專利名稱：檢測赤潮生物纖小裸甲藻的肽核酸探針及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分子探針，尤其是涉及一種用熒光標記肽核酸探針的設計以及在快速檢測和鑒定赤潮藻纖小裸甲藻(Takayama pulchellum)細胞及自然水體中低豐度單種目標赤潮藻細胞中的應用。
背景技術：
肽核酸(peptide nucleic acid；PNA)是一類不帶電荷的類似于肽鏈骨架結構并攜帶有堿基的新人工信息分子，該分子主鏈骨架是由單體N-(2-氨乙基)-甘氨酸間通過酰胺鍵反復連接而成的長鏈，側鏈則是利用亞甲羰酰鍵將堿基與主鏈骨架相連而形成。自PNA被發(fā)現(xiàn)10年以來，其作為一種優(yōu)良的寡核苷酸取代物而被廣泛地應用于分子生物學研究及相關領域，被認為是非常有前景的探針工具，PNA的特點使之能成為一種方便快捷的檢測模式，優(yōu)越性大大超過了DNA探針，它能特異地與目標生物的rRNA特異性靶序列發(fā)生結合，廣泛地應用于環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)和臨床標本的檢測和分析。因此目前人們已致力于發(fā)展有著廣泛應用前景的PNA探針技術來監(jiān)測赤潮類群，使這些細胞能通過光學或化學的手段檢測出來，但目前還沒有見到在赤潮檢測中使用PNA探針的報道。在其他相關研究方面，Litaker等采用PNA探針結合原位雜交的方法研究了異養(yǎng)甲藻(Pfiesteria piscicida)即幽靈藻(Dinophyceae)的細胞周期，表明其細胞周期是一種典型的自由生活的海洋甲藻，缺乏任何變形蟲階段或其他類似的階段。Worden等通過全細胞原位雜交法，使用PNA探針檢測未固定的海洋藍細菌，發(fā)現(xiàn)其檢測信號是DNA探針的5倍，這是由于PNA的特性使得雜交能在低鹽和較高溫度的條件下進行，而這些條件明顯地降低了rRNA和DNA二級結構的穩(wěn)定性，因此使PNA探針能有效地和比較難到達的靶位點發(fā)生有效結合，這是使用PNA探針的優(yōu)勢，提高了藍細菌的雜交效果。
日本學者最早報道了Takayama pulchellum，其為可能產(chǎn)生魚毒素、溶血性毒素和神經(jīng)性毒素的種類，1994年曾正式被描述并定名為Gymnodinium pulchellum，新近則被更名為Takayama pulchellum。在美國和澳大利亞都引發(fā)過赤潮，并導致大量魚類死亡，廈門海域曾在1986年發(fā)生過一次裸甲藻赤潮，密度達到107個/L，2003年7月再次發(fā)生了大規(guī)模的裸甲藻赤潮，密度達到了106個/L，經(jīng)鑒定證實為Takayama pulchellum。本申請人于2004和2005年也先后在廈門港采樣并分離到了Takayama pulchellum這種可能產(chǎn)毒的裸甲藻，表明其為廈門海域常見裸甲藻種類，尤其可見應用新技術對其進行快速監(jiān)測有著重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能快速檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻(T.pulchellum)的熒光標記肽核酸(PNA)探針及其設計方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種基于熒光標記肽核酸(PNA)探針應用于快速鑒定和檢測目標赤潮生物的方法。
本發(fā)明所述的快速檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸(PNA)探針其分子名稱為PNATP28S01，其分子結構的組成序列為[Flu]-○○ ATG CCA TCT CAA GA，其分子骨架不含戊糖和磷酸基團，呈電中性，4種單體分別攜帶有ATGC4種堿基以首尾相連構成鏈狀結構。
所述的熒光標記肽核酸(PNA)分子的N端標記有熒光報告基團FAM，激發(fā)光波長Ex＝494nm，發(fā)射光波長Em＝522nm，熒光報告基團和N端以連接器相連，C端無報告基團；Tm值分別為[1μM]＝68℃，[1nM]＝56℃，[1pM]＝44℃，分子量MW＝4428.85，由14個堿基組成，有17個殘基；嘌呤比例占50％，連續(xù)的嘌呤長度為4個，分子間堿基的互補性低(特征詳見表1)。
表1利用美國應用生物系統(tǒng)公司提供的PNA在線設計軟件對探針的設計和計算結果

注Flu，代表熒光標記；○○代表連接器；Ex激發(fā)光；Em發(fā)射光。
