專利名稱：鈉氫泵蛋白及其編碼基因和它們的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鈉氫泵蛋白，還涉及鈉氫泵蛋白的編碼基因，以及含有鈉氫泵基因的重組載體和細(xì)胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鈉氫泵(Na+/H+ antiporter)是細(xì)胞中負(fù)責(zé)Na+/H+交換的一種跨膜運輸?shù)鞍?，廣泛存在于細(xì)菌、人和高等植物的質(zhì)膜及許多真核生物細(xì)胞器的膜中。質(zhì)膜H+-ATPase用水解ATP的能量把H+從細(xì)胞 質(zhì)中泵出細(xì)胞，產(chǎn)生跨質(zhì)膜的H+電化學(xué)勢梯度，提供能量，驅(qū)動質(zhì)膜上的鈉氫泵蛋白，使H+順其電化學(xué)勢進(jìn)入細(xì)胞，同時Na+逆其電化學(xué)勢排出細(xì)胞。鈉氫泵蛋白通過Na+外排來保持細(xì)胞內(nèi)的低Na+水平和pH值的穩(wěn)定，是生物細(xì)胞耐受鹽堿的關(guān)鍵因子，另外它在細(xì)胞器的發(fā)生及離子均衡過程中，還執(zhí)行體積和滲透調(diào)節(jié)的功能，是保持細(xì)胞離子均衡的關(guān)鍵因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人基于對鈉氫泵的分子生物學(xué)研究，意外地發(fā)現(xiàn)從嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)中得到了一種鈉氫泵蛋白及其編碼基因，另一方面還提供了含有鈉氫泵基因的重組載體和細(xì)胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種鈉氫泵蛋白，其中，該鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種鈉氫泵基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。本發(fā)明還提供了得到的鈉氫泵蛋白及其編碼基因、含有該基因的重組載體及轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。鈉氫泵蛋白在耐鹽堿植物培育等方面具有重要的應(yīng)用潛力。通過克隆得到鈉氫泵基因，并通過轉(zhuǎn)基因的操作將微生物來源的鈉氫泵基因?qū)氲街参锛?xì)胞中，獲得耐鹽堿性提聞的轉(zhuǎn)基因植株成為可能。


圖1顯示了重組載體pUC18-Bspl65-NhaF導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-Bspl65-NhaF)的耐堿性的測定結(jié)果，其中，將重組載體pUC18-Bspl65_NhaF導(dǎo)入的大腸桿菌K12 (pUC18-Bspl65-NhaF)分別接種到pH為8.0、8.5、9.0和9.5 (含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE，5N NaOH調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。圖2顯示了重組載體pUC18-BspN165-NhaC導(dǎo)入的大腸桿菌K12 (pUC18-BspN165-NhaC)的耐鹽性的測定結(jié)果，其中，將重組載體pUC18-BspN165_NhaC導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)分別接種到含有0、2%、4%、6%和8%的NaCl的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。圖3顯示了鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc以及導(dǎo)入重組載體pUC18-Bspl65_NhaF的KNabc (pUC18_Bspl65_NhaF)耐堿性的測定結(jié)果，其中，將導(dǎo)入重組載體pUC18_Bspl65_NhaF 的 KNabc (pUC18_Bspl65_NhaF)和納氧栗缺失的大腸桿菌 KNabc 分別接種至Ij pH 為 8.0、8.5、9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS,HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。圖4顯示了鈉氫泵蛋白缺失的大腸桿菌KlNabc以及導(dǎo)入重組載體pUC18-BspN165-NhaC的KNabc (pUC18_BspN165_NhaC)耐鹽性的測定結(jié)果，其中，將導(dǎo)入重組載體pUC18-BspN165-NhaC的KNabc (pUC18-BspN165_NhaC)和鈉氫泵蛋白缺失的大腸桿菌KNabc分別接種到含有0、2%、4%、6%和8%的NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)。
具體實施方式
以下本發(fā)明的具體實施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種鈉氫泵蛋白，其中，該鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種鈉氫泵基因，其中，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的鈉氫泵基因是從嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)中克隆得到的。此外，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其中，該重組載體含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。在本發(fā)明中，所述“載體”可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的各種質(zhì)粒，粘粒,曬菌體及反轉(zhuǎn)錄病毒等。本發(fā)明優(yōu)選大腸桿菌pUC18質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有本發(fā)明提供的鈉氫泵基因。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選可以是大腸桿菌、枯草桿菌或煙草BY2細(xì)胞，最優(yōu)選大腸桿菌。
