專(zhuān)利名稱(chēng)：利用藥用真菌長(zhǎng)根菇生產(chǎn)胞外多糖的液體深層發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，是利用生物體的培養(yǎng)、發(fā)酵而制備已知的，或新的生物體，或其代謝物的技術(shù)。具體涉及一種利用藥用真菌長(zhǎng)根菇生產(chǎn)胞外多糖的液體深層發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)根菇(Oudemansiella radicata)，別名長(zhǎng)根小奧德蘑、大毛草菌、長(zhǎng)根金錢(qián)菌等。隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、傘菌目、白蘑科、小奧德蘑屬。長(zhǎng)根菇是食用中的上品，內(nèi)質(zhì)細(xì)嫩、柄脆可口，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素和微量元素成份，食用價(jià)值高，為上乘的珍稀食藥用真菌。日本學(xué)者大硺重逺等人1977年研究證實(shí)長(zhǎng)根菇多糖對(duì)小白鼠肉瘤S-180有明顯抑制作用，抑制率達(dá)95％以上，艾氏腹水癌達(dá)90％，并能提高肌體免疫功能，具有很高的藥用價(jià)值。
長(zhǎng)根菇是近幾年在國(guó)內(nèi)引進(jìn)栽培的新型藥用真菌，目前處于栽培試驗(yàn)及推廣階段，由于固體栽培存在周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、氣候影響等缺點(diǎn)，限制其大規(guī)模開(kāi)發(fā)使用，而采用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)是目前深度開(kāi)發(fā)藥用真菌活性多糖資源新的生產(chǎn)方法，并已成功的在靈芝、香菇、灰樹(shù)花、姬松茸等珍稀藥用菌實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，國(guó)內(nèi)外對(duì)長(zhǎng)根菇液體深層發(fā)酵技術(shù)的研究起步較晚，特別是在反應(yīng)器上對(duì)長(zhǎng)根菇發(fā)酵生產(chǎn)活性多糖的工程學(xué)研究方面，目前還尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的主要是從工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，對(duì)長(zhǎng)根菇發(fā)酵影響的培養(yǎng)基和工藝條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，篩選得到能降低工業(yè)生產(chǎn)成本的最適培養(yǎng)基成分及工藝條件，提出在7L發(fā)酵罐水平長(zhǎng)根菇液體深層發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵工藝。
以下用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)解決方案菌種本發(fā)明使用的菌種是長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心。
長(zhǎng)根菇菌種鑒定孢子無(wú)色，光滑，卵圓形至寬圓形，13～18μm×10～15μm。囊體近梭形，75～175μm×10～29μm。褶緣囊體無(wú)色，近梭形，頂端稍鈍，87～100μm×10～25μm，鑒定依據(jù)(卯曉嵐主編中國(guó)經(jīng)濟(jì)真菌，1998年2月，第1版)本發(fā)明工藝的總體流程包括斜面菌種培養(yǎng)→搖瓶種子培養(yǎng)→7L發(fā)酵罐培養(yǎng)→多糖提取測(cè)定1、斜面菌種培養(yǎng)以PDA培養(yǎng)基加5％的麩皮汁，在試管內(nèi)培養(yǎng)斜面菌種，培養(yǎng)溫度25-30℃，培養(yǎng)時(shí)間7-10天，pH 6.5-7.0。
2、搖瓶種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基(g/L)玉米粉10-30，蛋白胨2-5，黃豆餅粉3-5，蔗糖10-30，KH2PO42-4，MgSO4·7H2O 1-3，VB10.1-0.3培養(yǎng)條件將以活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種2-3塊于液體種子培養(yǎng)基，于500ml三角瓶裝液量100ml，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160-200rev/min，培養(yǎng)溫度26-30℃，pH 6.3-6.8，培養(yǎng)時(shí)間7-10天。
3、7L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)玉米粉10-40、黃豆餅粉2-5、KH2PO42-4、MgSO4·7H2O 1-3、棕櫚酸0-3、VB10.1-0.3，pH 6.0-6.5；培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按10％(v/v)的接種量接入裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的全自動(dòng)7L發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH-7BGZ)中，攪拌轉(zhuǎn)速160-300rev/min，發(fā)酵溫度26-30℃，通氣量3L/min，發(fā)酵過(guò)程溶解氧(DO)值由溶氧電極在線檢測(cè)。發(fā)酵時(shí)間至108-115小時(shí)時(shí)，溶解氧下降至35-40％，即可終止發(fā)酵。