本發(fā)明所述的快速檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸(PNA)探針的設計和獲取方法的步驟為1)靶DNA序列的獲得，采用DNA提取，PCR擴增，克隆，測序；2)將通過PCR產(chǎn)物克隆和測序得到的rDNA靶序列，利用核苷酸序列排列軟件Clustal X與從各大核酸數(shù)據(jù)得到親緣關系相近生物的5S RNA，18S RNA，28S RNA以及ITS1，ITS2序列分別進行排序；3)根據(jù)排序結果，初選出目標種保守序列，并選擇長度為18～25bp；利用GeneBank中的BLAST(英文全稱為Basic local alignment search tool，意為本地序列比對和搜索工具)接口將上述得到的特異性序列在已發(fā)表的核酸數(shù)據(jù)庫進行匹配性搜索，以篩選出在已知所有序列中保守屬與種的特異性序列；4)利用Oligo 6.0程序或Primer Select軟件(DNASTAR，Madison，WI)等檢測探針序列的各項參數(shù)指標(PNA和DNA)，計算其GC含量、結構特點、Tm值等；5)在第1)、2)、3)、4)步驟工作的基礎上進行PNA探針的設計和計算，并再次利用BLAST進行相似性搜索；6)選擇獲得陰性對照探針PNABacUni-I，序列為CTGCCTCCCGTAGGA，并進行輔助PNA探針設計，獲得符合條件的陽性對照探針PNA-Euk1209，序列為GCATCACAGACCTG。
在步驟1)中，rDNA的PCR擴增、純化及克隆方法為離心收集指數(shù)生長期末期的細胞，PCR基本程序為預變性94℃，5min；94℃，1min；54℃，1min；72℃，1min；30個循環(huán)；延伸72℃，10min，進行PCR擴增，擴增引物參見文獻侯建軍，黃邦欽.用PCR擴增裸甲藻和微小原甲藻rRNA基因的方法研究.湖北民院學報自然科學版，2005，23(1)82-85。PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，然后克隆到pGEM-T質粒(Promega)，藍白斑篩選，菌落PCR確定為陽性反應后送生工測序。
在步驟1)中，所述的離心收集指數(shù)生長期末期的細胞的基因組的提取方法采用改良的CTAB法，參考文獻Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning[M].Cold SpringHarbor，NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，456-490。所述的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒采用華美公司產(chǎn)品。
本發(fā)明中PNA探針的分子結構模式見圖1。
經(jīng)過步驟1)-4)獲得的探針及特點見表2。
在步驟5)中，所述的在第1)、2)、3)、4)步驟工作的基礎上進行PNA探針的設計和計算可用美國應用生物系統(tǒng)公司提供的在線軟件來進行，最后得到的PNA探針長度以11-15bp為宜，再利用BLAST進行相似性搜索。
表2根據(jù)設計方案1-4步獲得基本符合條件的被選DNA探針

經(jīng)過步驟5)最終獲得符合條件的PNA探針及特點見表1。
在步驟6)中，所述的選擇獲得陰性對照探針PNABacUni-I可根據(jù)文獻選擇，所述的文獻為Litaker R.W.，Vandersea M.W.，Kibler S.R.et al.. Life cycle of the hetero trophicdinoflagellate Pfiesteria piscicida (Dinophyceae)[J].J.Phycol.，2002，38(3)442～463。
所述的輔助PNA探針設計可根據(jù)文獻報道的Euk1209R序列，采用美國應用生物系統(tǒng)提供的在線軟件輔助PNA探針設計，所述的文獻為Chen Jixin，Huang Bangqin，Jiao Nianzhi et al.2003.Fluorescent in situ Hybridization witholigonucleotide probes to identify Alexandrium tamarense and Genus Alexandrium.InRecent
advances in the prevention and management of harmful algal blooms in the South China Sea.Edited by Kin-Chung Ho，Song-Hui Lv，Tsz-Sau Yu et al.，Proceedings of the International Confer-ence on the Prevention and Management of Harmful Algal Blooms in the South China ea.pp.81-88。
PNA探針標記后能直接利用落射熒光顯微鏡進行定性和半定量的檢測。在適當?shù)那闆r下，其反應產(chǎn)物可利用熒光分光光度計進行定量的檢測；在需要的情況下，也可以利用流式細胞儀進行定性和定量的檢測。
本發(fā)明所述的熒光標記肽核酸(PNA)探針快速檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的方法其步驟如下1)取培養(yǎng)樣品的固定細胞，通過離心沉淀，沉淀用PBS緩沖溶液洗滌后重新懸浮于雜交緩沖溶液中，加入含有終濃度為50～300nM的熒光標記PNA探針；2)細胞在40～60℃下溫孵、離心后，重新懸浮于雜交洗滌液中，在45～55℃下保溫；3)用離心法洗滌沉淀后，細胞重新懸浮于洗滌溶液中，將細胞懸浮液均勻鋪展在干凈的顯微鏡載玻片上，直到干燥，蓋上蓋玻片觀察。
