專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組人內(nèi)皮抑素腺病毒及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及到一種含重組人內(nèi)皮抑素基因的腺病毒及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
1971年，F(xiàn)olkman首次提出了腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移具有血管依賴(lài)性的觀(guān)點(diǎn)。近幾十年的研究不斷證實(shí)了這一觀(guān)點(diǎn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成密切相關(guān)，血管生成是腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要控制點(diǎn)(Skobe et al.，1997；Dameron et al.，1994；Volpert et al.，1997；Bertolini et al.，2000；Holmgren et al.，1995)。腫瘤的抗血管生成治療已成為腫瘤治療的一個(gè)新的研究方向。
內(nèi)皮抑素(endostatin)是O’Reilly等人于1997年發(fā)現(xiàn)的最為著名的內(nèi)源性血管生成抑制因子，它是膠原XVIII的C-末端片段(來(lái)源于人的內(nèi)皮抑素蛋白包含183個(gè)氨基酸，分子量大約為20kDa)。研究表明，內(nèi)皮抑素蛋白在體外可以有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移，在體內(nèi)可以抑制多種腫瘤模型的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。關(guān)于它抑制血管生成的作用機(jī)制研究也較多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素可以通過(guò)以下幾種途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)-與整合素V1(integrin V1)結(jié)合(Hamano et al.，2003)、抑制VEGF與受體的結(jié)合(Kim et al.，2002)、抑制Cyclin D1(Hanai et al.，2002)等。
目前認(rèn)為血管生成抑制因子這一大類(lèi)蛋白在治療上存在多方面的局限首先，由于其藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，體外表達(dá)的蛋白分子不穩(wěn)定，決定了蛋白輸注是一個(gè)長(zhǎng)期、反復(fù)、足量給藥的過(guò)程，大用量和短期多次輸注給病人帶來(lái)了很大的不便；另外，蛋白純化過(guò)程復(fù)雜費(fèi)時(shí)、產(chǎn)量較低，成本高，臨床應(yīng)用限制較大。
作為第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的內(nèi)源性的血管生成抑制因子，EntreMed公司在美國(guó)已完成I期臨床試驗(yàn)，正在進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)。I期臨床結(jié)果表明，人內(nèi)皮抑素重組蛋白具有良好的耐受性，最大用藥量(600mg/m2/天)也未顯示明顯的毒性，但靜脈血中有效濃度持續(xù)時(shí)間十分短暫(僅為10.7小時(shí))(Eder JP et al，2002；Herbst RS et al.，2002；Thomas JP et al.，2003)。如何在臨床應(yīng)用中長(zhǎng)時(shí)間維持內(nèi)皮抑素有效的血藥濃度是其運(yùn)用中的一個(gè)重要問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種重組人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因，其特征在于它是將IL-2基因信號(hào)肽序列的3’端與人內(nèi)皮抑素編碼序列的5’端連接而成，具有SEQID NO.1的核苷酸序列(見(jiàn)表1)。
表1 重組人內(nèi)皮抑素基因(SEQ ID NO.1)ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCGGCCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTGACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTCTGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAG本發(fā)明還提供了一種制備上述重組人內(nèi)皮抑素基因的方法，該方法包括以下步驟a、合成下列PCR引物5’引物(SEQ ID NO.2)5’CGG ATC CAT GTA CAG GAT GCA ACT CCT GTCTTG CAT TGC ACT AAG TCT TGC ACT TGT CAC GAA TTC GGC CCA CAGCCA CCG CGA CTT CCA GCC 3’，其中下劃線(xiàn)部分為IL-2基因信號(hào)肽序列；3’引物(SEQ ID NO.3)5’GCG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC3’；b、將人內(nèi)皮抑素編碼序列和克隆載體構(gòu)建成重組載體；c、以該重組載體為模板，用步驟1合成的PCR引物擴(kuò)增含IL-2基因信號(hào)肽的重組人內(nèi)皮抑素基因。
