專(zhuān)利名稱(chēng)：具有丙烯酸降解活性的紅平紅球菌lg12及使用其除去丙烯酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有丙烯酸降解活性和抗丙烯酸性的新型菌株紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)LG12，以及使用該菌株從包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法。
背景技術(shù)：
由現(xiàn)有技術(shù)可知，降解丙烯酸的微生物包括如假單胞菌(Pseudomonas sp.)的細(xì)菌和如地霉(Geotrichum sp.)、木霉(Trichodermasp.)、皺褶假絲酵母(Candida rugosa)和絲衣菌(Byssochlamys sp.)的霉菌。公知細(xì)菌在相對(duì)簡(jiǎn)單的環(huán)境中生長(zhǎng)，并容易培養(yǎng)細(xì)菌，但是不能在例如高于10g/L(1wt％)的高丙烯酸濃度下生長(zhǎng)。例如，假單胞菌在大于1.5g/L的丙烯酸濃度下顯示出生長(zhǎng)抑制(Shanker，R.，Arch.Microbiol.，154192，1990；Bringmann & Kuhn，Water Research，14231，1980)。
公知霉菌在相對(duì)高的丙烯酸濃度中生長(zhǎng)。例如，地霉和木霉在10天內(nèi)降解1wt％的丙烯酸(Heena Dave，Biotechnology letters，18963，1996)。另外，公知皺褶假絲酵母在4天內(nèi)降解2wt％的丙烯酸(Hasegawa，J.，J.Ferment.Technol.，60591，1992)，絲衣菌在14天內(nèi)降解7wt％的丙烯酸(Kazuhiro Takamizawa，Appl.Microbiol.Biotech.，40196，1993)。采用這些霉菌降解丙烯酸的缺點(diǎn)在于，其需要相對(duì)長(zhǎng)的降解時(shí)間、菌株生長(zhǎng)的復(fù)雜條件和長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。另一缺點(diǎn)在于，因?yàn)闆](méi)有建立霉菌的轉(zhuǎn)化方法，所以不易制備霉菌的重組菌株。
同時(shí)，紅球菌(Rhodococcus sp.)是革蘭氏陽(yáng)性菌，且屬于諾卡菌形放線(xiàn)菌(nocardioform Actinomycetes)。在現(xiàn)有技術(shù)中，紅球菌用于將如丙烯腈的腈化合物轉(zhuǎn)化為如丙烯酸的酸。例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,135,858號(hào)公開(kāi)了使用紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)J-1將如丙烯腈的腈化合物轉(zhuǎn)化為如丙烯酸的酸的方法。但是，丙烯酸聚集在培養(yǎng)基中，不能被紫紅紅球菌J-1降解。因此，還未得知可降解丙烯酸的紅球菌(Rhodococcus sp.)微生物。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題因此，仍存在對(duì)這樣一種微生物的需求該微生物需要如細(xì)菌一樣的簡(jiǎn)單的生長(zhǎng)條件，快速生長(zhǎng)，具有抗丙烯酸性，并且能快速降解丙烯酸。因此，本發(fā)明人作出努力，以發(fā)現(xiàn)能夠使用丙烯酸為碳源降解丙烯酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了屬于紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)的菌株，其既便在高濃度丙烯酸下也能生長(zhǎng)，并且可以迅速降解丙烯酸，從而完成本發(fā)明。
技術(shù)方案因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種屬于紅平紅球菌的菌株，其具有丙烯酸降解活性，并且抗高濃度丙烯酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用所述菌株從包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，在一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明提供一種具有丙烯酸降解活性的抗丙烯酸紅平紅球菌菌株。在本發(fā)明中，該菌株的保藏編號(hào)為KCTC 18102P。
屬于紅平紅球菌的菌株的本發(fā)明微生物具有抗丙烯酸性，并且具有降解丙烯酸的活性。與屬于例如大腸桿菌(Escherichia sp.)、假單胞菌、桿狀菌(Bacillus sp.)和念球菌(Candida sp.)的其它種的微生物相比，本發(fā)明菌株具有非常高的丙烯酸降解活性。另外，本發(fā)明菌株具有抗丙烯酸性，并且即使在高濃度丙烯酸中也能生長(zhǎng)。本發(fā)明菌株甚至可在小于5wt％的丙烯酸濃度下生長(zhǎng)，優(yōu)選1～4wt％下生長(zhǎng)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“丙烯酸降解活性”意為該菌株能在包含丙烯酸的培養(yǎng)基中使用丙烯酸作為碳源，同化或異化丙烯酸，從而降低培養(yǎng)基中丙烯酸的濃度。
