專(zhuān)利名稱(chēng)：多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及相對(duì)于大腸桿菌(E.coli)異源的多肽的制備方法。更具體地，本發(fā)明針對(duì)使用有機(jī)磷酸酯來(lái)提高所述多肽的產(chǎn)量。
2.相關(guān)技術(shù)描述借助于公知的分子生物學(xué)以及微生物遺傳操縱的相對(duì)簡(jiǎn)易性，在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)中用大腸桿菌表達(dá)異源蛋白質(zhì)極為高產(chǎn)。通常，用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如堿性磷酸酶啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、阿拉伯糖啟動(dòng)子等)來(lái)調(diào)控異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。對(duì)誘導(dǎo)的需要給予研究者控制靶向蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)間的機(jī)會(huì)。這種能力對(duì)于那些在高濃度時(shí)不被宿主良好耐受的異源蛋白質(zhì)尤為重要。通過(guò)在誘導(dǎo)表達(dá)前達(dá)到理想的細(xì)胞密度，所需蛋白質(zhì)的高量產(chǎn)出可以實(shí)現(xiàn)最大化。
當(dāng)微生物缺乏一種需要的養(yǎng)分時(shí)細(xì)胞停止生長(zhǎng)。限制型組分可以是碳、氮、磷、氧或任何細(xì)胞所需元素。在這種情況下，細(xì)胞不再處于生長(zhǎng)期。緩解由養(yǎng)分限制而造成的應(yīng)激反應(yīng)的培養(yǎng)的方法是提供所缺組分的飼料(feed)。在補(bǔ)料分批(fed-batch)發(fā)酵方法中引入的常用飼料包括葡萄糖、氨基酸、氧等等。
就細(xì)胞磷(P)而言，對(duì)于磷供給的需要并不令人驚訝，因?yàn)镻是在細(xì)胞中排在碳、氧、氮、氫之后、量位居第五的元素。Slanier，Adelberg and Ingraham，The Microbial World，4thed.(Prentice Hall，NJ 1976)，p.1357。磷是大量大分子如核酸、脂質(zhì)糖類(lèi)和膜脂質(zhì)中的必需元素。并且，它在高能磷酸酐鍵中的作用使其對(duì)于能量代謝尤為重要。大腸桿菌能利用無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)(Pi)、有機(jī)磷酸酯(鹽)(organophosphate)或磷酸酯作為主要的P源。從環(huán)境攝入Pi可以通過(guò)兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)-Pit和Pst系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。有機(jī)磷酸酯(鹽)大多數(shù)是非轉(zhuǎn)運(yùn)型的，它們首先需要先在周質(zhì)中被酶解，之后釋放的Pi能夠被Pi轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝入。只有幾種有機(jī)磷酸酯(鹽)是轉(zhuǎn)運(yùn)型的，3-磷酸-甘油(G3P)就是這樣一個(gè)例子。已知G3P和甘油磷酸-1-磷酸(G1P)是α-磷酸甘油。響應(yīng)于Pi-限制和碳-限制，大腸桿菌能從外部環(huán)境攝取存在的完整G3P到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室(compartment)，其中G3P經(jīng)代謝產(chǎn)生需要的磷酸酯(鹽)或碳。Wanner，“Phosphorus Assimulation and Control of the Phosphate Regulon”，inEscherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology，Neidhardt，ed.，(second edition)，American Society for Microbiology Press(1996)，pp.1357-1365。
G3P的更多文獻(xiàn)有，Silhavy et al.，J.Bacteriol.，126951-958(1976)，它涉及與大腸桿菌的sn-3-磷酸-甘油轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)的周質(zhì)蛋白；Argast et al.，J.Bacteriol.，1361070-1083(1978)，它涉及大腸桿菌中sn-3-磷酸-甘油的第二轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)；Elvin et al.，J.Bacteriol.，1611054-1058(1985)，它涉及由glpT-依賴(lài)型G3P轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)的Pi互換；Rao et al.，J.Bacteriol.，17574-79(1993)，它涉及glpT和glpD突變對(duì)phoA基因在大腸桿菌中表達(dá)的影響；和Elashviliet al.，Appl.Environ.Microbiol.，642601-2608(1998)，它涉及phnE和glpT基因增強(qiáng)大腸桿菌K-12中有機(jī)磷酸酯(鹽)的利用。另外，Vergeles et al.，Eur.J.Biochem.，233442-447(1995)公開(kāi)了也稱(chēng)為β-磷酸甘油的2-磷酸-甘油(G2P)和G3P作為蛇毒磷酸二酯酶酯化作用中核苷酸基受體的高度有效性。
對(duì)于兩種將外源性G3P攝入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Ugp和GlpT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的現(xiàn)有理解，已經(jīng)詳細(xì)描述于Neidhardt等編輯的書(shū)Escherichia coli andSalmonella，Cellular and Molecular Biology(第二版)如上所述，pp.1364中，參照參考文獻(xiàn)13和81。Ugp操縱子屬于pho調(diào)節(jié)子。它由對(duì)磷酸酯(鹽)的限制誘導(dǎo)并受phoB蛋白質(zhì)正向調(diào)控。Ugp系統(tǒng)是周質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)-依賴(lài)性的多組分轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其中ugpB編碼周質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)，ugpA和ugpC編碼完整的膜通道蛋白質(zhì)，并且ugpC編碼ATPase。GlpT是介導(dǎo)甘油、G3P、和甘油磷酰基磷酸二酯的攝入和代謝的glp系統(tǒng)的一部分(Lin et al.，Annu.Rev.Microbiol.，30535-578(1976)；Chapter 20；pg 307-342 Dissimilatory Pathwaysfor sugars，polyols and carboxylates.Escherichia coli and Salmonella，Cellularand Molecular Biology，第二版)。此轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是已知通過(guò)與外部G3P交換而介導(dǎo)Pi從細(xì)胞質(zhì)流出的陰離子交換器(exchanger)。在G3P上生長(zhǎng)的野生型菌株中，雖然通過(guò)Ugp系統(tǒng)攝入G3P的細(xì)胞所釋放的Pi不多，當(dāng)通過(guò)GlpT系統(tǒng)攝入G3P時(shí)，Pi可被釋放到周質(zhì)中。如果由于glpT-通透酶-介導(dǎo)的外流而釋放減低量的Pi，pho調(diào)節(jié)子活性，包括Ugp系統(tǒng)都將關(guān)閉。在某些情況下，GlpT是Pi通過(guò)與外部G3P交換而從細(xì)胞流出的唯一途徑。Elvin et al.，J.Bacteriol.，1611054-1058(1985)；Rosenberg，“Phosphate transport inprokaryotes，”p.205-248.In B.P.Rosen and S.Silver(ed.)，Ion Transport inProkaryotes(Academic Press，Inc.，New York，1987)。
比較Ugp和GlpT系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)G3P的能力，這兩個(gè)系統(tǒng)的最大速度相似。對(duì)于G3P的明顯親和力，Ugp系統(tǒng)比GlpT系統(tǒng)高。很可能，如果在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在G3P，那么兩個(gè)系統(tǒng)將能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供足夠的G3P。然而，經(jīng)過(guò)Ugp系統(tǒng)排它轉(zhuǎn)運(yùn)的G3P可作為磷酸酯(鹽)的唯一來(lái)源，而不是碳的唯一來(lái)源，但GlpT-轉(zhuǎn)運(yùn)的G3P可用作這兩者的的唯一來(lái)源(Schweizer et al.，JBacteriol.，1501154-1163(1982))。已經(jīng)為編碼pho-調(diào)節(jié)子-依賴(lài)性G3P轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的兩種ugp基因制作圖譜(Schweizer et al.，J.Bacteriol.，1501164-1171(1982))，已經(jīng)鑒定了包含這些基因的ugp區(qū)(Schweizer et al.，Mol.and Gen.Genetics，197161-168(1984))并且研究了ugp操縱子的調(diào)控作用(Schweizeret al.，J.Bacteriol.，163392-394(1985)；Kasahara et al.，J.Bacteriol.，173549-558(1991)；Su et al.，Molecular & General Genetics，23028-32(1991)；Brzoska et al.，“ugp-dependent transport system for sn-glycerol 3-phosphate ofEscherichia coli，”p.170-177 in A.Torriani-Gorini，F(xiàn).G.Rothman，S.Silver，A.Wright，and E.Yagil(ed.)，Phosphate Metabolism and Cellular Regulation inMicroorganisms(American Society for Microbiology，Washington，D.C.，1987)；Brzoska et al.，J.Bacteriol.，17615-20(1994)；和Xavier et al.，J.Bacteriol.，177699-704(1995))。
在野生型菌株中，存在G3P的穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)池并且維持在大約200μM。在菌株內(nèi)部，當(dāng)菌株生長(zhǎng)在作為唯一碳源的甘油上時(shí)，可以將甘油用甘油激酶(由glpK編碼)通過(guò)酶轉(zhuǎn)化為G3P，或者當(dāng)菌株生長(zhǎng)在甘油以外的碳源上時(shí)，通過(guò)用gpsA基因的基因產(chǎn)物G3P合酶還原糖酵解中間物磷酸二羥丙酮(dihydroxyactone phosphate)來(lái)合成G3P。因?yàn)镚3P是重要的形成所有磷脂分子支架的中間物，內(nèi)部的磷酸甘油也可以由磷脂和三乙酰甘油分解而產(chǎn)生。作為代謝產(chǎn)物，內(nèi)部的G3P可以傳送到磷脂生物合成途徑，或者被G3P脫氫酶氧化形成磷酸二羥丙酮并進(jìn)料到糖酵解途徑。
在用AP啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控大腸桿菌中的異源蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)，因?yàn)檎T導(dǎo)僅僅在培養(yǎng)基耗竭Pi后出現(xiàn)，誘導(dǎo)AP啟動(dòng)子活性的細(xì)胞通常磷酸酯(鹽)饑餓并處于健康下降狀況。它們可能必須搜尋細(xì)胞功能所需的磷酸酯(鹽)。搜尋這類(lèi)磷酸酯(鹽)的可能結(jié)果可包括核糖體更新(turnover)、細(xì)胞能量下降和蛋白酶表達(dá)及蛋白質(zhì)水解增加(St.John and Goldberg，J.Bacteriol.，1431223-1233(1980))，潛在的結(jié)果是導(dǎo)致健康細(xì)胞變少并且伴隨蛋白質(zhì)積累量下降。
提高大腸桿菌的代謝狀態(tài)可以可察覺(jué)地提高細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的能力。如果緩慢地進(jìn)料磷酸酯(鹽)，細(xì)胞僅會(huì)覺(jué)察到周質(zhì)中低Pi濃度，從而誘導(dǎo)pho調(diào)控子而不會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)P原子饑餓(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,304,472)。需要提供更多方法來(lái)在大腸桿菌中制備異源多肽。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種提高大腸桿菌中異源多肽表達(dá)的方法。進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯(鹽)如α-磷酸甘油到各種大腸桿菌宿主包括那些帶或不帶野生型glpT基因的宿主及那些帶或不帶野生型phoA基因的宿主，如(ugp+ΔglpTphoA-)大腸桿菌，顯示出在搖瓶和10-L-發(fā)酵規(guī)模中提高了異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，并預(yù)期在更大規(guī)模如10,000L有類(lèi)似表現(xiàn)。在應(yīng)用了多種啟動(dòng)子，包括可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如tac、T7或AP啟動(dòng)子的多個(gè)模型系統(tǒng)中觀察對(duì)于異源蛋白質(zhì)表達(dá)的產(chǎn)物產(chǎn)量益處。進(jìn)一步的有利之處在于產(chǎn)物可以在活動(dòng)生長(zhǎng)期較早獲得，即在相對(duì)其它較短的時(shí)間內(nèi)獲得。在某些實(shí)施方案中，更多產(chǎn)物可以在活動(dòng)生長(zhǎng)期較早獲得以顯著提高生產(chǎn)率。