在步驟1)中，雜交緩沖溶液的配方為25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS。
在步驟2)中，雜交洗滌液中的配方為10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA。
用于現(xiàn)場樣品的檢測應用方法為將現(xiàn)場樣品進行濃縮及顯微鏡計數(shù)后，用針筒吸取濃縮后的樣品，在針筒過濾器上低壓過濾，用針筒吸取緩沖溶液，清洗后濾掉。針筒吸取預熱的雜交緩沖液，清洗后濾掉。將濾膜置于載玻片上，直接加入預熱的雜交緩沖液與熒光探針，使探針終濃度達到50～300nM。將玻片置于溫濕雜交盒于暗處45～55℃雜交。溫濕暗雜交盒中的濕紙用雜交緩沖液潤濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜(根據(jù)濾膜大小，用量可以減半)。用45～60℃預熱的雜交清洗液洗滌濾膜來終止雜交反應，清洗后溫育，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜。加入封片劑進行復染并防止熒光衰退。蓋上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。玻片可以在冷凍條件下保存數(shù)月而熒光不會衰減。雜交緩沖溶液的配方為25mMTris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS；雜交洗滌液中的配方為10mm Tris，pH9.0，1mMEDTA。
用流式細胞儀進行檢測的方法為將實驗室培養(yǎng)的T.pulchellum單種藻細胞或混合樣品用終濃度為1％的多聚甲醛在0～4℃下固定，然后用乙醇PBS(磷酸緩沖溶液)進行脫色后，離心去上清，加入雜交緩沖溶液和探針，使探針的終濃度為50～300nM，溫育，雜交結束后加入預熱的雜交洗滌液，在45～55℃下溫孵，然后離心沉淀，最后將細胞重懸在PBS緩沖溶液中，樣品用流式細胞儀進行檢測。雜交緩沖溶液的配方為25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS；雜交洗滌液中的配方為10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA。
本發(fā)明的優(yōu)點是可以簡便、快捷地對有害赤潮生物T.pulchellum進行定性檢測和鑒定，在需要的情況下，也可以進行定量檢測，并能對形態(tài)相似或親緣關系相近的赤潮生物進行識別和區(qū)分，目前未見有相關的報道。本發(fā)明與當前國內外用得較多的免疫熒光探針和DNA探針等技術相比，PNA分子即非蛋白也非核酸，且目前已知的核酸酶和蛋白酶都不能識別攜帶嘌呤和嘧啶側鏈的這種不常見的聚酰胺主鏈，因此不論是在體內還是在體外，PNA在大范圍的pH以及超延伸時間下都很穩(wěn)定，不易被酶降解。PNA分子骨架不含戊糖和磷酸基，故呈電中性，此電中性的存在賦予了其許多DNA或DNA類似物所不具有的性質，如高靈敏度、高特異性、非鹽依賴性、高穩(wěn)定性等。這就使得PNA在雜交檢測過程中的靈敏度較DNA要高得多，中性骨架決定了它在與DNA雜交過程中不僅可以省去提高鹽濃度的操作，還可以運用降低雜交體系離子濃度來抑制非特異性的雜交和靶DNA序列自身復性對靈敏度的影響。檢測方法方面，PNA原位雜交(FISH)的分析步驟較少，并且可直接檢測PNA探針，因此省去了化學發(fā)光底物。且PNA探針有效地穿透赤潮藻疏水的細胞壁，這歸因于PNA探針的疏水特性。PNA赤潮檢測探針技術具有著快速、準確、專一性強等特點，能成為赤潮生物系統(tǒng)分類和生態(tài)學研究的重要工具，特別是目標生物在復雜生物群落中不占優(yōu)勢或者有大量背景噪音干擾的情況下，PNA探針技術的優(yōu)勢尤顯突出，操作方法使用方便，重復性好，準確性和可靠性高，省時省力，從而可很好地應用于赤潮生物T.pulchellum的鑒定和檢測以及分子生態(tài)學的研究等諸領域。


圖1為PNA分子的模式圖。從圖1中可見PNA探針的結構模式和標記方式等特點。在圖1中，熒光標記肽核酸(PNA)分子的N端標記有熒光報告基團FAM，激發(fā)光波長Ex＝494nm，發(fā)射光波長Em＝522nm，熒光報告基團和N端以連接器(Linker)相連，C端無報告基團；Tm值分別為[1μM]＝68℃，[1nM]＝56℃，[1pM]＝44℃，分子量MW＝4428.85，由14個堿基組成，有17個殘基；嘌呤比例占50％，連續(xù)的嘌呤長度為4個，分子間堿基的互補性低。
