專(zhuān)利名稱(chēng)：以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，以及利用所述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法。本發(fā)明還涉及一種用于上述篩選模型和篩選方法的過(guò)量表達(dá)MexAB-OprM蛋白之重組綠膿桿菌。本發(fā)明還涉及利用上述篩選模型和方法獲得的抗綠膿桿菌藥物。
背景技術(shù)：
綠膿桿菌(pseudomonas aeruginosa)，又名銅綠假單胞茵，是一種重要的院內(nèi)感染條件致病菌，在機(jī)會(huì)性感染的病源菌中位于前三甲之列，經(jīng)常感染癌癥病人、燒傷患者等免疫力低下的病人，引起茵血癥，肺炎，泌尿系統(tǒng)感染和囊性纖維化等疾病。
由于綠膿桿菌具有先天的和后天獲得的耐藥性，對(duì)多種在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上都大相徑庭的抗生素產(chǎn)生多重高度耐藥，使臨床治療十分困難，一旦感染，死亡率很高，為臨床醫(yī)生面臨的治療難題之一。
綠膿桿菌的耐藥機(jī)理十分復(fù)雜，但其對(duì)多種抗茵藥物產(chǎn)生多重高度耐藥主要得益于如下兩種機(jī)制一種是綠膿桿菌外膜通透性很低，其非特異性通透性?xún)H為大腸桿菌的0.2％-1％；另一種是綠膿桿菌中存在著可以外排多種藥物的主動(dòng)外排系統(tǒng)。有關(guān)綠膿桿菌外排泵的作用機(jī)制、耐藥機(jī)制、毒性機(jī)理的基礎(chǔ)研究已成為全球的研究熱點(diǎn)。目前在綠膿桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7種跨膜質(zhì)子梯度能驅(qū)動(dòng)(Transmembrane protongradient energy driven)的外排泵，分別命名為MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和最近發(fā)現(xiàn)的MexVW-OprM。對(duì)綠膿桿菌基因組數(shù)據(jù)的分析表明，可能還存在著8種潛在的外排系統(tǒng)。
隨著對(duì)外排泵研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到藥物的外排作用不僅可以直接降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，提高菌體對(duì)藥物的MIC值，還可以間接地通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)較低藥物濃度下，對(duì)抗性突變體進(jìn)行快速選擇，從而進(jìn)一步提高細(xì)菌的耐藥水平；篩選外排泵抑制劑(efflux pumpinhibitor，EPI)，不僅可以抑制綠膿桿菌的外排作用，大大降低綠膿桿菌對(duì)藥物的先天抗性，而且還可以逆轉(zhuǎn)后天獲得的抗性，降低臨床治療中高水平耐藥菌株出現(xiàn)的頻率，克服耐藥綠膿桿菌帶來(lái)的威脅。
在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的外排系統(tǒng)中，MexAB-OprM是綠膿桿菌中底物譜最廣，外排作用最強(qiáng)的外排泵，可以外排四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮類(lèi)抗生素、新生霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑等多種廣泛使用的抗生素，在綠膿桿菌的多重耐藥性中起著極其重要的作用。其他幾種外排泵，如MexCD-OprJ，MexEF-OprN和MexXY-OprM只在一些突變體中或是經(jīng)過(guò)特殊誘導(dǎo)才會(huì)表達(dá)，在通常的實(shí)驗(yàn)室條件中，并不表達(dá)或表達(dá)量很低。
對(duì)臨床分離的高度耐藥綠膿桿菌進(jìn)行分析的結(jié)果表明絕大多數(shù)的耐藥綠膿桿菌都有MexAB-OprM高表達(dá)，進(jìn)一步證明了MexAB-0prM外排系統(tǒng)，是綠膿桿菌產(chǎn)生多重高度耐藥性的主要原因。因此，有效抑制高度耐藥的綠膿桿菌之MexAB-OprM外排系統(tǒng)，將有助于改善綠膿桿菌的耐藥現(xiàn)狀。
國(guó)外一些著名的藥物研發(fā)機(jī)構(gòu)對(duì)于外排泵抑制劑的研究正如火如荼地進(jìn)行。1999年的ICAAC(The Interscience Conference onAntimicrobial Agents and Chemotherapy)會(huì)議上MicrocidePharmaceutical Co.和日本第一制藥株式會(huì)社共同報(bào)道了三種抗外排泵藥物的成功化學(xué)合成；2001年，日本的研究人員報(bào)道了在其化合物庫(kù)中篩選得到了一種外排抑制劑MC-207，110，可以使綠膿桿菌對(duì)左旋氧氟沙星的MIC值降低32到64倍，其結(jié)構(gòu)也被認(rèn)為是一種很有前景的先導(dǎo)化合物。對(duì)先導(dǎo)化合物MC-207110的最優(yōu)化處理得到的一些廣譜外排泵抑制劑，對(duì)綠膿桿菌體內(nèi)有效；2002年，發(fā)現(xiàn)的新的外排抑制劑(MC-02,595)，可以將左旋氧氟沙星的MI C值降低8倍，一系列以此化合物為基礎(chǔ)的研究正在展開(kāi)；2003年，篩選得到了作用于MexAB-OprM外排泵的抑制劑MC-510,050，正在對(duì)該化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以期獲得活性更強(qiáng)的外排抑制劑。但是，到目前為止，還沒(méi)有專(zhuān)門(mén)作用于外排系統(tǒng)的抗綠膿桿菌藥物應(yīng)用于臨床。因此，始終需要不斷篩選以早日獲得能夠真正用于臨床的抗綠膿桿菌藥物或前體化合物。