因此，本發(fā)明如下所述。本發(fā)明一方面提供了相對(duì)于大腸桿菌異源的多肽的制備方法，其包含(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼所述多肽的核酸，同時(shí)向培養(yǎng)基進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯(鹽)，從而表達(dá)所述核酸，和(b)從所述細(xì)胞回收所述多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，有機(jī)磷酸酯(鹽)是磷酸甘油，更優(yōu)選是α-磷酸甘油和/或β-磷酸甘油，并更優(yōu)選2-磷酸-甘油和3-磷酸-甘油的混合物或3-磷酸-甘油自身。在另一優(yōu)選的方面，培養(yǎng)在搖瓶或發(fā)酵罐，優(yōu)選發(fā)酵罐中進(jìn)行。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，從細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)或培養(yǎng)基中回收所述多肽。也優(yōu)選所述核酸的表達(dá)受可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如堿性磷酸酶啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、或T7啟動(dòng)子的調(diào)控，并優(yōu)選其中所述核酸的表達(dá)在培養(yǎng)步驟的活動(dòng)生長(zhǎng)期中開(kāi)始。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，大腸桿菌是野生型的。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，大腸桿菌是染色體glpT和染色體phoA缺陷型的，但優(yōu)選不是染色體ugp缺陷型的。優(yōu)選，無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)在培養(yǎng)步驟中也存在。
不受任何理論所限，相信在本方法中給細(xì)胞進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯(鹽)化合物可使Pho系統(tǒng)的pstS不會(huì)察覺(jué)磷酸酯(鹽)供給，但仍會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中分解時(shí)提供磷酸酯(鹽)，而且進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯如G3P，會(huì)有效地使細(xì)胞富集可利用的代謝中間物，所述中間物可被容易地進(jìn)料到重要的代謝途徑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示在搖瓶培養(yǎng)中利用tac啟動(dòng)子在BL21大腸桿菌宿主中表達(dá)分泌型llama抗體片段，該培養(yǎng)過(guò)程用水或200mM G3P作為低磷酸酯(鹽)(CRAP)或高磷酸酯(鹽)(THCD)培養(yǎng)基的補(bǔ)充物。
圖2顯示在搖瓶培養(yǎng)中利用T7啟動(dòng)子在HMS174大腸桿菌宿主中表達(dá)細(xì)胞質(zhì)Apo2L，該培養(yǎng)過(guò)程用水或200mM G3P作為CRAP培養(yǎng)基的補(bǔ)充物。
圖3顯示在發(fā)酵中進(jìn)料G3P對(duì)于分泌型IGF-1隨時(shí)間累積的作用。它使用了野生型大腸桿菌宿主、AP啟動(dòng)子和持續(xù)進(jìn)料的葡萄糖。
圖4顯示glpT突變和在發(fā)酵中進(jìn)料G3P對(duì)于分泌型IGF-1隨時(shí)間累積的作用。它使用了ΔglpT大腸桿菌宿主、AP啟動(dòng)子和多種G3P進(jìn)料速度。
圖5顯示pAPApo2-P2RU的質(zhì)粒圖譜。
圖6顯示人類(lèi)Apo-2配體cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。在核苷酸447位的“N”(SEQ ID NO1中)用于表示該核苷酸堿基可以是“T”或“G”。
圖7顯示進(jìn)料G3P對(duì)于ΔglpT大腸桿菌(43F6)宿主中Apo2L的比累積(specific accumulation)的作用，其中具有三個(gè)不同的進(jìn)料速度和一個(gè)無(wú)G3P進(jìn)料的對(duì)照。
圖8顯示向野生型glpT宿主(43E7)進(jìn)料磷酸甘油相比無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)對(duì)Apo2L的比總累積(specific total accumulation)的益處，其中細(xì)胞密度增加到OD550超過(guò)200。
圖9顯示在野生型glpT大腸桿菌宿主(43E7)和ΔglpT大腸桿菌(43F6)宿主中，用磷酸甘油替代無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)對(duì)Apo2L的比總累積的作用。
圖10顯示在ΔglpT大腸桿菌(61G1)宿主中，用α-磷酸甘油和β-磷酸甘油的50∶50混合物替代α-磷酸甘油進(jìn)料，相比無(wú)進(jìn)料的對(duì)照，對(duì)于總Apo2L累積的作用。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述定義“多肽”在本文中一般指具有10個(gè)以上氨基酸的肽和蛋白質(zhì)?！爱愒础倍嚯氖侵赶鄬?duì)于所用的宿主細(xì)胞而言外來(lái)的那些多肽，如大腸桿菌產(chǎn)生的人類(lèi)蛋白質(zhì)。所述多肽可以是原核多肽或真核多肽，優(yōu)選真核多肽，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物多肽，最優(yōu)選人類(lèi)多肽。
哺乳動(dòng)物多肽的實(shí)例包括下列分子，例如腎素；生長(zhǎng)激素，包括人生長(zhǎng)激素或牛生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素釋放因子；甲狀旁腺素；甲狀腺刺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；前胰島素；血小板生成素；卵泡刺激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如凝血因子VIIIC，凝血因子IX，組織因子，和von Willebrands因子；抗-凝血因子，如蛋白C；心房鈉尿肽(atrial naturietic factor)；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活劑，例如尿激酶或人尿或組織型纖溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；造血生長(zhǎng)因子；腫瘤壞死因子-α和-β；抗ErbB2結(jié)構(gòu)域抗體如2C4(WO01/00245；雜交瘤ATCC HB-12697)，其與ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域(例如，ErbB2的約殘基22-584所示區(qū)域中所含的任何一或多個(gè)殘基)結(jié)合；腦啡肽酶；Muellerian抑制物質(zhì)；松弛素A鏈；松弛素B鏈；前松弛素；小鼠絨毛膜促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白質(zhì)，例如β-內(nèi)酰胺酶；DNase；抑制素；激活素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)；激素或生長(zhǎng)因子的受體；整聯(lián)蛋白；蛋白A或D；類(lèi)風(fēng)濕因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF；心肌營(yíng)養(yǎng)蛋白(心臟肥大因子)如心營(yíng)養(yǎng)蛋白-1(CT-1)；血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如aFGF和bFGF；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8和CD19；促紅細(xì)胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干擾素，例如干擾素-α、-β和γ；血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；抗-HER-2抗體；Apo2配體(Apo2L)；超氧化物歧化酶；T細(xì)胞受體；表面膜蛋白；衰變(decay)加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；歸巢受體；地址素(adderssin)；調(diào)節(jié)蛋白；抗體；以及上述任何多肽的片段。
優(yōu)選多肽包括多肽如HAS、BSA、抗-IgE、抗-CD20、抗-IgG、t-PA、gp120、抗-CD11a、抗-CD18、2C4、抗-VEGF、VEGF、TGF-β、激活素、抑制素、抗-HER-2、DNase、IGF-I、IGF-II、腦IGF-I、生長(zhǎng)激素、松弛素鏈、生長(zhǎng)激素釋放因子、胰島素鏈或前胰島素、抗體和抗體片段、NGF、NT-3、BDNF、Apo2L、和尿激酶。所述多肽最優(yōu)選IGF-I或Apo2L。
術(shù)語(yǔ)“Apo2配體”、“Apo2L”和“TRAIL”在本文中可以互換使用，它們指包括圖6所示氨基酸序列(SEQ ID NO2)的含氨基酸殘基114-281、含殘基95-281、含殘基92-281、含殘基91-281、含殘基41-281、含殘基15-281、或含殘基1-281的多肽序列，以及上述序列的生物活性片段，以及上述序列的缺失、插入或取代的變體。一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽序列包含圖6(SEQ IDNO2)的殘基114-281。任選地，所述多肽序列包含圖6(SEQ ID NO2)的殘基92-281或殘基91-281。Apo2L多肽可以用圖6所示的天然核苷酸序列(SEQID NO1)編碼。任選地，編碼殘基Pro119(圖6；SEQ ID NO1)的密碼子可以是“CCT”或“CCG”。另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述片斷或變體是具有生物活性的并與上述任一上述序列具有至少大約80％的氨基酸同一性，更優(yōu)選至少大約90％的序列同一性，甚更優(yōu)選至少95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。此定義包含Apo2配體的取代變體，其中至少它的天然氨基酸之一被丙氨酸殘基取代。此定義也包含從Apo2配體來(lái)源分離的天然序列Apo2配體或通過(guò)重組或合成方法制備的天然序列Apo2配體。本發(fā)明的Apo2配體包括在WO 97/01633、WO 97/25428和WO 01/00832公開(kāi)的稱(chēng)為Apo2配體或TRAIL的多肽。術(shù)語(yǔ)“Apo2配體”和“Apo2L”通常指包括該多肽的單體、二聚體或三聚體形式的Apo2配體形式。除非特別指出，Apo2L序列中所指的氨基酸殘基的所有編號(hào)使用根據(jù)圖6(SEQ ID NO2)的編號(hào)。例如，“D203”或“Asp203”指在圖6所示序列(SEQ ID NO2)的位置203的天冬氨酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“Apo-2配體胞外結(jié)構(gòu)域”或“Apo2配體ECD”指基本無(wú)跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的Apo2配體的形式。通常地，ECD具有1％以下的所述跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，并優(yōu)選具有0.5％以下的這種結(jié)構(gòu)域?！吧飳W(xué)活性的”或“生物學(xué)活性”在涉及Apo2L時(shí)指(a)具有活體(in vivo)或離體(ex vivo)誘導(dǎo)或刺激至少一種哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞的凋亡的能力；(b)能夠產(chǎn)生抗體(即免疫原性)；(c)能夠結(jié)合和/或刺激Apo2L的受體；或(d)保留天然或天然出現(xiàn)的Apo2L多肽的能力。
術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指在具體宿主生物中表達(dá)可操作相連的編碼序列所必需的DNA序列。適宜于原核生物的控制序列包括啟動(dòng)子，任選還有操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。