圖2為使用FAM標記的PNA探針對單種樣品和混合樣品中目標生物T.pulchellum檢測和識別效果的落射熒光顯微鏡效果圖。從圖2中可見，陰性探針則不能發(fā)生特異性結合。特異性靶探針PNATP28S01和T.pulchellum雜交表現(xiàn)出和陽性探針一樣的雜交效果，而和其他非目標藻則無明顯的陽性反應(詳見圖2，A.B.C.D.E.F.)；混合樣品I(Mixed samples I)為赤潮異灣藻，錐裝施氏藻，鹽生杜氏藻，湛江叉鞭金藻，中肋骨條藻以及威氏海鏈藻組成?；旌蠘悠稩I(Mixedsamples II)由微小原甲藻，微小亞歷山大藻，東海原甲藻，米氏凱倫藻和短裸甲藻組成。PNATP28S01探針均能在這兩個藻的混合樣品中，將目標藻T.pulchellum識別出來，而不會和其他藻發(fā)生顯著的交叉反應。DAPI染色是為了幫助判斷染色的細胞是否屬于目標藻的活細胞(見圖2，G.H.I.J.K.L.)。在圖2中，A為對照組；B為纖小裸甲藻和探針PNABacUni-I雜交；C為纖小裸甲藻和探針PNAEuk1209R雜交；D為明視野照片；E為纖小裸甲藻用核酸染料DAPI染色效果；F為纖小裸甲藻和探針PNA28S01雜交；G.為混合樣品I；H.為混合樣品II；I為現(xiàn)場樣品三者和探針PNATP28S01的雜交效果；J、K、L分別為混合樣品、混合樣品、現(xiàn)場樣品用DAPI染色的效果圖。
圖3為DNA探針和PNA探針的陽性雜交率。從圖3中可顯示在同樣的探針濃度和同樣的雜交條件下，PNA探針的雜交率(95％)明顯高于DNATP18S02的66％和同序列DNA探針DNATP28S01的54％。在圖3中，橫坐標為探針PNAEuk1209，探針DNATP18S02，探針DNATP28S01，探針PNATP28S01，縱坐標為探針的雜交率(％)。
圖4為用DNA和PNA探針對T.pulchellum進行雜交后的標記目標藻細胞流式細胞儀檢測分析圖譜(直方圖)。從圖4中顯示，被PNA探針標記的經(jīng)過流式細胞儀檢測時，形狀一致的被標記的細胞和未被標記的細胞均能被有效地識別，熒光強度不同便形成了不同的峰值，從而構成不同的圖譜。從圖4中可以看出PNA探針的熒光強度與相似序列DNA探針標記的細胞有一定的差異，并明顯高于空白對照組和陰性對照組的自發(fā)熒光強度，從而使特異性標記的藻細胞能被檢出(見圖4)。在圖4中，橫坐標為熒光強度FL1LOG，縱坐標為事件數(shù)即細胞數(shù)量。曲線a為無探針，b為DNA探針，c為PNA探針。
圖5為用PNA探針對T.pulchellum的混合樣品中識別PNA探針標記目標藻細胞的流式細胞儀分析圖譜(直方圖)。流式細胞儀能根據(jù)PNA探針標記的綠色熒光信號的強弱，將靶細胞與混合藻種從復雜的背景中區(qū)分開來。從未被探針標記的細胞產(chǎn)生的波峰與標記探針波峰圖譜的分離程度，可以反映出特異性分子探針的雜交率較高。在圖5中，橫坐標為熒光強度FL1LOG，縱坐標為事件數(shù)即細胞數(shù)量。曲線d為其它非靶細胞，e為靶細胞。
具體實施例方式
以下實施例將結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例1T.pulchellum純種藻細胞和其他交叉實驗用藻的全細胞熒光原位雜交檢測。
1.全部檢測材料的來源及培養(yǎng)方法現(xiàn)場樣品采集方法用采水器采集5～10L海水，用10μm篩絹過濾濃縮，將水體積縮小為100～200mL，測量體積，根據(jù)樣品研究的需要分別加入1/10體積的多聚甲醛(10％)，終濃度1％，鏡檢計數(shù)?；罴毎蛛x采用毛細玻璃管或10μl的微量加樣槍在新鮮采集未固定的樣品中于體視顯微鏡下挑取目標藻的單細胞多個(根據(jù)情況可以先采用篩絹預過濾或加入f/2培養(yǎng)基預培養(yǎng))，置于多孔細胞培養(yǎng)板中，鏡檢觀察并加入f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)，逐步經(jīng)過多次挑取和馴化培養(yǎng)后，待細胞長至一定密度下時，可轉移至培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。將已分離出并能正常生長的藻用0.45μm的濾膜過濾海水煮沸后配成f/2培養(yǎng)基，在5000LX光強，L∶D＝12∶12的光周期和22℃的溫度下于廈門大學近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室藻種庫中進行純種無菌培養(yǎng)。其它用于驗證探針特異性的藻類詳見表3，培養(yǎng)方法相同。
表3 應用于熒光原位雜交的藻株

2.探針的雜交及驗證取100μl固定和脫色后的細胞(約105/ml)通過離心沉淀，沉淀用PBS緩沖溶液洗滌后重新懸浮于100μl的雜交緩沖溶液(25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS)中。加入含有50～300nM熒光標記的PNA探針(終濃度)。細胞在55℃下溫孵30min。10000rpm離心5min后，重新懸浮于500μl的雜交洗滌液中(10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA)，在55℃下溫孵10min，然后離心沉淀，重復3次，最后一次洗滌后，細胞重新懸浮于100μl洗滌溶液中，其中將2μl細胞懸浮液均勻鋪展在干凈的顯微鏡載玻片上，蓋上蓋玻片觀察。
