專利名稱：檢測黑麥草腥黑穗病菌的引物、探針及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和植物檢疫，尤其涉及一種黑麥草腥黑穗病菌的檢測方法，以及該檢測方法使用的引物與探針。
背景技術(shù)：
小麥印度腥黑穗病菌(Tilletia indica Mitra)是世界關(guān)注的危險性有害生物，也是我國對外公布的一類危險性有害生物，主要分布在印度、巴基斯坦、伊朗、伊拉克、尼泊爾、阿富汗、巴西、墨西哥、美國和南非等地。黑麥草腥黑穗病菌(Tilletia walkeri)是類似小麥印度腥黑穗病菌的新種，近年隨著糧食市場的開放，進(jìn)口糧食數(shù)量的不斷增加，黑麥草腥黑穗病菌傳入的機(jī)會和風(fēng)險也增加了，特別是主要糧食出口國美國也有黑麥草腥黑穗病菌的發(fā)生，給我國口岸檢疫帶來病菌檢測的新難題。目前常用的檢測和鑒定方法是形態(tài)特征鑒定和常規(guī)PCR技術(shù)。形態(tài)特征鑒定需要豐富的經(jīng)驗和一定數(shù)量的病菌冬孢子。常規(guī)PCR技術(shù)需要冬孢子萌發(fā)培養(yǎng)繁殖得到菌絲，整個處理和鑒定的過程長達(dá)2-3周，而且冬孢子休眠和不具存活力也影響病菌的鑒定。如果直接檢測孢子，從孢子中提取DNA再PCR檢測，需要的孢子量比較大，在實際的檢測過程中難以得到大量的孢子，而且實際的樣品中可能存在幾種病菌孢子。因此以上兩種鑒定方法的實用性受到一定的限制。
Frederick等(2000)報道了利用TaqMan探針進(jìn)行小麥印度腥黑穗病菌實時熒光PCR檢測方法。章桂明等(2002)也建立了小麥印度腥黑穗病菌的實時熒光PCR檢測方法(未發(fā)表)。已報道的實時熒光PCR方法的探針都是針對小麥印度腥黑穗病菌的線粒體序列，而線粒體序列的變異速率比核糖體序列變異速率更大，核糖體序列更為保守和穩(wěn)定。因此，針對黑麥草腥黑穗病菌的核糖體序列設(shè)計特異性探針，建立黑麥草腥黑穗病菌的實時熒光PCR檢測方法，可達(dá)到快速、準(zhǔn)確地檢測與鑒定的效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供用于檢測黑麥草腥黑穗病菌的引物。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供用于檢測黑麥草腥黑穗病菌的探針。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種檢測黑麥草腥黑穗病菌的方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了用于檢測黑麥草腥黑穗病菌的引物，它包含15個或更多個連續(xù)核苷酸的一條鏈或其互補(bǔ)鏈，其中一個或多個核苷酸是SEQ ID NO.1序列的32、57、258、277中任何位點的核苷酸。
較佳地，所述引物含有5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’或其互補(bǔ)鏈；5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’或其互補(bǔ)鏈。
在本發(fā)明的另一方面，提供了用于檢測黑麥草腥黑穗病菌的探針，它包含15個或更多個連續(xù)核苷酸的一條鏈或其互補(bǔ)鏈，其中一個或多個核苷酸是SEQ ID NO.1序列的67、78、82中任何位點的核苷酸。
較佳地，所述探針含有(FAM)-CGGAAGGAACAAGGC-(MGB)或其互補(bǔ)鏈。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測黑麥草腥黑穗病菌的方法，包括如下步驟(1)提取冬孢子DNA；(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列的引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(3)以步驟(2)的PCR產(chǎn)物為模板，用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增；(4)分析步驟(3)的實驗結(jié)果。
較佳地，步驟(3)中所述的引物為具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列的一對引物。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的檢測黑麥草腥黑穗病菌的方法使檢測時間大大縮短，八個小時內(nèi)即可完成檢測，而傳統(tǒng)的檢測方法需二至三周以上，且本發(fā)明單個冬孢子就可檢測，靈敏度有效提高，而傳統(tǒng)的檢測方法需100個孢子以上，此外，本發(fā)明能同時檢測兩種病菌冬孢子，而傳統(tǒng)的常規(guī)檢測方法不能同時檢測兩種病菌冬孢子。


