專利名稱:具有抗綠膿桿菌作用的人源化PcrV抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及識別PcrV的人源化單克隆抗體或其部分。具體而言,本發(fā)明涉及中和活性(下文也稱為細胞毒性抑制活性)較以往的抗PcrV抗體高的抗體或其部分,以及含有該抗體或其部分的藥物組合物。
背景技術(shù):
綠膿桿菌(銅綠假單胞菌,Pseudomonas aeruginosa)是自然界中廣泛存在的專性需氧性革蘭氏陰性桿菌。其病原性通常低,但其卻是引起在患有癌癥和糖尿病等各種基礎(chǔ)疾病的患者、給予具有免疫抑制作用的藥物的患者中多發(fā)的機會性感染病的病原菌,常常引起肺炎、尿路感染、敗血癥等,帶來嚴重后果。綠膿桿菌感染病在臨床領(lǐng)域中被認為是目前最難治療的感染病之一。其原因在于綠膿桿菌不僅對現(xiàn)有抗生素的感受性本來就低,而且容易獲得對各種抗生素的耐藥性,成為難治性的傾向強。因此,對于綠膿桿菌,在不斷開發(fā)新抗生素的對策方面存在局限,迫切希望不依賴于抗生素的療法。綠膿桿菌的高細胞毒性是通過經(jīng)由III型外毒素分泌系統(tǒng)將毒素注入真核細胞內(nèi)而發(fā)揮的。PcrV是由294個殘基(NCBI登錄號AAC 45935,序列號1)組成的III型外毒素分泌系統(tǒng)的構(gòu)成蛋白,己公開了編碼所述蛋白的操縱子序列(專利文獻1,非專利文獻 1)。對PcrV的控制可能與綠膿桿菌感染病的治療方法有關(guān)(非專利文獻2),因此報道了具有中和活性的針對PcrV的多克隆抗體(非專利文獻3、4)和單克隆抗體(專利文獻2、非專利文獻5、6)。但是,多克隆抗體難以人源化,而且難以改善抗原性而難以用作藥物組合物。 此外,迄今為止所報道的單克隆抗體的中和活性低,不能滿足臨床領(lǐng)域的要求?,F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻
專利文獻1 美國專利6551795 專利文獻2 日本特表2005-500250 非專利文獻
非專利文獻 1 :Yahr,T. L 等人,J. Bacteriol. 1997 年,第 179 卷,7165 頁非專利文獻 2 :T. Sawa 等人,Nature Medicine, 1999 年,第 5 卷,392 頁非專利文獻3 Jhime N等人,J. Immunol. 2001年,第167卷,5880頁非專利文獻4 Imamura Y等人,Eur. Respir. J. 2007年,第四卷,965頁非專利文獻 5 :Karine Faure 等人,J. Immune. Based. Therapies and Vaccines, 2003 年,第1卷
非專利文獻 6 :Dara W. Frank 等人,J. Infect. Disease,2002 年,第 186 卷,64 頁。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明所要解決的課題是提供對感染病、特別是綠膿桿菌引起的感染病的治療有效的方法。解決課題的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明人對針對PcrV的單克隆抗體的制備進行了深入的研究,結(jié)果成功地制備出認為對疾病的療效較以往己知的抗PcrV單克隆抗體更高的新型人源化單克隆抗體,從而完成了本發(fā)明。S卩,本發(fā)明涉及
(1)針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有至少1種選自下列(A) - (D)中的性質(zhì)
(A)在體外InM至200nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對白細胞的細胞毒性活性50%以上,
(B)在體外InM至50nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對骨髓瘤細胞的細胞毒性活性50%以
上,
(C)與PcrV的解離常數(shù)(Kd)為2X10-9(M)以下,和
(D)在序列號1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。(2)人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有由以保藏編號FERM ABP-11805保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的所有互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列。(3)針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有
1)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)SFTSYWMH(序列號15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列號 16)、YGNYVVYYTMDY (序列號 17),和
2)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)SASTSVSYME(序列號18)、TTSKLAS (序列號 19)、HQWRNYPET (序列號 20)。(4)針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有
1)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)SFTSYWMH(序列號15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列號16)、YGNYVVYYTMDY (序列號17),或由在上述3個CDR中的1個以上的CDR中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而產(chǎn)生的氨基酸序列所組成的3個CDR, 禾口
2)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)SASTSVSYME(序列號18)、TTSKLAS (序列號19)、HQWRNYPET (序列號20),或由在上述3個⑶R中的1個以上的CDR中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而產(chǎn)生的氨基酸序列所組成的3個CDR,
且具有至少1種選自下列(A) - (D)中的性質(zhì)
(A)在體外InM至200nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對白細胞的細胞毒性活性50%以上,
(B)在體外InM至50nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對骨髓瘤細胞的細胞毒性活性50%以上,和
(C)與PcrV的解離常數(shù)(Kd)為2X10-9(M)以下,
(D)在序列號1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。(5)針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有
1)具有序列號27的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);和
2)具有序列號觀的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。(6)含有上述(1) (5)中任一項所述的抗體或其部分作為有效成分的藥物組合物。
(7)編碼上述(3) (5)中記載的抗體的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。(8)含有上述(7)記載的多核苷酸的表達載體。(9)綠膿桿菌感染病的治療方法,包括向需要治療的患者施用有效量的上述(1) (5)中任一項記載的抗體或其部分。(10)上述(1) (5)中任一項記載的抗體或其部分在制備綠膿桿菌感染病的治療藥中的用途,和
(11)含有上述(1) (5)中任一項記載的抗體或其部分的藥物組合物,其用于治療綠膿桿菌感染病。發(fā)明的效果
本發(fā)明的人源化單克隆抗體或其部分對PcrV的中和活性非常優(yōu)異,因此用作綠膿桿菌引起的感染病的預防/治療藥。