3.結果PNA特異性探針和純種T.pulchellum的全細胞熒光原位雜交結果為以陽性探針來選擇合適的的PNA探針雜交條件。攜帶綠色熒光標記物質FAM的PNATP28S01探針進入了藻細胞并和目標基因發(fā)生了強烈的特異性結合，在落射熒光顯微鏡下，使藻細胞在494nm光激發(fā)下，發(fā)出522nm的綠色熒光。且雜交率接近100％。陰性探針和對照組則沒有明顯的綠色熒光信號檢出。PNATP28S01是T.pulchellum特異性探針，陽性探針PNAEuk1209R是針對真核生物18SrRNA設計，目的是用來摸索雜交條件，并確證靶探針的陰性反應不是由于PNA探針不能進入細胞造成的。陰性探針PNABacUni-I是針對原核生物細菌設計的，用來辨析探針陽性反應不是探針的非特異性結合。結果表明陽性探針PNAEuk1209R探針在熒光顯微鏡下表現(xiàn)出與PNABacUni-I探針和空白對照組完全不一樣的熒光效果。陽性對照組中T.pulchellum和其他種類驗證用藻的細胞質(核除外)呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，陰性對照組和空白對照組則只表現(xiàn)出微弱的橘黃色自發(fā)熒光。表明陽性探針能和T.pulchellum及其他類別藻的細胞質中核糖體RNA靶序列雜交，提示雜交程序，雜交方法和條件均符合PNA探針的雜交需要，而陰性探針則不能發(fā)生特異性結合。特異性靶探針PNATP28S01和T.pulchellum雜交表現(xiàn)出和陽性探針一樣的雜交效果，而和其他非目標藻則無明顯的陽性反應，表明PNATP28S01能有效地檢測出T.pulchellum。表1中提供了19種藻用于原位熒光雜交的交叉實驗，分屬于5個綱。通過選擇合適的與目標生物T.pulchellum一樣的雜交條件，均未表現(xiàn)出明的顯交叉反應(詳見圖2，A.B.C.D.E.F.)。
4.結論攜帶綠色熒光標記物質FAM的PNATP28S01探針進入了藻細胞并和目標基因發(fā)生了強烈的特異性結合，且和其他藻沒有發(fā)生明顯的交叉反應。
實施例2PNA探針和DNA探針的雜交效果比較。
1.檢測材料
實驗用的藻細胞株名稱及來源見表3。培養(yǎng)方法詳見實施例1第1條。
2.檢測方法詳見實施例1第2條，DNA和PNA探針原位雜交的熒光信號強度定量分析采用C-image公司的Simple PCI專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)進行分析。
3.結果在同樣的探針濃度下，將雜交率最高的DNA探針DNATP18S02和相似序列的DNA探針DNATP18S02與PNA探針的雜交效率和雜交后的熒光強度進行比較，發(fā)現(xiàn)在同樣的雜交條件下，PNA探針的雜交率(95％)明顯高于DNATP18S02的66％和同序列DNA探針DNATP28S01的54％。且同序列探針之間，PNA探針與DNA探針的雜交率差異顯著(p＝0.016＜0.05)(詳見圖3)。
根據(jù)Simple PCI專業(yè)圖像分析軟件計算被標記靶細胞的熒光信號強度結果也顯示，PNA探針的熒光信號強度顯著高于DNA探針的熒光強度(p＜0.01)。是DNA的5倍。且PNA探針的雜交條件較DNA要容易控制，其雜交體系也能兼容DNA的，PNA探針疏水性導致其通透率也高，容易進入細胞，同時PNA雜交的時間短，30min就可以獲得理想的雜交效果，要比DNA探針的雜交時間(3h)短很多。
4.結論PNA探針的雜交率顯著高于DNA探針，且雜交條件比DNA的容易控制。
實施例3熒光標記的PNA探針對混合藻種樣品的全細胞熒光雜交檢測。
1.檢測材料實驗用的藻細胞株名稱及來源見表3。用藻的培養(yǎng)方法詳見實施例1第1條。
2.檢測方法詳見實施例1第2條。
3.結果混合樣品I(Mixed samples I)為赤潮異灣藻，錐裝施氏藻，鹽生杜氏藻，湛江叉鞭金藻，中肋骨條藻以及威氏海鏈藻組成?；旌蠘悠稩I(Mixed samples II)由微小原甲藻，微小亞歷山大藻，東海原甲藻，米氏凱倫藻和短裸甲藻組成。在這兩個混合樣品中，加入約1/5混合體積的目標藻細胞培養(yǎng)液體，并用自然海水混合，模擬成自然海水的樣品特點。PNATP28S01探針均能在這兩個藻的混合樣品中，將目標藻T.pulchellum識別出來，而不會和其他藻發(fā)生顯著的交叉反應。熒光顯微鏡和流式細胞儀的檢測結果比較一致。用DAPI染色是為了幫助判斷染色的細胞是否屬于目標藻的活細胞(見圖2，G.H.I.J.K.L)。
4.結論用熒光標記的PNA探針能很容易地從混合樣品中檢測出目標生物T.pulchellum。
實施例4T.pulchellum藻與FAM標記特異性PNA探針雜交的流式細胞儀檢測。
1.材料同實施例1。
2.方法根據(jù)Amann(參見文獻Amann，R.In situ identification ofmicroorganisms by whole cell hybridizationwith rRNA-targeted nucleic acid probes.In Akkermann，A.D.L.，VanElsas，J.D.&de-Bruijin，F(xiàn).J.[Eds].Molecular Microbial Ecology Manual.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，The Netherlands，1995.1-15.)提出用流式細胞儀檢測原位熒光雜交的方法進行改進。將實驗室培養(yǎng)的T.pulchellum單種藻細胞或混合樣品用1％的多聚甲醛在4℃下固定1～2h，然后用乙醇PBS(70∶30，v/v)進行脫色1h。離心去上清，加入雜交緩沖溶液(25mM Tris-HCl，pH9.0；100mMNaCl；0.5％w/v SDS)50～100μl以及探針，使探針的終濃度為50～300nM。溫育30～60min，溫度為45～55℃。雜交結束后加入預熱的雜交洗滌液(10mM Tris，pH9.0，1mMEDTA)，在45～55℃下溫孵10～30min，然后采用離心法洗滌沉淀，重復洗滌2～3次。最后將細胞重懸在PBS緩沖溶液中(pH9.0)。樣品用Bechman coulte Epics Altra 2型流式細胞儀中進行檢測，激光波長為488nm。