在上述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0-3g/L的棕櫚酸有利于長(zhǎng)根菇菌絲體生長(zhǎng)和促進(jìn)長(zhǎng)根菇胞外多糖的合成，最佳添加濃度為1.5g/L，胞外多糖比未添加時(shí)提高30-40％。
發(fā)酵過(guò)程溶解氧消耗速率變化與胞外多糖合成速率變化趨于一致，胞外多糖合成量在110小時(shí)左右達(dá)最大值(2.80-2.87g/l)時(shí)，溶解氧下降到最低值(35％左右)，113小時(shí)之后胞外多糖合成量降低，溶解氧開(kāi)始上升，因此可以在線溶解氧濃度為控制策略，快速判定發(fā)酵過(guò)程是否結(jié)束，當(dāng)下降到最低值恒定時(shí)，即可終止發(fā)酵，此為最佳發(fā)酵周期，長(zhǎng)根菇胞外多糖產(chǎn)量也達(dá)最大值。
4、胞外多糖提取及測(cè)定將發(fā)酵液離心得上清液，向上清液中加入95％乙醇到濃度60％，4℃冰箱過(guò)夜，離心得胞外粗多糖，洗滌后蒸餾水溶解，用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供基于7L發(fā)酵罐水平，利用藥用真菌長(zhǎng)根菇生產(chǎn)胞外多糖液體深層發(fā)酵工藝，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，優(yōu)化篩選得到有利于降低工業(yè)生產(chǎn)成本的廉價(jià)原料玉米粉、黃豆餅粉為主要發(fā)酵原料，并發(fā)現(xiàn)、獲得能顯著提高長(zhǎng)根菇胞外多糖產(chǎn)量達(dá)30-40％的棕櫚酸為關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)添加因子，發(fā)酵過(guò)程以在線溶解氧濃度變化為控制策略，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵時(shí)工藝操作控制簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，從而有利于進(jìn)一步工業(yè)化放大及推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(添加棕櫚酸，發(fā)酵控制時(shí)間110小時(shí))菌種長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心。
(1)試管斜面培養(yǎng)在試管內(nèi)培養(yǎng)斜面菌種培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基加5％(重量百分比)的麩皮汁培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)時(shí)間8天，pH 6.7。
(3)搖瓶種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(g/L)玉米粉10，蛋白胨2，黃豆餅粉3，蔗糖20，KH2PO42，MgSO4·7H2O 2，VB10.1；培養(yǎng)條件將以活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種2-3塊于液體種子培養(yǎng)基，500ml三角瓶裝液量100ml，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180rev/min，培養(yǎng)溫度26℃，pH 6.5，培養(yǎng)時(shí)間7天。
(4)7L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)玉米粉20、黃豆餅粉3、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、棕櫚酸1.5、VB10.1mg，pH 6.2；培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按10％(v/v)的接種量接入裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的全自動(dòng)7L發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH-7BGZ)中，攪拌轉(zhuǎn)速180rev/min，發(fā)酵溫度26℃，通氣量3L/min，發(fā)酵過(guò)程溶解氧(DO)值由溶氧電極在線檢測(cè)。發(fā)酵時(shí)間至110小時(shí)左右時(shí)，溶解氧下降至35％左右，結(jié)束發(fā)酵，胞外多糖測(cè)定2.80-2.87g/L。
實(shí)施例2(不添加棕櫚酸工藝，發(fā)酵控制時(shí)間110小時(shí))菌種長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心。
(1)試管斜面培養(yǎng)在試管內(nèi)培養(yǎng)斜面菌種，培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基加5％(重量百分比)的麩皮汁培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間10天，pH 6.7。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(g/L)玉米粉20，蛋白胨2，黃豆餅粉3，蔗糖20，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1，VB10.1。
培養(yǎng)條件將以活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種2-3塊于液體種子培養(yǎng)基，500ml三角瓶裝液量100ml，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rev/min，培養(yǎng)溫度26℃，pH 6.5，培養(yǎng)時(shí)間7天。