圖1顯示了 ?(;1^抗體(明3、2六4、6 5、7六7和]\&113166)中生物素標記的PcrV被未標記的PcrV取代的曲線。圖2顯示了利用表面等離振子共振分析得到的?(1^抗體(明3、244、6 5、747和 Mab 166)的親和性。圖 3 顯示了 PcrV 抗體(1F3、2A4、6F5、7A7、Mab 166)與 Mabl66 的夾心測定 (sandwich assay) 1 !^ ^圖4顯示了卩(;1^抗體(訃3、2六4、6 5、7六7和Mabl66)對綠膿桿菌SR24株對U937 細胞的細胞毒性活性的抑制效果。圖5顯示了 PcrV抗體(1F3、2A4、6F5、7A7和Mabl66)對綠膿桿菌SRM株對骨髓瘤細胞P3U1的細胞毒性活性的抑制效果。圖6顯示了 PcrV抗體(1F3、2A4、9D12、12H9和Mabl66)中生物素標記的PcrV被未標記的全長PcrV和缺失突變PcrV取代的曲線。圖7顯示了在蛋白質(zhì)印跡法中,與PcrV抗體(1F3、2A4、9D12、12H9 ^P Mab 166)中的全長PcrV和缺失突變PcrV的反應(yīng)性。圖8通過細胞毒性抑制活性的抑制來顯示抗體與全長PcrV的關(guān)聯(lián)關(guān)系。圖9通過細胞毒性抑制活性的抑制來顯示抗體與缺失突變PcrV的關(guān)聯(lián)關(guān)系。圖10顯示了 1F3抗體可變區(qū)的氨基酸序列。下劃線部分表示⑶R區(qū)。圖11顯示了 2A4抗體可變區(qū)的氨基酸序列。下劃線部分表示⑶R區(qū)。圖12顯示了小鼠抗體(小鼠1F3)、模板人源化抗體(模板)、突變型人源化抗體(回復突變)、人源化抗體(人源化1F3)的重鏈可變區(qū),和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列比對。圖13顯示了小鼠/人嵌合抗體重鏈(H嵌合體)、小鼠/人嵌合抗體輕鏈(L嵌合體)、模板人源化抗體重鏈(HT)、模板人源化抗體輕鏈(LT)、突變型人源化抗體重鏈(HB)、 突變型人源化抗體輕鏈(LB)分別組合而成的抗體與PcrV抗原的親和性。圖14顯示了小鼠/人嵌合抗體重鏈(H嵌合體)、小鼠/人嵌合抗體輕鏈(L嵌合體)、突變型人源化抗體重鏈突變體(I48M、A67V、L69M、V71R、A78V、V93A、L94R)、模板人源化抗體輕鏈(LT)分別組合而成的抗體與PcrV抗原的親和性。
圖15顯示了人源化抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。下劃線部分表示CDR區(qū)。圖16顯示了人源化抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。下劃線部分表示CDR區(qū)。圖17顯示了小鼠/人嵌合抗體重鏈(H嵌合體)、小鼠/人嵌合抗體輕鏈(L嵌合體)、人源化抗體重鏈(hlF3 H)、人源化抗體輕鏈(hlF3 L)分別組合而成的抗體與PcrV抗原的親和性。圖18顯示了人源化pcrV抗體、小鼠pcrV抗體、Mabl66對綠膿桿菌SRM株對U937 細胞的細胞毒性活性的抑制效果。圖19顯示了人源化抗體、小鼠抗體、Mab 166對綠膿桿菌SRM株對骨髓瘤細胞的細胞毒性活性的抑制效果。
具體實施例方式作為本發(fā)明對象的“單克隆抗體”是與上述PcrV特異性結(jié)合的單克隆抗體。更具體而言,是具有至少1種選自下列的性質(zhì)的針對PcrV的單克隆抗體
(1)在體外InM至200nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對白細胞的細胞毒性活性50%以上,
(2)在體外InM至50nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對骨髓瘤細胞的細胞毒性活性50%以上,和
(3)與PcrV的解離常數(shù)(Kd)為2X10-9(M)以下,和
(4)在序列號1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。本發(fā)明的單克隆抗體可列舉的一個特征是具有強的細胞毒性抑制活性。例如, 當使用白細胞時,所述抗體具有這樣的抑制(中和)活性在1-200ηΜ、優(yōu)選2-lOOnM、更優(yōu)選 5-25nM范圍內(nèi)的濃度下,抑制50%以上的綠膿桿菌所具有的細胞毒性活性。此外,當使用骨髓瘤細胞時,所述抗體具有這樣的抑制活性在1-50ηΜ、優(yōu)選2-30nM、更優(yōu)選4-20nM范圍內(nèi)的濃度下,抑制50%以上的綠膿桿菌所具有的細胞毒性活性。這些值遠遠超過Dara W. Frank 等人(J. Infect. Disease,2002 年,第 186 卷,64 頁)報道的 Mabl66 的活性值。此外,本發(fā)明的單克隆抗體還具有以下特征在PcrV的全長氨基酸序列(序列號 1)的136位-233位的區(qū)域中具有其表位。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)識別該區(qū)的抗體比識別其他區(qū)的抗體具有更強的活性(細胞毒性抑制活性)。由于具有強的細胞毒性抑制活性,因此識別該區(qū)域的抗體對于感染病的治療是有用的??扇缦妈b定單克隆抗體的識別表位。首先,制備單克隆抗體所識別的分子的各種部分結(jié)構(gòu)。制作部分結(jié)構(gòu)時,有以下方法利用公知的寡肽合成技術(shù)制作其分子的各種部分肽的方法;利用基因重組技術(shù)將編碼目標部分肽的DNA序列整合到適當?shù)谋磉_質(zhì)粒中、在大腸桿菌等宿主內(nèi)外進行生產(chǎn)的方法等,但為了達到上述目的,一般將上述兩種方法組合使用。例如,利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因重組技術(shù),制作從抗原蛋白質(zhì)的C末端或N末端起按適當?shù)拈L度依次截短的一系列多肽,然后,研究單克隆抗體與這些多肽的反應(yīng)性,確定大致的識別位點。之后,利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的寡肽合成技術(shù),進一步更細致地合成各種對應(yīng)部分的寡肽或所述肽的突變體,研究本發(fā)明的預防或治療藥作為有效成分所含有的單克隆抗體與這些肽的結(jié)合性,或者研究肽對該單克隆抗體與抗原的結(jié)合的競爭抑制活性,從而限定表位。作為用于得到多種寡肽的簡便方法,還可以使用市售的試劑盒(例如SPOTs試劑盒(Genosys Biotechnologies公司制造)、采用多大頭針合成法的一系列多大頭針/肽合成試劑盒(chiron公司制造)等)??梢园凑找韵鲁绦騺頊y定細胞毒性抑制活性。首先,將作為細胞毒性抑制活性的測定對象的單克隆抗體按2倍稀釋系列進行稀釋,從而將其調(diào)整至適當?shù)臐舛?。隨后,用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基等稀釋受到綠膿桿菌的毒素等影響的細胞(下文中稱為靶細胞),從而將其調(diào)整至適當?shù)臄?shù)目。具體而言,當使用骨髓瘤細胞時,希望按照3 X 106-5 X IO6細胞/ml的范圍進行調(diào)整;使用白細胞時,希望按照IX 106-3X IO6細胞/ml的范圍進行調(diào)整。同樣地, 用培養(yǎng)用培養(yǎng)基等也將綠膿桿菌調(diào)整成1 X IO7-I X 108CfU/ml (菌落形成單位/毫升)。然后,在上述單克隆抗體的存在下,在同一試管或孔(例如微量培養(yǎng)板上的孔等體外條件)中, 利用適當?shù)呐囵B(yǎng)條件培養(yǎng)綠膿桿菌和靶細胞。此時的培養(yǎng)條件可以是有利于細胞、細菌生長的普通培養(yǎng)條件。此外,根據(jù)靶細胞的種類,將培養(yǎng)時間適當改變成最佳條件,例如,使用骨髓瘤細胞時,培養(yǎng)時間優(yōu)選1-3小時左右;使用白細胞時,培養(yǎng)時間優(yōu)選1-3小時左右。 以未添加抗體的孔作為對照組,計算相對于對照組抑制50%的濃度(有效濃度)。關(guān)于判定靶細胞的生死,確立了各種方法,在添加顯色試劑后,測定適當波長(例如400-500nm)下的吸光度等是有用的(參考文獻Nature Medicine, 1999年,第5卷,392-395頁)。本發(fā)明的單克隆抗體可列舉的一個特征是與PcrV具有高的親和性??梢酝ㄟ^各種方法來分析解離常數(shù)(Kd),其用作表示單克隆抗體與抗原的親和性的指標。例如, 按照使用用各種標記物標記的抗原Wkatchard法,使用市售的測定試劑盒BiacoreX (AmershamPharmacia公司制造)或類似試劑盒,按照該試劑盒所附帶的操作說明書和實驗操作方法,可以容易地進行分析。此外,結(jié)合活性的評估也可以使用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定法)、EIA (酶免疫測定法)、RIA (放射免疫測定法)或熒光抗體法等。使用這些方法求得的解離常數(shù)(Kd值)以M (摩爾)單位表示。被試驗的單克隆抗體解離常數(shù)越小,則表示具有越強的親和性。本發(fā)明的單克隆抗體或其部分與PcrV的解離常數(shù)(Kd)為2X 10_9 (M) 以下,優(yōu)選1.5 X 10_9 (M)以下,更優(yōu)選1.2 X 10_9 (M)以下。在本發(fā)明的單克隆抗體中,作為優(yōu)選的方案之一,可列舉這樣的抗體,所述抗體在免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)(Vh)中含有互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3,在此情況下,⑶Rl具有氨基酸序列SFTSYWMH (序列號15),CDR2具有氨基酸序列INPSNGRTNYNEKFNT (序列號 16),⑶R3具有氨基酸序列YGNYVVYYTMDY (序列號17),免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)中含有互補決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3,在此情況下,⑶Rl具有氨基酸序列SASTSVSYME (序列號 18),⑶R2具有氨基酸序列TTSKLAS (序列號19),⑶R3具有氨基酸序列HQWRNYPET (序列號 20)。