3.結果被PNA探針標記的經(jīng)過流式細胞儀檢測時，形狀一致的被標記的細胞和未被標記的細胞均能被有效地識別，熒光強度不同便形成了不同的峰值，從而構成不同的圖譜。從圖4中可以看出，流式細胞儀對PNA標記的T.pulchellum細胞檢測效果與熒光顯微鏡下的結果一致。且能對熒光強度進行量化，其熒光強度與相似序列DNA探針標記的細胞有一定的差異，并明顯高于空白對照組和陰性對照組的自發(fā)熒光強度，從而使特異性標記的藻細胞能被檢出(圖3A)。在混合樣品中，流式細胞儀也能根據(jù)PNA探針標記的綠色熒光信號的強弱，將靶細胞與混合藻種從復雜的背景中區(qū)分開來。從未被探針標記的細胞產(chǎn)生的波峰與標記探針波峰圖譜的分離程度，可以反映出特異性分子探針的雜交率較高(圖3B)。圖中的其他藻細胞也能產(chǎn)生一定的熒光強度，可能這些藻存在自發(fā)熒光以及部分藻也存在著較弱的交叉反應，導致其產(chǎn)生部分熒光信號(檢測結果詳見圖4)。
4.結論通過流式細胞儀定性和定量的檢測表明，PNA探針可以在混合樣品或單種樣品中很容易地把目標赤潮生物T.pulchellum從背景顆粒和陰性染色藻(不能被探針標記上熒光的混合藻)中區(qū)分開。
實施例5FAM標記特異性PNA探針應用于現(xiàn)場樣品的檢測結果。
1.材料及方法將現(xiàn)場樣品進行濃縮及顯微鏡計數(shù)后，用針筒吸取1～2ml濃縮后的樣品，在13mm針筒過濾器上低壓過濾，用針筒吸取1×PBS 1mL清洗一次5min，濾掉。針筒吸取預熱的雜交緩沖液1mL清洗一次，5min，濾掉。核孔濾膜可以室溫空氣干燥(大的濾膜如25mm可以剪成若干小塊，用作多樣本分析)。將濾膜置于載玻片上，直接加入預熱的雜交緩沖液100μl與熒光探針，使探針終濃度達到300nM。將玻片置于溫濕雜交盒于暗處55℃雜交30min。溫濕暗雜交盒(自制)中的濕紙用雜交緩沖液潤濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜(根據(jù)濾膜大小，用量可以減半)。用預熱的(55℃)雜交清洗液洗滌濾膜來終止雜交反應，以100μl清洗3次，每次溫育5min，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜。加入10-60uL封片劑Citifluor/DAPI-Mix(含1ug/mL DAPI)復染并防止熒光衰退。蓋上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。玻片可以在冷凍條件下保存數(shù)月而熒光不會衰減。
2.結果將采自廈門港的赤潮樣品用PNA探針進行檢測，在供試的9個樣品中，已經(jīng)用明視野結合DNA及Lectin探針進行了檢測，PNA探針的檢測結果顯著高于相似序列的DNA探針(TP28S01)檢出率(p＜0.01)，也高于最佳DNA探針(TP18S01)的檢出率。表明PNA探針能用于對現(xiàn)場復雜樣品進行檢測，且靈敏度高，檢出信號強烈，探針結合能力很強。這種探針可作為現(xiàn)場赤潮生物監(jiān)測的理想工具。檢測效果見圖2，I，檢測的具體結果詳見表4。
表4 2005年廈門西海域赤潮樣品中Takayama各探針的檢出數(shù)量和站位分布(Cell/L)

3.結論熒光標記的PNA探針能較好地應用于對現(xiàn)場樣品進行有效地檢測。
雖然PNA探針仍然存在一些不足，如價格過于昂貴，操作不慎容易產(chǎn)生假陽性，這些限制了其廣泛的應用，但使用PNA分子探針來檢測赤潮卻有著重要的前景。
實施例6以下給出熒光標記肽核酸(PNA)探針快速檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的方法的具體步驟。
取50～100μl純培養(yǎng)樣品的固定細胞(數(shù)量在104～105/ml之間)，通過離心沉淀，沉淀用PBS緩沖溶液洗滌后重新懸浮于50～100μl的雜交緩沖溶液中，加入含有終濃度為50～300nM的熒光標記PNA探針。細胞在40～60℃下溫孵30～60min，8000～10000rpm離心5～10min后，重新懸浮于100～500μl的雜交洗滌液中，在45～55℃下保溫10～20min。用離心法洗滌沉淀并重復2～3次，最后一次洗滌后，細胞重新懸浮于50～100μl洗滌溶液中，其中將2～5μl細胞懸浮液均勻鋪展在干凈的顯微鏡載玻片上，直到干燥，蓋上厚的蓋玻片觀察。