本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供了一種由上述的重組人內(nèi)皮抑素基因所編碼的重組人內(nèi)皮抑素多肽。
進(jìn)一步的，上述的重組人內(nèi)皮抑素多肽是本發(fā)明重組人內(nèi)皮抑素基因在真核細(xì)胞中表達(dá)得到的。
同時(shí)，本發(fā)明還提供了上述重組人內(nèi)皮抑素多肽在制備抗腫瘤藥物組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種含有上述的重組人內(nèi)皮抑素基因的重組載體，這些能攜帶本發(fā)明重組人內(nèi)皮抑素基因的各種載體是本領(lǐng)域已知的，如重組噬菌體、質(zhì)粒和其他的經(jīng)加工后可以含有本發(fā)明重組人內(nèi)皮抑素基因序列的原核和真核載體。
優(yōu)選的，所述載體是腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。
更優(yōu)選的，所述腺病毒是復(fù)制缺陷型腺病毒。
本發(fā)明還提供了上述的重組載體在制備抗腫瘤藥物組合物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供了含有上述的重組人內(nèi)皮抑素基因或上述的重組載體的宿主細(xì)胞。可用于實(shí)施本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞，例如細(xì)菌、酵母、或者是動(dòng)物細(xì)胞。
進(jìn)一步的，上述的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
更進(jìn)一步的，上述的所述宿主細(xì)胞是293細(xì)胞。
同時(shí)本發(fā)明還提供了上述的宿主細(xì)胞在制備含有重組人內(nèi)皮抑素基因的重組載體中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種抗腫瘤注射劑，該注射劑是由上述的重組人內(nèi)皮抑素多肽添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。
本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供一種抗腫瘤注射劑，該注射劑是由上述的重組載體添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。
進(jìn)一步的，上述的抗腫瘤注射劑是上述重組人內(nèi)皮抑素腺病毒添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。
再進(jìn)一步的，每毫升的上述抗腫瘤注射劑含有1×109-9×1011IU重組人內(nèi)皮抑素腺病毒和10-25mg蔗糖，pH值為7.5-8.5。
更進(jìn)一步的，上述的重組人內(nèi)皮抑素腺病毒是復(fù)制缺陷型的腺病毒。
根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，以RT-PCR方法從人正常肝組織的總RNA中擴(kuò)增人內(nèi)皮抑素cDNA；然后將人內(nèi)皮抑素編碼序列和克隆載體pUC18構(gòu)建成pUC18-endo；分別合成序列為SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的PCR引物；以pUC18-endo為模板，用步驟1所述的PCR引物擴(kuò)增本發(fā)明含IL-2基因信號(hào)肽的重組人內(nèi)皮抑素基因。
根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，能將本發(fā)明提供的重組人內(nèi)皮抑素基因構(gòu)建入各種常用的真核和原核載體以進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，可通過(guò)下列方法制備本發(fā)明重組載體將克隆到的重組人內(nèi)皮抑素基因構(gòu)建入pAdenoVator-CMV5穿梭載體，再與包含腺病毒基因組的質(zhì)粒pAdenoVatorΔE1E3共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，篩選出重組子，再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，篩選出重組腺病毒。
根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，可將本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞以擴(kuò)增該重組載體或者用于大量分泌表達(dá)重組人內(nèi)皮抑素多肽。
根據(jù)本發(fā)明的第五個(gè)方面，可將本發(fā)明提供的重組人內(nèi)皮抑素多肽添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備成注射劑，該注射劑能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。