對于上述⑶R區(qū)的序列,具有由在上述3個⑶R中的1個以上⑶R中缺失、取代或添加一個或多個氨基酸而成的氨基酸序列組成的3個CDR的變體也包含在本發(fā)明內(nèi),只要其在保持本發(fā)明期望的生物學活性(例如,親和性、細胞毒性抑制活性等)的范圍內(nèi)。作為本發(fā)明的單克隆抗體的優(yōu)選方案之一,可列舉具有上述特征的單克隆抗體的人源化單克隆抗體。人源化單克隆抗體是將人以外的哺乳動物、例如小鼠抗體的互補決定區(qū)(⑶R)移植到人抗體⑶R中得到的。因此,框架區(qū)衍生自人??梢詤⒄誎abat Ε. A.等人的文獻來選擇適合使用的框架區(qū)。在此情況下的FR可選擇CDR形成良好的抗原結(jié)合位點的FR。必要時,為了使重建的人源化抗體的CDR形成恰當?shù)目乖Y(jié)合位點,可以取代抗體的可變區(qū)的FR的氨基酸(Sato. K.等人,Cancer Res. 1993年,第53卷,851頁)。在此情況下,可以再次進行上述步驟。人源化單克隆抗體的一般制造方法也是已知的(例如,參見WO 95/14041號公報, WO 96/02576號公報)。具體而言,首先通過PCR方法,從制備成末端部分具有重疊部分的多個寡核苷酸合成編碼可變區(qū)的DNA序列,所述可變區(qū)設(shè)計為連接了小鼠抗體的CDR與人抗體的框架區(qū)(FR)(參見WO 98/13388號公報)。將所獲得的DNA與編碼人抗體的恒定區(qū)的 DNA連接,然后整合到表達載體中?;蛘?,可以將編碼抗體可變區(qū)的DNA整合到含有抗體恒定區(qū)的DNA的表達載體中。在制備用于本發(fā)明的抗體時,將抗體基因整合到表達載體中,以便在表達控制區(qū)例如增強子/啟動子控制下表達。之后,利用該表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞,可以表達抗體。宿主細胞可列舉例如COS細胞、CHO細胞等脊椎動物細胞,原核細胞,酵母等。對于抗體基因的表達,可以將抗體的重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)分別整合到表達載體中同時轉(zhuǎn)化宿主,或者也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合到單個表達載體中轉(zhuǎn)化宿主 (參見 WO 94/11523)。由上述方法獲得的期望的轉(zhuǎn)化體可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行培養(yǎng), 通過所述培養(yǎng),在轉(zhuǎn)化體細胞內(nèi)或細胞外產(chǎn)生PcrV的人源化單克隆抗體。對于用于所述培養(yǎng)中的培養(yǎng)基,可根據(jù)所使用的宿主細胞而恰當?shù)剡x擇各種常用的培養(yǎng)基,例如在上述COS 細胞的情況下,可使用RPMI-1640培養(yǎng)基、Dulbecco改良fegle極限必需培養(yǎng)基(DMEM)等培養(yǎng)基,在必要時向其中添加胎牛血清(FBS)等血清成分。培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化體時的培養(yǎng)溫度只要是不使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成能力顯著降低的溫度即可,優(yōu)選合適的是在32-42°C、最合適的是在37°C下培養(yǎng)。此外,在必要時,可以在含有1-10% (ν/ν)的二氧化碳的空氣中培養(yǎng)??梢岳盟龅鞍踪|(zhì)的物理性質(zhì)、化學性質(zhì)等,通過各種公知的分離操作方法,分離/純化含有在上述得到的轉(zhuǎn)化體的細胞內(nèi)或細胞外生產(chǎn)的本發(fā)明的PcrV的人源化單克隆抗體的級分。具體而言,作為這種方法,可以采用例如通過通常的蛋白質(zhì)沉淀劑處理,超濾、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜(HPLC)等各種層析方法,透析方法和它們的組合等。通過上述方法,可以容易地以高產(chǎn)率、高純度制備期望的PcrV的人源化單克隆抗體。由此,將為了人源化小鼠單克隆抗體(1F3)而確定的全部CDR序列和部分FR序列的氨基酸殘基移植到人抗體上,如此最佳化的抗體的可變區(qū)的氨基酸序列在圖15 (序列號27) 和圖16 (序列號28)中顯示。該人源化抗體(hlF3)與通過雜交瘤產(chǎn)生的小鼠抗體(mlF3)相比,具有等同強度的細胞毒性抑制活性。在抗體人源化過程中,在維持原始抗體活性的同時進行人源化一般而言是困難的,但是在本發(fā)明中,成功地獲得了具有與原始小鼠抗體等同活性的人源化抗體。由于人源化抗體在人體內(nèi)的抗原性低,其在以治療目的等施于人的情況下是有用的。本發(fā)明的人源化單克隆抗體使用人抗體的恒定區(qū)。作為優(yōu)選的人抗體的恒定區(qū), 重鏈可列舉CY,例如CYl、CY2、CY3、CY4,輕鏈可使用CK、CX。此外,為了改善抗體或其生產(chǎn)的穩(wěn)定性,可以對人抗體的C區(qū)域進行修飾。人源化時應(yīng)用的人抗體可以是IgG、 IgM、IgA、IgE、IgD等任一種同種型的人抗體,但在本發(fā)明中優(yōu)選使用IgG,更優(yōu)選IgGl或 IgG4。
本發(fā)明的人源化單克隆抗體可以是與聚乙二醇(PEG)、放射性物質(zhì)、毒素等各種分子結(jié)合的偶聯(lián)抗體。此類偶聯(lián)抗體可以通過對獲得的抗體施加化學修飾而獲得。抗體的修飾方法是本領(lǐng)域中已得到確立的。這些偶聯(lián)抗體也包含在本發(fā)明的人源化單克隆抗體中。此外,本發(fā)明的人源化單克隆抗體的N端或C端可以與其他的蛋白質(zhì)融合 (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274_1沘1)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當?shù)剡x擇融合的蛋白質(zhì)。進一步地,本發(fā)明的人源化單克隆抗體可以是細胞毒性抑制活性增加的抗體。作為細胞毒活性增加的抗體,可列舉例如缺失巖藻糖的抗體、糖鏈中添加了平分型 (bisecting) N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體、通過取代Fc區(qū)的氨基酸使與Fcy受體的結(jié)合活性改變的抗體等。這些活性增加的抗體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。本發(fā)明中的“單克隆抗體的部分”意味著上述本發(fā)明的單克隆抗體的部分,其為具有與所述單克隆抗體相同的對PcrV的特異結(jié)合性的區(qū)域(下文中,也簡單地將其稱為“抗體片段”)。具體而言,可以舉出對上述人PcrV具有特異結(jié)合性的Fab (抗原結(jié)合片段)、 F(ab' )2、Fab’、單鏈抗體(單鏈Fv ;下文記載為scFv)、二硫化物穩(wěn)定化抗體(二硫化物穩(wěn)定化Fv ;下文記載為dsFv)、2聚體化V區(qū)片段(下文記載為雙抗體)、含有⑶R的肽等(Expert opinion on therapeutic patents,第 6 卷,第 5 其月,第 441-456 頁,1996 年)。Fab是分子量約5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段,它是用木瓜蛋白酶分解IgG 鉸鏈區(qū)中交聯(lián)2條H鏈的2個二硫鍵(S-S鍵)上部的肽部分獲得的,由H鏈的N末端側(cè)約一半和L鏈全部構(gòu)成??梢砸阅竟系鞍酌柑幚砩鲜霰景l(fā)明的單克隆抗體獲得本發(fā)明中使用的Fab?;蛘?,也可以將編碼上述本發(fā)明的單克隆抗體的Fab的DNA插入細胞用表達載體中,將該載體導入細胞中使之表達而制造Fab。F(ab' )2是分子量約10萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段,它是用胃蛋白酶分解 IgG的鉸鏈區(qū)的2個S-S鍵的下部獲得的,由2個Fab’區(qū)在鉸鏈部分結(jié)合而構(gòu)成??梢杂梦傅鞍酌柑幚砩鲜霰景l(fā)明的單克隆抗體獲得本發(fā)明中使用的F(ab’)2?;蛘撸部梢詫⒕幋a所述單克隆抗體的F (ab’)2的DNA插入細胞用表達載體中,將該載體導入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使之表達而制造F(ab’)2。Fab'是切斷上述F(ab’ )2的鉸鏈之間的S-S鍵而得到的分子量約5萬的具有抗原結(jié)合活性的抗體片段??梢酝ㄟ^還原劑二硫蘇糖醇處理上述本發(fā)明的單克隆抗體的 F (ab,)2獲得本發(fā)明中使用的Fab,?;蛘?,也可以通過將編碼該單克隆抗體的Fab’的DNA 插入細胞用表達載體中,將該載體導入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使之表達而制造Fab’。scFv是使用適當?shù)碾慕宇^(下文表述為P)連接一條VH和一條VL得到的VH_P_VL 或VL-P-VH多肽,是具有抗原結(jié)合活性的抗體片段。本發(fā)明中使用的scFv中包含的VH和 VL可以是上述本發(fā)明的單克隆抗體的VH和VL??