當(dāng)核酸與另一核酸序列產(chǎn)生功能上的關(guān)聯(lián)時(shí)，該核酸與所述另一核酸序列是“可操作相連的”。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白時(shí)，編碼前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與編碼該多肽的DNA是可操作相連的；啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，所述啟動(dòng)子與該編碼序列是可操作相連的；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)處在促進(jìn)翻譯的位置時(shí)，它與編碼序列是可操作相連的。通常，“可操作相連”是指相連的DNA序列是鄰接的(contiguous)，而且，在分泌前導(dǎo)序列的情況中，是鄰接并處在同一個(gè)閱讀框中的。連接可通過(guò)在便利的限制性位點(diǎn)進(jìn)行連接來(lái)完成。如果不存在這類(lèi)位點(diǎn)，可根據(jù)常規(guī)實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
“細(xì)胞”，“細(xì)胞系”以及“細(xì)胞培養(yǎng)物”在本文中可以互換使用，它們都包括其后代。因此，“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代細(xì)胞及其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。還應(yīng)理解，由于有意或無(wú)意的突變，所有后代在DNA含量方面不一定完全相同。在最初的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出的、具有相同功能或生物活性的突變后代也包括在內(nèi)。不管命名有否不同，從上下文可以清楚顯示其含義。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“有機(jī)磷酸酯”指包含一或多個(gè)碳原子、也可包含鹵素原子的磷酸酯(鹽)化合物。這種磷酸酯(鹽)化合物必須是這樣，即它能被進(jìn)料到細(xì)胞培養(yǎng)中并被利用。這些化合物通常用作殺蟲(chóng)劑。“可轉(zhuǎn)運(yùn)的”有機(jī)磷酸酯可以從細(xì)胞的外環(huán)境轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)而不必需用任一種方式預(yù)先水解。如果大腸桿菌株在有機(jī)磷酸酯存在時(shí)生長(zhǎng)得不好，可以通過(guò)在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)phnE基因產(chǎn)物來(lái)增強(qiáng)對(duì)此有機(jī)磷酸酯的利用。此基因經(jīng)轉(zhuǎn)化賦予大腸桿菌株自發(fā)利用有機(jī)磷酸酯的表型。見(jiàn)Elashvili et al.，如上所述。適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)磷酸酯舉例包括烷基鹵代磷酸酯(鹽)(halophosphate)如二異丙基氟磷酸，烷基磷酸酯(鹽)如二異丙基磷酸酯(鹽)和3，4-二羥基丁基-1-磷酸，以及含糖或含鏈烷醇(alkanol)的磷酸酯(鹽)，如6-磷酸-己糖和3-磷酸-甘油。優(yōu)選葡萄糖-1-磷酸，己糖-6-磷酸和磷酸甘油，如葡萄糖-1-磷酸甘油，果糖-6-磷酸甘油，α-磷酸甘油如甘油-1-磷酸和3-磷酸-甘油，和β-磷酸甘油(2-磷酸-甘油)，更優(yōu)選磷酸甘油，更優(yōu)選α-和/或β-磷酸甘油，還優(yōu)選2-磷酸-甘油和/或3-磷酸-甘油，本文所用最優(yōu)選的是2-磷酸-甘油和3-磷酸-甘油的混合物或3-磷酸-甘油。本文所用的不是混合物或“G3P自身”的術(shù)語(yǔ)“G3P”指包含至少約80％3-磷酸-甘油的組合物；它可包含最多約20％的雜質(zhì)如G2P。G3P與G2P的混合物可包含不足約80％的G3P。
無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)是磷酸酯(鹽)化合物，不包含任何碳原子，磷酸酯(鹽)通常與堿金屬或堿土金屬連接如磷酸鉀、磷酸鈣、磷酸鎂或磷酸鈉。
“活動(dòng)生長(zhǎng)期”指培養(yǎng)步驟所處的時(shí)段，其中細(xì)胞正在活躍生長(zhǎng)，它們不是養(yǎng)分嚴(yán)重受限的細(xì)胞，如在靜止期的那些細(xì)胞。
進(jìn)行本發(fā)明的方式本發(fā)明提供了相對(duì)于大腸桿菌異源的多肽的制備方法。在此方法中，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述多肽的核酸的大腸桿菌細(xì)胞，同時(shí)向培養(yǎng)基進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯，從而表達(dá)所述核酸。然后從所述細(xì)胞回收所述多肽。該回收可以來(lái)自細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)或培養(yǎng)基。培養(yǎng)可以在任何合適的容器，優(yōu)選搖瓶或發(fā)酵罐，更優(yōu)選發(fā)酵罐中進(jìn)行。
使用培養(yǎng)參數(shù)并且以常規(guī)方式進(jìn)行多肽的制備，如下面所述的那些方法。
A.核酸及其修飾的選擇編碼目標(biāo)多肽的核酸可以適當(dāng)?shù)貋?lái)自任何來(lái)源的、編碼目標(biāo)多肽的RNA、cDNA或基因組DNA，只要其編碼所述目標(biāo)多肽。選擇合適的核酸來(lái)在大腸桿菌中表達(dá)異源多肽(包括其變體)的方法公知。
如果制備了單克隆抗體，編碼所述單克隆抗體的DNA可以容易地用常規(guī)方法分離并測(cè)序(例如通過(guò)使用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是優(yōu)選的這種DNA的來(lái)源。一旦分離，所述DNA可置于表達(dá)載體中，然后將該載體轉(zhuǎn)化到本文所述的細(xì)菌宿主細(xì)胞中來(lái)獲得在重組宿主細(xì)胞中合成的單克隆抗體。關(guān)于在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述文章包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.，5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.，130151-188(1992)。
對(duì)非人抗體進(jìn)行人源化的方法在本領(lǐng)域已經(jīng)作了描述。優(yōu)選地，人源化抗體含有一或多個(gè)從非人來(lái)源引入其中的氨基酸殘基。那些非人的氨基酸殘基通常稱(chēng)為“引進(jìn)(import)”殘基，它們通常取自“引進(jìn)的”可變區(qū)。人源化基本可以按照Winter及其合作者的方法進(jìn)行(Jones et al.，Nature，321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science，2391534-1536(1988))，用高變區(qū)序列取代人類(lèi)抗體的相應(yīng)序列。因此，所述“人源化”抗體是嵌合的抗體(美國(guó)專(zhuān)利4,816,567)，其中少于整個(gè)人可變區(qū)的部分已經(jīng)被來(lái)自非人物種的相應(yīng)序列所取代。實(shí)踐中，人源化抗體通常是人抗體，其中一些高變區(qū)殘基以及可能還有一些FR殘基被來(lái)自嚙齒類(lèi)動(dòng)物抗體類(lèi)似位點(diǎn)的殘基所取代。
對(duì)用于制備人源化抗體的人的輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇對(duì)于降低抗原性是很重要的。根據(jù)所謂的“最適合(best-fit)”方法，針對(duì)已知的人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)篩選嚙齒類(lèi)動(dòng)物抗體的可變區(qū)序列。接受與嚙齒類(lèi)動(dòng)物序列最接近的人的序列作為人源化抗體的人的框架區(qū)(FR)(Sims et al.，J.Immunol.，1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.，196901(1987))。另一種方法采用輕鏈或重鏈特定亞型的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。相同的框架可用于多種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，1512623(1993))。
更重要的是，將抗體人源化后仍保留對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達(dá)到此目的，根據(jù)一種優(yōu)選方法，用親本序列和人源化序列的三維模型，分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物，以此制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過(guò)觀察這些展示結(jié)果，可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過(guò)這種方法，可從受體(recipient)和引進(jìn)序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對(duì)靶抗原的親和力增加?？傊?，超變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。
本申請(qǐng)還涉及人源化抗體或親和力成熟的抗體的各種形式。例如，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，如Fab，其可任選與一個(gè)或多個(gè)靶向試劑偶聯(lián)以制備免疫偶聯(lián)物?；蛘?，所述人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是完整的抗體，例如完整的IgG1抗體。
Fab′-SH片段可從大腸桿菌直接回收，并經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)中分離F(ab′)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在其它實(shí)施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)(WO 93/16185；美國(guó)專(zhuān)利5,571,894和美國(guó)專(zhuān)利5,587,458)?？贵w片段也可以是“線性化抗體”，舉例如美國(guó)專(zhuān)利5,641,870所述。這類(lèi)線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。
雙特異性抗體是具有針對(duì)至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的抗體。例示性雙特異性抗體可以與同一蛋白質(zhì)的兩個(gè)不同表位結(jié)合。雙特異性抗體可制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(如F(ab′)2雙特異性抗體)。這些可以是多條抗體鏈的融合物或可以是一條鏈。一條重鏈自身可以是有活性的(competent)。
在制備雙特異性抗體的方法中，雙特異性免疫粘附素是通過(guò)將分別編碼包含與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列融合的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域但缺少輕鏈結(jié)合位點(diǎn)的第一融合物、包含與免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)序列融合的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域并保留輕鏈結(jié)合位點(diǎn)的第二融合物、以及免疫球蛋白輕鏈的DNA序列引入宿主細(xì)胞而制備的。然后培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以表達(dá)DNA序列來(lái)制備如下的混合物(i)包含與第二融合物-免疫球蛋白輕鏈配對(duì)物共價(jià)連接的第一融合物的異三聚體(heterotrimer)；(ii)包含兩個(gè)共價(jià)連接的第二融合物-免疫球蛋白輕鏈配對(duì)物的異四聚體(heterotetramer)；和(iii)包含兩個(gè)共價(jià)連接的第一融合物的分子的異二聚體。從細(xì)胞培養(yǎng)中除去產(chǎn)物的混合物，并從其它產(chǎn)物中分離異三聚體。此方法公開(kāi)于WO 94/04690。制備雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，見(jiàn)例如Suresh et al.，Methods in Enzymology，121210(1986)。
根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利5,731,168所述的另一種方法，可以改造一對(duì)抗體分子之間的界面，使得從重組細(xì)胞培養(yǎng)中收獲的異二聚體的百分比最大。優(yōu)選的界面包括抗體恒定區(qū)CH3結(jié)構(gòu)域的至少一部分。在該方法中，源于第一種抗體分子界面上的一條或多條氨基酸小側(cè)鏈被較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)取代。與所述大側(cè)鏈大小相同或相近的互補(bǔ)“溝”可通過(guò)將氨基酸大側(cè)鏈用小側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代而在第二種抗體分子的界面上形成。此機(jī)制使得異二聚體的產(chǎn)量比其它不必要的終產(chǎn)物如同二聚體等的產(chǎn)量高。
