Muc1和il-2雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種MUC1和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MUC1基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和MUC1基因；所述MUC1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQID?NO:3所示。本發(fā)明所述的雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來(lái)連接MUC1基因和IL-2基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)人上皮粘蛋白以及人白細(xì)胞介素-2，該重組載體可用于腫瘤的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
【專利說(shuō)明】MUC1和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤免疫治療的目的，不僅要有效激活消除腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，還要建立起長(zhǎng)遠(yuǎn)的抗腫瘤記憶效應(yīng)。腫瘤免疫治療包括兩個(gè)主要的策略:非特異性輔助免疫治療和抗原特異性免疫治療。非特異性輔助免疫治療，是通過(guò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)或局部細(xì)胞因子或共刺激分子的濃度來(lái)刺激免疫系統(tǒng)?？乖禺愋悦庖咧委?，包括抗原的轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)和呈遞，抗原激活的T細(xì)胞的遷移，以及采用抗原負(fù)載的DC細(xì)胞治療等。
[0003]研究表明，通過(guò)載體表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原并共表達(dá)細(xì)胞因子或共刺激分子，表現(xiàn)出相互協(xié)同促進(jìn)的作用，有助于誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。由此可見(jiàn)，要誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫應(yīng)答，不僅需要腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)和呈遞，還需要增強(qiáng)共刺激分子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫作用。在多數(shù)研究中，抗腫瘤免疫應(yīng)答的效果與共表達(dá)的免疫促進(jìn)型細(xì)胞因子和共刺激分子的數(shù)目呈正相關(guān)。
[0004]細(xì)胞因子基因免疫是目前腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)，將具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子基因?qū)胨拗黧w內(nèi)，并使之穩(wěn)定有效地表達(dá)，使體內(nèi)持續(xù)存在一定水平的內(nèi)源性細(xì)胞因子，以發(fā)揮抗腫瘤的作用。然而，現(xiàn)有的細(xì)胞因子基因免疫治療方法只是提高機(jī)體免疫能力，增強(qiáng)共刺激分子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫作用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)和呈遞。
[0005]人白細(xì)胞介素-2 (Interleukin-2, IL-2),又名T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T Cell GrowthFactor, TCRF)。IL-2是在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下，由T淋巴細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞系產(chǎn)生的在機(jī)體免疫反應(yīng)中具有重要調(diào)節(jié)作用的一種細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-2具有抗惡性腫瘤的作用。IL-2抗腫瘤作用的機(jī)制，主要通過(guò)刺激機(jī)體的固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷作用。IL-2可以促進(jìn)某一特定T細(xì)胞群的克隆性擴(kuò)增，其可通過(guò)提高NK細(xì)胞與淋巴激活殺傷細(xì)胞(LAK)的細(xì)胞數(shù)量和活性，并激活TIL細(xì)胞，從而誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng),使腫瘤生長(zhǎng)停止或瘤體消退。此外，IL-2也在調(diào)節(jié)T細(xì)胞成熟過(guò)程中起重要作用，同時(shí)也能協(xié)同刺激B細(xì)胞增殖與分泌、增強(qiáng)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。
[0006]IL-2單獨(dú)使用或者與淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞一起，用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和腎癌的治療，取得了不錯(cuò)的臨床效果。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)其對(duì)于淋巴瘤、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等實(shí)體惡性腫瘤有治療效果?；熤新?lián)合使用IL-2，被認(rèn)為對(duì)晚期胃癌、結(jié)腸癌等胃腸道惡性腫瘤以及非小細(xì)胞肺癌具有較好的治療效果。IL-2因其能夠激活抗腫瘤免疫作用，被認(rèn)為是治療消化系統(tǒng)實(shí)質(zhì)性腫瘤的有效選擇。然而，目前的IL-2基因免疫治療方法只是局部地提高機(jī)體的IL-2蛋白表達(dá)水平，其免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。
[0007]粘蛋白(Mucins，MUC)在正常人體內(nèi)主要存在于胃腸道、呼吸道、泌尿生殖道以及乳腺等多種上皮組織中，對(duì)正常的上皮起潤(rùn)滑和保護(hù)作用，同時(shí)還介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞粘附。而在腫瘤組織中，MUC多出現(xiàn)異常表達(dá)，表現(xiàn)為量和質(zhì)的改變，并且與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。
[0008]人上皮黏蛋白(MUCl)是由MUCl基因表達(dá)的粘蛋白家族中的一種I型跨膜蛋白，其多肽骨架主要由胞外段、跨膜段和胞內(nèi)段組成，胞外區(qū)由可變數(shù)目(20~125個(gè))串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number Tandem Repeats, VNTR)組成,抗原表位即位于VNTR區(qū)。此種肽鏈表位在正常表達(dá)時(shí)，被外周糖鏈所掩蓋，不能被識(shí)別；在癌變時(shí)，由于糖基轉(zhuǎn)移酶活性增高導(dǎo)致不完全糖基化，不完全糖基化又導(dǎo)致側(cè)鏈變短及核心膚暴露，顯現(xiàn)出相關(guān)膚抗原表位、糖抗原表位，從而獲得免疫原性。MUCl已確定在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]基于此，有必要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體，該重組載體可用于腫瘤的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供所述MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法。
[0011]本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供所述MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體在腫瘤的基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0012]MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MUCl基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和MUCl基因；所述MUCl基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。[0013]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為PIRES2-MUC1-1L-2重組載體；其中，MUCl基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
[0014]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被IL-2基因替代。
