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外膜蛋白Omp22作為鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗靶點(diǎn)的應(yīng)用

文檔序號(hào):9736565閱讀:971來源:國(guó)知局
外膜蛋白Omp22作為鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗靶點(diǎn)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域,具體的說是一種免疫保護(hù)性亞單位疫苗及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]
隨著醫(yī)藥技術(shù)的飛速發(fā)展,特別是抗生素的廣泛使用,使感染性疾病的救治水平得到不斷的提高,但隨之而來的是抗生素濫用現(xiàn)象的增多,在抗生素的強(qiáng)大壓力下,產(chǎn)生了大量的耐藥菌株,這些耐藥菌多次與藥物接觸后,對(duì)藥物的敏感性減小甚至消失,致使藥物對(duì)耐藥菌的療效降低甚至無效。不動(dòng)桿菌是近年來醫(yī)院院內(nèi)感染中分離率增長(zhǎng)較快的菌種,其中鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii , Ab)已成為臨床最為常見的院內(nèi)感染病原菌。
[0003]鮑曼感染可引發(fā)敗血癥、軟組織或傷口感染、插管相關(guān)感染、尿路感染、菌血癥、繼發(fā)性腦膜炎等。鮑曼對(duì)危重患者威脅尤其嚴(yán)重,特別容易在重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)引起爆發(fā)流行,具有高的致死率。
[0004]鮑曼不動(dòng)桿菌可引起嚴(yán)重臨床危害的主要原因是:(I)鮑曼在醫(yī)院環(huán)境中分布很廣且可長(zhǎng)期存活,主要存在人的皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中,對(duì)濕熱、紫外線、化學(xué)消毒劑有較強(qiáng)抵抗力,常規(guī)消毒劑只能抑制其生長(zhǎng)而不能將其殺滅。(2)尤為重要的是,鮑曼耐藥機(jī)制復(fù)雜,耐藥性嚴(yán)重。近年來,許多省份均已出現(xiàn)鮑曼播散和流行。有研究表明:鮑曼主要是通過多種抗生素水解酶的表達(dá)、外膜通透屏障、藥物主動(dòng)外排栗等機(jī)制的協(xié)同作用而呈現(xiàn)多重耐藥性。
[0005]鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性逐年增強(qiáng),近年來甚至出現(xiàn)“全耐藥”菌株,許多現(xiàn)有抗生素的治療作用已不明顯,給臨床治療帶來了很大的難題。新的抗生素發(fā)展緩慢,且鮑曼耐藥性適應(yīng)迅速,因此,尋求新的解決方案顯得極為重要。國(guó)內(nèi)目前對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌研究很大部分都集中于院內(nèi)鮑曼耐藥性的動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè),或是耐藥機(jī)制的研究。國(guó)外的研究主要從耐藥機(jī)制,致病機(jī)理和耐藥性的變化等方面入手,關(guān)于疫苗方面的研究主要集中在不動(dòng)桿菌滅活的全菌,全外膜蛋白(OMPs)和外膜蛋白囊泡(OMVs)的免疫原性和保護(hù)性的研究上。Michael J.McConnell等人的研究結(jié)果表明,OMPs和OMVs免疫的小鼠能抵抗鮑曼的感染和侵襲,同時(shí)還證明小鼠接受抗血清被動(dòng)免疫同樣能抵抗鮑曼的感染和侵襲。
[0006]值得注意的是,鮑曼不動(dòng)桿菌OMPs或OMVs由許多蛋白組成,而這些蛋白的分離和純化是一個(gè)繁雜的過程,且產(chǎn)量很難得到提高,有效成分與大量無關(guān)蛋白及雜質(zhì)混雜。雖然用OMPs或OMVs免疫相對(duì)于全菌免疫安全性上有所提高,但其中包含了菌體的很多外膜和細(xì)胞壁成分,包括LPS在內(nèi),仍會(huì)產(chǎn)生顯著的毒副作用。
[0007]利用免疫信息學(xué)和反向遺傳學(xué),分析多重耐藥不動(dòng)桿菌外膜蛋白成分的抗原性及免疫原性,并進(jìn)行基因克隆,蛋白表達(dá)、純化,以及免疫學(xué)研究,篩選出有效的外膜蛋白成分,探討鮑曼不動(dòng)桿菌免疫控制策略的潛能,將提升疫苗的有效性和安全性,因而較之OMPs、OMVs或者全菌疫苗具有更加現(xiàn)實(shí)和誘人的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]
將鮑曼不動(dòng)桿菌菌株ATCC 17978在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)收集菌體,以菌體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 17978 0mp22的核酸序列(SEQ ID NO:1所示),雙酶切后以基因工程手段連入原核表達(dá)載體,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a后挑取陽(yáng)性重組子,提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。
[0009]將0mp22重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組0mp22蛋白(SEQ ID NO:2所示),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲波破碎后收集包涵體并將其溶解、重折疊。
[0010]將重折疊后的蛋白以HisTrap FF柱進(jìn)行純化后獲得重組0mp22蛋白。
[0011]將該0mp22重組蛋白與氫氧化鈉招佐劑1:1混合后免疫小鼠,收集免疫后小鼠血清,進(jìn)行ELI SA檢測(cè)抗0mp22的特異性抗體滴度,發(fā)現(xiàn)經(jīng)0mp22免疫后小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較高的特異性抗體水平;并以該抗0mp22血清進(jìn)行Western blot檢測(cè)多株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌菌體蛋白,發(fā)現(xiàn)該抗體能特異性識(shí)別多株臨床鮑曼不動(dòng)桿菌菌體中的0mp22蛋白。