(3)7L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)玉米粉20、黃豆餅粉4、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、VB10.1，pH 6.0；培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按10％(v/v)的接種量接入裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的全自動(dòng)7L發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH-7BGZ)中，攪拌轉(zhuǎn)速200rev/min，發(fā)酵溫度26℃，通氣量3L/min，發(fā)酵過(guò)程溶解氧(DO)值由溶氧電極在線檢測(cè)。發(fā)酵時(shí)間至110小時(shí)左右時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，此時(shí)胞外多糖含量2.1-2.2g/L。
實(shí)施例3(添加棕櫚酸，發(fā)酵控制時(shí)間為113小時(shí))菌種長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心。
(1)試管斜面培養(yǎng)在試管內(nèi)培養(yǎng)斜面菌種培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基加5％(重量百分比)的麩皮汁培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)時(shí)間8天，pH 6.5。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(g/L)玉米粉10，蛋白胨2，黃豆餅粉3，蔗糖20，KH2PO42，MgSO4·7H2O1，VB10.1；培養(yǎng)條件將以活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種2-3塊于液體種子培養(yǎng)基，500ml三角瓶裝液量100ml，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rev/min，培養(yǎng)溫度26℃，pH 6.5，培養(yǎng)時(shí)間8天。
(3)7L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)玉米粉20、黃豆餅粉3、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、棕櫚酸1.5、VB10.1，pH 6.0。
培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按10％(v/v)的接種量接入裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的全自動(dòng)7L發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH-7BGZ)中，攪拌轉(zhuǎn)速180rev/min，發(fā)酵溫度26℃，通氣量3L/min，發(fā)酵過(guò)程溶解氧(DO)值由溶氧電極在線檢測(cè)。發(fā)酵時(shí)間至113小時(shí)左右時(shí)，溶解氧下降至38％左右，結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定胞外多糖含量為2.76-2.84g/L。
實(shí)施例4菌種長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心。
(1)試管斜面培養(yǎng)在試管內(nèi)培養(yǎng)斜面菌種培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基加5％(重量百分比)的麩皮汁培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)時(shí)間8天，pH 6.8。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(g/L)玉米粉20，蛋白胨2，黃豆餅粉4，蔗糖20，KH2PO44，MgSO4·7H2O2，VB10.1；培養(yǎng)條件將以活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種2-3塊于液體種子培養(yǎng)基，500ml三角瓶裝液量100ml，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rev/min，培養(yǎng)溫度28℃，pH 6.5，培養(yǎng)時(shí)間8天。
(3)7L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)玉米粉30、黃豆餅粉4、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、棕櫚酸1.5、VB10.1，pH 6.5。
培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按10％(v/v)的接種量接入裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的全自動(dòng)7L發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH-7BGZ)中，攪拌轉(zhuǎn)速180rev/min，發(fā)酵溫度26℃，通氣量3L/min，發(fā)酵過(guò)程溶解氧(DO)值由溶氧電極在線檢測(cè)。發(fā)酵時(shí)間至110小時(shí)左右時(shí)，溶解氧下降至35％左右，結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定胞外多糖含量為2.65-2.80g/L。
實(shí)施例5菌種長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心。