[0015]本發(fā)明所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0016]I)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段；
[0017]2)將步驟I)得到的MUCl基因片段連接于載體，構(gòu)建含有MUCl基因的重組載體；
[0018]3)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段；
[0019]4)將步驟3)得到的IL-2基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體。
[0020]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的pIRES2-MUCl-1L-2重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0021]a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段:從乳腺癌細(xì)胞MCF-7獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的MUCl特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0022]b)構(gòu)建pIRES2-MUCl-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶Bgl I1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的MUCl基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到pIRES2-MUCl-EGFP重組載體；
[0023]c)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到IL-2基因片段混合物，其中的一種IL-2基因片段具有BstXI和Not I酶切粘性末端；
[0024]d)構(gòu)建pIRES2-MUCl-1L-2重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX 1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-MUCl-EGFP重組載體，將步驟c)得到的IL-2基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-MUC1-1L-2 重組載體。
[0025]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟a)所述的MUCl特異性引物為:
[0026]MUCl 上游引物:5’ -GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3’，
[0027]MUCl 下游引物:5’ -TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3’。
[0028]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟c)所述的IL-2特異性引物包括IL-2第一引物對(duì)和IL-2第二引物對(duì)，所述的IL-2第一引物對(duì)由IL-2上游長(zhǎng)引物和IL-2下游長(zhǎng)引物組成，所述的IL-2第二引物對(duì)由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物組成:
[0029]IL-2第一引物對(duì)為:
[0030]IL-2 上游長(zhǎng)弓丨物:5，-AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3，，
[0031]IL-2 下游長(zhǎng)引物:5’-GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT-3’ ；
[0032]IL-2第二引物對(duì)為:
[0033]IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0034]IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
[0035]本發(fā)明所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體在腫瘤基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0036]在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染腫瘤患者自身或異體分離的樹突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，進(jìn)行腫瘤基因免疫治療。
[0037]本發(fā)明所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來(lái)連接MUCl基因和IL-2基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)人上皮粘蛋白(MUCl)以及人白細(xì)胞介素-2(IL-2)，可減少基因載體的用量，減少非治療相關(guān)的外源基因序列的引入。其中，MUCl是腫瘤靶向性的相關(guān)抗原，IL-2是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，兩者聯(lián)合使用，既可以發(fā)揮細(xì)胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又可以靶向性地產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)，從而能夠獲得更好的腫瘤免疫治療效果。將雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染腫瘤患者自身或異體分離的樹突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，MUCl的大量表達(dá)，可刺激樹突狀細(xì)胞遞呈MUCl多肽與MHC復(fù)合物，進(jìn)而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性殺傷性T細(xì)胞，靶向性殺傷表達(dá)MUCl多肽的腫瘤細(xì)胞；而IL-2的大量表達(dá)，能進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力，并能增強(qiáng)特異性T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增能力和細(xì)胞活力，增強(qiáng)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，協(xié)同擴(kuò)大抗腫瘤免疫效應(yīng)。
[0038]IRES序列是來(lái)源于某些病毒和細(xì)胞mRNA5’端的一段非翻譯區(qū)，可以不依賴帽的方式啟動(dòng)遠(yuǎn)端的mRNA翻譯，可在上游啟動(dòng)子的控制下和與之相連的基因共同轉(zhuǎn)錄，在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的蛋白。IRES連接多基因進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，多個(gè)基因的mRNA在同一條轉(zhuǎn)錄子上，但轉(zhuǎn)錄后的翻譯過(guò)程相互獨(dú)立，上游基因以傳統(tǒng)方式進(jìn)行翻譯，下游基因依靠IRES序列以不依賴帽的方式進(jìn)行翻譯，保證了各個(gè)基因的獨(dú)立結(jié)構(gòu)及功能。利用IRES代替內(nèi)部啟動(dòng)子，不但可使多基因共表達(dá)載體大大縮小，而且還克服了傳統(tǒng)多基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子之間的相互抑制現(xiàn)象，避免融合蛋白的產(chǎn)生。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1為實(shí)施例一所得的含有特異性酶切位點(diǎn)序列的MUCl基因片段的電泳圖，其中，I為MUCl基因，M為標(biāo)記；
[0040]圖2 為 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒圖譜；
[0041]圖3為實(shí)施例二所得的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體圖譜；
[0042]圖4為實(shí)施例二所得的pIRES2-MUCl-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0043]圖5為實(shí)施例二所得的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0044]圖6為實(shí)施例 三所得的帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端的IL-2基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A，2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B，M為標(biāo)記；
[0045]圖7為實(shí)施例三所述的雜交PCR反應(yīng)的流程圖；
[0046]圖8為實(shí)施例四所得的PIRES2-MUC1-1L-2重組載體圖譜；