本發(fā)明人首次提出建立以綠膿桿菌外排泵為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選模型，旨在從微生物的代謝產(chǎn)物中優(yōu)選的以外排泵MexAB-OprM為靶點(diǎn)篩選抗耐藥綠膿桿菌藥物。所述篩選模型在國(guó)內(nèi)、外的文獻(xiàn)中均未見(jiàn)到相關(guān)的報(bào)道。
具體的，在缺失外排系統(tǒng)的綠膿桿菌中克隆表達(dá)外排蛋白mexAB-oprM基因，構(gòu)建過(guò)量表達(dá)MexAB-OprM蛋白的綠膿桿菌，以此作為檢定菌建立高通量的藥物篩選模型，篩選作用于MexAB-OprM的抗耐藥綠膿藥物。本發(fā)明的篩選模型克服了現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)大腸桿菌作為宿主表達(dá)外排蛋白所導(dǎo)致的外排底物譜發(fā)生改變，以及由于外膜通透性不同所帶來(lái)的假陽(yáng)性，具有極高的特異性。
采用本發(fā)明所述篩選模型獲得的抗耐藥綠膿桿菌藥物與目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗細(xì)菌藥物具有完全不同的作用機(jī)制，可以大大降低綠膿桿菌對(duì)藥物的先天抗性，克服由于外排作用導(dǎo)致的高度耐藥綠膿桿菌，逆轉(zhuǎn)其后天獲得的抗性，使一大批因?yàn)榫G膿桿菌的外排作用失去對(duì)相關(guān)感染的治療功能的抗生素在臨床應(yīng)用中恢復(fù)應(yīng)有的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人針對(duì)綠膿桿菌的耐藥機(jī)制，通過(guò)分子生物學(xué)方法，構(gòu)建高效表達(dá)外排泵，特別是過(guò)量表達(dá)外膜蛋白MexAB-OprM的重組綠膿桿菌作為檢定菌，成功建立了作用于綠膿桿菌外排系統(tǒng)之藥物的高通量藥物篩選模型。該模型能夠用于從微生物代謝產(chǎn)物中篩選例如以外排泵MexAB-OprM為靶點(diǎn)的新型抗耐藥綠膿桿菌藥物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，涉及一種以綠膿桿菌外排泵例如外膜蛋白Mex AB-OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選模型。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種以外膜蛋白Mex AB-OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，其是通過(guò)以重組綠膿桿菌XY229(含有質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM)為檢定茵，以剛好低于所述檢定菌MIC值濃度的抗生素(MexAB-OprM的底物)為輔助抗生素，通過(guò)比較加入或不加入待測(cè)化合物后不同時(shí)間點(diǎn)于540nm測(cè)定的光吸收值，從待測(cè)樣品中獲得以外膜蛋白Mex AB-OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物。
在本發(fā)明中，所述待測(cè)樣品，包括但不限于，天然來(lái)源的樣品和微生物發(fā)酵產(chǎn)物，和人工合成的化合物。
本發(fā)明還涉及一種利用本發(fā)明上述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法，所述方法包括如下步驟1)在加入終濃度為100μg/ml的鏈霉素和100μg/ml的氨芐青霉素的MH培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)接種含有重組質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌作為檢定茵；2)在96孔板中分別加入生長(zhǎng)對(duì)照組(C)和樣品篩選組(S)的樣品，樣品對(duì)照組(S’)，在540nm波長(zhǎng)下分別檢測(cè)生長(zhǎng)對(duì)照組、樣品對(duì)照組和樣品篩選組樣品的光吸收值，其中生長(zhǎng)對(duì)照組的組成為MH液體培養(yǎng)基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及1％的步驟1)中制備的檢定菌過(guò)夜培養(yǎng)物；樣品對(duì)照組的組成為MH液體培養(yǎng)基，剛好低于所述檢定茵MIC值的輔助抗生素以及待測(cè)發(fā)酵液樣品；樣品篩選組的組成為MH液體培養(yǎng)基，剛好低于所述檢定茵MIC值的輔助抗生素，1％的步驟1)中制備的檢定茵過(guò)夜培養(yǎng)物以及待測(cè)發(fā)酵液樣品；3)將生長(zhǎng)對(duì)照組、樣品對(duì)照組和樣品篩選組的樣品于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，再次分別測(cè)定540nm處的光吸收。
