一種腸膜明串珠菌及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種腸膜明串珠菌及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸膜明串珠菌是乳酸菌中的明串珠菌屬的重要菌種。美國(guó)FDA和AAFC0于1989 年將其列為可以直接食（飼）用的42種安全微生物之一。我國(guó)衛(wèi)生部也于2012年將腸膜 明串珠菌腸膜亞種列入了《可用于食品的菌種名單》。
[0003] 研究證實(shí)，腸膜明串珠菌不僅具有普通乳酸菌的高產(chǎn)酸能力、抗氧化能力和頡頏 致病菌的特性，還具有在發(fā)酵中可產(chǎn)生種類豐富、數(shù)量較多的胞外多糖的能力。腸膜明串珠 菌也被發(fā)現(xiàn)廣泛分布在發(fā)酵食品中，特別是發(fā)酵乳品、腌制泡菜和釀制果酒中。
[0004] 腸膜明串珠菌發(fā)酵蔗糖合成大量的葡聚糖，是生產(chǎn)代血漿的主要成分一右旋糖酐 的原料。在醫(yī)療上十分重要，具有維持血液滲透壓和增加血溶量的作用，是目前公認(rèn)的優(yōu)良 血漿代用品之一，臨床上常用于治療由于失血、創(chuàng)傷、燒傷和中毒等引起的失血性休克。隨 著腸膜明串珠菌胞外多糖的研究越來(lái)越全面和深入，由腸膜明串珠菌合成的功能性低聚糖 產(chǎn)品有望實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的腸膜明串珠菌主要產(chǎn)生可溶性多糖，不產(chǎn)生不可溶性多糖或者 不可溶性多糖產(chǎn)量很低，故此缺乏可以大量產(chǎn)生不可溶性多糖的新菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有的腸膜明串珠菌主要產(chǎn)生可溶性多糖， 不產(chǎn)生不可溶性多糖或者不可溶性多糖產(chǎn)量很低的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一株腸膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。所述的腸膜明串珠菌可以制備多糖， 尤其是大量制備不溶性多糖，可以更好地應(yīng)用于乳制品發(fā)酵以及貯藏中。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案之一是：一種腸膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides)，其 保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為：CGMCCNo. 10064。
[0008] 從黑龍江省的農(nóng)家腌制泡菜中分離而得，獲得所述的腸膜明串珠菌CGMCC No. 10064。對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果為腸膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides，命名為 BD3749。該菌株已于2014年11月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心，并收到保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)CGMCCNo. 10064。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案之二是：一種制備所述的腸膜明串珠菌CGMCCNo. 10064的方 法，其包括以下的步驟：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的腸膜明串珠菌CGMCCNo. 10064即可。
[0010] 其中，所述的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基，能夠生長(zhǎng)所述的腸膜明串珠菌CGMCC No. 10064即可。較佳地為TYC培養(yǎng)基，所述的TYC培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的TYC培養(yǎng)基，較佳 地包括如下組分：胰胨（或酪朊水解物）1. 5g;酵母膏0. 5g;L-胱氨酸0. 02g;乙酸鈉2. 0g; Na2S04 0 . 01g;NaCl0.lg;蔗糖5. 0g;蒸餾水100ml;如果為TYC固體培養(yǎng)基，則除了上述組 分，較佳地還包括1. 5-2. 0克（g)的瓊脂，更佳地包括1. 8g瓊脂。
[0011] 所述培養(yǎng)的溫度為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，能夠生長(zhǎng)所述的腸膜明串珠菌CGMCC No. 10064,較佳地為25~37°C，更佳地為30~37°C，最佳為30°C。所述培養(yǎng)的時(shí)間為本 領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間，較佳地為18~72小時(shí)（h)，更佳地為18小時(shí)（h)或72小時(shí)（h)，最佳地 為18小時(shí)（h)。所述培養(yǎng)的pH為本領(lǐng)域常規(guī)的pH，能夠生長(zhǎng)所述的腸膜明串珠菌CGMCC No. 10064,較佳地為4~6,更佳地為4~5。
[0012] 本發(fā)明培養(yǎng)條件為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)條件，較佳地為好氧靜置培養(yǎng)，震蕩培養(yǎng)或者 厭氧靜置培養(yǎng)，所述震蕩培養(yǎng)的震蕩速度為常規(guī)的，較佳地為180r/min。
[0013] 較佳地，所述的培養(yǎng)前還包括使用種子培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)的步驟。所述的種子 培養(yǎng)為本領(lǐng)域常規(guī)的種子培養(yǎng)。所述的種子培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的種子培養(yǎng)基，較佳地為 TYC培養(yǎng)基；所述種子培養(yǎng)的時(shí)間為本領(lǐng)域常規(guī)的時(shí)間，較佳地為16~32h，更佳地為16~ 24h，最佳為24h;所述種子培養(yǎng)的溫度為本領(lǐng)域常規(guī)的溫度，較佳地為28~32°C，更佳為 30°C。所述種子培養(yǎng)的接種量為本領(lǐng)域常規(guī)的接種量，較佳地為1~2%，更佳為1 %，所述 百分比為體積百分比。