圖1是本發(fā)明的檢測黑麥草腥黑穗病菌的流程圖；圖2是本發(fā)明的引物和探針位置圖；圖3是本發(fā)明的單個冬孢子的實時熒光PCR檢測實驗結(jié)果圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
針對病原菌ITS(internal transcribed spacer，核糖體基因的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列的特異性位點差異(G/A)，設(shè)計了檢測黑麥草腥黑穗病菌的TaqMan-MGB(Minor Groove Binder)探針TWAL，建立了單個冬孢子的real time PCR檢測技術(shù)，圖1為檢測黑麥草腥黑穗病菌的技術(shù)流程圖。
檢測原理見圖2所示，在黑麥草腥黑穗病菌的核糖體序列中設(shè)計特異性引物和TaqMan-MGB特異性探針，它們的序列如下上游引物D-FPa5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’(SEQ IDNO.2)；下游引物T-RPb5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’(SEQ ID NO.3)；黑麥草腥黑穗病菌探針TWAL(FAM)-CGGAAGGAACAAGGC(MGB)(SEQID NO.4)。
檢測黑麥草腥黑穗病菌的步驟如下1)冬孢子DNA獲取準(zhǔn)備滅菌的干凈蓋玻片塊(2mm×2mm)，將單個冬孢子挑至一個蓋玻片小塊上，用另一個蓋玻片小塊蓋住，輕輕按壓蓋玻片小塊使孢子破裂，最后將兩個蓋玻片小塊一起轉(zhuǎn)移至盛有PCR反應(yīng)液的PCR小管中進(jìn)行擴(kuò)增。
2)第一輪擴(kuò)增利用引物Til1(5’-AAGGTTTCTGTAGGTGAACCT-3’)(SEQ ID NO.5)/Til4(5’-GATATGCTTAAGTTCAGCGG G-3’)(SEQ ID NO.6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增20個循環(huán)，PCR反應(yīng)總體積為30μl，包含10mmol/L Tris-HCl；50mmol/L KCl(pH8.3)；1.5mmol/L MgCl2；dATP，dGTP，dCTP，dTTP濃度為100μmol/L；引物濃度100nmol/L；0.5U Taq DNA聚合酶(寶生物工程有限公司)。加雙蒸水至終體積為30μl，混勻離心，置于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。取產(chǎn)物1μl進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增。
3)實時熒光PCR檢測實時熒光PCR擴(kuò)增體系25μl(大連寶生物工程有限公司TaKaRareal-time PCR core kit)5×real time PCR Buffer(Mg2+free)5μl，Mg2+solution(250mmol/L)0.5μl，dNTP mixture(各10mmol/L)0.75μl，TaKaRa Ex-Taq HS(5U/μl)0.25μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.5μl，TaqMan-MGB探針(5μmol/L)0.6μl，DNA(10～20ng/μl)模板0.5μl，超純水補(bǔ)至25μl，實時熒光PCR擴(kuò)增在ABI PRISM 7700定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。兩步法擴(kuò)增反應(yīng)程序50℃ 2min，預(yù)變性95℃10min；然后95℃ 15s，65℃ 1min循環(huán)40次。反應(yīng)用水作空白對照，用黑麥草腥黑穗病菌的菌絲DNA為陽性對照，用腥黑粉菌以外的真菌DNA作為陰性對照。
4)檢測實驗結(jié)果如圖3所示，定量PCR儀檢測到以黑麥草腥黑穗病菌的菌絲DNA為模板的陽性對照FAM熒光信號增長，陰性對照和空白對照都沒有熒光信號增長，而樣品的檢測結(jié)果是FAM熒光信號增長，表明檢測到的真菌是黑麥草腥黑穗病菌。在圖3中，有2條上升的曲線，其中，左邊數(shù)字標(biāo)號為2的一條曲線代表黑麥草腥黑穗病菌的單個冬孢子的檢測結(jié)果，右邊一條數(shù)字標(biāo)號為4的曲線代表作為陽性對照的黑麥草腥黑穗病菌的菌絲DNA的檢測結(jié)果，數(shù)字1曲線是小麥印度腥黑穗病菌的單個冬孢子的檢測結(jié)果，數(shù)字3曲線代表作為陽性對照的小麥印度腥黑穗病菌的菌絲DNA的檢測結(jié)果，數(shù)字5曲線是沒有模板DNA的陰性對照，由圖3表明此次實時熒光PCR檢測到的真菌是黑麥草腥黑穗病菌。