雙特異性抗體包括交聯(lián)抗體或“異源偶聯(lián)物”抗體。例如，可使異源偶聯(lián)物中的抗體之一與抗生物素蛋白偶聯(lián)，使另一抗體與生物素偶聯(lián)。已有觀點(diǎn)認(rèn)為，這類(lèi)抗體可用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞導(dǎo)向不想要的細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利4676980)，和用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，和EP03089)。異源偶聯(lián)物抗體可通過(guò)任何方便的交聯(lián)方法制備。適當(dāng)?shù)慕宦?lián)制劑和多種交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域公知，可公開(kāi)在美國(guó)專(zhuān)利4,676,980中。
從抗體片段制備雙特異性抗體的技術(shù)已在文獻(xiàn)中描述。例如，雙特異性抗體可利用化學(xué)連接來(lái)制備。Brennan et al.，Science，22981(1985)中描述了將完整抗體經(jīng)蛋白水解制備成F(ab′)2片段的方法。這些片段在二巰基復(fù)合劑亞砷酸鈉存在時(shí)被還原，從而穩(wěn)定相鄰的二巰基，并阻止分子間形成二硫鍵。生成的Fab′片段之后被轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。其中一種Fab′-TNB衍生物經(jīng)巰基乙胺還原成Fab′-硫醇(thiol)，再與等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物混合形成雙特異性抗體。如此產(chǎn)生的雙特異性抗體可用于選擇性固定酶的試劑。
另外，F(xiàn)ab′-SH片段可從大腸桿菌直接回收，并經(jīng)化學(xué)偶聯(lián)形成雙特異性抗體(Shalaby et al.，J.Exp.Med.，175217-225(1992))。
直接從重組細(xì)胞培養(yǎng)中制備并分離雙特異性抗體片段的各種技術(shù)也已有描述。例如，可用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體(Kostelny et al.，J.Immunol.，1481547-1553(1992))。將來(lái)自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽與兩種不同抗體的Fab′部分通過(guò)基因融合而連接。使抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)被還原，形成單體，然后被再氧化形成抗體異二聚體。該方法也可用于制備抗體同二聚體。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)描述的“二價(jià)抗體(diabody)”技術(shù)提供了另一種制備雙特異性抗體片段的方法。所述片段中含有重鏈可變區(qū)(VH)，其通過(guò)接頭與輕鏈可變區(qū)(VL)相連，該接頭非常短，使得同一鏈的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法配對(duì)。因此，一個(gè)片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域被迫與另一片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。用單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)制備雙特異性抗體片段的另一種策略也有報(bào)道(Gruber et al.，J.Immunol.，1525368(1994))。
本發(fā)明還涉及二價(jià)以上的抗體。例如可制備三特異性抗體(Tutt et al.，J.Immunol.，14760(1991))。
編碼多肽變體的核酸分子用本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括，但不限于，從天然來(lái)源分離(在存在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過(guò)對(duì)早先制備的該多肽變體或非變體形式進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變，PCR誘變或盒式誘變來(lái)制備。
優(yōu)選修飾本發(fā)明抗體的效應(yīng)器功能(effector function)，以便，例如，增強(qiáng)與Fc受體的結(jié)合。這可以通過(guò)在抗體Fc區(qū)引入一或多個(gè)氨基酸取代而獲得。或者，或另外，可在Fc區(qū)引入半胱氨酸殘基，使得在此區(qū)形成鏈間二硫鍵。
為了延長(zhǎng)該抗體的血清半壽期，可在該抗體(尤其抗體片段)中摻入補(bǔ)救(salvage)受體結(jié)合表位，如美國(guó)專(zhuān)利5,739,277所述。本文中術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)救受體結(jié)合表位”是指IgG分子(例如IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長(zhǎng)該IgG分子的體內(nèi)血清半壽期的表位。
本發(fā)明還涉及抗體的其它修飾。例如，可以使抗體與多種非蛋白質(zhì)聚合物中的一種，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯(polyoxyalkylene)，或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物連接。
B.將核酸插入復(fù)制型載體可以將異源核酸(如cDNA或基因組DNA)適當(dāng)插入復(fù)制型載體中，以便在適宜啟動(dòng)子控制下在大腸桿菌中表達(dá)。許多載體可用于此目的，對(duì)合適的載體的選擇主要取決于要被插入該載體的核酸的大小和要被該載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。每種載體根據(jù)與其相容的具體宿主細(xì)胞而包含不同的組分。依具體的宿主種類(lèi)不同，載體組分通常包括但不限于一或多個(gè)下述組分信號(hào)序列，復(fù)制起點(diǎn)，一或多個(gè)標(biāo)志基因，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
一般來(lái)說(shuō)，包含復(fù)制子和源于與宿主細(xì)胞相容的物種的控制序列的質(zhì)粒載體與大腸桿菌宿主聯(lián)用。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，大腸桿菌通常用pBR322轉(zhuǎn)化，這是來(lái)源于大腸桿菌的質(zhì)粒(參見(jiàn)例如，Bolivar et al.，Gene，295(1977))。pBR322含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗藥性基因，并由此提供鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)便方法。pBR322質(zhì)?；蚱渌?xì)菌質(zhì)粒或噬菌體也通常包含或在修飾后包含能被大腸桿菌宿主使用的啟動(dòng)子，以表達(dá)該選擇標(biāo)記基因。
(i)信號(hào)序列組分編碼本發(fā)明目標(biāo)多肽的DNA不僅可以直接表達(dá)，也可作為與另一多肽的融合物來(lái)表達(dá)，所述另一多肽優(yōu)選信號(hào)序列或在成熟多肽的N末端具有特異性裂解位點(diǎn)的其它多肽。通常，信號(hào)序列可以是載體的組分，或者是插入載體中編碼多肽的DNA的一部分。所選異源信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶裂解)的一種序列。
對(duì)于不識(shí)別和加工天然或真核生物多肽信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，信號(hào)序列則被選自，例如，下組的原核生物信號(hào)序列取代堿性磷酸酶，青霉素酶，1pp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。
(ii)復(fù)制起點(diǎn)組分表達(dá)載體包含能使該載體在一或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。在多種細(xì)菌中，這樣的序列眾所周知。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。
(iii)選擇基因組分表達(dá)載體通常包含選擇基因，也稱(chēng)為選擇標(biāo)志。該基因編碼為生長(zhǎng)在選擇性培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的存活或生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)。未用包含選擇基因的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞將不能在所述培養(yǎng)基中存活。選擇標(biāo)志與本發(fā)明使用和定義的遺傳標(biāo)志不同。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性，(b)彌補(bǔ)并非由遺傳標(biāo)記造成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺陷，或(c)提供復(fù)合培養(yǎng)基不能供給的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。
選擇方案的一個(gè)實(shí)例是利用藥物阻滯(arrest)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。在這種情況下，那些被目標(biāo)核酸成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生能賦予藥物抗性的多肽，從而在選擇中存活。這種顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素(Southern et al.，J.Molec.Appl.Genet.，1327(1982))，霉酚酸(Mulligan et al.，Science，2091422(1980))或潮霉素(Sugden et al.，Mol.Cell.Biol.，5410-413(1985))。這三個(gè)實(shí)例利用在真核控制下的細(xì)菌基因，來(lái)分別傳遞對(duì)適當(dāng)?shù)乃幬颎418或新霉素(遺傳霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。
(iv)啟動(dòng)子組分用于產(chǎn)生目標(biāo)多肽的表達(dá)載體含有可被大腸桿菌識(shí)別并與編碼目標(biāo)多肽的核酸可操作相連的適宜啟動(dòng)子。適用于大腸桿菌宿主的啟動(dòng)子包括，β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang et al.，Nature，275615(1978)；Goeddel etal.，Nature，281544(1979))，阿拉伯糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Guzman et al.，J.Bacteriol.，1747716-7728(1992))，堿性磷酸酶，T7啟動(dòng)子，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel，Nucleic Acids Res.，84057(1980)；和EP 36,776)，和雜合(hybrid)啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子(deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983))。但其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是適宜的。它們的核苷酸序列業(yè)已公開(kāi)，因而技術(shù)人員可以利用連接子或銜接子(adaptor)提供任何所需限制酶位點(diǎn)，將這些核苷酸序列與編碼目標(biāo)多肽的DNA可操作連接(Siebenlist et al.，Cell，20269(1980))。
優(yōu)選地，本文使用的啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即被誘導(dǎo)劑或條件(如周質(zhì)磷酸酯(鹽)耗竭)激活的啟動(dòng)子。優(yōu)選本文的此類(lèi)可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是堿性磷酸酶啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。
用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子通常還含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其與編碼目標(biāo)多肽的DNA可操作連接。該啟動(dòng)子可通過(guò)限制酶消化，與細(xì)菌來(lái)源的DNA脫離，并插入到含有所需DNA的載體中。
(v)構(gòu)建并分析載體包含上述所列一或多個(gè)組分的適宜載體可使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)構(gòu)建。分離的質(zhì)?；駾NA片段按所需形式裂解，剪裁(tailored)和再連接，以產(chǎn)生所需質(zhì)粒。
為了分析證實(shí)所構(gòu)建質(zhì)粒中的正確序列，用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12株294(ATCC 31,446)或其它菌株，并用相應(yīng)的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇出成功的轉(zhuǎn)化體。制備來(lái)自轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶消化進(jìn)行分析，和/或用Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467(1977)或Messing et al.，Nucleic Acids Res.，9309(1981)的方法，或用Maxamet al.，Methods in Enzymology，65499(1980)的方法測(cè)序。