4)依據(jù)步驟2)和3)中兩次測(cè)定的光吸收值，判定所述待測(cè)樣品是否具有抗耐藥綠膿桿菌活性。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種以外排蛋白MexAB-OprM為靶點(diǎn)篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物的方法，包括1)在3ml MH培養(yǎng)基中，加入終濃度為100μg/ml的鏈霉素和100μg/ml的氨芐青霉素，接種含有重組質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌XY229(CGMCC1375)作為檢定菌，37℃，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)；2)在96孔板中分別加入生長(zhǎng)對(duì)照組(C)，樣品對(duì)照組(S’)和樣品篩選組(S)的樣品，在540nm波長(zhǎng)下分別檢測(cè)生長(zhǎng)對(duì)照組、樣品對(duì)照組和樣品篩選組樣品的光吸收值，其中生長(zhǎng)對(duì)照組的組成為MH液體培養(yǎng)基180μl，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及1％的步驟1)中制備的檢定茵過(guò)夜培養(yǎng)物；樣品對(duì)照組的組成為MH液體培養(yǎng)基180μl，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及待測(cè)發(fā)酵液樣品20μl；樣品篩選組的組成為MH液體培養(yǎng)基180μl，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素，1％的步驟1)中制備的檢定菌過(guò)夜培養(yǎng)物以及待測(cè)發(fā)酵液樣品20μl；3)將生長(zhǎng)對(duì)照組、樣品對(duì)照組和樣品篩選組的樣品于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，再次分別測(cè)定540nm處的光吸收。
4)依據(jù)步驟2)和3)中兩次測(cè)定的光吸收值，判定所述待測(cè)樣品是否具有抗耐藥綠膿桿菌活性。
在本發(fā)明中，通過(guò)如下方程計(jì)算各濃度的輔助抗生素對(duì)綠膿桿菌的生長(zhǎng)抑制作用R={1-(S24-S0)-(S′24-S′0)C24-C0}×100]]>其中R為細(xì)菌生長(zhǎng)抑制率(100％)，C24-C0為37℃培養(yǎng)24小時(shí)后生長(zhǎng)對(duì)照組中的樣品之光吸收OD540值的增加量，S24-S0為37℃培養(yǎng)24小時(shí)后樣品篩選組中的樣品之光吸收OD540值的增加量，S’24-S’0為37℃培養(yǎng)24小時(shí)后樣品對(duì)照組中的樣品之光吸收OD540值的增加量。
R值越大，表明綠膿桿菌被抑制的程度越高。換言之，如果待測(cè)樣品例如微生物發(fā)酵液中含具有外排泵抑制劑作用的活性成分，則將顯著性降低輔助抗生素抑菌濃度，故而可將R值顯著性升高改變作為初篩依據(jù)。
在本發(fā)明中，將R值大于50％的樣品確定為初篩陽(yáng)性樣品。
本發(fā)明所述篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法還可以包括復(fù)篩的步驟。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，針對(duì)初篩陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)篩的方法，包括分別以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素為鑒定組，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一種MexAB-OprM的底物)為對(duì)照組，對(duì)于初篩所得的陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)篩。
本發(fā)明還涉及一種用于上述篩選模型和篩選方法的過(guò)量表達(dá)MexAB-OprM蛋白之重組綠膿桿菌。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，作為檢定菌用于本發(fā)明篩選模型的重組綠膿桿菌是含有重組質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌XY229，其已于2005年5月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京，中關(guān)村北一條13號(hào)，100080)，保藏號(hào)CGMCC 1375。