序列表<110>上海出入境檢驗檢疫局<120>檢測黑麥草腥黑穗病菌的引物、探針及方法<130>NP-10482<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>300<212>DNA<213>Tilletia walkeri<400>1atcattagtg aattacggag ctcttcttcg gaagagtctc cttctctttt atcccaacac 60caaactacgg aaggaacaag gccttgcgct gagtacctgt ccggatggaa cagagttgct 120agtacttcgg tattggcagc gctgctccaa cccttttaaa cacttaagaa ttaaagaatg 180ttaaaactat tgtcttcgga cataaactaa tatacaactt ttgacaacgg atctcttggt 240tctcccatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt 300<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2
ttctctttta tcccaacacc aaact 25<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cttatcgcat ttcgctgcg19<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<400>4cggaaggaac aaggc15<210>5<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5aaggtttctg taggtgaacc t 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6gatatgctta agttcagcgg g 2權(quán)利要求
1.用于檢測黑麥草腥黑穗病菌的引物，其特征在于，它包含15個或更多個連續(xù)核苷酸的一條鏈或其互補(bǔ)鏈，其中一個或多個核苷酸是SEQ IDNO.1序列的32、57、258、277中任何位點的核苷酸。
2.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，它含有5’-TTCTCTTTTATCCCAACACCAAACT-3’或其互補(bǔ)鏈。
3.如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，它含有5’-CTTATCGCATTTCGCTGCG-3’或其互補(bǔ)鏈。
4.用于檢測黑麥草腥黑穗病菌的探針，其特征在于，它包含15個或更多個連續(xù)核苷酸的一條鏈或其互補(bǔ)鏈，其中一個或多個核苷酸是SEQ IDNO.1序列的67、78、82中任何位點的核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的探針，其特征在于，它含有(FAM)-CGGAAGGAACAAGGC-(MGB)或其互補(bǔ)鏈。
6.一種檢測黑麥草腥黑穗病菌的方法，其特征在于，它包括如下步驟(1)提取冬孢子DNA；(2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6序列的引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；(3)以步驟(2)的PCR產(chǎn)物為模板，用權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增；(4)分析步驟(3)的實驗結(jié)果。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的引物為具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列的一對引物。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測黑麥草腥黑穗病菌Tilletia walkeri的特異引物和探針，以及運用該引物和探針進(jìn)行黑麥草腥黑穗病菌檢測的方法。本發(fā)明的檢測黑麥草腥黑穗病菌的方法使檢測時間大大縮短，靈敏度大大提高，單個冬孢子就可檢測，且本發(fā)明能同時檢測兩種病菌冬孢子，進(jìn)一步提高了檢測效率。
文檔編號C12N15/11GK101054600SQ20061002568
公開日2007年10月17日 申請日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者易建平, 周國梁, 印麗萍 申請人:上海出入境檢驗檢疫局