專利名稱：通過fad依賴性單加氧酶直接電化學(xué)再生的酶促氧合方法
背景技術(shù)：
未反應(yīng)烴的選擇性氧化作用仍代表著合成有機(jī)化學(xué)的最具挑戰(zhàn)性前沿之一。尤其需要處理的是反應(yīng)物活化和反應(yīng)選擇性之間的精密平衡?！敖?jīng)典的”化學(xué)氧供體如過氧化物、次氯酸鹽、亞碘酰苯或二環(huán)氧乙烷[1]缺乏氧化更復(fù)雜的底物所需要的選擇性。
另外，最具催化能力的化學(xué)方法尚未得到充分的發(fā)展，因此催化劑的轉(zhuǎn)換數(shù)和頻率以及立體辨別能力偏低[2，3]。另一方面，自然界已發(fā)展出恰好符合前述標(biāo)準(zhǔn)的通用催化工具。
單加氧酶通常以完全的區(qū)域選擇性和立體選擇性方式催化高度多樣化的氧化反應(yīng)，其催化劑性能達(dá)到每分鐘數(shù)百個(gè)轉(zhuǎn)換數(shù)[4]?；钚匝趸悇e從單加氧酶活性位點(diǎn)的分子氧原位產(chǎn)生，從而使不良副反應(yīng)最小化。因此，單加氧酶是用于合成有機(jī)化學(xué)的有前途的催化劑[5-8]。然而，單加氧酶是輔因子依賴性酶，其需要提供還原當(dāng)量用于O2活化。通常，那些還原當(dāng)量源自昂貴且不穩(wěn)定的煙酰胺輔因子(NAD(P)H)[9-11]。而且，單加氧酶經(jīng)常由復(fù)雜的多酶體系組成，該多酶體系完成從NAD(P)H到末端加氧酶的電子轉(zhuǎn)移。由于其復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和NAD(P)H依賴性，單加氧酶的制備性應(yīng)用，除少數(shù)例外[8，12-16]，一直以來在很大程度上限制于使用代謝活性微生物的完整細(xì)胞方法[5，8，17-19]。
考慮到模仿天然單加氧酶循環(huán)的復(fù)雜性，直接向氧合循環(huán)中引入還原力可以大幅度簡(jiǎn)化生物催化的氧化反應(yīng)。由于所使用的還原力是可控制的并且負(fù)極用作電子的免試劑源，所以電化學(xué)還原法成為選擇方法之一。在這方面，血紅素依賴性單加氧酶類目前已成為優(yōu)選的研究對(duì)象。在單加氧酶的血紅素-鐵中心和負(fù)極之間的電傳遞是通過直接接觸[20，21]和經(jīng)由介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的人工[22]或生物氧化還原傳遞[23-25]而建立。
與對(duì)P450單加氧酶的多種研究活動(dòng)相反，令人驚奇的是，用于黃素依賴性單加氧酶類的相似方法尚沒有報(bào)道，因?yàn)樵撁割惔呋铣尚匝趸磻?yīng)如羥基化[12，26，27]、Baeyer-Villiger氧化[28，29]、和環(huán)氧化作用[30]。
來自假單胞菌(Pseudomonas sp.)VLB120的苯乙烯單加氧酶(StyAB)催化廣范圍苯乙烯衍生物的特異性(S)-環(huán)氧化作用[31，32]。該酶由催化環(huán)氧化反應(yīng)的FAD依賴性單加氧酶組分(StyA)和遞送還原當(dāng)量從NADH經(jīng)FADH2到StyA的NADH依賴性還原酶組分(StyB)組成[33]。
先前我們已經(jīng)證明，由于StyB可以被化學(xué)還原劑置換而不損害反應(yīng)的立體化學(xué)過程或反應(yīng)速率，所以StyB不直接參與環(huán)氧化反應(yīng)[34]。通過使用作為轉(zhuǎn)移氫化催化劑的有機(jī)金屬絡(luò)合物[Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+連同作為還原當(dāng)量的化學(xué)計(jì)量性來源的甲酸鹽實(shí)現(xiàn)FADH2的原位再生。
發(fā)明描述以下發(fā)明涉及由FAD依賴性單加氧酶催化的從離析物E到產(chǎn)物P的酶促氧合方法，其特征在于FAD依賴性單加氧酶是由直接的電化學(xué)還原再生。
離析物E的化學(xué)特性可以是廣泛多樣的，只要單加氧酶，特別是FAD依賴性單加氧酶能夠接受離析物E作為氧合底物即可。優(yōu)選的離析物E是化合物取代的苯乙烯和苯乙烯衍生物，特別優(yōu)選的是表1中提到的底物。