根據(jù)本發(fā)明的第六個(gè)方面，可將本發(fā)明提供的重組載體添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備成注射劑，該注射劑能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。而該注射劑可以通過(guò)以下方法制備得到無(wú)菌條件下取注射用水，再加入原料重組人內(nèi)皮抑素腺病毒1×109-9×1011IU/ml和蔗糖10～25mg/ml，在無(wú)菌條件下混合均勻，加緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.5-8.5后無(wú)菌過(guò)濾分裝成注射劑，低溫保存。
特別需要說(shuō)明的是，以上生產(chǎn)和操作本發(fā)明公開(kāi)的重組基因、重組多肽、重組載體和抗腫瘤注射劑的具體技術(shù)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可按照已描述的技術(shù)完成。
本發(fā)明重組人內(nèi)皮抑素基因能夠?qū)崿F(xiàn)重組人內(nèi)皮抑素多肽的分泌表達(dá)，含有該重組人內(nèi)皮抑素基因的重組腺病毒能在感染真核細(xì)胞后使其大量穩(wěn)定的分泌表達(dá)高活性的重組人內(nèi)皮抑素多肽，在體外可以有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移。由本發(fā)明重組腺病毒制備成的抗腫瘤注射劑，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染進(jìn)腫瘤細(xì)胞后能夠使機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)高水平的人內(nèi)皮抑素并保持完整的生物活性，能有效抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。本發(fā)明抗腫瘤注射劑可以彌補(bǔ)蛋白輸注的藥物昂貴、體內(nèi)穩(wěn)定性差等缺陷，能增大給藥時(shí)間的間隔、大大減少給藥量、減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)并提高患者的生活質(zhì)量，具有很好的市場(chǎng)前景。


圖1RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖譜(1％Agarose電泳)，其中M為1kb DNA Iadder(GBICO)，C表示陰性對(duì)照，1表示加1ul模板RNA，2表示加2ul模板RNA。
圖2 PCR產(chǎn)物的電泳圖譜(1％Agarose電泳)，其中M為1OObp DNA Iadder(GBICO)，1pUC18-endo為模板圖3pAd-endo的酶切鑒定結(jié)果(Pac I)(1％Agarose電泳)，其中M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3、4、6、10、11、15分別為篩選出的單克隆的編號(hào)圖4PCR擴(kuò)增鑒定重組腺病毒(P1+P2)(1％Agarose電泳)其中，M為100bp PCR MolecularRuler(Bio-Rad)，C為陽(yáng)性對(duì)照(pAd-endo)，1-6分別表示1-6號(hào)空斑。
圖5PCR擴(kuò)增鑒定重組腺病毒(P3+P4)(1％Agarose電泳)，其中M表示100bp PCRMolecular Ruler(Bio-Rad)；C1表示陰性對(duì)照(pAdenoVator-endo)；C2表示陽(yáng)性對(duì)照(pAd-endo)；1-6分別表示1-6號(hào)空斑圖6不同細(xì)胞株的Western Blot鑒定結(jié)果，其中細(xì)胞系(cell line)A549為人肺癌細(xì)胞株A549、HeLa為人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、HepG2為人肝癌細(xì)胞株HepG2、COS-7為非洲綠猴腎細(xì)胞COS-7，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖7 體外內(nèi)皮細(xì)胞(HU-VEC)抑制實(shí)驗(yàn)，其中NS為對(duì)照組，ADE為重組樣品組，ADC為空載病毒組(Ad-Null)。
圖8(圖中的縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)應(yīng)該為中文)腫瘤生長(zhǎng)的抑制曲線(xiàn)，其中NS為空白對(duì)照組，ADC為腺病毒空載體組(Ad-Null)(1×109IU/只)、ADE1為重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組(5×108IU/只)、ADE2為重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組(1×109IU/只)、ADE3為重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組(5×109IU/只)。
