一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明設計生物工程領域，尤其涉及一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體，具有補虛損、益精氣、保肺、益腎、止血化痰、滋補強壯等功效。但由于過度采集，自然界中野生蟲草資源匱乏，而蟲草多糖、蟲草酸和蟲草素是冬蟲夏草的主要活性物質(zhì)，據(jù)藥理學及臨床研究表明，蟲草多糖可以增強免疫力，抗腫瘤及降血糖等功能，對于蟲草多糖的研究和生產(chǎn)，大多集中在子實體和菌絲體的提取、分離和純化，液態(tài)培養(yǎng)冬蟲夏草產(chǎn)生胞外蟲草多糖的研究較少，現(xiàn)有技術中獲得冬蟲夏草胞外多糖的方法有兩種:(I)采用常用的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)冬蟲夏草而獲得胞外多糖，但是胞外多糖產(chǎn)量較低。(2)通過改變冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵的工藝提高胞外多糖的產(chǎn)量，但是效果并不明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明的目的在于提出一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，具體包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2P04、MgS04.7H20、土豆和由組氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、維生素B2和砸組成的混合營養(yǎng)包，由組氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、維生素B2和砸組成的混合營養(yǎng)包的配比科學全面，有效的促進冬蟲夏草細胞的生長，尤其是能夠大幅提高胞外多糖的產(chǎn)量，為冬蟲夏草菌絲體和胞外多糖的大規(guī)模開發(fā)與應用提供了原料保證。
[0004]為達到上述目的，本發(fā)明可通過如下技術方案來實現(xiàn):
[0005]—種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，包括:葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、MgSO4.7H20、土豆和混合營養(yǎng)包。
[0006]優(yōu)選，一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，包括:混合營養(yǎng)包0.02%?0.15%，葡萄糖I?5%、蛋白胨I?4%、酵母粉0.5?3%、KH2P04 0.1?0.5%、MgSO4.7H20 0.1?0.5%和土豆5?40%，溶劑為水，以上組分均為質(zhì)量百分含量。
[0007]優(yōu)選，一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，包括:混合營養(yǎng)包0.04 ?0.15%，葡萄糖 3%、蛋白胨 1.5%、酵母粉0.5%、KH2P04 0.3%、MgS04.7Η20 0.15%和土豆20%，溶劑為水，以上組分均為質(zhì)量百分含量。
[0008]優(yōu)選，一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，包括:混合營養(yǎng)包0.08 ?0.15%，葡萄糖 3%、蛋白胨 1.5%、酵母粉0.5% ^KH2PO4 0.3% ^MgSO4.7Η20 0.15%和土豆20%，溶劑為水，以上組分均為質(zhì)量百分含量。
[0009]優(yōu)選，一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，包括:混合營養(yǎng)包0.04 ?0.08%，葡萄糖 3%、蛋白胨 1.5%、酵母粉0.5% ^KH2PO4 0.3% ^MgSO4.7Η20 0.15%和土豆20%，溶劑為水，以上組分均為質(zhì)量百分含量。
[0010]優(yōu)選，一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基，包括:混合營養(yǎng)包0.08%，葡萄糖 3%、蛋白胨 1.5%、酵母粉 0.5%^KH2PO4 0.3%^MgSO4.7Η20 0.15%和土豆20%，溶劑為水，以上組分均為質(zhì)量百分含量。
[0011]進一步地，混合營養(yǎng)包包括:組氨酸25-38%、賴氨酸25-38%、谷氨酰胺15-20%、維生素Β215-20%和砸1_2%，以上組分均為質(zhì)量百分含量。
[0012]優(yōu)選，混合營養(yǎng)包包括:組氨酸31.1%、賴氨酸31.1%、谷氨酰胺18.3%、維生素Β218.3%和砸1.2%，以上組分均為質(zhì)量百分含量。
[0013]—種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)冬蟲夏草獲得胞外多糖的方法依次包括以下步驟:
[0014](I)配制營養(yǎng)包；
[0015](2)配制液態(tài)培養(yǎng)基；
[0016](3)發(fā)酵培養(yǎng):配制的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入容量為IL的發(fā)酵罐，滅菌，在無菌條件下將菌種接種到液體培養(yǎng)基，于24°C及150r/min條件下恒溫培養(yǎng)；
[0017](4)發(fā)酵結束后用顯微鏡觀察發(fā)酵液中菌絲體生長情況，并將發(fā)酵液接種到營養(yǎng)瓊脂平板上來檢查其是否染菌；
[0018](5)將在步驟(3)中檢測到的未被染菌的發(fā)酵液在4000r/min條件下離心20min得到小球形式的發(fā)酵菌絲體，然后將菌絲體和上清液進行冷凍干燥并儲存在_18°C的冰箱里備用；
[0019](6)將步驟(4)中離心得到的上清液減壓濃縮或常壓蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度不超過100°C，得到粘稠狀液體；