根據(jù)本發(fā)明的單加氧酶優(yōu)選來自假單胞菌的苯乙烯單加氧酶(StyAB)[31，32]。其它的優(yōu)選酶列于圖9。
電酶促環(huán)氧化作用的最初實(shí)驗(yàn)是使用反式-β-甲基苯乙烯作為底物進(jìn)行的。使用相對(duì)Ag/AgClsat的-550mV負(fù)極電勢(shì)以恒電勢(shì)電解。當(dāng)反應(yīng)介質(zhì)中缺少StyA或FAD時(shí)，沒有檢測(cè)到產(chǎn)物形成。另一方面，在全部反應(yīng)組分存在下電解形成了可水解的、更具極性的產(chǎn)物，經(jīng)確認(rèn)該產(chǎn)物實(shí)際上是對(duì)映體純(1S，2S)-1-苯基丙烯氧化物[36]。同樣地，廣泛多樣的不同取代的芳乙烯化合物可以被轉(zhuǎn)化成為超過98％光學(xué)純的對(duì)應(yīng)的(S)環(huán)氧化物(表1)。
表1取代苯乙烯衍生物的電酶促環(huán)氧化作用 一般條件10mL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH7.5)，T＝30℃，c(StyA)＝2.13μM，c(FAD)＝300μM，c(觸酶)＝480UmL-1，c(反式-β-甲基苯乙烯)＝2mM，負(fù)極14cm2。T＝25℃，15分鐘后測(cè)定活性。
然而，盡管電酶促氧合反應(yīng)的立體辨別符合用完整細(xì)胞[31，32]和無細(xì)胞反應(yīng)[34，35]所得到的數(shù)值，但是環(huán)氧化作用速率相對(duì)較差。在起始速率的研究中，已測(cè)定出高達(dá)2.1Umg-1的特異性StyA活性[33]。因此，表1中所述速率僅組成部分的(少于2％)StyA催化電勢(shì)。為了確定存在的電酶促環(huán)氧化反應(yīng)限速因子，我們還考察了不同反應(yīng)參數(shù)對(duì)電酶促環(huán)氧化反應(yīng)速率的影響。
如

圖10所示，電酶促環(huán)氧化反應(yīng)的速率與所使用的生物催化劑濃度相關(guān)。觀察到不依賴生物催化劑濃度的特異性StyA活性為35.5+2.1 U g-1。該特異性活性是溫度依賴性的，在其它條件相同時(shí)，隨著反應(yīng)溫度從例如25℃增加至37℃環(huán)氧化作用活性增加2.5倍[36]。因此，乍一看，StyA似乎是電酶促反應(yīng)中的限速因素。然而，與最大值相比StyA的催化性能較差，這表明仍有其它因素嚴(yán)重限制著電酶促環(huán)氧化反應(yīng)速率。
將相對(duì)Ag/AgClsat的負(fù)極電勢(shì)從-550降低至-650mV并不顯著影響反應(yīng)進(jìn)程[36]，表明從負(fù)極到FAD的電子轉(zhuǎn)移并非FADH2再生的限速因素。然而，作為非均相反應(yīng)，F(xiàn)ADH2的再生可以通過向負(fù)極表面的傳質(zhì)來限制。實(shí)際上，我們觀察到，高達(dá)至少500μM的增加的FAD濃度導(dǎo)致產(chǎn)生增加的環(huán)氧化作用速率[36]。這些結(jié)果與先前結(jié)果相悖，在先前的結(jié)果中，使用FADH2的均相再生觀察到10和20μM之間的限定的最佳FAD濃度[33，34]。關(guān)于該點(diǎn)，F(xiàn)ADH2的自催化氧化作用[37]解釋了FAD濃度高于20μM時(shí)環(huán)氧化作用速率的下降。在這種情況下，由于負(fù)極表面FAD的可用性增加，增加的FADH2生成速率可以使該作用失效。倘若后者的假設(shè)正確并且負(fù)極FADH2再生受到擴(kuò)散限制的影響，負(fù)極表面也應(yīng)影響再生速率。因此，研究了負(fù)極表面相與反應(yīng)體積比率的影響。如圖11所示，特異性StyA活性(此處描述為轉(zhuǎn)換頻率[每分鐘的催化循環(huán)])與負(fù)極面積和反應(yīng)體積的比率直接相關(guān)。
總之，這些觀察表明，在電酶促環(huán)氧化反應(yīng)中的StyA活性受限于環(huán)氧化反應(yīng)的FADH2的可用性。由于還原的黃素在分子氧存在下并不穩(wěn)定[37]，我們研究了通氣對(duì)電酶促環(huán)氧化反應(yīng)速率的影響(圖12)。