圖9對(duì)照組、空載體組及Ad-E2組的荷瘤小鼠(A)及剝離出的腫瘤(B)照片，其中a為對(duì)照組，b為空載體組，c為ADE2(重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組1×109IU/只)。
圖10肺部轉(zhuǎn)移腫瘤計(jì)數(shù)結(jié)果，其中NS為空白對(duì)照組，ADC為腺病毒空載體組(Ad-Null)(1×109pfu/只)、ADE1為重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組(5×108IU/只)、ADE2為重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組(1×109IU/只)、ADE3為重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組(5×109IU/只)。
以下結(jié)合附圖通過(guò)具體實(shí)施方式
的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進(jìn)，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人內(nèi)皮抑素基因的制備本實(shí)施例用RT-PCR方法從人肝臟的總RNA中擴(kuò)增人內(nèi)皮抑素cDNA片段。
根據(jù)人內(nèi)皮抑素基因序列設(shè)計(jì)并合成RT-PCR引物，為了能將PCR產(chǎn)物直接插入克隆載體-pUC18(購(gòu)自Invitrogen公司)，在5’引物和3’引物中均設(shè)計(jì)入BaMH I酶切位點(diǎn)，引物序列如下5’引物5’CGG GAT CCA CAG CCA CCG CGA CTT CCA GCC 3’3’引物5’GCG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC 3’RT-PCR條件如下
RT-PCR反應(yīng)混合物在50℃變性30分鐘后，按下列條件進(jìn)行反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)94℃變性30秒；50℃退火30秒；68℃延伸1分鐘。反應(yīng)10個(gè)循環(huán)。
PCR反應(yīng)94℃變性30秒；52℃退火30秒；68℃延伸1分鐘。反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。然后68℃再延伸12分鐘。
反應(yīng)完成后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，結(jié)果表明擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的570bp左右的DNA片段(見(jiàn)圖1)。經(jīng)測(cè)序，表明所得到重組質(zhì)粒中的目的基因與發(fā)表的人內(nèi)皮抑素基因序列完全一致。
實(shí)施例2含人IL-2基因信號(hào)肽編碼的人內(nèi)皮抑素基因的制備參考人IL-2的cDNA序列(GI28178860)，設(shè)計(jì)并合成PCR引物如下5’引物5’CGG ATC CAT GTA CAG GAT GCA ACT CCT GTC TTG CAT TGCACT AAG TCT TGC ACT TGT CAC GAA TTC GGC CCA CAG CCA CCG CGA CTTCCA GCC 3’3’引物5’GCG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC 3’在5’引物和3’引物中均設(shè)計(jì)入BamH I酶切位點(diǎn)，直接插入穿梭載體pAdenovator-CMV5；其中5’引物的斜體部分為人IL-2的信號(hào)肽序列。
然后以pUC18-endo為模板擴(kuò)增含IL-2基因信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素DNA片段，PCR條件如下94℃變性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸30秒。反應(yīng)30個(gè)循環(huán)。然后72℃再延伸12分鐘。
反應(yīng)完成后，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物(結(jié)果見(jiàn)圖2)，得到了預(yù)計(jì)大小(630bp左右)的DNA片段。按產(chǎn)品操作手冊(cè)將其插入穿梭質(zhì)粒pAdenoVator-CMV5(購(gòu)自Qbiogene公司)，測(cè)序結(jié)果表明所得到含IL-2基因信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素DNA片段與預(yù)計(jì)的完全一致。
實(shí)施例3重組腺病毒的構(gòu)建及篩選1、將克隆到的包含人IL-2信號(hào)肽的人內(nèi)皮抑素基因構(gòu)建入pAdenoVator-CMV5穿梭載體后，再與包含腺病毒基因組(E1，E3缺失)的環(huán)狀質(zhì)粒pAdenoVatorΔE1E3(購(gòu)自Qbiogene公司)用常規(guī)的電穿孔方法共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183(購(gòu)自Qbiogene公司)，篩選重組子-pAd-endo，進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明分別篩選到了具有兩種重組位點(diǎn)的重組子pAd-endo(1)和pAd-endo(3)(見(jiàn)圖3)。其中同源重組位點(diǎn)位于左臂的切出3.0kb的片段，重組位點(diǎn)位于復(fù)制子的切出大小為4.5kb的片段。
