專利名稱：基因重組技術(shù)制備pgrp的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肺癌抗原的人工制備技術(shù)，具體為基因重組技術(shù)大量制備PGRP(31-98)。
背景技術(shù)：
應(yīng)用普通生物化學(xué)方法從肺癌組織或血清中提取PGRP(31-98)不僅繁瑣，而且由于肺癌組織或血清有限從而給PGRP(31-98)的大量提取帶來了一定的難度。日本學(xué)者用pATTrp載體、EcoRI和SalI兩個酶切位點在大腸桿菌中表達了帶有17個氨基酸的TrpE融合蛋白的PGRP(31-98)并對其進行了分離、純化。此表達系統(tǒng)中由于帶有TrpE蛋白較長，表達后需要用溴化氰切除。這一切除過程不僅不利于大量制備工藝的進行，而且給后續(xù)的分離、純化帶來了一定的難度同時也不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。國內(nèi)尚未見基因重組表達制備PGRP(31-98)的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決上述技術(shù)存在的缺點，提供了一種新的、既能保證PGRP(31-98)表達正確，又能較簡單地進行分離、純化的基因重組技術(shù)和方法。
用pRSETc載體與PGRP(31-98)基因片段進行連接，采用NheI和HindIII雙雙酶切位點定向克隆，以保證正確的插入連接方向；將連接有目的基因的pRSETc載體轉(zhuǎn)化到廣泛用于靶基因表達的大腸桿菌BL21DE3進行重組表達；將表達的PGRP(31-98)產(chǎn)物進行分離、純化和鑒定。
與現(xiàn)有技術(shù)相比上述技術(shù)方案具有以下改進1、選擇pRSETc載體含有強啟動子(T7啟動子)，利用IPTG誘導(dǎo)T7聚合酶，顯著提高了PGRP(31-98)目的基因的表達水平；該質(zhì)粒具有一特殊的結(jié)構(gòu)功能，為表達產(chǎn)物應(yīng)用Ni柱親和層析、快速純化提供了方便、經(jīng)濟的手段。2、大腸桿菌BL21DE3不表達Ompt和Lon蛋白酶，因此表達產(chǎn)物比較穩(wěn)定，不會被宿主菌蛋白水解酶所降解。3、pRSETc載體在BL21DE3菌株中的高效表達有利于PGRP(31-98)產(chǎn)物的大量制備和應(yīng)用多種方法進行純化、鑒定。
本技術(shù)方案不僅保證了PGRP(31-98)表達產(chǎn)物的正確、特異、穩(wěn)定和高效，相對現(xiàn)有技術(shù)大大縮短了制備的時間；克服了現(xiàn)有技術(shù)中用溴化氰切除表達產(chǎn)物上的TrpE蛋白帶來的缺點，有利于大量人工制備工藝的建立和產(chǎn)品的穩(wěn)定。


圖1 重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖3 Ni柱親和層析純化后的SDS-PAGE電泳圖4 高效液相色譜純化后SDS--PAGE電泳圖5 與抗-PGRP(31-98)單克隆抗體結(jié)合的酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果具體實施方式
1、重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建載體pRSETc質(zhì)粒經(jīng)NheI和HindIII雙酶切位點37℃雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖純化后回收與純化的PGRP(31-98)基因一定比例加入T4DNA連接酶中，16℃孵育過夜。
2、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和鑒定將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21DE3，在含氨芐的LB培養(yǎng)基上篩選出陽性克隆。將篩選出的陽性克隆在培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)后做如下鑒定(1)酶切產(chǎn)物的鑒定收菌，提取質(zhì)粒。用限制性核酸內(nèi)切酶NheI和HindIII雙酶切位點37℃雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳測定其是否含有PGRP(31-98)基因片段。
(2)PCR產(chǎn)物的鑒定取1ul的菌液在25ul的PCR反應(yīng)體系中進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳測定其是否含有PGRP(31-98)基因片段。
(3)PGRP(31-98)基因的測序?qū)⒋竽c桿菌BL21DE3菌液進行測序，檢查是否含有正確讀碼框架。測序結(jié)果該菌液中pRSETc質(zhì)粒含有正確的PGRP(31-98)基因鹼基序列。
3、重組PGRP(31-98)基因的表達和分離、純化PGRP(31-98)基因(1)重組PGRP(31-98)基因的表達選取含有PGRP(31-98)基因的克隆，接種于含氨芐的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后收菌。菌液經(jīng)超聲波裂解后，分別取上清、沉淀和全菌進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色、凝膠成象系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。
(2)重組PGRP(31-98)的分離、純化應(yīng)用Ni柱親和層析分離、純化重組PGRP(31-98)。用梯度洗脫液進行洗脫并收集樣品待檢。SDS-PAGE電泳顯示經(jīng)過這一分離可去除大量的雜蛋白，分子量約10.0KD左右。
應(yīng)用高效液相色譜法進一步分離、純化重組PGRP(31-98)。收集各峰待檢。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后可見目的蛋白電泳帶，純度95％以上，分子量約在10.0KD左右。
4、重組PGRP(31-98)免疫活性的測定應(yīng)用PGRP(31-98)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒就重組PGRP(31-98)免疫活性進行了檢測。結(jié)果表明該蛋白能夠和抗-PGRP(31-98)單克隆抗體結(jié)合(圖7)，定量檢測濃度為1.299mg/ml。
本發(fā)明所述的方法在插入基因的兩端設(shè)計了雙酶切位點，保證了正確的插入方向，重組體一次完成，純化操作簡便、快速，相對現(xiàn)有技術(shù)大大縮短了生產(chǎn)制備的時間；表達產(chǎn)物正確、特異、穩(wěn)定，純化的重組PGRP(31-98)能與抗-PGRP(31-98)單克隆抗體發(fā)生特異反應(yīng)，證明其具有良好的免疫活性，為制備各種抗體和診斷試劑盒奠定了良好的原料基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.在基因重組技術(shù)制備肺癌抗原PGRP(31-98)時采用pRSETc質(zhì)粒。
2.在基因重組技術(shù)制備肺癌抗原PGRP(31-98)時采用大腸桿菌BL21DE3。
3.在基因重組技術(shù)制備肺癌抗原PGRP(31-98)采用NheI和HindIII雙酶切位點定向克隆。
4.在制備肺癌抗原PGRP(31-98)時采用Chelating Sepharose Fast Flow Ni柱親和層析分離、純化重組PGRP(31-98)。
全文摘要
本發(fā)明為基因重組技術(shù)制備PGRP
文檔編號C07K1/14GK1752212SQ200510065889
公開日2006年3月29日 申請日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者周小林 申請人:中國輻射防護研究院