在另一技術(shù)方案中，本發(fā)明提供一種從包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法，該方法包含如下步驟將紅平紅球菌菌株或其培養(yǎng)液與包含丙烯酸的污染物混和；以及培養(yǎng)該混合物。
在本發(fā)明方法中，除丙烯酸包含在培養(yǎng)基中外，菌株的培養(yǎng)條件與本技術(shù)領(lǐng)域公知的條件相同。任何包含丙烯酸的污染物可用作包含丙烯酸的污染物。包含丙烯酸的污染物的例子包括丙烯酸本身、以及包含丙烯酸的溶液、污水、廢水等從下面的詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求中，本發(fā)明的上述和其它特征、以及實(shí)施方案將會(huì)更加顯而易見(jiàn)。


圖1顯示根據(jù)本發(fā)明分離的12HPL菌株的掃描電子顯微鏡照片。
圖2顯示通過(guò)尋找與根據(jù)本發(fā)明分離的12HPL菌株的16S rRNA的1,454bp核苷酸序列的同源性而獲得的系統(tǒng)樹(shù)。
圖3顯示各包含1wt％、2wt％和4wt％丙烯酸的培養(yǎng)基中，本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株的丙烯酸降解活性。
圖4顯示向本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株的培養(yǎng)基中加入丙烯酸、巴豆酸、甲基丙烯酸和2-氯丙烯酸后，各酸的殘余量的測(cè)試結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下文將通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是，應(yīng)該能夠理解，這些實(shí)施例僅僅是說(shuō)明的目的，其不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1使用丙烯酸作為碳源從土壤中分離微生物收集韓國(guó)全羅北道井邑市公路附近的土壤，并在室溫下干燥24小時(shí)。1.0g干燥的土壤樣品加入到含5ml的丙烯酸(2mM)的20ml液體培養(yǎng)基(見(jiàn)表1和2；在下述過(guò)程也是相同的)的50ml擋板燒瓶(baffle flask)中，并在200rpm、30℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。然后，1ml的培養(yǎng)液加入到20ml的新制的液體培養(yǎng)基中，在上述相同的條件下培養(yǎng)。這一過(guò)程重復(fù)三次，然后，培養(yǎng)物涂覆在LB平板培養(yǎng)基上，并在30℃培養(yǎng)。完成培養(yǎng)后，使用丙烯酸作為碳源的新型菌株從LB平板培養(yǎng)基的菌落中分離出來(lái)，并命名為“2HPL”。

包含丙烯酸的液體培養(yǎng)基的組成
痕量金屬溶液和維生素溶液的組成


丙烯酸加入到液體培養(yǎng)基時(shí)，用氫氧化鈣(Ca(OH)2)中和培養(yǎng)基，并在引入前通過(guò)0.22mm的濾膜過(guò)濾。
實(shí)施例2鑒別分離的12HPL菌株在本實(shí)施例中，實(shí)施例1分離的12HPL菌株用電子顯微鏡和分子生物法鑒別。
(1)電子顯微鏡的的形態(tài)學(xué)特性首先將12HPL菌株涂覆在LB平板培養(yǎng)基上，并在30℃下培養(yǎng)3天。然后，用掃描電子顯微鏡觀察培養(yǎng)物的形態(tài)特征(圖1)。圖1顯示12HPL菌株的掃描電子顯微鏡照片。如圖1所示，12HPL菌株具有現(xiàn)有技術(shù)中公知的通常在紅球菌(Rhodococcus sp.)中可觀察到的長(zhǎng)圓柱形的特征。
(2)通過(guò)與16S rRNA核苷酸序列同源性比較的分類(lèi)首先，使用Wizard基因DNA純化試劑盒(Promega公司，商品目錄號(hào)A1120)，從12HPL菌株中分離染色體。然后，通過(guò)使用分離的染色體作為模板、具有引物HK12(序列識(shí)別號(hào)1)和HK13(序列識(shí)別號(hào)2)的PCR擴(kuò)增16S rRNA(Qiong Cheng，J.Bacteriol.，1824744，2000)。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行加入HK12引物，在95℃預(yù)變性5min，各包括95℃變性1min、50℃退火1min和72℃聚合1分30秒的10次循環(huán)，然后，加入HK13引物，在上述相同的條件下進(jìn)行30次循環(huán)。向PCR反應(yīng)混合物中加入200mM dNTP、1.5mM MgCl2、10ml 10x緩沖液、50ng模板DNA、5單位Taq聚合酶、0.1單位pfu聚合酶、20pmole的各引物，和加入水以使最終體積為100ml。