2、使用常規(guī)共轉(zhuǎn)染方法將線(xiàn)性化的重組質(zhì)粒pAd-endo與脂質(zhì)體Lipofectamine(購(gòu)自Invitrogen公司)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)，篩選重組腺病毒Ad-E。14天后，挑取6個(gè)邊界清晰，與其它空斑分隔較開(kāi)的空斑，進(jìn)行擴(kuò)增。
3、抽提腺病毒DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增人內(nèi)皮抑素DNA片段鑒定是否為重組腺病毒，同時(shí)鑒定腺病毒特征性的E2B區(qū)片段。
其中，擴(kuò)增人內(nèi)皮抑素DNA片段的引物為5’引物(P1)5’CGG GAT CCA TGT ACA GGA TGC AAC TCC TG 3’3’引物(P2)5’GCG GAT CCT ACT TGG AGG CAG TCA TGA AGC 3’擴(kuò)增腺病毒特異性的E2B區(qū)的引物為5’引物(P3)5’TCG TTT CTC AGC AGC TGT TG 3’3’引物(P4)5’CAT CTG AAC TCA AAG GGT GG 3’經(jīng)鑒定，挑取的空斑均插入人內(nèi)皮抑素(630bp左右的條帶，見(jiàn)圖4)；挑取的空斑均擴(kuò)增出腺病毒E2B陽(yáng)性條帶(860bp左右，見(jiàn)圖5)。
4、用篩選到的病毒感染A549細(xì)胞，取培養(yǎng)上清用常規(guī)ELISA方法鑒定人內(nèi)皮抑素的表達(dá)情況，表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2各空斑內(nèi)皮抑素的表達(dá)情況

從測(cè)定結(jié)果看來(lái)，pAd-endo(1)各個(gè)克隆的表達(dá)均略高于pAd-endo(3)，說(shuō)明同源重組位點(diǎn)位于左臂的更有利于內(nèi)皮抑素基因的表達(dá)。選擇表達(dá)最高的空斑Ad-E(1)-6#，命名為Ad-E。
實(shí)施例4重組腺病毒的擴(kuò)增和純化將Ad-E病毒種子液逐級(jí)擴(kuò)增，最終感染5×106個(gè)293細(xì)胞，培養(yǎng)48～72小時(shí)直至出現(xiàn)完全CPE，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞沉淀重懸于100ml含5％FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基，-20℃/37℃反復(fù)凍融三次，離心去細(xì)胞碎片，上清即為病毒裂解液，備用。
采用常規(guī)兩步CsCl密度梯度超離心法純化Ad-E，第一步采用不連續(xù)CsCl梯度去除大部分的細(xì)胞碎片以及缺陷的病毒顆粒(即不具備感染活性的病毒顆粒)，第二步采用連續(xù)CsCl密度梯度徹底將具備感染活性的病毒顆粒與缺陷的病毒顆粒區(qū)分開(kāi)，最后再通過(guò)透析脫鹽，去除CsCl，得到重組人內(nèi)皮抑素腺病毒-Ad-E。實(shí)施例5重組腺病毒Ad-E對(duì)不同細(xì)胞的感染活性及Western Blot鑒定分別將人肺癌細(xì)胞株A549、人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、人肝癌細(xì)胞株HepG2、非洲綠猴腎細(xì)胞COS-7(購(gòu)自ATCC)接種于6孔板，將實(shí)施例4所得的重組人內(nèi)皮抑素腺病毒以不同的MOI值(multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù))0，5，10，20，40，80進(jìn)行感染，培養(yǎng)48小時(shí)后，取上清液用試劑盒(購(gòu)自Chemicon)檢測(cè)內(nèi)皮抑素的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3不同細(xì)胞感染不同量的Ad-E的表達(dá)情況

結(jié)果表明，重組腺病毒Ad-E能感染包括肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等多種細(xì)胞類(lèi)型，表達(dá)并分泌人內(nèi)皮抑素，說(shuō)明Ad-E具有較廣譜的感染范圍及較高的表達(dá)活性。
同時(shí)以羊抗人內(nèi)皮抑素抗體(1∶250)(購(gòu)自R&D Systems)為一抗、HRP-Protein A(購(gòu)自Bio-Rad)為二抗(1∶3000)，用常規(guī)Western Blot法進(jìn)一步鑒定表達(dá)產(chǎn)物是否與預(yù)計(jì)的相同。
結(jié)果表明結(jié)果見(jiàn)圖6，四種不同的細(xì)胞株中均特異地表達(dá)人內(nèi)皮抑素蛋白，雜交條帶與預(yù)計(jì)的一致(20kDa左右)。