(1)試管斜面培養(yǎng)在試管內(nèi)培養(yǎng)斜面菌種培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基加5％(重量百分比)的麩皮汁培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)時(shí)間8天，pH 6.7。
(2)搖瓶種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基(g/L)玉米粉20，蛋白胨3，黃豆餅粉3，蔗糖10，KH2PO42，MgSO4·7H2O1，VB10.1；培養(yǎng)條件將以活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種2-3塊于液體種子培養(yǎng)基，500ml三角瓶裝液量100ml，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速180rev/min，培養(yǎng)溫度28℃，pH 6.5，培養(yǎng)時(shí)間9天。
(3)7L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)玉米粉40、黃豆餅粉3、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、棕櫚酸1.5、VB10.1，pH 6.5。
培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按10％(v/v)的接種量接入裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的全自動(dòng)7L發(fā)酵罐(上海保興BIOTECH-7BGZ)中，攪拌轉(zhuǎn)速180rev/min，發(fā)酵溫度28℃，通氣量3L/min，發(fā)酵過(guò)程溶解氧(DO)值由溶氧電極在線檢測(cè)。發(fā)酵時(shí)間至110小時(shí)左右時(shí)，溶解氧下降至37％左右，結(jié)束發(fā)酵，測(cè)定胞外多糖含量為2.54-2.65g/L。
權(quán)利要求
1.利用藥用真菌長(zhǎng)根菇生產(chǎn)胞外多糖的液體深層發(fā)酵工藝，菌種長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心；按以下步驟進(jìn)行(1)斜面菌種培養(yǎng)以PDA培養(yǎng)基加5％的麩皮汁，在試管內(nèi)培養(yǎng)斜面菌種，培養(yǎng)溫度25-30℃，培養(yǎng)時(shí)間7-10天，pH6.5-7.0；(2)搖瓶種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基(g/L)玉米粉10-30，蛋白胨2-5，黃豆餅粉3-5，蔗糖10-30，KH2PO42-4，MgSO4·7H2O 1-3，VB10.1-0.3；培養(yǎng)條件將已活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種2-3塊于液體種子培養(yǎng)基，于500ml三角瓶裝液量100ml，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160-200rev/min，培養(yǎng)溫度26-30℃，pH6.3-6.8，培養(yǎng)時(shí)間7-10天；(3)7L發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)玉米粉10-40、黃豆餅粉2-5、KH2PO42-4、MgSO4·7H2O1-3、棕櫚酸0-3、VB10.1-0.3，pH6.0-6.5；培養(yǎng)條件將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按10％(v/v)的接種量接入裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的全自動(dòng)7L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速160-300rev/min，發(fā)酵溫度26-30℃，通氣量3L/min，發(fā)酵過(guò)程溶解氧(DO)值由溶氧電極在線檢測(cè)，發(fā)酵時(shí)間至108-115小時(shí)時(shí)，溶解氧下降至35-40％，即可終止發(fā)酵；(4)胞外多糖提取及測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用藥用真菌長(zhǎng)根菇生產(chǎn)胞外多糖的液體深層發(fā)酵工藝，菌種為長(zhǎng)根菇1號(hào)(Oudemansiella radicata)，購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心；本發(fā)明工藝的總體流程包括斜面菌種培養(yǎng)→搖瓶種子培養(yǎng)→7L發(fā)酵罐培養(yǎng)→多糖提取測(cè)定，本發(fā)明優(yōu)化篩選得到有利于降低工業(yè)生產(chǎn)成本的廉價(jià)原料玉米粉、黃豆餅粉為主要發(fā)酵原料，并發(fā)現(xiàn)、獲得能顯著提高長(zhǎng)根菇胞外多糖產(chǎn)量達(dá)30－40％的棕櫚酸為關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)添加因子，發(fā)酵過(guò)程以在線溶解氧濃度變化為控制策略，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模發(fā)酵時(shí)工藝操作控制簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)，有利于進(jìn)一步工業(yè)化放大及推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1683547SQ20051002038
公開(kāi)日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月18日
發(fā)明者鄒祥, 胡昌華 申請(qǐng)人:西南師范大學(xué)