本發(fā)明通過(guò)成功建立作用于綠膿桿菌外排泵的藥物篩選模型，能夠高通量地從微生物代謝產(chǎn)物中和其他來(lái)源的化合物中，篩選作用于外排泵的抗耐藥綠膿桿菌新型藥物及先導(dǎo)化合物，以克服目前臨床上綠膿桿菌高度耐藥問(wèn)題，為解決臨床上所面臨的治療難題做出貢獻(xiàn)。
實(shí)施例1外膜蛋白mexAB-oprM操縱子基因的克隆1)用CTAB法從野生綠膿桿茵PAO1中提取總DNA按照常規(guī)方法過(guò)夜培養(yǎng)5ml的PAO1懸液，離心2分鐘。沉淀加入567μl的pH8.0的TE緩沖液，重懸，加入30μl的10％的SDS溶液和6μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，37℃水浴1小時(shí)?；旌衔锛尤?00μl的5mol/l的NaCl溶液，再加入80μl的CTAB/NaCl溶液，65℃溫浴10分鐘。酚/氯仿/異戊醇抽提兩次。用異丙醇常溫下沉淀基因組DNA。
2)PCR擴(kuò)增目的基因?qū)⑷绮襟E1)所述獲得的綠膿桿菌PAO1的基因組DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII處理，作為PCR的模版。根據(jù)綠膿桿菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)引物引物15’-AGCGAGCTCAGCAGGCGTCCGTCGAAAAGG-3’；引物25’-CAGAAGCTTGCTGACCCGCAACCGCTAAG-3’，擴(kuò)增得到mexAB-oprM操縱子基因。
實(shí)施例2過(guò)量表達(dá)MexAB-OprM蛋白的重組綠膿桿菌的構(gòu)建1)將實(shí)施例1所得操縱子基因mexAB-oprM連接到表達(dá)載體pAK1900用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII將如實(shí)施例1所述獲得的存在于克隆載體pUC 18中的目的基因切下后，進(jìn)行去磷酸化處理，連接到同樣由HindIII處理并去磷酸化的表達(dá)載體pAK1900中，得到重組質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM。
2)常規(guī)方法電擊轉(zhuǎn)化宿主茵XY229(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM四種外排泵缺失，由Komori.Y博士惠贈(zèng))。
3)制備感受態(tài)細(xì)胞挑單茵落接種到25ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將1ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種到50ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.5；把培養(yǎng)物冰浴10分鐘后，用冰預(yù)冷的SMEB緩沖液洗兩遍。然后用200μl SMEB緩沖液重懸，置于冰上待用。
4)電擊轉(zhuǎn)化把1μl pAK 1900、pAK1900-mexAB-oprM分別與40μl依上述步驟3)制備好的感受態(tài)細(xì)胞XY229混勻，轉(zhuǎn)移到0.2cm電擊轉(zhuǎn)化杯中，電擊(C＝25μF；PC＝200ohm；V＝2.5kV)。電擊完成后，迅速把質(zhì)粒/細(xì)胞混合物轉(zhuǎn)移到1ml SOC培養(yǎng)基中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)，然后涂布氨芐平板，37℃過(guò)夜孵化。挑選陽(yáng)性克隆，并提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。
實(shí)施例3以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選之初篩模型本發(fā)明所述初篩模型采用濁度法高通量篩選具有抑制外排泵活性的物質(zhì)。以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)為檢定菌，以剛好低于其MIC值濃度的抗生素(MexAB-OprM的底物)為輔助抗生素，初篩天然樣品及人工合成的化合物。如下表所示在96孔板中分別加入相應(yīng)組分，于540nm測(cè)定光吸收。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，再次測(cè)定540nm處的光吸收。

用如下方程計(jì)算各濃度輔助抗生素對(duì)綠膿桿菌的生長(zhǎng)抑制作用R={1-(S24-S0)-(S′24-S′0)C24-C0}×100]]>其中R值大于50％的確定為初篩陽(yáng)性樣品根據(jù)光吸收度所反映出的綠膿桿菌生長(zhǎng)情況，篩選有外排泵抑制活性的陽(yáng)性發(fā)酵液。
實(shí)施例4以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB-OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿茵藥物篩選之復(fù)篩模型以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素為鑒定組，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一種MexAB-OprM的底物)為對(duì)照組，對(duì)于初篩所得的陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩模型的實(shí)驗(yàn)步驟參照初篩模型。其中鑒定組XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素復(fù)篩的實(shí)驗(yàn)方案，就是初篩的那個(gè)方案。各個(gè)對(duì)照組只需把鑒定菌和輔助抗生素調(diào)整成相應(yīng)的成分既可。