梢酝ㄟ^由生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNA,構(gòu)建scFv表達載體,導入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使之表達而制造本發(fā)明中使用的scFv。dsFv是將VH和VL中的各1個氨基酸殘基被半胱氨酸殘基取代而成的多肽通過S-S鍵結(jié)合得到的??梢园凑沼蒖eiter等公開的方法(Protein Engineering, 7, 697(1994)),基于抗體的立體結(jié)構(gòu)預測來選擇取代為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基。本發(fā)明中使用的dsFv中包含的VH或VL可以是本發(fā)明的單克隆抗體的VH或VL??梢酝ㄟ^從生產(chǎn)本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤獲得編碼VH和VL的cDNA,插入適當?shù)谋磉_載體中而構(gòu)建dsFv 表達載體,將該表達載體導入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使之表達而制造本發(fā)明中使用的 dsFv。雙抗體是由抗原結(jié)合特異性相同或不同的scFv形成2聚體產(chǎn)生的抗體片段,是對相同抗原具有二價抗原結(jié)合活性,或?qū)Σ煌目乖哂?種特異性抗原結(jié)合活性的抗體片段。例如,在本發(fā)明的單克隆抗體中特異性反應(yīng)的二價雙抗體可以如下制造獲得編碼本發(fā)明單克隆抗體的VH和VL的cDNA,構(gòu)建編碼具有3-10個殘基的肽接頭的scFv的DNA,將該DNA插入細胞用表達載體中,將該表達載體導入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使雙抗體表達。含有⑶R的肽包含VH或VL的⑶R的至少1個區(qū)域以上而構(gòu)成??梢灾苯踊蛴蛇m當?shù)碾慕宇^介導來結(jié)合多個CDR??梢匀缦轮圃彀景l(fā)明使用的CDR的肽在獲得編碼本發(fā)明單克隆抗體的VH和VL的cDNA后,構(gòu)建編碼⑶R的DNA,將該DNA插入動物細胞用表達載體中,將該載體導入大腸桿菌、酵母或動物細胞中使其表達。此外,也可以通過Fmoc法 (芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法來制造包含CDR的肽。本發(fā)明的單克隆抗體或其部分可以是其修飾物,只要能夠適用于本發(fā)明即可。作為修飾物,可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。對抗體的修飾可以是通過導入化學鍵進行的修飾,也可以是對抗體的氨基酸序列進行的修飾。本發(fā)明的單克隆抗體或其部分也包括這些抗體修飾物。為了得到這樣的抗體修飾物,可以通過對所得抗體施加修飾而得到。這些方法在本領(lǐng)域已經(jīng)確立。在其他觀點中,本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的人源化單克隆抗體(hlF3)的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。優(yōu)選地,本發(fā)明的多核苷酸具有序列號四和30的任一項記載的堿基序列。此外,在嚴格條件下與所述多核苷酸雜交,且編碼具有與本發(fā)明抗體等同活性的抗體的多核苷酸也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。對本發(fā)明的多核苷酸沒有特別的限制,只要編碼本發(fā)明的抗體即可,它是由多數(shù)脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等核苷酸組成的聚合物。其可以含有非天然的堿基。 本發(fā)明的多核苷酸可用于通過基因工程方法制備抗體。此外,本發(fā)明的多核苷酸也可以作為探針使用,用于篩選與本發(fā)明抗體具有等同功能的抗體。即,可以將編碼本發(fā)明抗體的多核苷酸或其部分作為探針使用,通過雜交、基因擴增技術(shù)(例如PCR)等技術(shù),獲得在嚴格條件下與所述多核苷酸雜交,且編碼具有與本發(fā)明抗體等同活性的抗體的DNA。此類DNA也包含在本發(fā)明的多核苷酸內(nèi)。雜交技術(shù)(Sambrook,J等人,Molecular Cloning第 2版,9. 47-9. 58,Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)。作為雜交條件,可列舉例如低嚴格條件。低嚴格條件是在雜交后的洗滌中例如42°C、0. 1 X SSC、0. 1%SDS的條件,優(yōu)選 50°C、0. 1 X SSC、0. 1%SDS的條件。作為更優(yōu)選的雜交條件,可列舉高嚴格條件。高嚴格條件是例如65°C、5 X SSC和0. 1%SDS的條件。在這些條件中,溫度越高,越可以預期有效獲得具有高同一性的多核苷酸。但是,作為影響雜交的嚴格性的因素,考慮溫度、鹽濃度等多個因素,本領(lǐng)域技術(shù)人員通過恰當?shù)剡x擇這些因素,可以實現(xiàn)相同的嚴格性。對于通過這些雜交技術(shù)、基因擴增技術(shù)獲得的多核苷酸編碼的、與本發(fā)明抗體功
10能等同的抗體,通常地,這些抗體的氨基酸序列具有高同一性。本發(fā)明的抗體也包含與本發(fā)明抗體的功能等同、且與所述抗體的氨基酸序列具有高同一性的抗體。高同一性指在氨基酸水平上通常至少50%以上的同一性,優(yōu)選75%以上的同一性,更優(yōu)選85%以上的同一性, 更優(yōu)選95%以上的同一性。為了確定多肽同一性,可利用文獻(Wilbur,W. J.和Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80,726-730)中記載的算法。本發(fā)明的單克隆抗體或其部分作為藥物組合物是有用的。因此,含有本發(fā)明的單克隆抗體及其部分的藥物組合物可以口服或非口服(胃腸外)地全身或局部給藥。作為非口服(胃腸外)給藥,可以選擇例如點滴等靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、鼻腔內(nèi)給藥、吸入等,但己知綠膿桿菌通過呼吸道感染特別地對肺上皮細胞、肺泡的巨噬細胞造成損傷(T. Sawa等人,Nature Medicine, 1999年,第5卷,392頁),因此期望鼻腔內(nèi)給藥、吸入。給予本發(fā)明的藥物組合物,用于治療由綠膿桿菌引起的囊性纖維化、感染病患者。 例如,有效給藥量在每次每Ikg體重0. Olmg-IOOmg的范圍內(nèi)選擇?;蛘?,可以選擇每名患者l-1000mg、優(yōu)選5-50mg的給藥量。但含有本發(fā)明的單克隆抗體或其部分的藥物組合物并不限于上述給藥量。此外,可以根據(jù)患者的年齡、癥狀適當選擇給藥時期。根據(jù)給藥途徑, 本發(fā)明的藥物組合物也可以同時含有藥學上可接受的載體、添加劑。作為這種載體和添加劑的例子,可以舉出水、藥學上可接受的有機溶劑、膠原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸鈉、水溶性葡聚糖、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、酪蛋白、 二甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、允許作為藥物添加劑的表面活性劑等。所用添加劑根據(jù)劑型從上述物質(zhì)中適當選擇或組合選擇,但并不限于此。下文通過參考例說明針對PcrV的小鼠單克隆抗體的制備方法。參考例1
重組Mab 166的制備
為了進行比較實驗,制作Mabl66 (日本特愿2005-500250等)作為重組抗體。首先,從產(chǎn)生IgGh亞類的抗體的雜交瘤中提取mRNA,通過RT-PCR法克隆H鏈和 L鏈的恒定區(qū)。將通過PCR擴增的各片段插入pcDNA3. 1(+)載體(Invitrogen公司制造)的 NheI、NotI位點中,再整合多克隆位點以便可以插入可變區(qū)部分的DNA片段。之后,將Mabl66可變區(qū)部分的H鏈和L鏈的基因序列各分成4份,然后合成它們的有義DNA和反義DNA,進行退火反應(yīng)。通過DNA連接酶連接退火后的片段,將H鏈克隆到 MfeI和BlpI區(qū)中,將L鏈克隆到EcoRV和BsiwI區(qū)中。使用Lipofectamine 2000 Gnvitrogen公司制造),將己確認核苷酸序列的H鏈和L鏈的載體導入HEK239T細胞中,48小時后回收其細胞上清。使用蛋白G (PIERCE公司制造)柱從回收的細胞上清中純化重組Mabl66。參考例2 抗原的制備