C.選擇并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞作為表達(dá)本發(fā)明質(zhì)粒的適宜親代宿主的大腸桿菌宿主包括大腸桿菌W3110(ATCC 27,325)、大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、和大腸桿菌X1776(ATCC 31,537)。這些實(shí)例是為了說(shuō)明而不是為了限制。上述任一種菌株的突變細(xì)胞都可用作起始宿主，它們通過(guò)進(jìn)一步突變，可以包含至少本文所需的最少基因型。大腸桿菌菌株W3110是優(yōu)選的親代宿主，因?yàn)樗侵亟MDNA產(chǎn)物發(fā)酵的通用宿主菌株。用作親代宿主的起始大腸桿菌宿主的實(shí)例，與它們的基因型一起，都包括在如下表中

還優(yōu)選在制備36F8菌株的過(guò)程中的中間物，即27B4(美國(guó)專(zhuān)利5,304,472)和35E7(一種比27B4生長(zhǎng)好的自發(fā)、溫度-耐受性菌落分離物)。另一種適宜的菌株是具有突變的周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌株，見(jiàn)1990年8月7日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利4,946,783。
一個(gè)實(shí)施方案中，所用的大腸桿菌宿主細(xì)胞就glpT基因而言是野生型的如43E7，或者是glpT基因缺陷型的如43F6或61G1。另一個(gè)實(shí)施方案中，所用的大腸桿菌宿主細(xì)胞就phoA基因而言是野生型的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，大腸桿菌是染色體phoA缺陷型的。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，大腸桿菌是染色體glpT和染色體phoA缺陷型的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，大腸桿菌是染色體glpT和染色體phoA缺陷型的，但不是染色體ugp缺陷型的。最優(yōu)選的這種突變型大腸桿菌宿主是43F6或61G1，其基因型已于上表中給出。上面的“就glpT而言是野生型的”是指glpT+或glpT感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌宿主，即在染色體glpT無(wú)缺陷的那些。同樣地，上面的“就phoA而言是野生型的”是指phoA+或phoA感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌宿主，即在染色體phoA無(wú)缺陷的那些。
本發(fā)明菌株可以通過(guò)親本菌株的染色體整合或其它技術(shù)來(lái)生產(chǎn)，包括以下實(shí)施例中所述的技術(shù)。
編碼所述多肽的核酸被插入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選地，這可以通過(guò)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、并在為了誘導(dǎo)各種啟動(dòng)子而酌情改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)而完成。
轉(zhuǎn)化是指將DNA作為染色體外元件或通過(guò)染色體整合體導(dǎo)入生物體從而使此DNA能夠復(fù)制。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，采用適合該細(xì)胞的常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。使用氯化鈣的鈣處理法，如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的部分1.82所述，通常用于原核細(xì)胞或基本含有細(xì)胞壁屏障的其它細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化的另一方法可以使用聚乙二醇/DMSO，如Chung和Miller，Nucleic AcidsRes.，163580(1988)所述。另一種方法可以使用的技術(shù)為電穿孔。
D.培養(yǎng)宿主細(xì)胞用于制備本發(fā)明多肽的大腸桿菌細(xì)胞在通常于Sambrook et al.出處同上，描述的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如溫度、pH等等，是那些選作用來(lái)表達(dá)的宿主細(xì)胞以前所用的條件，對(duì)于一般技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
培養(yǎng)細(xì)胞并且向培養(yǎng)基進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯如磷酸甘油，例如α-磷酸甘油和/或β-磷酸甘油，尤其為2-磷酸-甘油和/或3-磷酸-甘油。培養(yǎng)可以在搖瓶或發(fā)酵罐、優(yōu)選發(fā)酵罐中進(jìn)行。多肽優(yōu)選從細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)或培養(yǎng)基中回收。
在本發(fā)明方法中，所述核酸的表達(dá)可以在培養(yǎng)步驟中的任何時(shí)段開(kāi)始。然而，優(yōu)選所述核酸的表達(dá)在細(xì)胞密度仍上升時(shí)開(kāi)始。這可以通過(guò)在細(xì)胞生長(zhǎng)停止前用合適的誘導(dǎo)子或誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。
用于使多肽制備達(dá)到最大化的向培養(yǎng)基進(jìn)料有機(jī)磷酸酯的速度，依賴(lài)于很多因素，包括有機(jī)磷酸酯的種類(lèi)、有機(jī)磷酸酯的濃度、所制備多肽的種類(lèi)、啟動(dòng)子種類(lèi)、所用的宿主細(xì)胞菌株、及培養(yǎng)液中的細(xì)胞密度。如果多肽是IGF-I而有機(jī)磷酸酯是用于延續(xù)制備時(shí)間(extend the production duration)的3-磷酸-甘油，在所述的培養(yǎng)條件下，用10-L的方法，有機(jī)磷酸酯的進(jìn)料速度優(yōu)選每大約8-10升大約1-7mmoles/小時(shí)(見(jiàn)圖4)，更優(yōu)選大約1-6mmoles/小時(shí)，更優(yōu)選大約2-6mmoles/小時(shí)，更優(yōu)選大約2-5mmoles/小時(shí)，更優(yōu)選大約3-4mmoles/小時(shí)。最適的進(jìn)料速度取決于方法、細(xì)胞密度、及呼吸速度等等。
同樣，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中多肽是Apo2L并且有機(jī)磷酸酯是用于使產(chǎn)物表達(dá)移向與活動(dòng)生長(zhǎng)期同步的3-磷酸-甘油，并用10-L的方法，有機(jī)磷酸酯的進(jìn)料速度優(yōu)選每大約8-10升大約4-17mmoles/小時(shí)(見(jiàn)圖7)，更優(yōu)選大約6-16mmoles/小時(shí)，更優(yōu)選大約8-15mmoles/小時(shí)，最優(yōu)選大約10-14mmoles/小時(shí)。最適的有機(jī)磷酸酯進(jìn)料速度需要由具體異源蛋白的表達(dá)所用的個(gè)別方法來(lái)確定。
還可以包括除碳、氮和無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)來(lái)源之外的任何其它必要培養(yǎng)基成分，它們可以合適的濃度單獨(dú)加入，或與其它組分或培養(yǎng)基(如復(fù)合氮源)一起組合成混合物再加入。優(yōu)選地，在培養(yǎng)步驟的起始培養(yǎng)基中也包含無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)。如果存在所述的無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)、優(yōu)選磷酸鈉和/或磷酸鉀，那么無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)與有機(jī)磷酸酯的比率取決于表達(dá)多肽的種類(lèi)和使用的有機(jī)磷酸酯的種類(lèi)等因素。此比率可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易確定的任何比例，通常從大約1∶10(1份的Pi比10份的有機(jī)磷酸酯)到1∶0.25。對(duì)于Apo2配體，優(yōu)選從大約1∶4到1∶0.25，并更優(yōu)選從大約1∶3到1∶0.5，還優(yōu)選從大約1∶3到1∶1，更優(yōu)選從大約1∶2到1∶1，最優(yōu)選大約1∶1。這些比率可較早地誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，在有些情況下可較早產(chǎn)生更多產(chǎn)物。培養(yǎng)基的pH主要取決于宿主生物體，可以是大約5-9的任何pH。
如果啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么，為了使誘導(dǎo)發(fā)生，通常用高細(xì)胞密度方法將細(xì)胞培養(yǎng)至一定光密度(如A550約200)，以此啟動(dòng)誘導(dǎo)(例如，通過(guò)添加誘導(dǎo)物，通過(guò)耗竭培養(yǎng)基組分等)，從而誘導(dǎo)編碼目標(biāo)多肽的基因表達(dá)。
使用堿性磷酸酶啟動(dòng)子時(shí)，用于產(chǎn)生本發(fā)明目標(biāo)多肽的大腸桿菌細(xì)胞在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在所述適宜培養(yǎng)基中，堿性磷酸酶啟動(dòng)子可以通常如Sambrook等(出處同上)所述那樣被誘導(dǎo)。首先，培養(yǎng)基可含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需的無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)，其量足以支持明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)并避免在啟動(dòng)子控制下對(duì)靶異源多肽合成的誘導(dǎo)。隨細(xì)胞生長(zhǎng)并利用磷酸酯(鹽)，它們降低培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)水平，從而當(dāng)無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)被耗竭時(shí)誘導(dǎo)多肽的合成。通過(guò)添加例如含有G2P和G3P的混合物或G3P飼料的飼料，會(huì)在周質(zhì)及支持培養(yǎng)基中在缺如無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)情況下或處在無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)饑餓水平的情況下，繼續(xù)生長(zhǎng)到較高的細(xì)胞密度，如達(dá)到OD550為200或更高，使產(chǎn)物的積累增加或延續(xù)。
E.檢測(cè)表達(dá)基因表達(dá)可以直接在樣品中測(cè)定，例如用常規(guī)Northern印跡法來(lái)定量mRNA轉(zhuǎn)錄(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980))，斑點(diǎn)印跡(RNA分析)或原位雜交，它們使用基于編碼多肽的序列適當(dāng)標(biāo)記的探針。可以使用各種標(biāo)記物，最常見(jiàn)的是放射性同位素，尤其是32P。然而，也可使用其它技術(shù)，例如使用生物素-修飾的核苷酸以便引入到多核苷酸中。生物素在以后作為與抗生物素蛋白或用各式各樣標(biāo)記物(如放射性核素，熒光體，酶等)標(biāo)記的抗體相結(jié)合的位點(diǎn)?；蛘?，可以使用各種檢測(cè)(assays)或凝膠(gels)方法檢測(cè)蛋白質(zhì)。
為了使表達(dá)的基因產(chǎn)物分泌，在足以分泌基因產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。這些條件包括例如溫度、養(yǎng)分及允許由細(xì)胞分泌的細(xì)胞密度條件。另外，這些條件是那些細(xì)胞能執(zhí)行基本的轉(zhuǎn)錄、翻譯、及從一個(gè)細(xì)胞區(qū)室向另一個(gè)細(xì)胞區(qū)室傳遞蛋白質(zhì)的細(xì)胞功能的條件，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣。
F.純化多肽以下方法單獨(dú)或聯(lián)合可以作為適當(dāng)純化方法的實(shí)例免疫親和或離子交換柱的分級(jí)分離；乙醇沉淀；反相HPLC；疏水相互作用層析(HIC)；硅層析；離子交換樹(shù)脂如S-SEPHAROSETM和DEAE層析；層析聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；以及使用例如SEPHADEXTMG-75介質(zhì)的凝膠過(guò)濾，但具體用什么方法取決于多肽的類(lèi)型。單克隆抗體可以通過(guò)常規(guī)抗體純化方法從培養(yǎng)基適當(dāng)分離，所述方法例如蛋白-A SEPHAROSETM介質(zhì)層析、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、或親和層析。
本發(fā)明通過(guò)參考以下實(shí)施例可以更全面地理解。但它們不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。本文引用的所有文獻(xiàn)和專(zhuān)利都引入作為參考。
實(shí)施例1向搖瓶培養(yǎng)進(jìn)料G3P以制備Llama抗體片段(重鏈)和Apo2L背景