[0014] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是：所述的腸膜明串珠菌CGMCCNo. 10064在胞外多 糖生產(chǎn)中的應(yīng)用。所述胞外多糖包括可溶性的和不溶性的。
[0015] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0016] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0017] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明提供的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)可以制備多糖，尤其能夠大量制備不可溶性多糖，從而可以更好地控制乳 清析出。因此所述菌株以及該菌株制備而得的不可溶性多糖均能被用于乳制品發(fā)酵中，尤 其是在固體型蛋白產(chǎn)品（如奶酪）制備中起到凝固劑的作用，在牛奶制品貯藏中也能避免 因乳清析出造成產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重破壞，從而影響其品質(zhì)及貨架期。所述菌株培養(yǎng)方法 簡(jiǎn)單易操作，其制備而得的不可溶性多糖量大，適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)。
[0018] 牛物材料保藏信息
[0019] 本發(fā)明的腸膜明串珠菌BD3749,已于2014年11月26日保藏在中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 10064，培養(yǎng)物名稱是 BD3749,分類命名是腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明腸膜明串珠菌BD3749在TYC上培養(yǎng)的菌落形態(tài)。
[0021] 圖2為本發(fā)明腸膜明串珠菌BD3749與標(biāo)準(zhǔn)菌株腸膜明串珠菌ATCC10830a菌落形 態(tài)的對(duì)比。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書選擇。
[0023] 本發(fā)明所用到的培養(yǎng)基成分如下：
[0024]TYC培養(yǎng)基（液體TYC培養(yǎng)基）：胰蛋白胨1. 5g;酵母膏0. 5g;L_胱氨酸0. 02g; 乙酸鈉 2. 0g;Na2S04 0·Olg;NaCl0·lg;鹿糖 5. 0g;蒸餾水 100ml;115°C，滅菌 15min。
[0025] TYC固體培養(yǎng)基：液體TYC培養(yǎng)基另加入1. 8g瓊脂。
[0026] 實(shí)施例1菌株BD3749的分離
[0027] 取黑龍江省的農(nóng)家腌制泡菜，以無(wú)菌方式取lg，浸入無(wú)菌生理鹽水中，取浸出液進(jìn) 行梯度稀釋，通過(guò)涂布的方式將稀釋液均勻涂布于固體TYC培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)24-48h。選 取粘鼻涕狀、具有良好拉絲性的單菌落多個(gè)，分別轉(zhuǎn)接到新的固體TYC培養(yǎng)基上，得到多個(gè) 純化的菌落，將其中一個(gè)單菌落命名為BD3749。
[0028] 實(shí)施例2菌株BD3749的特征
[0029] 1、菌落特征
[0030] 取菌株BD3749的單菌落，轉(zhuǎn)接到TYC固體培養(yǎng)基（瓊脂）上，于37°C厭氧箱恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀察其菌落的大小、顏色、邊緣、凸起、光滑度、粘性、透明度等特點(diǎn)。 結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，菌株BD3749形成粘鼻涕狀、具有良好拉絲性的、邊緣整齊、凸 起、光滑、無(wú)色不透明的單菌落。
[0031] 2、形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征
[0032] 挑取在TYC固體培養(yǎng)基（瓊脂）上培養(yǎng)24h的新鮮培養(yǎng)物，進(jìn)行生理生化測(cè)試。結(jié) 果顯示，BD3749為革蘭氏陽(yáng)性球菌，兼性厭氧。接觸酶實(shí)驗(yàn)陰性，氧化酶陰性。
[0033] 3、API5〇CH鑒定特征
[0034] 利用API50CH鑒定系統(tǒng)（生產(chǎn)廠商：bioM^rieux)測(cè)定菌株BD3749發(fā)酵碳水 化合物的產(chǎn)酸情況。API50CH的試劑條中，不同的序列號(hào)對(duì)應(yīng)不同的碳源，同時(shí)，其中含有 指示劑，這樣，如果其對(duì)應(yīng)的碳源被利用，則培養(yǎng)液pH下降，指示劑便會(huì)改變顏色，利于觀 察記錄。
[0035]API50CH鑒定系統(tǒng)操作步驟如下：
[0036] 1)API50CH基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨lg，酵母膏0· 5g，硫酸銨2g，酚紅0· 18g， 無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)（Cohen-Bazire)lOml，磷酸鹽緩沖液（pH7. 8) 1000ml。
[0037] 2)在平板上培養(yǎng)菌株BD3749,挑取有多個(gè)大小相近，單菌落分離的平板。挑取大 小相近的單菌落若干個(gè)，加入1)中的培養(yǎng)基中，制成〇D_= 0. 4~0. 6的菌懸液。
[0038] 3)將接過(guò)種的API50CH培養(yǎng)基加入到含有實(shí)驗(yàn)條的小管中，上面覆蓋一層已滅 菌的石蠟油。
[0039] 4)在30 °C的恒溫培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng)，分別在24h和48h記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。
[0040] 菌株BD3749利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果如表1所示。
[0041] 表1.菌株BD3749的API50CH鑒定結(jié)果
[0042]
[0044] " + "表示利用糖產(chǎn)酸，表示不產(chǎn)酸。
[0045] 4、16srDNA序列同源性分析
[0046] 挑取TYC平板培養(yǎng)的BD3749菌株2-3環(huán)接入30ml液體TYC培養(yǎng)基中，置 于30°C下，180r/min振蕩培養(yǎng)18h。12000rpm離心5min收集菌體。利