提取由東海大學提供的綠膿桿菌標準株P(guān)AOl的染色體DNA,以該DNA為模板,利用PCR 法擴增編碼PcrV蛋白的基因(序列號2)。在5’側(cè)引物中設(shè)有限制酶Sph I識別位點,在3’ 側(cè)引物中設(shè)有限制酶Hind III識別位點(序列號3、4),進一步地,在插入表達載體時,設(shè)計成在組氨酸標簽與起始密碼子之間插入半胱氨酸,以進行生物素標記。將擴增的PCR片段克隆到PQE30載體(GE Healthcare公司制造)的Sph I和Hind III位點中。確認核苷酸序列后,將該載體導入大腸桿菌JM109中,得到重組大腸桿菌(PcrV-JM109)。將PcrV-JM109 在500ml的LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中在37°C下培養(yǎng),當0D600達到0. 5時,加入200 μ 1 0. IM的IPTG,誘導PcrV的表達。再在37°C下培養(yǎng)1. 5小時后,將菌體離心分離,加入15ml 含有 0. 5%溶菌酶(Sigma 公司制造)的緩沖液 A (25mM Tris-HCl (pH8. 0),0. 5M NaCl,2mM MgCl2),在0°C下放置30分鐘后,進行超聲處理。離心后,得到可溶級分,將其通入His-Bind 柱(Novagen公司制造)后,用含有200mM咪唑的緩沖液B (20mM磷酸緩沖液(pH7. 4),500mM NaCl)洗脫。最終的洗脫組分針對IOmM磷酸緩沖液(pH7. 4)透析,由此進行緩沖液置換??乖呐N锼貥擞?br>
如上所述,使表達/純化的PcrV蛋白在終濃度為IOmM的巰基乙胺溶液中,在37°C下反應(yīng)150分鐘,還原半胱氨酸殘基。向被還原的SH基中添加按摩爾比計20倍量的PEO-馬來酰亞胺活化的生物素(PIERCE公司制造),在4°C下反應(yīng)過夜后,進行透析以便除去過多的生物素??乖拿庖?br>
將作為抗原純化的20 μ g PcrV和弗氏完全佐劑同時對7只4周齡Balb/c雌性小鼠腹腔內(nèi)給藥,作為初次免疫。之后,在14天后、35天后將20 μ g PcrV和弗氏不完全佐劑同時給藥,作為加強免疫。進一步地,在77天后腹腔給予20 μ g PcrV和尾靜脈給予10 μ g PcrV, 作為最終免疫。雜交瘤的制備
最終免疫3天后摘出脾臟,回收脾細胞。使用50%的聚乙二醇4000使脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(p3X63-Ag8.Ul,東京腫瘤研究所)融合,用含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基進行選擇。PcrV抗體的選定
細胞融合8天后,篩選特異性抗體產(chǎn)生細胞。篩選中使用的免疫測定如下。在96孔微量滴定板(Nunc公司制造)的各孔中加入200 μ 1含有2 μ g抗小鼠IgG抗體(Shikiyagi公司制造)的iTris緩沖液(50mM Tris_HCl,pH7. 5),在4°C下固定16小時。用300 μ 1洗滌液 (含有0. 1% Tween20的生理鹽水)洗滌這些孔2次后,加入300 μ 1 BlockAce (大日本制藥公司制造),在室溫放置2小時,進行封閉(抗小鼠IgG抗體固相化板)。各孔用300 μ 1洗滌液洗滌2次后,用150 μ 1緩沖液C (含有0. 9 %氯化鈉,0. 05 %疊氮化鈉,0. 5 %牛血清白蛋白,0.01% Tween 80,25 μ M 二亞乙基三胺-N, N, N,,N,,,N,,-五乙酸的 50mM Tris 緩沖液、pH7. 6)稀釋50 μ 1雜交瘤培養(yǎng)上清并添加到各孔中,在4°C下反應(yīng)過夜。用300 μ 1洗滌液洗滌3次后,加入200 μ 1含有IOng Eu-標記的鏈霉親和素(PERKIN ELMER公司制造) 和25ng生物素標記PcrV的緩沖液C,在室溫反應(yīng)1小時。反應(yīng)后,用300 μ 1洗滌液洗滌 3次,添加200 μ 1增強試劑(1. 39g/l鄰苯二甲酸鉀、19. 3mg/l三正辛基氧化膦、4. 59mg/l 2-萘甲酰三氟丙酮、1.0g/l Triton-X100、6. Og/1乙酸),測定它的時間分辨熒光。根據(jù)篩選結(jié)果,選擇20個對重組PcrV顯示出強親和性的雜交瘤克隆,按照實施例 4確認對綠膿桿菌產(chǎn)生的細胞毒性的抑制活性。其結(jié)果是,在10個克隆中觀察到細胞毒性抑制活性,利用有限稀釋法對這些克隆進行2次克隆,由此獲得了產(chǎn)生識別PcrV的單克隆抗體的雜交瘤克隆。從獲得的10個克隆中選擇4個細胞毒性抑制活性高的克隆,將其分別命名為1F3、2A4、6F5、7A7。對于這些抗體,使用小鼠單克隆抗體同種型ELISA試劑盒(BD Biociences公司制造)確定抗體亞類,結(jié)果IF3為IgG2a、2A4為IgG2b、6F5為IgG2a、7A7 為 IgG2a。產(chǎn)生單克隆抗體1F3和2A4的雜交瘤,于平成21年1月15日(2009年1月15日) 分別以保藏號FERM ABP-11805和FERM ABP-11806在獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(茨城縣筑波市東1-1-1中央第6號)進行國際保藏。參考例3 抗體的結(jié)合活件
為了測定抗體(1F3、2A4、6F5、7A7)的結(jié)合活性,進行競爭免疫測定。向96孔微量滴定板(Nunc公司制造)的各孔中加入ΙΟΟμΙ含有1.5yg抗小鼠Fc抗體(Jackson ImmunoReseach 公司制造)的 Tris 緩沖液(50mM Tris-HCl,pH7. 5),在 4°C 固定 16 小時。將這些孔用300 μ 1洗滌液洗滌2次,之后加入300μ 1含10%蔗糖的BlockAce (大日本制藥公司制造)溶液,在室溫放置2小時,進行封閉(抗小鼠IgG抗體固相化板)。將各孔用300 μ 1 洗滌液洗滌2次,之后添加2ng/孔的各種抗體,以及自500ng/孔起以10倍稀釋系列稀釋5 個階段的未標記的PcrV。之后,添加5ng/孔的生物素化PcrV,反應(yīng)過夜。用300 μ 1洗滌液洗滌4次,添加100/孔的增強溶液(Wallac公司制造)后攪拌1分鐘,之后測定時間分辨熒光。其結(jié)果是,與Mabl66相比,1F3、2A4、6F5、7A7顯示出與PcrV的強結(jié)合活性(圖1)。接下來,通過表面等離振子共振分析,算出lF3、2A4、6F5、7A7、Mabl66與PcrV的親和性。使用小鼠抗體捕獲試劑盒(Biacore公司制造),將抗小鼠抗體固定在CM5傳感器芯片上,然后捕獲各PcrV抗體。在設(shè)置所述固相傳感器芯片的BICORE TlOO上加載重組PcrV, 求得親和性。其結(jié)果是,Mab 166的親和性為3. OX 10_9,與此相對,1F3的親和性為3. 7X 10_10, 2A4的親和性為3. 5X10_1(I,6F5的親和性為1. 1X10_10,7A7的親和性為1. 1X10—9,所有克隆的親和性均比Mabl66高(圖2)。參考例4
能否與Mabl66進行夾心測定
為了證明1F3、2A4、6F5、7A7與Mabl66的表位不同,研究能否進行所述抗體與Mabl66 (下文也稱為ml66)的夾心測定。最初,將Mab 166進行生物素標記。將100 μ g的Mab 166和7. 853 μ g的NHS-PE04 生物素(PIERCE公司制造)在0. IM PBS (pH7. 4)中混合,在冰中反應(yīng)2小時。然后,進行凝膠層析(G2000SW柱(T0SH0公司制造)),以便從反應(yīng)溶液中除去未反應(yīng)的生物素。之后,進行夾心測定。向96孔微量滴定板(Nunc公司制造)中加入100 μ 1含有各50(^8的卩《^抗體(訃3、2六4、6卩5、7六7)的?85(-)溶液,在4°C固定16小時。將這些孔用300 μ 1洗滌液(含有0. 01 % Tween20的生理鹽水)洗滌1次,之后加入300 μ 1 BlockAce (大日本制藥公司制造),在室溫放置2小時,進行封閉。將各孔用300μ 1洗滌液洗滌2次, 之后添加100 μ 1含有50 μ g PcrV和50ng生物素標記Mab 166的測定緩沖液(Wallac公司制造),在4°C反應(yīng)過夜。用洗滌液洗滌3次后,添加ΙΟΟμΙ含有50ng Eu-標記的鏈霉親和素(Wallac公司制造)的測定緩沖液,在室溫反應(yīng)1小時。用洗滌液洗滌4次,添加100 μ 1增強溶液后,攪拌1分鐘,測定其時間分辨熒光。其結(jié)果是,1F3、2A4、6F5、7A7可以與Mab 166進行夾心測定,表明該抗體組與 Mab 166的表位不同(圖3)。參考例5
細胞毒件抑制活件試驗
對1F3、2A4、6F5、7A7進行細胞毒性抑制活性試驗。其方法如下。首先,從32μ g/ml起,將1F3、2A4、6F5、7A7以2倍稀釋系列進行稀釋,將其向96 孔微量培養(yǎng)板的各孔中分別注入10μ 1。接下來,使用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(含碳酸氫鈉、不含L-谷氨酰胺和酚紅的RPMI 1640 (Sigma公司制造)),將骨髓瘤細胞P3U1 (從ATCC獲得)調(diào)整至5X IO6細胞/ml、或者將作為白細胞的一種的U937 (從ATCC獲得)細胞調(diào)整至 IX IO6細胞/ml,在所述96孔微量培養(yǎng)板中添加各100μ 1。進一步使用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基將在陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton Broth (Difco)中培養(yǎng)過夜的綠膿桿菌SRM株調(diào)整至 IXlO8 cfu/ml,將所得菌液按10μ 1/孔進行添加,在37°C、5% CO2存在下培養(yǎng)3小時。經(jīng)過3小時后,添加各10 μ 1 WST-8 (Kishida化學公司制造),在使用骨髓瘤細胞P3U1時在 37°C,5% CO2存在下培養(yǎng)3小時,在使用U937細胞時培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)結(jié)束后,測定450nm 波長處的吸光度。其結(jié)果是,使用白細胞U937細胞時,其細胞毒性抑制活性(IC50)如下與Mabl66 的 IC50 值 213nM 以上相比,1F3 的 IC50 為 5. 3nM、2A4 的 IC50 為 20. 7nM、6F5 的 IC50 為 12. 7nM、7A7的IC50為14. 7nM ;使用骨髓瘤細胞U3P1時,與Mabl66的IC50值MnM相比, 1F3 的 IC50 為 4. 0nM、2A4 的 IC50 為 16nM、6F5 的 IC50 為 7. 3nM、7A7 的 IC50 為 6. OnM0 即, 與己知具有強活性的 Mabl66 (Frank 等人,The Journal of Infectious Diseases, 2002 年,第186卷,66頁)相比,1F3、2A4、6F5、7A7對任一細胞均具有更強的細胞毒性抑制活性 (圖4和圖5)。參考例6