將把最終濃度200mM的G3P添加到低磷酸酯(鹽)(CRAP)或高磷酸酯(鹽)培養(yǎng)基(THCD)中與各自添加對(duì)照物(水)進(jìn)行比較，觀察在搖瓶培養(yǎng)中對(duì)表達(dá)異源蛋白的影響。在本實(shí)施例的第一部分，靶異源蛋白是13kD llama抗-HCGCamelid單體(camelid monobody)。以前顯示Camelid抗體有兩個(gè)種，由兩條重鏈加上兩條輕鏈組成的經(jīng)典IgG分子，和缺少輕鏈的重鏈IgG分子稱(chēng)為單體(monobody)。Camelid單體由大腸桿菌B菌株BL21，用tac啟動(dòng)子在低磷酸酯(鹽)(CRAP)或高磷酸酯(鹽)(THCD)富集培養(yǎng)基中表達(dá)。位于抗體片段編碼序列之前的malE結(jié)合蛋白質(zhì)信號(hào)序列指導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)分泌到宿主的周質(zhì)。在本實(shí)施例的第二部分，用T7啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控Apo2配體在G3P-補(bǔ)充的和未補(bǔ)充的CRAP培養(yǎng)基中的大腸桿菌K12菌株HMS174中的表達(dá)。在上述兩個(gè)試驗(yàn)中制備異源蛋白是通過(guò)在達(dá)到理想的細(xì)胞密度后添加IPTG來(lái)誘導(dǎo)的。
材料和方法pCB36624 86.RIG質(zhì)粒的構(gòu)建通過(guò)修飾載體pL1602來(lái)構(gòu)建pCB36624_86.RIG(Sidhu et al.，J.Mol.Biol.，296487-495(2000))。有pTac啟動(dòng)子序列和malE分泌信號(hào)序列的載體pS1602，包含融合于噬菌體mu的基因-3次要衣殼蛋白(p3)C-末端結(jié)構(gòu)域的人生長(zhǎng)激素序列。去除編碼hGH的序列，所得的載體序列作為載體骨架用于插入編碼llama抗-HCG抗體的合成的DNA片段(Spinelli et al.，Nat.Struct.Biol.3(9)752-757(1996))。所得的噬菌粒(pCB36624)受IPTG-可誘導(dǎo)型Ptac啟動(dòng)子控制編碼融合產(chǎn)物(Amman and Brosius，Gene，40183-190(1985))。所表達(dá)的多肽依次包括麥芽糖結(jié)合蛋白信號(hào)肽、抗-HCG編碼區(qū)、FLAG表位標(biāo)簽、含抑制性終止密碼子的Gly/Ser-富集接頭肽(linker peptide)、P3C(噬菌體衣殼蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域)。
用Sidhu et al.，J.Mol.Biol.，296487-495(2000)的方法，通過(guò)適當(dāng)設(shè)計(jì)的“終止模板”噬菌粒來(lái)構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)。對(duì)于文庫(kù)NNS17，用包含取代了密碼子93，94，100和101的終止密碼子TAA的pCB36624衍生物作為Kunkel誘變方法的模板(Kunkel et al.，Methods Enzymol.，154367-382(1987))，該方法設(shè)計(jì)了誘變的寡核苷酸NNS17以在修復(fù)終止密碼子的同時(shí)引入在編碼Gly95和Trp103的密碼子之間的17 NNK兼并密碼子。
NNS17GCC GTC TAT ACT TGT GGT GCT GGT NNS NNS NNS NNS
NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGGGGT CAG GGT(SEQ ID NO3)像所有單體一樣，llama抗-HCG是Vh3家族成員因此被蛋白質(zhì)A識(shí)別。蛋白質(zhì)A的結(jié)合相互作用可用作CDR3-介導(dǎo)的穩(wěn)定性的替代物(surrogate)。所得噬菌體文庫(kù)經(jīng)多輪抗蛋白質(zhì)A分選來(lái)作為支架穩(wěn)定性和表達(dá)的讀出信息(readout)。分析被分選文庫(kù)在NNS文庫(kù)中氨基酸分布的選擇偏好。根據(jù)所測(cè)序的殘基發(fā)現(xiàn)，以位置96，97和98的序列命名的支架RIG顯示為最占優(yōu)勢(shì)的克隆。支架RIG的17個(gè)氨基酸長(zhǎng)的CDR3序列被確定為RIGRSVFNLRRESWVTW(SEQ ID NO4)。含支架RIG的噬菌粒重命名為pCB36624_86.RIG，其DNA序列如下。
5′-GATGTTCAGT TGCAGGAATCAGGCGGTGGCTTGGTACAGGCCGGAGGTTC GTTGCGTTTGTCCTGTGCTGCCTCGGGTGCTACTGGTTCT ACTTATGATATGGGCTGGTTTCGTCAGGCTCCGGGTAAAG AACGTGAATCGGTTGCCGCCATTAACTGGGGGTCGGCTGG GACTTACTATGCTTCGTCCGTCCGTGGTCGTTTTACTATT TCACGTGATAATGCCAAAAAAACTGTCTATTTGCAGATGA ATTCATTGAAACCAGAAGATACTGCCGTCTATACTTGTGG TGCTGGTAGGATCGGCCGGTCGGTCTTCAACTTGAGGAGG GAGAGCTGGGTCACGTGGTGGGGTCAGGGTACCCAGGTCA CTGTCTCCTCTGCCGGTGGTATGGATTATAAAGATGATGA TGATAAA-3′(SEQ ID NO5)pet19b.nohis質(zhì)粒的構(gòu)建用常用的分子生物學(xué)技術(shù)，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從自人胎盤(pán)cDNA分離的全長(zhǎng)Apo2L克隆擴(kuò)增Apo2L的密碼子114-281。將包含限制性位點(diǎn)以利于克隆的額外核苷酸分別添加到5’和3’序列。5’寡核苷酸引物具有如下序列5’GCTTGCTACATATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGA 3’(SEQ IDNO6)，它含有用下劃線表示的Nde I限制性位點(diǎn)。3’寡核苷酸引物具有如下序列5’CTTGAATAGGATCCCTATTAGCCAACTAAAAAGGCCCCAAAAAAACTGGC3’(SEQ ID NO7)，它含有用下劃線表示的BamHI限制性位點(diǎn)。所得片段用限制性位點(diǎn)Nde I到BamH I亞克隆到經(jīng)修飾的桿狀病毒表達(dá)載體pVL1392(Pharmingen)的閱讀框架中，并處于包含His10標(biāo)簽和腸激酶切割位點(diǎn)的序列的下游(Pitti et al.，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1997))。用Nde I和BamH I消化pVL1392-Apo2L，所產(chǎn)生的Nde I-到-BamH I片段被亞克隆到也用Nde I和BamH I消化的pET-19b(Novagen)中。所得質(zhì)粒被命名為pet19b.nohis。
細(xì)菌菌株用常規(guī)方法，用pCB36624_86.RIG和pet19b.nohis分別轉(zhuǎn)化BL21(stratagene)和HMS174(Merck)的感受態(tài)細(xì)胞。在含50μg/mL羧芐青霉素(LB+CARB50TM羧芐青霉素)的LB平板上生長(zhǎng)并劃線純化后挑出轉(zhuǎn)化體，并在含50μg/mL CARE50TM羧芐青霉素的LB培養(yǎng)液中于30℃溫箱中培養(yǎng)。pCB36624_86.RIG和HMS174/pet19b.nohis分別賦予制備宿主BL21/pCB36624_86.RIG和pet19b.nohis羧芐青霉素抗性，從而使轉(zhuǎn)化的宿主在抗生素存在時(shí)生長(zhǎng)。
發(fā)酵培養(yǎng)基用低磷酸酯(鹽)(CRAP)培養(yǎng)基和高磷酸酯(鹽)(THCD)培養(yǎng)基評(píng)估llama抗體片段和Apo2配體的產(chǎn)生。培養(yǎng)基組分(每升初始的培養(yǎng)基所用的每種成分的量)列表如下

為制備200mM的G3P-補(bǔ)充培養(yǎng)基，在接種前將5ml的1M DL-α-磷酸甘油(G3P)(Sigma Chem.Co.)添加到20ml的含50μg/ml羧芐青霉素的低-PO4培養(yǎng)基(低-PO4培養(yǎng)基+CARB50TM羧芐青霉素)或含50μg/ml羧芐青霉素的高-PO4培養(yǎng)基(高-PO4培養(yǎng)基+CARB50TM羧芐青霉素)。對(duì)于未補(bǔ)充的(對(duì)照)培養(yǎng)基，用5ml水替代G3P。
搖瓶發(fā)酵在含25ml對(duì)照或G3P-補(bǔ)充培養(yǎng)基的125-ml帶擋板(baffled)燒瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。將在LB+CARB50TM羧芐青霉素中生長(zhǎng)的BL21/pCB36624_86.RIG或HMS174/pet19b.nohis的過(guò)夜培養(yǎng)物反向稀釋大約1∶100來(lái)接種到對(duì)照或G3P-補(bǔ)充培養(yǎng)基中。在30℃在搖床上以250RPM溫育培養(yǎng)物，在細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)基支持的潛在細(xì)胞生長(zhǎng)的大約50-60％時(shí)添加1mM IPTG來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)。在加入誘導(dǎo)物之前以及在接種后大約24hrs，從1ml液態(tài)培養(yǎng)物制備細(xì)胞沉淀顆粒(pellets)，并儲(chǔ)存于-20℃。
用PAGE和光密度測(cè)定法分析Llama抗體片段的累積將從1ml培養(yǎng)物樣本制備的冰凍(-20℃)細(xì)胞沉淀顆粒融化并重懸于足夠量的10mM TRIS，pH7.6+1mM EDTA，pH8.0(TE)中，使細(xì)胞懸液達(dá)到1OD/25μl的濃度。將25μl的TE-細(xì)胞懸液與25μl含β-巰基乙醇的2×樣品緩沖液混合。將混合物在95℃以上加熱5分鐘，之后向NU-PAGETM預(yù)制的10％Bis-Tris凝膠(Novex)的每孔上樣10μl(相當(dāng)于0.2OD)。在MES緩沖液(2-(N-morpholino)ethanesulphonic acid的去離子水溶液，用如1N NaOH調(diào)節(jié)到合適的pH)中進(jìn)行電泳。用COOMASSIE BLUE R250TM染料染色分離膠然后脫色。在用Kodak照像系統(tǒng)掃描濕的凝膠后，用Kodak DIGITALSCIENCE 1DTM照像軟件測(cè)定13-kD抗體片段的條帶強(qiáng)度。
用反相HPLC分析的Apo2配體的累積將從1ml培養(yǎng)物樣本制備的冰凍(-20℃)細(xì)胞沉淀顆粒重懸于足夠量的TE緩沖液中以使細(xì)胞懸液達(dá)到1OD/25μl的濃度。將20μl的細(xì)胞懸液與480μl的6M鹽酸胍，pH9.0+100mM二硫蘇糖醇(DTT)混合，并可在于13,000rpm離心15分鐘之前在室溫溫育1小時(shí)來(lái)回收上清/提取物。在將20μl上樣到HPLC(PerSeptive Biosystems POROSR1/10介質(zhì))來(lái)進(jìn)行反相層析之前，將此提取物通過(guò)MILLIPORETM旋轉(zhuǎn)-濾器過(guò)濾。在80℃進(jìn)行HPLC分離，流動(dòng)相以1.0ml/min流動(dòng)，并用0.1％TFA中28％到35％的乙腈梯度在20分鐘中將Apo2L與污染蛋白質(zhì)分離。在280nm波長(zhǎng)進(jìn)行峰值檢測(cè)。樣本中單體的量用來(lái)自與用相同方法分析的5-20μg純化標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)的峰下面積的平均反應(yīng)率(average response factor)(mAU/μg)來(lái)計(jì)算。
結(jié)果圖1顯示，相對(duì)于所述對(duì)照，在補(bǔ)充了200mM G3P的高-PO4(THCD)和低-PO4(CRAP)培養(yǎng)基中抗體以較高水平表達(dá)。
圖2顯示，相對(duì)于所述對(duì)照，在補(bǔ)充了200mM G3P的低-PO4(CRAP)培養(yǎng)基中Apo2L蛋白質(zhì)以較高水平表達(dá)。
實(shí)施例2將G3P進(jìn)料到野生型或(ΔglpTphoA-ugp+)宿主的10-L發(fā)酵培養(yǎng)來(lái)制備受堿性磷酸酶啟動(dòng)子調(diào)控的IGF-I材料與方法表達(dá)IGF-I的pBKIGF-2B質(zhì)粒用于表達(dá)本文IGF-I的質(zhì)粒pBKIGF-2，如美國(guó)專(zhuān)利5,342,763具體所述來(lái)構(gòu)建。此質(zhì)粒從pBR322的基本骨架構(gòu)建。用于在大腸桿菌中表達(dá)IGF-I基因所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列是堿性磷酸酶啟動(dòng)子和trp Shine-Dalgarno序列提供的。lambda to轉(zhuǎn)錄終止子位于IGF-I終止密碼子附近。從細(xì)胞質(zhì)分泌蛋白質(zhì)是由lamB信號(hào)序列指導(dǎo)的。大部分rhIGF-I發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周質(zhì)空間中。質(zhì)粒pBKIGF-2B賦予被轉(zhuǎn)化的宿主四環(huán)素抗性。