用于現(xiàn)場樣品的檢測應用方法為將現(xiàn)場樣品進行濃縮及顯微鏡計數(shù)后，用針筒吸取1～5ml濃縮后的樣品，在13～25mm針筒過濾器上低壓過濾，用針筒吸取緩沖容易1～5mL，清洗一次，5～10min，濾掉。針筒吸取預熱的雜交緩沖液1～5mL清洗一次，5～10min，濾掉。核孔濾膜可以室溫空氣干燥。將濾膜置于載玻片上，直接加入預熱的雜交緩沖液50～100μl與熒光探針，使探針終濃度達到50～300nM。將玻片置于溫濕雜交盒于暗處45～55℃雜交30～60min。溫濕暗雜交盒(為自制產(chǎn)品)中的濕紙用雜交緩沖液潤濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜(根據(jù)濾膜大小，用量可以減半)。用預熱的(45～60℃)雜交清洗液洗滌濾膜來終止雜交反應，以50～100μl清洗2～3次，每次溫育5～10min，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜。加入10-60uL封片劑進行復染并防止熒光衰退。蓋上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。玻片可以在冷凍條件下保存數(shù)月而熒光不會衰減。
用流式細胞儀進行檢測的方法為將實驗室培養(yǎng)的T.pulchellum單種藻細胞或混合樣品用終濃度為1％的多聚甲醛在0～4℃下固定1～2h，然后用乙醇PBS(磷酸緩沖溶液)(70∶30，v/v)進行脫色1～1.5h，離心去上清，加入雜交緩沖溶液50～100μl以及探針，使探針的終濃度為50～300nM。溫育30～60min，溫度為45～60℃。雜交結束后加入預熱的雜交洗滌液，在45～55℃下溫孵10～30min，然后離心沉淀并重復3次，最后將細胞重懸在PBS緩沖溶液中(pH9.0)，樣品用Bechman coulte Epics Altra 2型流式細胞儀中進行檢測，激光波長為488nm，功率為50W。
本申請涉及到的核酸序列(以下序列方向均為5’-3’方向)1.纖小裸甲藻PNA肽核酸探針名稱及序列(自主設計)PNATP28S01，ATG CCA TCT CAA GA。
2.纖小裸甲藻DNA探針的序列(自主設計)TP18S01，CAATACCAGGGCGAACCT；TP18S02，CAGGCCGAGCCAGATACGCA；TP28S01，CGATGCCATCTCAAGACT；TP28S02，GAACGAAGCACGGGAAGTGAA。
3.根據(jù)參考文獻(黃邦欽，陳紀新，焦念志，等.應用熒光原位雜交和特異性寡核苷酸探針檢測亞歷山大藻屬和塔瑪亞歷山大藻探索.高技術通訊，2003，1390-95)設計的PNA陽性探針名稱及序列如下PNA-Euk1209，GCATCACAGACCTG。
4.根據(jù)文獻(Litaker R.W.，Vandersea M.W.，Kibler S.R.et al..Life cycle of the hetero trophicdinoflagelate Pfiesteria piscicida(Dinophyceae)[J].J.Phycol.，2002，38(3)442～463.)得到的PNA陰性探針名稱及序列如下PNABacUni-I，CTGCCTCCCGTAGGA。
權利要求
1.檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針，其特征在于熒光標記肽核酸分子名稱為PNATP28S01，熒光標記肽核酸分子結構的組成序列為[Flu]-OOATG CCA TCT CAA GA，其分子骨架不含戊糖和磷酸基團，呈電中性，4種單體分別攜帶有ATGC4種堿基以首尾相連構成鏈狀結構。
2.如權利要求1所述的檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針，其特征在于所述的熒光標記肽核酸分子的N端標記有熒光報告基團FAM，激發(fā)光波長Ex＝494nm，發(fā)射光波長Em＝522nm，熒光報告基團和N端以連接器相連，C端無報告基團，Tm值分別為[1μM]＝68℃，[1nM]＝56℃，[1pM]＝44℃，分子量MW＝4428.85，由14個堿基組成，有17個殘基，嘌呤比例占50％，連續(xù)的嘌呤長度為4個，分子間堿基的互補性低。
3.如權利要求1所述的檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針的設計和獲取方法，其特征在于其步驟為1)靶DNA序列的獲得，采用DNA提取，PCR擴增，克隆，測序；2)將通過PCR產(chǎn)物克隆和測序得到的rDNA靶序列，利用核苷酸序列排列軟件Clustal X與從各大核酸數(shù)據(jù)得到親緣關系相近生物的5S RNA，18S RNA，28S RNA以及ITS1，ITS2序列分別進行排序；3)根據(jù)排序結果，初選出目標種的保守序列，并選擇長度為18～25bp；利用GeneBank提供的BLAST接口將步驟2)得到的特異性序列在已發(fā)表的核酸數(shù)據(jù)庫進行匹配性搜索，篩選出在已知所有序列中保守屬與種的特異性序列；4)利用Oligo 6.0程序或Primer Select軟件(DNASTAR，Madison，WI)檢測探針序列的各項參數(shù)指標，計算其GC含量、結構特點、Tm值；5)在第1)、2)、3)、4)步驟工作的基礎上進行PNA探針的設計和計算，并再次利用BLAST進行相似性搜索；6)選擇獲得陰性對照探針PNABacUni-I，序列為CTGCCTCCCGTAGGA，并進行輔助PNA探針設計，獲得符合條件的陽性對照探針PNA-Euk1209，序列為GCATCACAGACCTG。