[0047]圖9為實(shí)施例四所得的pIRES2-MUCl-1L-2重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為Bgl II/EcoR I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，2為EcoR I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，3為Bgl I I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下述實(shí)施例中，所用到的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，例如PCR技術(shù)、引物設(shè)計(jì)技術(shù)、載體構(gòu)建技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)、電泳技術(shù)等均為基因工程中的常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社第三版；或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行)。在操作過(guò)程中所用到的設(shè)備、試劑、載體、菌株等，均為通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0049]實(shí)施例一:獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段
[0050]1、引物設(shè)計(jì)
[0051]根據(jù)MUCl基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)和pIRES2_EGFP質(zhì)粒載體上預(yù)期插入的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物如下:
[0052]MUCl上游引物(如序列表中SEQ ID NO: 4所示):
[0053]5? -GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3?(下劃線部分為 Bgl II 酶切位點(diǎn)序列)，
[0054]MUCl下游引物(如序列表中SEQ ID NO: 5所示):
[0055]5，-TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn)序列)。
[0056]2、獲取cDNA模板[0057]TRIzon法從人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中提取RNA(TRIzon總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為CW0580)，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為RR019A)。
[0058]3、獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段
[0059]以人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中提取的RNA所反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在上述含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得MUCl基因片段，其上游含有Bgl II酶切位點(diǎn)序列，下游含有EcoR I酶切位點(diǎn)序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果如圖1所示。
[0060]PCR反應(yīng)體系如下(50 μ L):
[0061]
【權(quán)利要求】
1.MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MUCl基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有IL-2基因、IRES序列和MUCl基因； 所述MUCl基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述的載體為pIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為pIRES2_MUCl-1L_2重組載體；其中，MUCl基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體中的EGFP序列被IL-2基因替代。
4.權(quán)利要求1所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: O獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段； 2)將步驟I)得到的MUCl基因片段連接于載體，構(gòu)建含有MUCl基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段； 4)將步驟3)得到的IL-2基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體。
5.權(quán)利要求2所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段:從乳腺癌細(xì)胞MCF-7獲取cDNA作為模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的MUCl特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Bgl`II和EcoR I酶切位點(diǎn)的MUCl基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； b)構(gòu)建pIRES2-MUCl-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶BglI1、EcoR I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的MUCl基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到pIRES2-MUCl-EGFP重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到IL-2基因片段混合物，其中的一種IL-2基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)構(gòu)建pIRES2-MUCl-1L-2重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstXI, Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-MUCl-EGFP重組載體，將步驟c)得到的IL-2基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MUC1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-MUC1-1L-2 重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟a)所述的MUCl特異性引物為: MUCl 上游引物:5’ -GAAGATCTATGACACCGGGCACCC-3’， MUCl 下游引物:5’ -TTGAATTCCTACAAGTTGGCAGAAGTGG-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟c)所述的IL-2特異性引物包括IL-2第一引物對(duì)和IL-2第二引物對(duì)，所述的IL-2第一引物對(duì)由IL-2上游長(zhǎng)引物和IL-2下游長(zhǎng)引物組成，所述的IL-2第二引物對(duì)由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物組成: IL-2第一引物對(duì)為: IL-2 上游長(zhǎng)引物:5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，IL-2 下游長(zhǎng)引物:5’ -GGCCGCTCAAGTCAGTGTTGAGATGAT-3’ ； IL-2第二引物對(duì)為: IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’， IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’。
8.權(quán)利要求1或2所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體在腫瘤基因免疫治療中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:將所述的MUCl和IL-2雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染腫瘤患者自身或異體分離的樹突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，進(jìn)行腫瘤基因免疫治療。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103555764SQ201310578761
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】栗炳南, 豐慧根, 左百樂(lè), 林俊堂, 曹毓林 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院