細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件IGF-I發(fā)酵所用的宿主是大腸桿菌W3110的衍生物(Bachmann，Cellularand Molecular Biology，vol.2(Washington，D.C.American Society forMicrobiology，1987)，pp.1190-1219)。用菌株43E7(大腸桿菌W3110fhuA(tonA)Δ(argF-lac)ptr3 degP41 ΔompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoA)進(jìn)行有關(guān)野生型glpT宿主的試驗(yàn)，并用菌株43F6(大腸桿菌W3110 fhuA(tonA)Δ(argF-lac)ptr3 degP41 ΔompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoA ΔglpT)進(jìn)行有關(guān)ΔglpT突變的宿主的試驗(yàn)。通過(guò)常用方法，用pBKIGF-2B轉(zhuǎn)化43E7或43F6的感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體在含20μg/mL四環(huán)素(LB+TET20TM四環(huán)素)的LB平板上生長(zhǎng)并劃線純化后挑出轉(zhuǎn)化體，并在含20μg/mL TET20TM四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中于37℃搖床/溫箱中生長(zhǎng)，之后在發(fā)酵罐中進(jìn)行試驗(yàn)。pBKIGF-2B賦予制備的宿主四環(huán)素抗性，并允許轉(zhuǎn)化的宿主在抗生素存在時(shí)生長(zhǎng)。
10-L發(fā)酵方法發(fā)酵培養(yǎng)基組分和用于表達(dá)IGF-I的方案與美國(guó)專(zhuān)利5,342,763所描述的IGF-I方法有些類(lèi)似。簡(jiǎn)言之，43E7/pBKIGF-2或43F6/pBKIGF-2的搖瓶接種培養(yǎng)物主要用于接種豐富制備(rich production)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基的組分(每升初始的培養(yǎng)基所用的每種成分的量)列表如下

*初始時(shí)將部分葡萄糖、酵母提取物、蛋氨酸和NZ Amine AS添加到培養(yǎng)基中，剩下的在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)料。
10-L發(fā)酵是補(bǔ)料分批方法，發(fā)酵參數(shù)設(shè)置如下攪拌 1000RPM通氣 10.0slpmpH控制7.3溫度 37℃背壓(Back pressure) 0.3bar葡萄糖進(jìn)料用算式通過(guò)計(jì)算機(jī)控制、在DO2跌至30％后將溶解氧濃度(DO2)維持在空氣飽和的30％。
復(fù)合氮進(jìn)料當(dāng)OD550達(dá)到40時(shí)開(kāi)始0.2mL/min的恒定進(jìn)料速度并在剩余時(shí)間內(nèi)保持該速度持續(xù)時(shí)間 40到50小時(shí)在涉及進(jìn)料3-磷酸-甘油(G3P)的試驗(yàn)中，適當(dāng)量的1M G3P儲(chǔ)存液摻料到復(fù)合氮進(jìn)料中，隨后的補(bǔ)充進(jìn)料的進(jìn)料速度增加到將所需量的復(fù)合氮和G3P給到培養(yǎng)物。
用IGF-I累積的差異來(lái)評(píng)估是否進(jìn)料G3P對(duì)ΔglpT突變的影響。溶解于6M胍+100mM DTT的樣品中的IGF-I的總量用反相HPLC方法如美國(guó)專(zhuān)利6,559,122所述來(lái)進(jìn)行測(cè)量。
結(jié)果圖3顯示通過(guò)野生型宿主(43E7)和AP啟動(dòng)子以及持續(xù)進(jìn)料的葡萄糖，向培養(yǎng)物進(jìn)料G3P比不添加G3P時(shí)分泌型IGF-I的量顯著升高。
圖4顯示通過(guò)ΔglpT宿主(43F6)和AP啟動(dòng)子，向每大約8升培養(yǎng)物以1.18或3.28mmoles/小時(shí)進(jìn)料G3P，比不添加G3P時(shí)分泌型IGF-I的量顯著升高，但不比每大約8升培養(yǎng)物以8.22mmoles/小時(shí)進(jìn)料G3P時(shí)高。最適進(jìn)料速度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)產(chǎn)物、有機(jī)磷酸酯種類(lèi)等容易地確定。在所描述的發(fā)酵方法的條件下，在10-升發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生IGF-I，每大約8-10升，最適G3P進(jìn)料速度在大約1-7mmoles/小時(shí)，更優(yōu)選大約1-6mmoles/小時(shí)，更優(yōu)選大約2-6mmoles/小時(shí)，更優(yōu)選大約2-5mmoles/小時(shí)，最優(yōu)選大約3-4mmoles/小時(shí)的優(yōu)選范圍。這個(gè)范圍內(nèi)的進(jìn)料速度不僅會(huì)使產(chǎn)物的量超過(guò)對(duì)照，而且相對(duì)于對(duì)照它還會(huì)延長(zhǎng)制備時(shí)間。
實(shí)施例3進(jìn)料3-磷酸-甘油可提高10-L方法中的Apo2配體累積Apo2配體的背景凋亡誘導(dǎo)配體2(Apo2L)(Pitti et al.，J.Biol.Chem.，27112687-12690(1996))，也稱(chēng)為腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)(Wiley et al.，Immunity，3673-682(1995))是一種II類(lèi)膜蛋白，并且是TNF家族配體的成員。Apo2L/TRAIL通過(guò)結(jié)合其相關(guān)(cognate)死亡受體引起在多種癌細(xì)胞而不是大多數(shù)正常細(xì)胞中的凋亡(WO 99/00423；Ashkenazi，F(xiàn)ASEB J.，13(7)A1336(April 23，1999)；Ashkenazi，Nature Reviews-Cancer，2420-430(2002))。Apo2配體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶片段，對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基114-281(從這里起稱(chēng)為Apo2L/TRAIL)，現(xiàn)正在作潛在的臨床研究并已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達(dá)。
發(fā)酵方法的概述表達(dá)載體編碼堿性磷酸酶(AP)啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控大約19.5-kDa多肽的制備。所表達(dá)的新生多肽，從核糖體釋放后，在細(xì)胞質(zhì)中折疊成單體，進(jìn)一步締合成為有生物活性的同三聚體。發(fā)酵中，將方法參數(shù)設(shè)定為在大約3.0mmoles/L-min的峰值氧攝入速度時(shí)行使細(xì)胞活性。收獲培養(yǎng)液后，細(xì)胞質(zhì)誘捕(trapped)的異源蛋白通過(guò)機(jī)械細(xì)胞破裂而釋放到細(xì)胞裂解物中，并可以從中回收。
材料和方法pAPApo2-P2RU質(zhì)粒的構(gòu)建pAPApo2-P2RU描述于2001年1月4日公開(kāi)的WO 01/00832中。主要地，此質(zhì)粒，其構(gòu)建體如圖5所示，編碼了共表達(dá)的Apo-2L(氨基酸殘基114-281)及pro2和argU編碼的具有罕見(jiàn)密碼子的tRNA，該共表達(dá)受堿性磷酸酶啟動(dòng)子的調(diào)控?；趐BR322的質(zhì)粒(Sutcliffe，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，4377-90(1978))pAPApo2-P2RU用于在大腸桿菌中制備Apo-2L。Apo-2L表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯序列是由堿性磷酸酶啟動(dòng)子和trpShine-Dalgarno序列提供的，如對(duì)于質(zhì)粒所描述的(Chang et al.，Gene，55189-196(1987))。Apo-2L的編碼序列(來(lái)自114-281)位于所述啟動(dòng)子和Shine-Dalgarno序列的下游，并且在起始的蛋氨酸之前。此編碼序列包括編碼Apo-2L的殘基114-281的核苷酸(圖6所示，圖6的SEQ ID NOs1和2分別為核苷酸和氨基酸序列)，只是編碼殘基Pro119的密碼子變?yōu)椤癈CG”而不是“CCT”，從而消除潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)。編碼lambda to轉(zhuǎn)錄終止子的序列(Scholtissek et al.，Nucleic Acids Res.，153185(1987))在Apo-2L編碼序列之后。
此外，該質(zhì)粒也包括針對(duì)pro2 tRNA(Komine et al.，J.Mol.Biol.，212579-598(1990))和argU/dnaY(Garcia et al.，Cell，45453-459(1986))的表達(dá)的序列。這些基因通過(guò)PCR從大腸桿菌W3110克隆，并置于lambda to轉(zhuǎn)錄終止子序列下游。該質(zhì)粒賦予制備宿主四環(huán)素和氨芐青霉素的抗性。
細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件菌株43E7(大腸桿菌W3110 fhuA(tonA)phoAΔ(argF-lac)ptr3 degPompTilvG+))作為野生型制備宿主與glpT-突變宿主43F6比較Apo2配體和稀有密碼子tRNA的表達(dá)。制備43E7或43F6的感受態(tài)細(xì)胞并用常用方法通過(guò)pAPApo2-P2RU轉(zhuǎn)化。從含20μg/ml四環(huán)素的LB平板(LB+Tet20)挑出轉(zhuǎn)化體、劃線純化，并在含20μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)液中于30℃搖床/溫箱中生長(zhǎng)，之后在-80℃儲(chǔ)藏于DMSO中。
制備Apo2L的發(fā)酵方法通過(guò)用新解凍的庫(kù)存培養(yǎng)小瓶接種含4-6nM磷酸鈉的無(wú)菌LB培養(yǎng)基來(lái)制備搖瓶接種物。在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目股貋?lái)施加選擇性壓力來(lái)確保質(zhì)粒的保持。在大約30℃(28℃-32℃)振搖溫育瓶中的培養(yǎng)物14-18小時(shí)。然后用此培養(yǎng)物來(lái)接種制備發(fā)酵容器。接種體積在最初培養(yǎng)基體積的0.1％到10％之間。
在表1所示的制備培養(yǎng)基中制備Apo2L，得到大約10升的最終培養(yǎng)體積。在大約30℃(28-32℃)和控制在大約7.0(6.5-7.5)的pH進(jìn)行發(fā)酵。設(shè)定通氣速度和攪拌速度以向培養(yǎng)物提供足夠的氧。就在所述分批進(jìn)料的磷酸鹽耗竭前(在大約75-85OD)，開(kāi)始進(jìn)料DL-α-磷酸甘油進(jìn)料(所購(gòu)產(chǎn)品的說(shuō)明顯示產(chǎn)物純度為80-90％，β-磷酸甘油列為主要雜質(zhì))并以理想的進(jìn)料速度來(lái)進(jìn)料。在整個(gè)發(fā)酵方法中，基于計(jì)算機(jī)算式向細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)料葡萄糖作為主要碳源，同時(shí)確保有氧環(huán)境。
在發(fā)酵過(guò)程中二次分批添加大約50-150μM(最終濃度)的ZnSO4，一批就在誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá)前，另一批大約在改進(jìn)的同三聚體裝配的制備過(guò)程的中點(diǎn)(mid-point)。在此實(shí)施例中，在大約80-120OD550的培養(yǎng)光學(xué)密度并在接種后大約28小時(shí)進(jìn)行上述添加。
可在收獲前大約34-45小時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。
表1針對(duì)AP啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)的制備培養(yǎng)基組分

a發(fā)酵時(shí)可將部分的這些組分進(jìn)料到培養(yǎng)物中，按需加入氨水來(lái)控制pH。
用離子交換HPLC層析方法評(píng)估發(fā)酵方法中可溶產(chǎn)物的累積在發(fā)酵時(shí)程中取培養(yǎng)液樣本。通過(guò)離心收集將來(lái)自1毫升培養(yǎng)液樣本的細(xì)胞沉淀顆粒稀釋到OD550為20的細(xì)胞密度，并將所得細(xì)胞沉淀顆粒保存在-20℃等待分析。使細(xì)胞沉淀顆粒融化并在0.5ml的提取緩沖液(50mMHEPES，pH8.0，50mM EDTA和0.2mg/ml母雞蛋白溶菌酶)中重懸，再經(jīng)機(jī)械破壞從細(xì)胞質(zhì)釋放產(chǎn)物。通過(guò)離心從細(xì)胞裂解物中去除固體，之后將澄清過(guò)的裂解物上樣到HPLC柱(DIONEX PROPACTMIEX介質(zhì))作三聚體定量。HPLC分析方法通過(guò)使用25-mM磷酸酯(鹽)(pH7.5)緩沖液中的5％-22％的1M NaCl梯度，以0.5ml/min的流速經(jīng)25分鐘，將產(chǎn)物與污染的大腸桿菌蛋白質(zhì)分離。
用反相HPLC層析評(píng)估發(fā)酵方法中的總單體Apo2L的表達(dá)用新鮮培養(yǎng)液或之前冰凍后融化的樣本作總的制備的單體的定量。20μl樣本與480μl6M鹽酸胍，pH9.0和100mM DTT混合，并可在于13,000rpm離心15mins之前在室溫溫育1小時(shí)來(lái)回收提取物。在將20μl上樣到HPLC柱(PerSeptive Biosystems POROSR1/10介質(zhì))來(lái)進(jìn)行反相層析之前，將此提取物通過(guò)旋轉(zhuǎn)-濾器過(guò)濾。在80℃進(jìn)行HPLC分離，流動(dòng)相以1.0ml/min流動(dòng)，并用0.1％TFA中28％到35％的乙腈梯度在20分鐘中將Apo2L與污染蛋白質(zhì)分離。在280nm波長(zhǎng)進(jìn)行峰值檢測(cè)。樣本中單體的量用從相同方法分析的5-20μg純化標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)的峰下面積得到的平均反應(yīng)率(mAU/μg)來(lái)計(jì)算。