[0020](7)將步驟(5)經(jīng)濃縮得到的粘稠狀液體加入兩倍體積的95%的乙醇進行醇析，其醇析時間不低于24小時，得到白色纖維狀沉淀；
[0021](8)將經(jīng)醇析得到的白色纖維狀沉淀物用75%的乙醇洗滌并離心，重復數(shù)次，最后將經(jīng)過數(shù)次洗滌、離心而得到的沉淀物在60°C烘干，得灰白色粗多糖，并測定胞外多糖的含量。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
[0023](I)本發(fā)明特制的液態(tài)培養(yǎng)基是專門用于生產(chǎn)冬蟲夏草胞外多糖的培養(yǎng)基，其中包含一個混合營養(yǎng)包，可促進冬蟲夏草細胞的生長，尤其是大幅提高胞外多糖的產(chǎn)量，冬蟲夏草胞外多糖含量達8.08g/l，比不含混合營養(yǎng)包的培養(yǎng)基發(fā)酵冬蟲夏草得到的胞外多糖的含量提高了 76%。
[0024](2)本發(fā)明特制的液態(tài)培養(yǎng)基成本低，并且大幅提高胞外多糖的產(chǎn)量，具有良好的工業(yè)應用化前景。
【附圖說明】
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[0025]圖1為培養(yǎng)基中混合營養(yǎng)包的質(zhì)量百分比為0、0.02%、0.04%、0.08%、0.15%時得到的胞外多糖的含量。
【具體實施方式】
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[0026]下面結合具體實施例對本發(fā)明的內(nèi)容進一步說明。
[0027]實施例1
[0028](I)液態(tài)培養(yǎng)基的配制:按質(zhì)量百分比計包括葡萄糖3%、蛋白胨1.5%、酵母粉
0.5%、KH2PO4 0.3% ^MgSO4.7H20 0.15%和土豆 20%，溶劑為水，液態(tài)培養(yǎng)基 PH 值為 6.0 ；
[0029](2)發(fā)酵培養(yǎng):配制的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入容量為IL的發(fā)酵罐，滅菌，在無菌條件下將菌種接種到液體培養(yǎng)基，于24°C及150r/min條件下恒溫培養(yǎng)；
[0030](3)發(fā)酵結束后用顯微鏡觀察發(fā)酵液中菌絲體生長情況，并將發(fā)酵液接種到營養(yǎng)瓊脂平板上來檢查其是否染菌；
[0031](4)將在步驟(3)中檢測到的未被染菌的發(fā)酵液在4000r/min條件下離心20min得到小球形式的發(fā)酵菌絲體，然后將菌絲體和上清液進行冷凍干燥并儲存在_18°C的冰箱里備用；
[0032](5)將步驟(4)中離心得到的上清液減壓濃縮或常壓蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度不超過100°C，得到粘稠狀液體；
[0033](6)將經(jīng)濃縮得到的粘稠狀液體加入兩倍體積的95%的乙醇進行醇析，其醇析時間不低于24小時，得到白色纖維狀沉淀；
[0034](7)將經(jīng)醇析得到的白色纖維狀沉淀物用75%的乙醇洗滌并離心，重復數(shù)次，最后將經(jīng)過數(shù)次洗滌、離心而得到的沉淀物在60°C烘干，得灰白色粗多糖，并測定胞外多糖的含量。
[0035]實施例2
[0036](I)配制營養(yǎng)包，混合營養(yǎng)包按質(zhì)量百分比計包括:組氨酸31.1 %、賴氨酸31.1 %、谷氨酰胺18.3%、維生素B218.3%和砸1.2% ；
[0037](2)配制液態(tài)培養(yǎng)基:一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比計包括:混合營養(yǎng)包0.02%、葡萄糖3%、蛋白胨1.5%、酵母粉0.5%、KH2PO4 0.3%、MgSO4.7H20 0.15%和土豆20%,溶劑為水，液態(tài)培養(yǎng)基PH值為6.0 ；
[0038](3)發(fā)酵培養(yǎng):配制的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入容量為IL的發(fā)酵罐，滅菌，在無菌條件下將菌種接種到液體培養(yǎng)基，于24°C及150r/min條件下恒溫培養(yǎng)；
[0039](4)發(fā)酵結束后用顯微鏡觀察發(fā)酵液中菌絲體生長情況，并將發(fā)酵液接種到營養(yǎng)瓊脂平板上來檢查其是否染菌；
[0040](5)將在步驟(3)中檢測到的未被染菌的發(fā)酵液在4000r/min條件下離心20min得到小球形式的發(fā)酵菌絲體，然后將菌絲體和上清液進行冷凍干燥并儲存在_18°C的冰箱里備用；
[0041](6)將步驟(4)中離心得到的上清液減壓濃縮或常壓蒸發(fā)濃縮，濃縮溫度不超過100°C，得到粘稠狀液體；
[0042](7)將經(jīng)濃縮得到的粘稠狀液體加入兩倍體積的95%的乙醇進行醇析，其醇析時間不低于24小時，得到白色纖維狀沉淀；
[0043](8)將經(jīng)醇析得到的白色纖維狀沉淀物用75%的乙醇洗滌并離心，重復數(shù)次，最后將經(jīng)過數(shù)次洗滌、離心而得到的沉淀物在60°C烘干，得灰白色粗多糖，并測定胞外多糖的含量，得到的胞外多糖含量較實施例1提高11%。
[0044]實施例3
[0045](I)配制營養(yǎng)包，混合營養(yǎng)包按質(zhì)量百分比計包括:組氨酸31.1 %、賴氨酸31.1 %、谷氨酰胺18.3%、維生素B218.3%和砸1.2% ；
[0046](2)配制液態(tài)培養(yǎng)基:一種用于冬蟲夏草液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比計包括:混合營養(yǎng)包0.04%、葡萄糖3 %、蛋白胨1.5 %、酵母粉0.5%、KH2PO4 0.3%、MgSO4.7H20 0.15%和土豆20%,溶劑為水，液態(tài)培養(yǎng)基PH值為6.0 ；
[0047](3)發(fā)酵培養(yǎng):配制的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入容量為I