獲得的16S rRNA PCR產(chǎn)物插入到pGEM T-easy載體(Promega公司)中，然后測(cè)定從重組pGEM T-easy載體得到的16S rDNA的1,454bp核苷酸序列。然后，使用Clustal XTM程序分析1,454bp核苷酸序列的系統(tǒng)樹(shù)(圖2)。圖2顯示通過(guò)本發(fā)明的12HPL菌株與16S rRNA的1,454bp核苷酸序列之間的同源性探究獲得的系統(tǒng)樹(shù)。如圖2所示，確定在本發(fā)明中分離的12HPL菌株與紅平紅球菌菌株具有大于99％的同源性。
形態(tài)學(xué)特征的電子顯微鏡分析結(jié)果和通過(guò)與16S rRNA的同源性探究的系統(tǒng)分類(lèi)表明，本發(fā)明的12HPL菌株是屬于紅平紅球菌的新型菌株，可同化丙烯酸，并具有抗丙烯酸性。結(jié)果，發(fā)明的12HPL菌株命名為紅平紅球菌LG12(Rhodococcus erythropolis LG12)，于2004年5月19日在國(guó)際保藏單位韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)以保藏編號(hào)KCTC 18102P保藏。
實(shí)施例3測(cè)定紅平紅球菌LG12的丙烯酸降解活性在本實(shí)施例中，與其它多種微生物相比較，分析紅平紅球菌LG12的丙烯酸降解活性。
在LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的各微生物菌落在3ml的YEPD液體培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)中接種并培養(yǎng)。將0.3ml獲得培養(yǎng)物加入到包含3ml YEPD液體培養(yǎng)基的15ml一次性試管(Falcon公司)中，并在200rpm、30℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。然后，將丙烯酸加入到培養(yǎng)基中，使得最后的濃度為1％，1天后，用高效液相色譜(HPLC)(Waters公司)分析殘留的丙烯酸濃度。液相色譜中的流動(dòng)相為水和乙腈的7∶3的混合物，溶劑的流速為1ml/min，使用Capcel PAK C18柱子，在210nm下檢測(cè)。微生物的丙烯酸降解活性的分析結(jié)果如下表3所示。
在表3中，相對(duì)于以本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株的丙烯酸降解活性為100％，顯示了各種微生物菌株的丙烯酸降解活性。如表3所示，不僅與如假單胞菌、念球菌、大腸桿菌和桿狀菌的屬于其它屬的微生物相比，甚至與紅球菌屬的其它種相比，紅平紅球菌LG12菌株都具有非常高的丙烯酸降解活性。
紅平紅球菌LG12與其它多種菌株的丙烯酸降解活性


實(shí)施例4測(cè)定紅平紅球菌LG12的丙烯酸降解活性在本實(shí)施例中，在各種條件下測(cè)定紅平紅球菌LG12的丙烯酸降解活性。
首先，使本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株在YEPD固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以獲得單菌落。將該菌落加入到包含3ml YEPD液體培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)的15ml培養(yǎng)管(Falcon公司)中，并在200rpm、30℃的振蕩培養(yǎng)箱(Jeio技術(shù)有限公司)中培養(yǎng)1～2天。當(dāng)培養(yǎng)基的OD600達(dá)到30時(shí)，將丙烯酸加入到培養(yǎng)基中，以使最終的濃度為1wt％、2wt％和4wt％，繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)在各反應(yīng)時(shí)間分析殘留的丙烯酸量。
另外，為檢測(cè)丙烯酸對(duì)菌株的丙烯酸降解活性的誘導(dǎo)效應(yīng)，當(dāng)在YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的過(guò)程中，菌株的生長(zhǎng)達(dá)到OD600為15時(shí)，將丙烯酸加入到培養(yǎng)基中，以使最終的濃度為0.1wt％。然后，繼續(xù)培養(yǎng)，直到菌株的生長(zhǎng)達(dá)到OD600為30。在該培養(yǎng)過(guò)程中，其它條件與上述相同。以實(shí)施例3相同的方式使用HPLC進(jìn)行丙烯酸的分析(圖3)。
圖3顯示在各包含1wt％、2wt％和4wt％的丙烯酸的培養(yǎng)基中紅平紅球菌LG12的丙烯酸降解活性。如圖3所示，作為在菌株培養(yǎng)期間加入丙烯酸的結(jié)果，本發(fā)明的菌株顯示出增加丙烯酸降解的誘導(dǎo)效應(yīng)，甚至對(duì)4wt％的丙烯酸具有抗酸性，并能在大約4天內(nèi)降解4wt％的丙烯酸。