權(quán)利要求
1.一種以綠膿桿菌外排泵為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，其特征在于使用過(guò)量表達(dá)所述綠膿桿菌外排泵的重組綠膿桿菌為檢定菌，以剛好低于所述檢定菌MIC值濃度的外排泵之底物抗生素為輔助抗生素，通過(guò)比較加入或不加入待測(cè)化合物后不同時(shí)間點(diǎn)于540nm測(cè)定的光吸收值，用于以綠膿桿菌外排泵為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選。
2.權(quán)利要求1所述的篩選模型，其中所述綠膿桿菌外排泵選自MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、MexJK-OprM、MexGHI-OpmD和MexVW-OprM，優(yōu)選的為外膜蛋白MexAB-OprM。
3.權(quán)利要求1所述的篩選模型，其中所述檢定菌為含有重組質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌XY229(CGMCC1375)。
4.一種利用權(quán)利要求1所述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法，包括如下步驟1)在加入終濃度為100μg/ml的鏈霉素和100μg/ml的氨芐青霉素的MH培養(yǎng)基中，37℃，200rpm過(guò)夜培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌作為檢定菌；2)在96孔板中分別加入生長(zhǎng)對(duì)照組(C)和樣品篩選組(S)的樣品，樣品對(duì)照組(S’)，在540nm波長(zhǎng)下分別檢測(cè)生長(zhǎng)對(duì)照組、樣品對(duì)照組和樣品篩選組樣品的光吸收值，其中生長(zhǎng)對(duì)照組的組成為MH液體培養(yǎng)基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及1％的步驟1)中制備的檢定菌過(guò)夜培養(yǎng)物；樣品對(duì)照組的組成為MH液體培養(yǎng)基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素以及待測(cè)發(fā)酵液樣品；樣品篩選組的組成為MH液體培養(yǎng)基，剛好低于所述檢定菌MIC值的輔助抗生素，1％的步驟1)中制備的檢定菌過(guò)夜培養(yǎng)物以及待測(cè)發(fā)酵液樣品；3)將生長(zhǎng)對(duì)照組、樣品對(duì)照組和樣品篩選組的樣品于37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，再次分別測(cè)定540nm處的光吸收；4)依據(jù)步驟2)和3)中兩次測(cè)定的光吸收值，判定所述待測(cè)樣品是否具有抗耐藥綠膿桿菌活性。
5.權(quán)利要求4的方法，其中還包括如下的復(fù)篩步驟分別以XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+輔助抗生素為鑒定組，以XY229(pAK1900)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)、XY229(pAK1900-mexAB-oprM)+抗生素(另外一種MexAB-OprM的底物)為對(duì)照組，對(duì)于初篩所得的陽(yáng)性樣品進(jìn)行復(fù)篩。
6.一種用于權(quán)利要求1的篩選模型和/或權(quán)利要求4的篩選方法的過(guò)量表達(dá)MexAB-OprM蛋白之重組綠膿桿菌。
7.權(quán)利要求6所述重組綠膿桿菌，其為含有重組質(zhì)粒pAK1900-mexAB-oprM的重組綠膿桿菌CGMCC1375。
8.利用權(quán)利要求1的篩選模型和/或權(quán)利要求2的方法獲得的抗綠膿桿菌藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以綠膿桿菌外排泵外膜蛋白MexAB－OprM為靶點(diǎn)的抗綠膿桿菌藥物篩選模型，以及利用所述篩選模型篩選抗耐藥綠膿桿菌的藥物之方法。本發(fā)明還涉及一種用于上述篩選模型和篩選方法的過(guò)量表達(dá)MexAB－OprM蛋白之重組綠膿桿菌。本發(fā)明還涉及利用上述篩選模型和方法獲得的抗綠膿桿菌藥物。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1876832SQ20051007527
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者肖春玲, 楊麗霞, 田睿, 姚天爵, 劉藝霜, 游雪甫 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所