[0012]向小鼠腹腔注射臨床分離的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,連續(xù)觀察一周,發(fā)現(xiàn)經(jīng)0mp22免疫后的小鼠存活率為100%,對(duì)照組存活率僅為0,同時(shí)在小鼠外周血、肝臟、肺、腎臟、脾臟中的細(xì)菌載量在疫苗組中較對(duì)照組降低了 14-1O6倍,且在血清中的炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低,顯示了該亞單位疫苗抗原具有較高的免疫保護(hù)性。
[0013]將0mp22免疫后小鼠的抗血清通過尾靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi),再以臨床分離的耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染,發(fā)現(xiàn)被動(dòng)免疫后的小鼠保持了 100%的存活率,而對(duì)照組僅為0,在小鼠外周血、肝臟、肺、腎臟、脾臟中的細(xì)菌載量在疫苗組中較對(duì)照組降低了 15-1O6倍,且在血清中炎癥細(xì)胞因子水平顯著降低,顯示了針對(duì)0mp22的抗血清具有被動(dòng)免疫保護(hù)效果,在體內(nèi)具有有效的殺菌活性;且該抗血清反應(yīng)出對(duì)多株不同來源的鮑曼不動(dòng)桿菌都具有體內(nèi)殺傷效應(yīng),體現(xiàn)出了 0mp22作為鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗的廣泛交叉保護(hù)性。
【附圖說明】
[0014]
圖1顯示了鮑曼不動(dòng)桿菌亞單位疫苗抗原0mp22的氨基酸在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得的保守性數(shù)據(jù),結(jié)果顯示有781株的0mp22蛋白具有100%的保守性。
[0015]圖2顯示了融合表達(dá)的0mp22在BL2UDE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)前后的情況,及HisTrapFF柱純化后的蛋白情況,圖片為考馬斯亮藍(lán)染色后全菌及純化蛋白的SDS-PAGE分析。
[0016]圖3顯示了經(jīng)不同劑量的0mp22免疫兩次及三次后7天或21天小鼠血清中0mp22特異性抗體的滴度水平(n=6)。
[0017]圖4顯示了以Western blot檢測(cè)0mp22抗血清特異性識(shí)別臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的情況,以大腸桿菌DH5a菌體為陰性對(duì)照樣品。
[0018]圖5顯示了經(jīng)不同劑量(5,10,20,50ug)0mp22免疫三次后,感染了鮑曼不動(dòng)桿菌Ab I的小鼠存活率情況(n=6 )。
[0019]圖6顯示了經(jīng)50ug0mp22主動(dòng)免疫后,感染鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的小鼠各器官中的細(xì)菌載量情況,對(duì)照組為純佐劑免疫對(duì)照(n=6)。
[0020]圖7顯示了經(jīng)50ug 0mp22主動(dòng)免疫后,感染鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的小鼠血液中的細(xì)菌載量情況,對(duì)照組為純佐劑免疫對(duì)照(n=6)。
[0021]圖8顯示了經(jīng)抗0mp22血清被動(dòng)免疫后,感染鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的小鼠存活率情況,對(duì)照組為純佐劑免疫的血清對(duì)照(n=6)。
[0022]圖9顯示了經(jīng)抗0mp22血清被動(dòng)免疫后,感染鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的小鼠各器官中的細(xì)菌載量情況,對(duì)照組為純佐劑免疫的血清對(duì)照(n=6 )。
[0023]圖10顯示了經(jīng)抗0mp22血清被動(dòng)免疫后,感染鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的小鼠血液中的細(xì)菌載量情況,對(duì)照組為純佐劑免疫的血清對(duì)照(n=6)。
[0024]圖11顯示了經(jīng)抗0mp22血清被動(dòng)免疫后,感染來源不同的鮑曼不動(dòng)桿菌Ab4的小鼠存活率情況,對(duì)照組為純佐劑免疫的血清對(duì)照(n=6 )。
[0025]圖12顯示了經(jīng)抗0mp22血清被動(dòng)免疫后,感染來源不同的鮑曼不動(dòng)桿菌Abl4的小鼠存活率情況,對(duì)照組為純佐劑免疫的血清對(duì)照(n=6 )。
[0026]圖13顯示了經(jīng)0mp22主動(dòng)免疫后,感染鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子及趨化因子水平情況,對(duì)照組為純佐劑免疫對(duì)照(n=6)。
[0027]圖14顯示了經(jīng)抗0mp22血清被動(dòng)免疫后,感染鮑曼不動(dòng)桿菌Abl的小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子及趨化因子水平情況,對(duì)照組為純佐劑免疫的血清對(duì)照(n=6)。
[0028]SEQ ID NO:1為本發(fā)明中鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白22(0mp22)的基因序列。
[0029]SEQ ID NO:2為本發(fā)明中鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白22(0mp22)的氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0030]
通過以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明,以便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明。下述實(shí)施例僅僅出于示范性目的,并非意在限制本發(fā)明的
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