缺失突變PcrV的制備
按照以下方法制備缺失突變PcrV (136-233)。以PcrV抗原蛋白表達質(zhì)粒pQE30_PcrV為模板,使用5,側(cè)弓丨物 GCTCGAGGATCCCAAGGCGCTGACCGC (序列號 5)、3,側(cè)引物 GTTAAGCTTCTCGAAGGGGTACTC (序列號 6 )進行PCR,使用BamHI、HindI 11對己擴增的片段進行限制酶處理,并插入pET3^(Novagen 公司制造)中。確認核苷酸序列后,將該載體導入大腸桿菌BL21-DE3株中,得到重組大腸桿菌(缺失突變PcrV-BL21)。在37°C下,使用^il LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基預培養(yǎng)(前培養(yǎng))該表達株一晝夜。在500ml LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中加入2mL預培養(yǎng)液,在37°C 下培養(yǎng),當0D600達到0. 5時,加入培養(yǎng)液并在冰上靜置30分鐘。加入IPTG使其終濃度達到0. 75mM,使用震蕩培養(yǎng)器在15°C下以160rpm培養(yǎng)一晝夜,誘導PcrV的表達。將培養(yǎng)液于4°C下以X5000g離心30分鐘(min),并收集細菌。除去上清,向菌體中加入IOml含有 0. 溶菌酶(Sigma 公司制造)的緩沖液 X (25mM Tris-HCl (pH7. 5)、150mM NaCl、2mM MgCl2),使其懸浮,在冰上靜置1小時后,邊冰冷邊進行超聲粉碎處理。通過離心得到可溶性級分,將其通入充填有Ni-NTA瓊脂糖(Oiagen)的柱中,然后用緩沖液Y (25mM Tris-HCl (pH7. 5)、150mM NaCl、200mM咪唑)洗脫。將最終的洗脫級分針對IOmM磷酸緩沖液(pH7. 4)透析,由此進行緩沖液置換。表位區(qū)的確定
向96孔微量滴定板(Nunc公司制造)的各孔中加入150 μ 1含有1. 5 μ g抗小鼠IgG Fc 抗體(Jackson Immuno Research 公司制造)的 Tris 緩沖液(50nM Tris_HCl、pH7. 5),在 4°C 固定16小時。將這些孔用300 μ 1洗滌液(含0. 1 % Tween20的生理鹽水)洗滌2次,之后加入300μ 1封閉溶液(50mM Tris-HCl pH7. 5,2% BlockAce (大日本制藥公司制造)、10% 蔗糖),在室溫下放置2小時,將各孔封閉(抗小鼠IgG抗體固相化板)。將各孔用300μ 1洗滌液洗滌1次,之后向各孔中分別添加50 μ 1用緩沖液C (含0. 9%氯化鈉、0. 05%疊氮化鈉、0. 5%牛血清白蛋白、0. 01% Tween80、25 μ M 二亞乙基三胺一 N,N,N,,N,,,N,,-五乙酸的50mM Tris緩沖液、pH7. 6)稀釋至80ng/ml的PcrV抗體溶液,向各孔中分別加入50 μ 1 用緩沖液C稀釋至200ng/ml的Eu-標記鏈霉親和素(PERKIN ELMER公司制造)溶液,再向各孔中分別加入100μ 1用DELFIA測定緩沖液稀釋至各濃度的缺失突變PcrV蛋白,在4°C 下反應(yīng)一夜。用300 μ 1洗滌液洗滌3次,之后添加200 μ 1增強試劑(1. 39g/l鄰苯二甲酸鉀、19. 3mg/l三正辛基氧化膦、4. 59mg/l 2-萘甲酰三氟丙酮、1. 0g/lTriton_X100、6. Og/1 乙酸),測定其時間分辨熒光(圖6)。其結(jié)果是,PcrV抗體1F3、2A4、9D12、12H9以及用作參考例的KaloBios公司的 ml66對PcrV全長(1-294)顯示出反應(yīng)性。另一方面,雖然1F3、2A4對PcrV (136-233)顯示出反應(yīng)性,但ml66和不具有中和活性的9D12、12H9對PcrV (136-233)沒有顯示出反應(yīng)性。此外,還利用蛋白質(zhì)印跡法進行了結(jié)合分析。將己純化的重組PcrV蛋白進行 SDS-PAGE后,將其轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將轉(zhuǎn)印的膜用BlockAce (大日本制藥制)溶液在室溫下邊震蕩邊封閉2小時。向膜上加入稀釋至1 μ g/ml的PcrV抗體溶液,在4°C下反應(yīng)一夜,之后用洗滌液B (10福磷酸緩沖液(?!17.4)、0.05(%1^擾1120)洗滌。向膜上加入作為二次抗體的標記抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare公司制造)溶液,在室溫反應(yīng)2小時,之后用洗滌液B洗滌膜,用ECL plus蛋白質(zhì)印跡法測定系統(tǒng)(GE Healthcare公司制造)進行顯色,用LAS-1000 (FUJIFILM)拍照(圖7)。PcrV中和抗體1F3、2A4對全長PcrV和缺失突變 PcrV 二者都有反應(yīng),但ml66和中和活性低的6F5、7A7只對全長PcrV有反應(yīng)而不對缺失突變PcrV反應(yīng)。由此可知PcrV中和抗體1F3、2A4的表位區(qū)是氨基酸殘基136-233的區(qū)域,ml66、 6F5、7A7不是僅以氨基酸殘基136-233作為表位區(qū)。 PcrV蛋白白憤寺定Rij細朐,毒+杉舌+牛的強It的才目關(guān)個牛
使用全長PcrV蛋白(序列號1)和缺失突變PcrV蛋白(具有序列號1中的136位-233 位的氨基酸序列),進行l(wèi)F3、2A4、ml66的細胞毒性抑制活性的抑制試驗。其方法如下。首先,將1F3、2A4、ml66分別從200nM、200nM、400nM起以2倍稀釋系列進行稀釋, 向96孔微量培養(yǎng)板中分別注入10 μ 1。本試驗中1F3、2A4、ml66的試驗濃度范圍分別是 1. 56-6. 25nM、6. 25-25nM、50_200nM。對于各試驗濃度范圍,以30、10、3、1,0. 3倍摩爾濃度向96孔板中添加10 μ 1全長PcrV蛋白和缺失突變PcrV蛋白,在室溫放置30分鐘。然后, 使用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(含碳酸氫鈉、不含L-谷氨酰胺和酚紅的RPMI 1640 (Sigma公司制造))制備骨髓瘤細胞U3P1,使其達到5X IO6細胞/ml,向所述96孔微量培養(yǎng)板中添加各 70μ1。進一步地,用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基將在Mueller Hinton Broth (Difco)中培養(yǎng)一夜的綠膿桿菌SRM株配制成lX108Cfu/ml,將得到的菌液添加10μ 1,在37°C、5% CO2存在下培養(yǎng)3小時。經(jīng)過3小時后,添加各10μ 1的WST-8 (KiShida化學公司制造),在37°C、 5% CO2存在下培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)結(jié)束后,測定450nm波長處的吸光度。其結(jié)果是,未添加PcrV蛋白時,與ml66相比,1F3、2A4顯示出強的細胞毒性抑制活性。另一方面,添加全長PcrV蛋白時,所有抗體均抑制己添加的全長PcrV蛋白的濃度依賴性細胞毒性抑制活性(圖8 )。與此相比,添加缺失突變PcrV蛋白時,其氨基酸區(qū)(136-233 ) 具有表位的1F3、2A4抑制己添加的缺失突變蛋白的濃度依賴性細胞毒性抑制活性,但不具有表位的ml66在細胞毒性抑制活性方面沒有觀察到變化(圖9)。根據(jù)以上結(jié)果認為氨基酸殘基136-233中具有表位的抗體(1F3和2A4)較該區(qū)不具有表位的抗體(ml66)具有更強的細胞毒性抑制活性。即,可認為細胞毒性抑制活性的強度根據(jù)PcrV抗體所識別的區(qū)而不同,但具有強細胞毒性抑制活性的抗體是只在氨基酸殘基136-233區(qū)與PcrV蛋白具有反應(yīng)性的抗體。參考例8