實(shí)施例6重組人內(nèi)皮抑素腺病毒抗腫瘤注射劑的制備在無(wú)菌條件下取500ml注射用水，加入實(shí)施例4所得的重組人內(nèi)皮抑素腺病毒Ad-E(1×1013IU)、Tris0.484g、MgCl20.076g、蔗糖16g，混合均勻，再加注射用水至總體積1000ml，同時(shí)用HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0。無(wú)菌過(guò)濾后分裝成1ml/支的重組腺病毒Ad-E注射劑，于-20℃保存。
以下通過(guò)試驗(yàn)例的方式對(duì)本發(fā)明的有益效果做進(jìn)一步詳述，但不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)驗(yàn)例1重組腺病毒Ad-E的體外活性測(cè)定——抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖1、實(shí)驗(yàn)方法從新鮮胎兒臍帶(由四川大學(xué)第二醫(yī)院提供)中分離培養(yǎng)HU-VEC細(xì)胞，按5000個(gè)/孔接種于明膠包被的96孔板，分別加入20μl倍半稀釋的Ad-E和Ad-Null(空載腺病毒)的感染上清液，再加入80μl M199培養(yǎng)液(含5％FBS，3ng/ml bFGF)培養(yǎng)；培養(yǎng)72小時(shí)后每孔加入MTT至終濃度0.5mg/ml，37℃孵育4小時(shí)；吸出上清，加入二甲亞砜(DMSO)100μl，室溫振搖5-10分鐘后，在酶標(biāo)儀上讀取A550nm值。
按下列公式計(jì)算內(nèi)皮抑素對(duì)HU-VEC細(xì)胞增殖的抑制率 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明(見(jiàn)圖7)內(nèi)皮抑素濃度與抑制率之間存在劑量依從性，在1∶8稀釋濃度時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞抑制率達(dá)到50％(ED50)；Ad-Null(ADC)感染上清則無(wú)抑制效應(yīng)。這說(shuō)明了Ad-E表達(dá)的內(nèi)皮抑素在體外的確可以顯著地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
實(shí)驗(yàn)例2.重組腺病毒Ad-E抗腫瘤注射劑的體內(nèi)活性測(cè)定——抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移1、實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)采用肺癌模型對(duì)實(shí)施例6制備的抗腫瘤注射劑抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的效果進(jìn)行測(cè)定。
選取50只生長(zhǎng)健壯的雌性裸鼠(6-8周齡裸鼠(16-20g)，購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，每只接種8×106A549/100μl于腋下，直至腫瘤直徑長(zhǎng)至2～3mm，隨機(jī)分為5組，分別為空白對(duì)照組(NS)、腺病毒空載體組(Ad-Null)(1×109IU/只)、重組人內(nèi)皮抑素腺病毒組ADE-1(5×1O8IU/只)、ADE-2(1×109IU/只)、ADE-3(5×109IU/只)。每組分別于腫瘤內(nèi)多點(diǎn)注射Ad-E注射劑或?qū)φ赵噭?，共四?治療第0、5、10，15天)。每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、寬，腫瘤體積按以下方法計(jì)算體積(mm3)＝O.52×長(zhǎng)(length)×寬2(width2)。腫瘤生長(zhǎng)抑制用方差分析，P＜O.05則認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
觀(guān)察四個(gè)月結(jié)束后，取腫瘤組織及器官，稱(chēng)取腫瘤重量及肺濕重，計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。
2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果a、實(shí)驗(yàn)期間各組均未觀(guān)察到明顯的毒副反應(yīng)。在給藥兩周內(nèi)治療組Ad-E腫瘤生長(zhǎng)減慢甚至縮小，而Ad-Null及對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)較快，且沒(méi)有明顯差異；觀(guān)察四個(gè)月后治療組中腫瘤抑制率均大于40％(P＜0.05)(見(jiàn)圖8)。圖9顯示了三個(gè)不同組——對(duì)照組、空載體組及Ad-E2治療組的荷瘤小鼠及腫瘤的情況對(duì)比。
b、同時(shí)，對(duì)照組中有全身淋巴結(jié)及肝、脾、肺轉(zhuǎn)移。治療組間腫瘤體積無(wú)顯著性差異，但對(duì)照組肺轉(zhuǎn)移率(＞70％)明顯高于治療組(＜40％)(P＜0.05)；對(duì)照組肺濕重及肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)多于治療組(P＜0.05)。肺轉(zhuǎn)移數(shù)與治療劑量呈負(fù)相關(guān)(圖10)，其中ADE3組發(fā)生肺轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)最少(P＜0.05)。
