/L，尿素0.8g/L，酵母膏0.8g/L;種子培養(yǎng)時間為12h，接種量10%;發(fā)酵溫度28'C，培養(yǎng)基初始pH7.8。實施例4如實施例1所述發(fā)酵條件，在5L發(fā)酵罐上考察不同攪拌轉(zhuǎn)速對生物絮凝劑XM—ll合成的影響。圖2為不同攪拌轉(zhuǎn)速下生物絮凝劑XM-11的絮凝活性隨時間的變化趨勢曲線。圖3為攪拌轉(zhuǎn)速對XM-ll終產(chǎn)量及產(chǎn)率系數(shù)的影響。由圖2可見，在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速對絮凝劑的合成影響較大，這種影響主要體現(xiàn)在發(fā)酵過程的中后期階段。隨攪拌轉(zhuǎn)速增加，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到15h后，絮凝活性開始出現(xiàn)顯著差距，尤其當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速升高至200r/tnin時，其發(fā)酵所得絮凝活性比不攪拌發(fā)酵(0r/min)時降低了70%以上；當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速升高至300r/min時，絮凝活性幾乎消失。實施例5如實施例2所述發(fā)酵條件，在5L發(fā)酵罐上考察不同攪拌轉(zhuǎn)速對生物絮凝劑XM—ll合成的影響。實施例6如實施例3所述發(fā)酵條件，在5L發(fā)酵罐上考察不同攪拌轉(zhuǎn)速對生物絮凝劑XM—ll合成的影響。實施例7采用上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其中葡萄糖15g/L，尿素0.5g/L，酵母膏0.5g/L;種子培養(yǎng)時間為8h，接種量8%;發(fā)酵溫度25'C，培養(yǎng)基初始pH4.0。發(fā)酵過程的分階段供氧控制策略為020h維持?jǐn)嚢柁D(zhuǎn)速100r/min，20h后停止攪拌至第45h，整個發(fā)酵過程通氣量維持在1L/L/min。分階段供氧控制發(fā)酵過程曲線如圖4所示。為了更深入地理解不同攪拌方式下發(fā)酵過程的特征，對不同攪拌方式下發(fā)酵過程的主要參數(shù)進(jìn)行了比較(參見表l)。表1不同供氧控制模式下的發(fā)酵過程主要參數(shù)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>有明顯提高，但進(jìn)入后期階段后，絮凝劑產(chǎn)量出現(xiàn)了大幅度提高，最終發(fā)酵液所得絮凝活性達(dá)到900.0U/mL，比單一攪拌轉(zhuǎn)速下的最高產(chǎn)量550U/mL提高了63.6%，發(fā)酵周期也由34h縮短到30h。而菌體生長量與攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min和200r/min時的基本相當(dāng)。從表1可以更清楚地看到采用分階段供氧控制模式優(yōu)化生物絮凝劑XM—ll的發(fā)酵過程非常有效。與單一攪拌轉(zhuǎn)速控制模式相比，在前者的發(fā)酵狀態(tài)下，不僅絮凝劑產(chǎn)量有了大幅度提高，其生產(chǎn)強(qiáng)度也比攪拌轉(zhuǎn)速恒定為0、100和200r/min的分批發(fā)酵過程分別提高了81.2%、120%和420%;同時產(chǎn)率比只通氣不攪拌時提高45%。實施例8采用如實施例7所述發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，考察分階段供氧控制發(fā)酵模式對生物絮凝劑XM—11合成的影響。其區(qū)別在于所采用的分階段供氧控制策略為020h維持?jǐn)嚢柁D(zhuǎn)速150r/min，20h后停止攪拌，發(fā)酵至第56h結(jié)束，整個發(fā)酵過程通氣量維持在3L/L/min。實施例9采用如實施例7所述發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，考察分階段供氧控制策略對生物絮凝劑XM—ll合成的影響。其區(qū)別在于所采用的分階段供氧控制策略為020h維持?jǐn)嚢柁D(zhuǎn)速120r/min，20h后停止攪拌，發(fā)酵至第48h結(jié)束，整個發(fā)酵過程通氣量維持在2L/L/min。實施例10采用如實施例7所述發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件，考察分階段供氧控制發(fā)酵模式對生物絮凝劑XM—11合成的影響。其區(qū)別在于所采用的分階段供氧控制策略為0-20h維持?jǐn)囻绒D(zhuǎn)速100r/min，20h后停止攪拌，發(fā)酵至第30h結(jié)束，整個發(fā)酵過程通氣量維持在1.5L/L/min。8權(quán)利要求1.生物絮凝劑XM-11的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法，采用的菌種為諾卡氏菌(Nocardiasp.)XM-B11，于2007年08月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo.2135，其特征在于包括以下步驟1)將菌種在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2)種子培養(yǎng)時間為8～16h，接種量為8％～15％；3)液體發(fā)酵條件為25～30℃；4)液體發(fā)酵分階段供氧控制模式為發(fā)酵初期0～20h維持?jǐn)嚢柁D(zhuǎn)速100～150r/min，至第30～56h結(jié)束發(fā)酵。2.如權(quán)利要求l所述的生物絮凝劑XM-ll的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成采用葡萄糖、尿素、酵母膏、KH2P04、NaCl和MgSCV7H20。3.如權(quán)利要求l所述的生物絮凝劑XM-ll的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法，其特征在于液體發(fā)酵培養(yǎng)基各成份的含量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖1520g、尿素0.5lg、酵母膏0.5lg、KH2PO40.2g、NaC10.2g和MgS04.7H200.4g。4.如權(quán)利要求l所述的生物絮凝劑XM-ll的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法，其特征在于液體發(fā)酵的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為4.010.0。5.如權(quán)利要求l所述的生物絮凝劑XM-ll的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法，其特征在于液體發(fā)酵的整個發(fā)酵過程通氣量為13L/L/min。全文摘要生物絮凝劑XM-11的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法，涉及一種生物絮凝劑，尤其是涉及一種生物絮凝劑XM-11的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法。提供一種生物絮凝劑XM-11的發(fā)酵過程分階段供氧的控制方法。菌種為諾卡氏菌(Nocardiasp.)XM-B11。將菌種在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；種子培養(yǎng)時間為8～16h，接種量為8％～15％；液體發(fā)酵條件為25～30℃；液體發(fā)酵分階段供氧控制模式為發(fā)酵初期0～20h維持?jǐn)嚢柁D(zhuǎn)速100～150r/min，至第30～56h結(jié)束發(fā)酵。既保證菌種在發(fā)酵初期階段生長良好，又使發(fā)酵后期生物絮凝劑處于最佳合成狀態(tài)，減少生物絮凝劑的生產(chǎn)能耗，降低成本。文檔編號C12N1/20GK101165169SQ20071000960公開日2008年4月23日申請日期2007年9月28日優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日發(fā)明者寧何,盧英華,寅李,李清彪,堅陳申請人:廈門大學(xué)