針對人PcrV的小鼠單克降杭體(1F3和2A4)的氨某酸序歹U的分析使用RNeasy Mini試劑盒(QIAGEN公司制造),從所確立的雜交瘤細胞中提取RNA。使用快速擴增cDNA末端的5’RACE系統(tǒng)2. O版(Invitrogen公司制造),從提取的1 μ g RNA中擴增DNA片段。此時,用于cDNA合成的引物如下對于1F3為TAGAGTCACCGAGGAGCCAGTTGT (序列號7);對于2A4為TCCAGAGTTCCAAGTCACAGTCAC (序列號8)。此外,在5,RACE法中使用的引物如下對于1F3為AGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGT (序列號9),對于2A4為 AGGGGCCAGTGGATAGACTGATGGGGGTGT (序列號 10)。用 TOPO TA 克隆試劑盒(Invitrogen 公司制造)克隆所擴增的片段,使用Applied Biosystems 3130遺傳分析儀(Applied Biosystems公司制造)分析核苷酸序列。1F3的分析結(jié)果見圖10,2A4的分析結(jié)果見圖11。 將可變區(qū)的氨基酸序列應(yīng)用于Kabat等人制成的抗體氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(“kquence of Proteins of Immunological hterest”,美國衛(wèi)生與公共福利部,1983)研究同一性,結(jié)果是1F3的重鏈可變區(qū)中的互補決定區(qū)是SFTSYWMH(序列號15)、INPSNGRTNYNEKFNT(序列號 16)、YGNYVVYYTMDY (序列號17),輕鏈可變區(qū)中的互補決定區(qū)是SASTSVSYME (序列號18)、 TTSKLAS (序列號19)、HQWRNYPET (序列號20)。同樣進行研究的結(jié)果是2A4的重鏈可變區(qū)中的互補決定區(qū)是 SITSDYAWN (序列號 21)JITYNGDTSYNPSLKS (序列號 22)、SRNYYGAWFAY (序列號23),輕鏈可變區(qū)中的互補決定區(qū)是KASQYVGTTVA (序列號M)、RASTRHT (序列號 25 )、QQYCSSPLT (序列號洸)。下文給出了實施例來具體說明本發(fā)明,但本發(fā)明并不限于下述實施例。作為抗體制備方法,如果沒有特別限定,則采用Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publications)中記載的方法。另外,作為基因操作方法,如果沒有特別限定,則米用 Molecular cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(Cold Spring Harbor Laboratory)中記載的方法。實施例1
(1)小鼠單克隆抗體1F3的人源化關(guān)于如上制備的小鼠單克隆抗體1F3的人源化,是將小鼠抗體的CDR移植到人種系 (germline)受體序列中制備的。具體而言,用IgBLAST (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)檢索與小鼠抗體重鏈、輕鏈各自的V基因區(qū)氨基酸序列同源性最高的人種系受體序列,對于J基因區(qū),從 IMGT (http://imgt. cines. fr/)中選擇與小鼠抗體DNA序列同源性高的序列。檢索的結(jié)果是獲得了與小鼠抗體重鏈V基因區(qū)同一性最高的人種系受體序列來源的抗體基因序列,其IMGT基因名是IGHV1-46*01,獲得了與J基因區(qū)同一性最高的人種系受體序列來源的抗體基因序列,其IMGT基因名是IGHJ6*01,將它們作為用于重鏈移植的人框架序列。同樣地,獲得了與小鼠抗體輕鏈V基因區(qū)同一性最高的人種系受體序列來源的抗體基因序列,其IMGT基因名是IGKV1-9*01,獲得了與J基因區(qū)同一性最高的人種系受體序列來源的抗體基因序列,其IMGT基因名是IGKJ2*02,將它們作為用于輕鏈移植的人框架序列。然后,根據(jù)Kabat 編號(Wu, Τ. T.和 Kabat, E. A. , J. Exp. Med. Augl; 132⑵211-50, (1970))標明氨基酸序列的編號,限定小鼠抗體重鏈CDRHl、CDRH2、CDRH3 和輕鏈⑶RL1、⑶RL2、⑶RL3,將這些⑶R區(qū)移植到人的框架序列上,將其設(shè)計為模板人源化抗體。確認所設(shè)計的模板人源化抗體與小鼠抗體的氨基酸序列的差異是在Chothia編號 (Chothia C.和 Lesk, A. M. , J. Mol. Biol. , 196 901-917 ;Chothia C.等人,Nature, 342:877-883,(1989))中的氨基酸序列號 H5、H7、Hll、H12、H20、H38、H40、H48、H66、H67、 H69、H71、H75、H78、H81、H83、H87、H93、H94、H108、L1、L3、L9、L10、L11、L15、L17、L18、L19、 L21、L40、L42、L43、L46、L70、L71、L72、L78、L79、L80、L83、L85、L100。為了鑒定小鼠抗體中的體細胞突變位點,在IgBLAST中檢索小鼠抗體重鏈、輕鏈各自的V基因區(qū)氨基酸序列,獲得的同一性最高的重鏈序列的基因名是J558. 33,而同一性最高的輕鏈序列的基因名是IGKV4-80*01。在IgBLAST中檢索小鼠抗體重鏈的D基因區(qū)氨基酸序列,獲得的同一性最高的重鏈序列的基因名是IGHD2-1*01。在IMGT中檢索小鼠抗體重鏈、輕鏈各自的J基因區(qū)DNA序列,獲得的同一性最高的重鏈序列的基因名是IGHJ4*01, 而同一性最高的輕鏈序列的基因名是IGKJ4*01。將這些小鼠種系序列與小鼠抗體比較,將不同的側(cè)鏈作為體細胞突變位點,其中確認小鼠抗體和模板人源化抗體之間不同的側(cè)鏈是 H93、H94、L9、L46。將H71、H94確認為小鼠抗體與模板人源化抗體之間不同的規(guī)范(Canonical)側(cè)鏈 (http://www. bioinf. org. uk/abs/chothia. html)。在小鼠抗體與模板人源化抗體之間不同的側(cè)鏈中,位于 Vernier 區(qū)(Foote等人,J. Mol. Biol. , 224.487,(1992))中的是H48、 H67、H69、H71、H78、H93、H94、L46、L71。沒有確定在小鼠抗體與模板人源化抗體之間不同的鏈間包裝殘基(packing residue)。綜合這些結(jié)果,設(shè)計了將小鼠抗體型突變(回復突變) 全部導入模板人源化抗體的H48、H67、H69、H71、H78、H93、H94、L9、L46、L71的氨基酸側(cè)鏈中的突變型人源化抗體。設(shè)計了將作為所設(shè)計的模板人源化抗體可變區(qū)(圖12 ;模板)和突變型人源化抗體可變區(qū)(圖12 ;回復突變)的重鏈恒定區(qū)序列的人IgG4 Pro恒定區(qū)序列, 與作為輕鏈恒定區(qū)序列的人IgK恒定區(qū)序列連接而成的DNA序列,通過下文記載的方法, 分別構(gòu)建模板人源化抗體重鏈表達質(zhì)粒(圖13 ;HT)、模板人源化抗體輕鏈表達質(zhì)粒(圖13 ; LT)、突變型人源化抗體重鏈表達質(zhì)粒(圖13 ;HB)、突變型人源化抗體輕鏈表達質(zhì)粒(圖13 ;LB)。(2)抗體基因表汰載體的制備
首先,為了避免鉸鏈區(qū)部分的S-S鍵斷開(Angal等人,1993,Mol. Immunol. 30(1) :105-108 和 khuurman 等人,2001,Mol. Immunol. 38:1-8),將第 2 位的絲氨酸序列變?yōu)楦彼?,在將IgG4的恒定區(qū)DNA分為4份后,合成它們的有義DNA和反義DNA,進行退火反應(yīng)。通過DNA連接酶連接退火后的片段,在Nhel、NotI位點處插入到pcDNA3. 1 (+) 載體(Invitrogen公司制造)中,進而整合多克隆位點以便能夠插入可變區(qū)的DNA片段。然后,將人源化PcrV抗體的可變區(qū)部分的基因序列按重鏈和輕鏈分別分為4份后,合成它們的有義DNA和反義DNA,進行退火反應(yīng)。通過DNA連接酶連接退火后的片段,將重鏈克隆到MfeI和BlpI區(qū)中,并將輕鏈克隆到EcoRV和BsiWI區(qū)中,確定DNA堿基序列。制備小鼠/人嵌合1F3抗體作為抗體人源化時的指標。在小鼠抗體的重鏈可變區(qū)中設(shè)計人IgG4 Pro恒定區(qū)序列作為重鏈恒定區(qū)序列,通過下述方法構(gòu)建表達質(zhì)粒,得到小鼠/人嵌合抗體重鏈表達質(zhì)粒(圖13 ;H嵌合體)。在小鼠抗體的輕鏈可變區(qū)中設(shè)計連接人 Ig κ恒定區(qū)序列的DNA序列作為輕鏈恒定區(qū)序列,通過上述方法構(gòu)建表達載體,得到小鼠/ 人嵌合抗體輕鏈表達質(zhì)粒(圖13 ;L嵌合體)。在哺乳動物培養(yǎng)細胞中共轉(zhuǎn)染小鼠/人嵌合抗體重鏈表達質(zhì)粒和小鼠/人嵌合抗體輕鏈表達質(zhì)粒、模板人源化抗體重鏈表達質(zhì)粒和模板人源化抗體輕鏈表達質(zhì)粒、模板人源化抗體重鏈表達質(zhì)粒和突變型人源化抗體輕鏈表達質(zhì)粒、突變型人源化抗體重鏈表達質(zhì)粒和模板人源化抗體輕鏈表達質(zhì)粒、突變型人源化抗體重鏈表達質(zhì)粒和突變型人源化抗體輕鏈表達質(zhì)粒,使用其培養(yǎng)上清,通過表面等離振子共振分析(BIAcoreT-100,GE Healthcare)測定與作為抗原的重組PcrV的親和性(圖13)。