以上結(jié)果表明，在人肺癌模型中Ad-E能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。
綜上，由本發(fā)明重組人內(nèi)皮抑素基因構(gòu)建的重組腺病毒能感染多種腫瘤細(xì)胞，并大量穩(wěn)定地分泌表達(dá)高活性的重組人內(nèi)皮抑素多肽，在體外可以有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移。由本發(fā)明重組腺病毒制備的抗腫瘤注射劑，能使機(jī)體持續(xù)高水平的表達(dá)具有完整生物活性的重組人內(nèi)皮抑素多肽，從而能在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。在以上實(shí)例中每5天注射一次都能有很好的抗腫瘤效果，這增大給藥時(shí)間的間隔、彌補(bǔ)了蛋白輸注人內(nèi)皮抑素藥物體內(nèi)穩(wěn)定性差、有效濃度持續(xù)時(shí)間十分短暫(僅為10多個(gè)小時(shí))的局限，能大大減少給藥量、降低用藥成本、減輕患者負(fù)擔(dān)，同時(shí)還提高了患者的生活質(zhì)量，具有很好的市場(chǎng)前景。
同時(shí)由本領(lǐng)域常識(shí)可知，若有不同的要求，本發(fā)明的抗腫瘤注射劑中重組腺病毒的用量可以在一個(gè)較大范圍內(nèi)變動(dòng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)一些已知的因素，諸如疾病的種類(lèi)，病情嚴(yán)重程度，病人體重，劑型，所選用藥途徑等很容易地加以確定。
以上的較優(yōu)的具體實(shí)施方式
是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的舉例說(shuō)明，但并非對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以作出各種變型或改進(jìn)，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的精神及所附上的權(quán)利要求書(shū)定義的范圍之內(nèi)。
一種重組人內(nèi)皮抑素腺病毒及其制備方法和用途.ST25.txtSEQUENCE LISTING<110>四川大學(xué)成都恩多施生物工程技術(shù)有限公司<120>一種重組人內(nèi)皮抑素腺病毒及其制備方法和用途<130>3408<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>615<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>重組人內(nèi)皮抑素基因<400>1atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcg 60gcccacagcc accgcgactt ccagccggtg ctccacctgg ttgcgctcaa cagccccctg 120tcaggcggca tgcggggcat ccgcggggcc gacttccagt gcttccagca ggcgcgggcc 180gtggggctgg cgggcacctt ccgcgccttc ctgtcctcgc gcctgcagga cctgtacagc 240atcgtgcgcc gtgccgaccg cgcagccgtg cccatcgtca acctcaagga cgagctgctg 300tttcccagct gggaggctct gttctcaggc tctgagggtc cgctgaagcc cggggcacgc 360atcttctcct ttgacggcaa ggacgtcctg aggcacccca cctggcccca gaagagcgtg 420tggcatggct cggaccccaa cgggcgcagg ctgaccgaga gctactgtga gacgtggcgg 480acggaggctc cctcggccac gggccaggcc tcctcgctgc tggggggcag gctcctgggg 540cagagtgccg cgagctgcca tcacgcctac atcgtgctct gcattgagaa cagcttcatg 600actgcctcca agtag 615<210>2<211>93<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>5’引物<400>2cggatccatg tacaggatgc aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg cacttgtcac 60gaattcggcc cacagccacc gcgacttcca gcc 93<210>3<211>30<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>3’引物<400>3gcggatccta cttggaggca gtcatgaagc 30
權(quán)利要求