有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)增加通氣速率急劇加速環(huán)氧化物形成速率。沒有活躍的空氣通入時(shí)，在反應(yīng)中測(cè)定的特異性StyA活性在30Ug-1范圍(圖12)。另外，僅總體形成約50μM的環(huán)氧化物，說明超過80％的溶解氧被酶促環(huán)氧化作用之外的反應(yīng)消耗。另一方面，高通氣率增加特異性StyA活性高達(dá)215Ug-1，相當(dāng)于最大StyA活性的約10％。這是令人感興趣的，因?yàn)殛P(guān)于P450單加氧酶的直接還原再生的研究從總體限制性的酶促氧合反應(yīng)鑒定了電化學(xué)再生反應(yīng)的氧化解偶聯(lián)[22，24，38]。例如，Vilker和合作者發(fā)現(xiàn)，如果在應(yīng)用負(fù)極電勢(shì)和在正極原位再生氧之前用氬清除電解緩沖液，則P450cam驅(qū)動(dòng)的樟腦羥基化急劇增加?？紤]到如體系1所列出的FADH2氧化作用機(jī)制[37]可以解釋這一明顯的矛盾。
體系1FADH2的非StyA相關(guān)氧化作用的主要機(jī)制[37]。k1＝1×106M-1s-1；k1＝5×108M-1s-1；k2＝8×107M-1s-1因此，由可逆的同比例形成的半醌自由基陰離子限制還原黃素的非酶支持氧化的總體速率。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)中c(O2)不影響FADH2的非酶支持再次氧化的速率。另一方面，分子氧直接參與形成有催化活性的4α-過氧黃素。假設(shè)這是StyA催化的環(huán)氧化反應(yīng)的總限速步驟，這將足以解釋環(huán)氧化作用速率對(duì)通氣速率的依賴。后者的假定得到使用FAD依賴性對(duì)羥基苯乙酸酯-3-羥化酶的類似結(jié)果支持，其中發(fā)現(xiàn)4α-過氧黃素的形成是限速的和O2依賴性的[39]。未來實(shí)驗(yàn)將更加仔細(xì)地檢查O2原位濃度對(duì)電酶促反應(yīng)的影響。
迄今為止，新的電酶促環(huán)氧化反應(yīng)制備性應(yīng)用的一個(gè)特殊挑戰(zhàn)是其相對(duì)低的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。通常，反應(yīng)在1-1.5小時(shí)后終止。從目前獲得的結(jié)果可以得出一些定性結(jié)論。首先，可以檢測(cè)到總體反應(yīng)時(shí)間與所應(yīng)用的總蛋白質(zhì)含量相關(guān)(比較圖10)，其次，反應(yīng)時(shí)間隨著通氣率下降(圖12)。兩個(gè)觀察到的現(xiàn)象都指向該反應(yīng)條件下生物催化劑的低穩(wěn)定性。該StyA的低穩(wěn)定性可以部分歸因于StyA暴露于局部高濃度的部分還原的氧(源自O(shè)2的負(fù)極還原)引起的負(fù)極表面對(duì)StyA的吸附[40]。另外，O2的非均相攝取導(dǎo)致在液-氣界面產(chǎn)生剪切力和表面張力使生物催化劑的三維結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。先前研究表明了額外“犧牲”蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白(BSA)[35]的有益影響，StyA的非均相化，如通過固定到Eupergit C也是可行的。以在多種條件下增加生物催化劑穩(wěn)定性為目的的進(jìn)一步研究正在進(jìn)行。
總之，我們的研究首次證明了黃素依賴性單加氧酶的直接電化學(xué)再生。僅由電能驅(qū)動(dòng)，由相應(yīng)的芳乙烯化合物合成光學(xué)純的環(huán)氧化物。因此，由3個(gè)多肽(StyA、StyB和NADH再生酶)和2個(gè)輔因子(NADH和FAD)組成的相當(dāng)復(fù)雜的天然電子傳遞鏈可以被消減至最簡(jiǎn)生物催化環(huán)氧化反應(yīng)所決定必須的成分。目前，已表明電酶促方法對(duì)于簡(jiǎn)化這類復(fù)雜酶系統(tǒng)是有效的，其可以延伸至其它酶促氧合反應(yīng)[41]，使得僅使用電化學(xué)槽中的所分離單加氧酶和FAD可進(jìn)行合成性反應(yīng)，如氧化脫硫作用[42]、芳香環(huán)的特異性羥基化[43-45]、對(duì)映體選擇性Baeyer-Villiger反應(yīng)[46]以及甚至選擇性的鹵化反應(yīng)[47]。