此外，本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的鈉氫泵蛋白及其編碼基因、及含有鈉氫泵基因的重組載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。所述生物為植物或微生物。實施例1編碼鈉氫泵的核苷酸序列的克隆(I)嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)總DNA的提取和純化取嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)的新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50毫摩爾/升Tris緩沖液中(pH 8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25毫摩爾/升乙二胺四乙酸(EDTA) (pH 8.0)，混勻后于37°C放置20分鐘，然后加入2毫升10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，55°C放置5分鐘，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取最后一次抽提的上清溶液，加入2倍體積乙醇，沉淀DNA。將沉淀回收的DNA先后用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌后，將所得DNA溶于0.5毫升TE緩沖液(pH 8.0,10毫摩爾/升Tris，I毫摩爾/升EDTA)，加入10毫克/毫升RNA酶(RNase) 3微升，37°C保溫I小時，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取上清液加入2倍體積乙醇，沉淀回收DNA，先后用70體積％乙醇溶液和無水乙醇洗滌后，真空干燥DNA沉淀，用去離子水溶解，得總DNA溶液。DNA溶液的紫外分光光度計測定結(jié)果為八26。/八280 — I.818，A260/A230 — 2.052。(2)鈉氫泵基因的克隆分析嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)的基因組信息后，設(shè)計鈉氫泵基因的上下游引 物，其中上游引物為5’ -TATGACCATGATTACATGGCTCTTCCTGAA-3，，下游引物為5 ’ -CAGGTC GACTCTAGATTAAAAACTGTCTCTC-3 ’。通過高保真的核酸聚合酶Pyrobest (Takara)，以上述提取的嗜堿芽孢桿菌(N16-5，CGMCC N0.0369)基因組為模板擴增出鈉氫泵基因的全長。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因的大小，并將PCR產(chǎn)物送至諾賽基因公司測序，最后得到1173bp的如SED ID NO:1所示的核苷酸序列。實施例2編碼鈉氫泵的基因功能驗證(I)重組克隆載體 pUC18-pUC18-Bspl65_NhaF 的構(gòu)建利用Cycle-pure Kit純化上述得到的PCR產(chǎn)物。利用Fast clone Kit將純化的PCR產(chǎn)物和pUC18連接，將構(gòu)建好的重組載體pUC18-Bspl65-NhaF通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到大腸桿菌K12BW25113中。通過含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB平板的篩選以及PCR驗證得到含有重組載體pUC18-Bspl65-NhaF插入的陽性克隆大腸桿菌K12 (pUC18-Bspl65_NhaF)，經(jīng)測序證實pUC18-Bspl65_NhaF插入的擴增序列與鈉氫泵的核苷酸序列完全一致。(2)大腸桿菌K12BW25113鈉氫泵缺失體的構(gòu)建通過設(shè)計含有待敲除基因的上下游同源臂的DNA片段的引物擴增打靶基因，利用大腸桿菌入噬菌體具有和宿主不同的λ Red重組系統(tǒng)將目的基因快速準(zhǔn)確的敲除。通過敲除大腸桿菌K12BW2511的鈉氫泵基因，得到大腸桿菌K12BW25113鈉氫泵基因完全缺失的突變體 E.CoIi KNabc。(3)重組載體pUC18-Bspl65-NhaF導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-Bspl65-NhaF)的耐堿性的測定將重組載體pUC18-Bspl65_NhaF 導(dǎo)入的大腸桿菌 K12 (pUC18_Bspl65_NhaF)分別接種至Ij pH 為 8.0,8.5,9.0 和 9.5 (含有 50mM 的 CAPS,HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定OD_，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結(jié)果如圖1所示。 (4)重組載體pUC18-BspN165-NhaC導(dǎo)入的大腸桿菌K12(pUC18-BspN165-NhaC)的耐鹽性的測定將重組載體pUC18-BspN165-NhaC 導(dǎo)入的大腸桿菌 K12 (pUC18_BspN165_NhaC)分別接種到含有0、2%、4%、6%和8%的NaCl的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結(jié)果如圖2所示。