結(jié)果圖7顯示在對(duì)于ΔglpT宿主(43F6)用最適的G3P進(jìn)料速度時(shí)比產(chǎn)物滴度(specific product titer)(指圖中μg/OD-ml的比滴度(specific titer))提高。所有的G3P-進(jìn)料都比無(wú)進(jìn)料對(duì)照的表現(xiàn)好。此實(shí)施例中，當(dāng)大約8升培養(yǎng)物的進(jìn)料速度從6增加到12mmole/小時(shí)的時(shí)候，比產(chǎn)物滴度提高，但當(dāng)速度增加12mmole/小時(shí)以上到18mmole/小時(shí)的時(shí)候，比滴度降低。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于產(chǎn)物、有機(jī)磷酸酯種類(lèi)等容易地確定G3P的最適進(jìn)料速度。在這些具體條件下，在10升發(fā)酵罐中培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)制備此具體產(chǎn)物Apo2L，每大約8-10升，G3P的優(yōu)選進(jìn)料速度在優(yōu)選大約4-17mmole/小時(shí)，更優(yōu)選大約6-16mmole/小時(shí)，更優(yōu)選大約8-15mmole/小時(shí)，并最優(yōu)選大約10-14mmole/小時(shí)的范圍。
圖8顯示向野生型glpT宿主(43E7)進(jìn)料G3P比進(jìn)料無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)的比產(chǎn)物滴度(指圖中以μg/OD-ml表示的比總累積(specific total accumulation))提高。與無(wú)進(jìn)料對(duì)照相比，進(jìn)料甘油磷酸增加了Apo2L的比總累積，進(jìn)料無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)消極地(negatively)影響了比總累積。降低甘油磷酸進(jìn)料，預(yù)期也產(chǎn)生類(lèi)似的趨勢(shì)。該結(jié)果顯示，通過(guò)向野生型glpT宿主進(jìn)料甘油磷酸可獲得高水平表達(dá)。并且，在該具體試驗(yàn)中，與無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)進(jìn)料的情況類(lèi)似，在進(jìn)料甘油磷酸時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞密度增加到OD550 200以上，而無(wú)進(jìn)料甘油磷酸時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞密度不增加。
實(shí)施例4在活動(dòng)生長(zhǎng)期中由AP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Apo2L產(chǎn)物的表達(dá)與實(shí)施例3所述相同構(gòu)建質(zhì)粒、制備宿主菌株、設(shè)置培養(yǎng)基組分、實(shí)施發(fā)酵方法和產(chǎn)物分析，只是磷酸酯(鹽)分批和G3P添加不同。在對(duì)照方法的鹽分批進(jìn)料中包括的無(wú)機(jī)磷酸鹽部分由等摩爾量的G3P替代，所述G3P或者在接種后立即加入或者在分批進(jìn)料的無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)耗盡前幾小時(shí)加入。在這些實(shí)施例中，預(yù)期加入的G3P是作為大部分加入后細(xì)胞生長(zhǎng)的磷酸酯(鹽)來(lái)源。
在活動(dòng)生長(zhǎng)期中制備Apo2L的發(fā)酵方法接種物制備方案與實(shí)施例3所描述的相同。在表1給出的制備培養(yǎng)基(除了從初始的分批進(jìn)料中去除75％或50％的磷酸酯(鹽)、并在接種后用等摩爾量的G3P替代作為分批添加物)中制備Apo2L。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方案中在大約30℃(28-32℃)進(jìn)行發(fā)酵，并將pH控制在大約7.0(6.5-7.5)。通氣速率和攪拌速率如實(shí)施例3所述。對(duì)于用G3P替代50％無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)的情況，在培養(yǎng)基滅菌前將無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)分批進(jìn)料，并在預(yù)計(jì)分批的磷酸酯(鹽)耗盡前大約1-2小時(shí)(OD550為大約30-40)用3-磷酸-甘油來(lái)替代。對(duì)于用G3P替代75％無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)的情況，在接種發(fā)酵罐后立即加入無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)和G3P。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，基于計(jì)算機(jī)的計(jì)算，向細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)料葡萄糖作為主要碳源，同時(shí)確保需氧條件。在發(fā)酵過(guò)程中如前面的部分所述加入Zn。發(fā)酵進(jìn)行大約34-45小時(shí)。
結(jié)果
圖9顯示對(duì)于野生型和glpT-突變宿主，當(dāng)加入G3P來(lái)替代50％-75％的PO4分批進(jìn)料時(shí)，在活動(dòng)生長(zhǎng)期中明顯地較早出現(xiàn)對(duì)異源蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)，比總累積曲線相對(duì)于用無(wú)G3P替代的野生型宿主進(jìn)行的一式兩份對(duì)照向左偏移。這表明本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可在發(fā)酵過(guò)程中較早獲得產(chǎn)物。
本文試驗(yàn)的所有Pi與G3P的比率對(duì)于無(wú)論何種宿主都可實(shí)現(xiàn)此優(yōu)點(diǎn)，表2顯示對(duì)于glpT-突變宿主43F6使用Pi比G3P的1∶1或1∶3的比率，會(huì)產(chǎn)生最高容積的Apo2L產(chǎn)率(平均值大約為0.34mg/ml-hr，對(duì)照宿主的平均值大約為0.24mg/ml-hr)。并且，使用任一比率和野生型或突變型的宿主較早(22-26小時(shí)相比28-30小時(shí))實(shí)現(xiàn)峰值比累積(peak specificaccumulation)(μg/OD-ml)。這顯示在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明在比其它短大約10％到25％的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，可得到相等的(如果不是更高的)單體Apo2L的量，來(lái)顯著提高方法的產(chǎn)率。
表2在發(fā)酵的最初30小時(shí)通過(guò)加入磷酸甘油替代初始分批進(jìn)料無(wú)機(jī)磷酸鹽的效果

實(shí)施例5用α-和β-磷酸甘油的50/50混合物進(jìn)行由AP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Apo2L產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行與實(shí)施例3所述類(lèi)似的方法，除了用等級(jí)較低的α-和β-磷酸甘油的約50∶50的混合物而不是G3P作為使用菌株61G1(glpT突變宿主)的進(jìn)料。
結(jié)果圖10顯示用所述混合物或等級(jí)較高的G3P材料都會(huì)類(lèi)似地獲得比無(wú)進(jìn)料對(duì)照提高的產(chǎn)量。應(yīng)用α/β混合物會(huì)降低原材料的花費(fèi)而不影響制備結(jié)果。
權(quán)利要求
1.相對(duì)于大腸桿菌異源的多肽的制備方法，其包含(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述多肽的核酸的大腸桿菌細(xì)胞，同時(shí)向所述培養(yǎng)基進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯，從而表達(dá)所述核酸，和(b)從所述細(xì)胞回收所述多肽。
2.權(quán)利要求1的方法1，其中所述有機(jī)磷酸酯是磷酸甘油。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述磷酸甘油是α-磷酸甘油或β-磷酸甘油或其混合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述磷酸甘油是2-磷酸-甘油和3-磷酸-甘油的混合物或是3-磷酸-甘油。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)在搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽從細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)或培養(yǎng)基中回收。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸的表達(dá)受可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是堿性磷酸酶啟動(dòng)子。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是tac啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸的表達(dá)在處于培養(yǎng)步驟的活動(dòng)生長(zhǎng)期時(shí)開(kāi)始。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法，其中所述大腸桿菌是染色體phoA缺陷型的。
13.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述大腸桿菌是染色體glpT野生型的。
14.權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中所述大腸桿菌是染色體glpT缺陷型的。
15.權(quán)利要求1-12或14任一項(xiàng)的方法，其中所述大腸桿菌是染色體phoA和glpT缺陷型的。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述大腸桿菌不是染色體ugp缺陷型的。
17.權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽是真核生物多肽。
18.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽是哺乳動(dòng)物多肽。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽是是胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。
20.權(quán)利要求19的方法，其中有機(jī)磷酸酯的進(jìn)料速度為每大約8-10升大約1-7mmoles/小時(shí)，并且在10升發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中有機(jī)磷酸酯的進(jìn)料速度為每大約8-10升大約2-6mmoles/小時(shí)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中有機(jī)磷酸酯的進(jìn)料速度為每大約8-10升大約3-4mmoles/小時(shí)。
23.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽為Apo2L。
24.權(quán)利要求23的方法，其中有機(jī)磷酸酯的進(jìn)料速度為每大約8-10升大約4到17mmoles/小時(shí)，并且在10升發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中進(jìn)料速度為每大約8-10升大約6-16mmole/小時(shí)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中進(jìn)料速度為每大約8-10升大約8-15mmole/小時(shí)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中進(jìn)料速度為每大約8-10升大約10-14mmole/小時(shí)。
28.權(quán)利要求1-27任一項(xiàng)的方法，其中在培養(yǎng)步驟中也存在無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)。
29.權(quán)利要求28的方法，其中無(wú)機(jī)磷酸酯(鹽)與有機(jī)磷酸酯的比率從大約1∶10到1∶0.25。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述多肽是Apo2L并且所述比率是大約1∶3到1∶0.5。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述比率是大約1∶1。
全文摘要
本發(fā)明描述了相對(duì)于大腸桿菌異源的多肽的制備方法，其中在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼所述多肽的核酸的大腸桿菌細(xì)胞，同時(shí)向該培養(yǎng)基進(jìn)料可轉(zhuǎn)運(yùn)的有機(jī)磷酸酯，從而表達(dá)所述核酸。然后從所述細(xì)胞回收所述多肽。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1954074SQ200580015378
公開(kāi)日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者蘇珊·L·伍恩-拉姆, 詹姆斯·R·斯沃茨 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司