實(shí)驗(yàn)部分具有可獲得的最高純度的化學(xué)藥品購(gòu)自Fluka(Buchs，瑞士)并且在使用前不再純化。
如前所述，StyA自重組大腸埃希氏菌(Escherichia coli)JM101富集[35]。凍干生物催化劑的純度約為70％(如通過SDS凝膠電泳所測(cè)定)。
電解在恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)器中進(jìn)行。使用圓柱形的碳?xì)肿鳛樨?fù)極(工作電極)并調(diào)節(jié)相對(duì)于飽和Ag/AgClsat參比電極的電勢(shì)。工作電極的大小在指定的宏觀范圍內(nèi)(對(duì)應(yīng)于27.1±2.1mgcm-2的平均值)。選擇隔開的或未隔開的電解槽。對(duì)于隔開的電解槽，Pt絲對(duì)電極被置于透析膜上；或者另外使用Pt箔(直徑1cm)。在反應(yīng)器中補(bǔ)入所指示反應(yīng)組分之后，使用相對(duì)Ag/AgClsat的-550mV負(fù)極電勢(shì)。對(duì)于隔開的電解槽，由非均相空氣通入提供O2(使用Hewlett Packard皂膜式流量計(jì)估計(jì)通氣速率)；在未隔開的電解槽的情況下，O2在對(duì)電極產(chǎn)生。
如通過使用先前報(bào)道方案的HPLC所測(cè)定，基于產(chǎn)物形成測(cè)定反應(yīng)速率(及其計(jì)算的酶性能)[34，35]。
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權(quán)利要求
1.由FAD依賴性單加氧酶催化的從離析物E到產(chǎn)物P的酶促氧合方法，其特征在于通過直接的電化學(xué)還原再生FAD依賴性單加氧酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中氧合反應(yīng)是環(huán)氧化作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中氧合反應(yīng)是氧化脫硫作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中氧合反應(yīng)是對(duì)映體選擇性Baeyer-Villiger反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中氧合反應(yīng)是芳香族分子的羥基化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中FAD依賴性單加氧酶是4-羥基苯乙酸酯-單加氧酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中FAD依賴性單加氧酶是吡咯-2-羧酸酯-單加氧酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中FAD依賴性單加氧酶是氯苯酚-4-羥化酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中離析物E是取代的或未取代的苯乙烯。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中FAD依賴性單加氧酶是來自假單胞菌的苯乙烯單加氧酶(Sty AB)。
全文摘要
由FAD依賴性單加氧酶催化的酶促氧合和直接電化學(xué)再生FAD依賴性單加氧酶的方法。
文檔編號(hào)C12P7/00GK1954077SQ200580015356
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月13日
發(fā)明者A·施米德, F·霍爾曼, K·霍夫施泰特爾, T·哈比歇爾, B·豪爾 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司