小鼠/人嵌合抗體的親和性分析的KD值是2. 6 X ΙΟ, M,此外,模板人源化抗體重鏈和模板人源化抗體輕鏈的抗體的KD值是2. 2 X ΙΟ"7 M,模板人源化抗體重鏈和突變型人源化抗體輕鏈的抗體的KD值是6. 5 X 10_7 M,確定親和性大幅度降低。另一方面,突變型人源化抗體重鏈和模板人源化抗體輕鏈的抗體的KD值是3. 3 X 10, M,突變型人源化抗體重鏈和突變型人源化抗體輕鏈的抗體的KD值是3. 4 X 10, M,顯示維持了與小鼠 /人嵌合抗體相近的親和性。根據(jù)該結(jié)果判斷,突變型人源化抗體重鏈對維持親和性是重要的,輕鏈則使用模板人源化抗體輕鏈和突變型人源化抗體輕鏈中的任一種都沒有差別。因此,關(guān)于輕鏈,選擇與人種系來源序列相近的模板人源化抗體輕鏈。關(guān)于重鏈,制備將各種突變回復到人種系來源序列的人源化抗體,所述突變是導入了回復突變的氨基酸側(cè)鏈H48、 H67、H69、H71、H78、H93、H94,通過表面等離振子共振分析來評估與抗原的親和性(圖14)。 其結(jié)果是H93的Val改變?yōu)锳la的人源化抗體的KD值是1. O X 10_9 M,H94的Leu改變?yōu)锳rg的人源化抗體的KD值是3. 2 X 10_7 M,雖然親和性降低了,但在其他突變回復到人種系來源序列的人源化抗體中沒有見到大的親和性下降。根據(jù)上述結(jié)果,確定人源化抗體序列,其中H93、H94采用小鼠抗體來源的序列, H48、H67、H69、H71、H78采用人種系氨基酸序列(圖15,圖16)。根據(jù)下文(3)的方法制備具有該序列的抗體,通過表面等離振子共振分析確定親和性,結(jié)果是確定了與小鼠抗體等同的親和性(圖17)。(3)重組抗體的制備
使用Lipofectamine 2000 Gnvitrogen公司制造),將用上述方法制備的重鏈基因和輕鏈基因?qū)際EK239F細胞中,72小時后回收其細胞上清。使用蛋白G(PIERCE公司制造) 柱從回收的細胞上清中純化重組抗體。實施例2
進行mlF3 (小鼠抗體)、hlF3 (人源化抗體)和ml66的細胞毒性抑制活性實驗。方法如下。首先,將mlF3、hlF3和ml66分別自200nM、200nM、800nM起,以2倍稀釋系列進行稀釋,向96孔微量培養(yǎng)板的各孔中分別注入10μ 1。然后,使用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(含碳酸氫鈉、不含L-谷氨酰胺和酚紅的RPMI 1640 (Sigma公司制造))將骨髓瘤細胞U3P1配制為 5X IO6細胞/ml,或?qū)937細胞配制為1 X IO6細胞/ml,向所述96孔微量培養(yǎng)板中添加各 70μ1。進一步地,用細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基將在陽離子調(diào)節(jié)的Mueller Hinton Broth(Difco) 中培養(yǎng)一夜的綠膿桿菌SRM株配制成1 X 108cfu/ml,以10 μ 1/孔添加,在37°C、5% CO2存在下培養(yǎng)3小時。經(jīng)過3小時后,添加各10 μ 1的WST-8(Kishida化學公司制造),在37°C、 5% CO2存在下培養(yǎng)1小時。培養(yǎng)結(jié)束后,測定450nm波長處的吸光度。其結(jié)果是,在使用 U937細胞的情況下(圖18),其細胞毒性活性(IC50)是,與ml66的98. 4 nM相對,mlF3為 1.4 nM、hlF3為1.5 nM,在使用骨髓瘤細胞的情況下(圖19),與ml66為85. 4 nM相對,1F3 為1. 5 nM、hlF3為1. 3 nM。即,mlF3和hlF3的細胞毒性抑制活性的程度相同,顯示出比 ml66強的活性。產(chǎn)業(yè)實用性
本發(fā)明的人源化單克隆抗體或其部分不僅對PcrV有高的親和性,而且在綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa)對真核細胞的細胞毒性活性方面也顯示出強的抑制活性。因此,含有該單克隆抗體或其部分的藥物組合物作為目前在醫(yī)療領(lǐng)域中難以治療的綠膿桿菌相關(guān)的感染病的治療藥是有用的。
權(quán)利要求
1.針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有至少1種選自下列 (1)-(4)中的性質(zhì)(1)在體外InM至200nM的濃度下,抑制綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)對白細胞的細胞毒性活性50%以上,(2)在體外InM至50nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對骨髓瘤細胞的細胞毒性活性50%以上,(3)與PcrV的解離常數(shù)(Kd)為2X10—9(M)以下,和(4)在序列號1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。
2.人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有由以保藏編號FERMABP-11805 保藏的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的所有互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸序列。
3.針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有1)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)SFTSYWMH(序列號15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列號 16)、YGNYVVYYTMDY (序列號 17),和2)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)SASTSVSYME(序列號18)、TTSKLAS (序列號 19)、HQWRNYPET (序列號 20)。
4.針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有1)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的重鏈可變區(qū)SFTSYWMH(序列號15)、 INPSNGRTNYNEKFNT (序列號16)、YGNYVVYYTMDY (序列號17),或由在上述3個CDR中的1個以上的CDR中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而產(chǎn)生的氨基酸序列所組成的3個CDR, 和2)互補決定區(qū)中含有以下氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)SASTSVSYME(序列號18)、TTSKLAS (序列號19)、HQWRNYPET (序列號20),或由在上述3個⑶R中的1個以上的⑶R中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而產(chǎn)生的氨基酸序列所組成的3個CDR,且具有至少1種選自下列(1)- (4)中的性質(zhì)(1)在體外InM至200nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對白細胞的細胞毒性活性50%以上,(2)在體外InM至50nM的濃度下,抑制綠膿桿菌對骨髓瘤細胞的細胞毒性活性50%以上,和(3)與PcrV的解離常數(shù)(Kd)為2X10-9(M)以下,(4)在序列號1所示氨基酸序列的136位至233位中具有表位。
5.針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,所述抗體或其部分具有1)具有序列號27的氨基酸序列的重鏈可變區(qū);和2)具有序列號觀的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。
6.以權(quán)利要求1-5的任一項所述的抗體或其部分作為有效成分包含的藥物組合物。
7.編碼權(quán)利要求3-5所述的抗體的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的多核苷酸。
8.含有權(quán)利要求7所述的多核苷酸的表達載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了在感染病、特別是綠膿桿菌引起的感染病的治療中作為有效手段的、針對PcrV的人源化單克隆抗體或其部分,和包含所述抗體或其部分作為有效成分的藥物組合物。具體而言,本發(fā)明的人源化單克隆抗體對于綠膿桿菌對靶細胞的細胞毒性具有優(yōu)異的抑制活性。此外,本發(fā)明的人源化單克隆抗體對PcrV具有高親和性。
文檔編號A61K39/395GK102341496SQ201080010648
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者佐藤剛章, 山野佳則, 川本敬子, 沼田義人, 辻敏永 申請人:鹽野義制藥株式會社