(5)鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc以及導(dǎo)入重組載體pUC18_Bspl65_NhaF的KNabc (pUC18_Bspl65_NhaF)耐喊性的測定將導(dǎo)入重組載體pUC18-Bspl65_NhaF 的 KNabc (pUC18_Bspl65_NhaF)和鈉氫泵缺失的大腸桿菌KNabc分別接種到pH為8.0,8.5,9.0和9.5(含有50mM的CAPS、HEPES和TRICINE, 5N NaOH調(diào)節(jié))的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結(jié)果如圖3所示。(6)鈉氫泵蛋白缺失的大腸桿菌KNabc以及導(dǎo)入重組載體pUC18_BspN165_NhaC的KNabc (pUC18-BspN165-NhaC)耐鹽性的測定將導(dǎo)入重組載體pUC18-BspN165_NhaC 的 KNabc (pUC18_BspN165_NhaC)和鈉氫泵蛋白缺失的大腸桿菌KNabc分別接種到含有0、2%、4%、6%和8%的NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12小時后測定0D_，以大腸桿菌K12為對照(每組三個平行)，結(jié)果如圖4所示。從圖1中可以看出，導(dǎo)入重組載體pUC18-Bspl65_NhaF的大腸桿菌K12在pH為
8.0,8.5,9.0和9.5的LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)，12小時后測定OD6tltl明顯高于導(dǎo)入PUC18空載體的大腸桿菌K12，這也證明了鈉氫泵基因(Bspl65-NhaF)的導(dǎo)入能夠提高大腸桿菌K12的耐堿性。從圖2中可以看出，導(dǎo)入重組載體pU18-BspN165_NhaC的大腸桿菌K12 (pUC18-BspN165-NhaC)在有0、2%、4%、6%和 8% 的 NaCl 的 LB液體培養(yǎng)基中(100 μ g/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)12小時后測定OD6tltl明顯高于以導(dǎo)入pUC18空載體的大腸桿菌K12，這也證明了鈉氫泵基因(Bspl65-NhaF)的導(dǎo)入能夠提高大腸桿菌K12的耐鹽性。從圖3中可以看出，導(dǎo)入重組載體pUC18_Bspl65_NhaF的大腸桿菌KNabc在pH
8.0，8.5，9.0 和 9.5 (含有 50mM CAPS, HEPES 和 TRICINE, 5N NaOH 調(diào)節(jié))的 LB 液體培養(yǎng)基中，12小時后測定OD6tltl明顯高于導(dǎo)入pUC18大腸桿菌鈉氫泵的缺失體KNabc，這也證明了鈉氫泵基因(Bspl65-NhaF)的導(dǎo)入能夠提高大腸桿菌KNabc的耐堿性。從圖4中可以看出，導(dǎo)入重組載體pUC18-BspN165_NhaC的KNabc (pUC18-BspN165-NhaC)在含有 0、2%、4%、6%和 8% 的 NaCl 的 LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時后測定0D_，明顯高于鈉氫泵蛋白缺失的大腸桿菌KNabc，這也證明了鈉氫泵基因(Bspl65-NhaF)的導(dǎo)入能夠提高大腸桿菌KNabc的耐鹽性。綜上所述，本申請?zhí)峁┑拟c氫泵基因在耐鹽堿生物的培育等方面具有重要的應(yīng)用潛力。通過克隆得到鈉氫泵基因，并通過轉(zhuǎn)基因的操作將微生物來源的鈉氫泵導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，獲得耐鹽堿性提高的轉(zhuǎn)基因植株成為可能。
權(quán)利要求
1.一種納氧栗蛋白，其特征在于，該納氧栗蛋白具有SEQ ID No:2所不的氣基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鈉氫泵蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No:2所示的氨基酸序列。
3.一種鈉氫泵基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No:2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No:1所示的核苷酸序列。
5.一種重組載體，其特征在于，該重組載體含有權(quán)利要求3所述的基因。
6.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特 征在于，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
8.權(quán)利要求1所述的鈉氫泵蛋白、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求5所述的重組載體、權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中，所述生物為植物或微生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鈉氫泵蛋白，其中，該鈉氫泵蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該鈉氫泵蛋白具有將SEQ ID No2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有鈉氫泵蛋白活性的氨基酸序列。此外，還涉及鈉氫泵蛋白的編碼基因，其中，該基因具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。還涉及含有鈉氫泵基因的重組載體和細(xì)胞，以及鈉氫泵蛋白及其編碼基因含有該基因的重組載體及細(xì)胞在培育具有耐鹽性和耐堿性轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK103087164SQ20111033806
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者馬延和, 翟磊, 薛燕芬 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所