實(shí)施例5檢驗(yàn)紅平紅球菌LG12對(duì)丙烯酸降解活性的特異性在本實(shí)施例中，研究本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株是否在各化合物中特定地降解丙烯酸。
使發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株在YEPD固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，以獲得單菌落。然后，該單菌落接種到包含3ml的YEPD液體培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖)的15ml的培養(yǎng)管(Falcon公司)中，并在200rpm、30℃的振蕩培養(yǎng)箱(Jeio技術(shù)有限公司)中培養(yǎng)，直到OD600達(dá)到30。然后，分別將丙烯酸、巴豆酸、甲基丙烯酸和2-氯丙烯酸加入到培養(yǎng)基中，以使最終的濃度為0.5wt％。加入后，在一定間隔測(cè)定殘留化合物的濃度。采用實(shí)施例3相同的方法，使用HPLC測(cè)定上述化合物的濃度(圖4)。
圖4顯示向本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株的培養(yǎng)液中加入丙烯酸、巴豆酸、甲基丙烯酸和2-氯丙烯酸后，各酸的殘余量。由圖4可知，在具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物中，丙烯酸的殘留量特定地且明顯地被降低。這一結(jié)果表明，本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株特定地降解丙烯酸。
盡管已參考具體特點(diǎn)描述本發(fā)明，但對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，本說(shuō)明書(shū)只是優(yōu)選的實(shí)施方案，其不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍由所附權(quán)利要求和其等同物所限定。
工業(yè)應(yīng)用性如上所述，根據(jù)本發(fā)明的紅平紅球菌LG12菌株不僅具有丙烯酸降解活性，而且具有抗高濃度丙烯酸性，因此可用于有效地從包含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸。
序列表<110>LG化學(xué)株式會(huì)社(LG CHEM，LID.)<120>具有丙烯酸降解活性的紅平紅球菌LG12及使用其除去丙烯酸的方法<130>IP06-1033-XC15<140>PCT/KR2005/003063<141>2005-09-15<150>KR 10-2004-0073916<151>2004-09-15<160>2<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>正向引物<400>1gagtttgatc ctggctcag 19<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2taccttgtta cgactt 1權(quán)利要求
1.一種具有丙烯酸降解活性的抗丙烯酸紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)菌株。
2.如權(quán)利要求1所述的抗丙烯酸紅平紅球菌菌株，其中所述菌株的保藏編號(hào)為KCTC 18102P。
3.如權(quán)利要求1所述的抗丙烯酸紅平紅球菌菌株，其中所述菌株能在1～5wt％的丙烯酸濃度下生長(zhǎng)。
4.一種從含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法，該方法包括以下步驟將含丙烯酸的污染物與權(quán)利要求1～3任意一項(xiàng)所述的紅平紅球菌菌株或其培養(yǎng)液混和；和培養(yǎng)該混合物。
5.從含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法，其中含丙烯酸的污染物為含丙烯酸的污水或廢水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有丙烯酸降解活性和抗丙烯酸性的新型菌株紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)LG12，及使用該菌株從含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸的方法。根據(jù)本發(fā)明的菌株不但具有丙烯酸降解活性，而且具有抗高濃度丙烯酸性，因此可用于從含丙烯酸的污染物中除去丙烯酸。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1914312SQ200580003225
公開(kāi)日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者李相賢, 趙俊衡, 樸五鎮(zhèn), 李周遠(yuǎn), 樸時(shí)載 申請(qǐng)人:Lg化學(xué)株式會(huì)社