1.一種重組人內(nèi)皮抑素基因，其特征在于該重組人內(nèi)皮抑素基因是由IL-2基因信號(hào)肽序列的3’端與人內(nèi)皮抑素編碼序列的5’端連接而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人內(nèi)皮抑素基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.一種重組內(nèi)皮抑素多肽，其特征在于它是由權(quán)利要求1或2所述的重組人內(nèi)皮抑素基因編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組內(nèi)皮抑素多肽，其特征在于它是由權(quán)利要求1或2所述的重組人內(nèi)皮抑素基因編碼并在真核細(xì)胞中表達(dá)得到。
5.一種重組載體，其特征在于含有如權(quán)利要求1或2所述的重組人內(nèi)皮抑素基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于所述的載體為腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述的腺病毒為復(fù)制缺陷型腺病毒。
8.一種含有權(quán)利要求1或2所述重組人內(nèi)皮抑素基因的宿主細(xì)胞。
9.一種含有權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述重組載體的宿主細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
11.一種抗腫瘤注射劑，其特征在于它是由權(quán)利要求3或4所述的重組人內(nèi)皮抑素多肽添加藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的。
12.一種抗腫瘤注射劑，其特征在于它是由權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的重組載體添加藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成的注射劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗腫瘤注射劑，其特征在于每毫升含有1×109-9×1011IU重組人內(nèi)皮抑素腺病毒和10-25mg蔗糖，pH值為7.5-8.5。
14.一種制備權(quán)利要求1所述的重組人內(nèi)皮抑素基因的方法，其特征在于包括以下步驟a、分別合成如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的PCR引物；b、將人內(nèi)皮抑素編碼序列和克隆載體pUC18構(gòu)建成pUC18-endo；c、以pUC18-endo為模板，用步驟a合成的PCR引物擴(kuò)增含IL-2基因信號(hào)肽的重組人內(nèi)皮抑素基因。
15.一種制備權(quán)利要求5所述重組載體的方法，其特征在于包括以下步驟a、將本發(fā)明重組人內(nèi)皮抑素基因構(gòu)建入pAdenoVator-CMV5穿梭載體；b、將步驟a所得載體與包含腺病毒基因組的質(zhì)粒pAdenoVatorΔE1E3共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出重組子；c、將b步驟所得重組子再轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，擴(kuò)增制備重組腺病毒。
16.一種制備權(quán)利要求13所述的抗腫瘤注射劑的方法，其特征在于包括以下步驟a、在無(wú)菌條件下取注射用水，再按以下配比加入原料重組人內(nèi)皮抑素腺病毒1×109-9×1011IU/ml、蔗糖10～25mg/ml；b、在無(wú)菌條件下將步驟a產(chǎn)物混合均勻，加緩沖液調(diào)節(jié)pH值至7.5-8.5；c、將步驟b產(chǎn)物無(wú)菌過(guò)濾后分裝成注射劑，低溫保存。
17.權(quán)利要求3或4所述的重組人內(nèi)皮抑素多肽在制備抗腫瘤藥物組合物中的應(yīng)用。
18.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的重組載體在制備抗腫瘤藥物組合物中的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求8或9所述的宿主細(xì)胞在制備含重組人內(nèi)皮抑素基因的重組載體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將IL－2基因信號(hào)肽序列的3’端與人內(nèi)皮抑素編碼序列的5’端連接而成的新的重組人內(nèi)皮抑素(endostatin)基因。并用該重組基因構(gòu)建入腺病毒，將這種重組腺病毒制備成抗腫瘤注射劑。使用本發(fā)明提供的抗腫瘤注射劑，可以在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，并且能使機(jī)體持續(xù)表達(dá)高水平的人內(nèi)皮抑素并保持完整的生物活性，可以彌補(bǔ)蛋白輸注的藥物昂貴、體內(nèi)穩(wěn)定性差等局限，能降低用藥成本、提高患者的生活質(zhì)量，具有很好的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1935999SQ200510021720
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者魏于全, 楊莉 申請(qǐng)人:四川大學(xué), 成都恩多施生物工程技術(shù)有限公司