4.如權利要求3所述的檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針的設計和獲取方法，其特征在于在步驟1)中，rDNA的PCR擴增、純化及克隆方法為離心收集指數(shù)生長期末期的細胞，基因組的提取方法采用改良的CTAB法，PCR基本程序為預變性94℃，5min；94℃，1min；54℃，1min；72℃，1min；30個循環(huán)；延伸72℃，10min；進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化，然后克隆到pGEM-T質粒，藍白斑篩選，菌落PCR確定為陽性反應后送生工測序。
5.如權利要求1所述的檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針在檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻中的應用。
6.如權利要求5所述的檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針在檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻中的應用，其特征在于其步驟為1)取培養(yǎng)樣品的固定細胞，通過離心沉淀，沉淀用PBS緩沖溶液洗滌后重新懸浮于雜交緩沖溶液中，加入含有終濃度為50～300nM的熒光標記PNA探針；2)細胞在40～60℃下溫孵、離心后，重新懸浮于雜交洗滌液中，在45～55℃下保溫；3)用離心法洗滌沉淀后，細胞重新懸浮于洗滌溶液中，將細胞懸浮液均勻鋪展在干凈的顯微鏡載玻片上，直到干燥，蓋上蓋玻片觀察。
7.如權利要求6所述的檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針在檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻中的應用，其特征在于用于現(xiàn)場樣品的檢測應用方法為將現(xiàn)場樣品進行濃縮及顯微鏡計數(shù)后，用針筒吸取濃縮后的樣品，在針筒過濾器上低壓過濾，用針筒吸取緩沖溶液，清洗后濾掉；針筒吸取預熱的雜交緩沖液，清洗后濾掉；將濾膜置于載玻片上，直接加入預熱的雜交緩沖液與熒光探針，使探針終濃度達到50～300nM；將玻片置于溫濕雜交盒于暗處45～55℃雜交；溫濕暗雜交盒中的濕紙用雜交緩沖液潤濕，并確保含探針的雜交緩沖液完全覆蓋濾膜；用45～60℃預熱的雜交清洗液洗滌濾膜來終止雜交反應，清洗后溫育，洗滌后用干凈濾紙吸干濾膜；加入封片劑進行復染并防止熒光衰退；蓋上蓋玻片并封片，儲存于暗處以備檢測。
8.如權利要求6所述的檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針在檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻中的應用，其特征在于用流式細胞儀進行檢測的方法為將實驗室培養(yǎng)的T.pulchellum單種藻細胞或混合樣品用終濃度為1％的多聚甲醛在0～4℃下固定，然后用乙醇磷酸緩沖溶液進行脫色后，離心去上清，加入雜交緩沖溶液和探針，使探針的終濃度為50～300nM，溫育，雜交結束后加入預熱的雜交洗滌液，在45～55℃下溫孵，然后離心沉淀，最后將細胞重懸在PBS緩沖溶液中，樣品用流式細胞儀進行檢測。
9.如權利要求6或7或8所述的檢測和鑒定有害赤潮塵物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針在檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻中的應用，其特征在于雜交緩沖溶液的配方為25mMTris-HCl，pH 9.0；100mMNaCl；0.5％w/vSDS；雜交洗滌液中的配方為10mM Tris，pH 9.0，1mMEDTA。
全文摘要
檢測赤潮生物纖小裸甲藻的肽核酸探針及其應用，涉及一種分子探針，提供一種能快速檢測和鑒定有害赤潮生物纖小裸甲藻的熒光標記肽核酸探針及其設計方法與應用。分子名稱為PNATP28S01，分子結構組成序列為[Flu]－OO ATG CCA TCT CAA GA，呈電中性，4種單體分別攜帶有ATGC4種堿基以首尾相連構成鏈狀結構。探針設計時，將rDNA靶序列用核苷酸序列排列軟件與從各大核酸數(shù)據(jù)得到親緣關系相近生物的序列排序；選出目標種保守序列，將特異性序列進行匹配性搜索，篩選出在已知序列中保守屬與種的特異性序列；檢測探針序列參數(shù)；進行PNA探針的設計和計算，得陰陽性對照探針。
文檔編號C12Q1/04GK1884581SQ20061003572
公開日2006年12月27日 申請日期2006年6月1日 優(yōu)先權日2006年6月1日
發(fā)明者黃邦欽, 侯建軍 申請人:廈門大學