一種利用熒光輔助糖電泳對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析鑒定不同木聚糖酶功能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于熒光輔助糖電泳技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用熒光輔助糖電泳對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析檢測(cè)不同木聚糖酶功能的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在木質(zhì)纖維素中木聚糖是繼纖維素之后最為豐富的植物細(xì)胞壁多糖，但是木聚糖的結(jié)構(gòu)組成卻明顯復(fù)雜于纖維素。木聚糖骨架是由木糖殘基通過β_1，4糖苷鍵連接而成，并被L-阿拉伯糖、葡萄糖醛酸及4-0-甲基葡萄糖醛酸等側(cè)鏈糖基取代。由于木聚糖結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜，導(dǎo)致對(duì)其降解利用需要復(fù)雜的酶系。降解木聚糖骨架的酶主要包括I，4-13_D-木聚糖酶、β-木糖苷酶，側(cè)鏈的去除主要由L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶等完成。在木聚糖降解酶系中，I，4-13_D-木聚糖酶在將木聚糖降解為木寡糖中發(fā)揮著重要的作用，降解產(chǎn)生的木寡糖可以在木糖苷酶的作用下完全轉(zhuǎn)化成木糖。木寡糖已于2008年被中國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新功能性食品(2008，衛(wèi)生部)，它具有高效、穩(wěn)定、安全、無毒等優(yōu)點(diǎn)，因此越來越多地被用于食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域。而木糖在生物燃料的生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。I，4_β-D-木聚糖酶的功能差異及與β-木糖苷酶的比例決定著木寡糖的種類及木糖的產(chǎn)量。農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯中含有豐富的可利用木聚糖，通過不同酶系的作用可以產(chǎn)生不同種類價(jià)值的產(chǎn)品，因此，快速確定不同木聚糖酶的功能差異及酶系中酶與酶之間的協(xié)同對(duì)復(fù)配特定的降解酶系用于不同的生產(chǎn)需求具有重要意義。
[0003]木聚糖酶的功能差異主要通過酶解產(chǎn)物反映，目前，對(duì)于木聚糖的復(fù)雜酶解產(chǎn)物，特別是低聚木糖尚缺乏快速、靈敏和可定量的分析方法。常用的方法有薄層層析(TLC)技術(shù)、高效液相色譜(HPLC)法等。TLC檢測(cè)過程中容易使復(fù)雜樣品擴(kuò)散、拖尾從而影響分離和定量結(jié)果，而HPLC對(duì)糖的檢測(cè)靈敏度不高，尤其是對(duì)木寡糖的分離效果不佳。熒光輔助糖電泳(FACE)使用焚光基團(tuán)標(biāo)記單糖、寡糖和多糖還原端，8-萘胺-1，3，6_三磺酸(ANTS)和7-萘胺-1，6_二磺酸(ANDS)經(jīng)常用作熒光標(biāo)記物，其氨基基團(tuán)可以與糖環(huán)呈打開狀態(tài)的單糖或寡糖形成席夫堿，再經(jīng)過一種合適的還原劑(NaCNBH3)還原，使熒光標(biāo)記物的耦合變?yōu)椴豢赡娣磻?yīng)，使木聚糖酶解產(chǎn)物可以在凝膠上得以有效的分離，并通過靈敏的熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行鑒定分析。但檢索發(fā)現(xiàn)有關(guān)利用熒光輔助糖電泳對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析鑒定不同木聚糖酶功能的方法還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種利用熒光輔助糖電泳對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析鑒定不同木聚糖酶功能的方法。
[0005]本發(fā)明所述利用熒光輔助糖電泳對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析鑒定不同木聚糖酶功能的方法，步驟是:
[0006](I)利用玉米芯制備粒徑均一超細(xì)的玉米芯木聚糖粉，獲得玉米芯木聚糖；
[0007](2)用不同待鑒定木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖實(shí)施酶解；
[0008](3)利用熒光輔助糖電泳對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析；
[0009](4)根據(jù)對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析結(jié)果判定待鑒定木聚糖酶功能的差異；
[0010]其特征在于:
[0011 ]步驟(I)所述利用玉米芯制備粒徑均一超細(xì)的玉米芯木聚糖粉的方法是:
[0012]①將烘干后的玉米芯粉碎成粒徑為0.2±0.1mm的顆粒，過80目篩子，獲得粒徑均一的玉米芯粉；
[0013]②將制得的粒徑均一的玉米芯粉按質(zhì)量體積比1:8-9的比例加入蒸餾水，于105土2 °C預(yù)處理40-50min，然后用8層紗布過濾，收集濾渣；
[0014]③將濾渣烘干后研磨l-2h;
[0015]④研磨后加入與①所述蒸餾水體積相同量的濃度為15%(w/v)的氫氧化鈉溶液，于115 ± 2 °C下蒸煮40-50min，然后用8層紗布過濾，收集濾液；
[0016]⑤濾液用濃度為30%(w/v)的氫氧化鈉溶液對(duì)其進(jìn)行脫色處理0.5-lh;
[0017]⑥脫色處理后的溶液用濃度為15% (w/v)的三氯乙酸溶液脫蛋白，其中所述溶液與三氯乙酸溶液的體積比為8:1;
[0018]⑦將脫蛋白后的溶液以8000r/min離心30min，收集上清液，然后加入濃鹽酸將該溶液的pH調(diào)至6.0;
[0019]⑧加入⑦制得的溶液3倍體積量的無水乙醇，醇沉12-20h，然后8000r/min離心20min，收集的沉淀物即為木聚糖粗提物；
[°02°]⑨將木聚糖粗提物用三蒸水充分?jǐn)嚢枨逑?，?000r/min離心20min，收集沉淀物，如此重復(fù)3次；
[0021]⑩將⑨制得的沉淀物于-20°C冷凍干燥12_20h，得到純木聚糖粉末，再研磨1.5-3h，研磨后的粉末過100?200目篩子，即得到粒徑均一超細(xì)的聚合度在40-100范圍內(nèi)的玉米芯木聚糖；
[0022]步驟(2)所述用不同待鑒定木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖實(shí)施酶解的方法是:
[0023]①利用磷酸氫二鈉/檸檬酸緩沖液將步驟(I)制得的玉米芯木聚糖配成濃度為1%的且pH適于待鑒定木聚糖酶反應(yīng)的木聚糖溶液；
[0024]②將制備的木聚糖溶液與蛋白濃度為0.0lmg/mL的待鑒定木聚糖酶溶液按體積比為6:4混合，在該待鑒定木聚糖酶的最適溫度條件下分別進(jìn)行時(shí)間為2min、5min、15min、3011^11、601^11、1201^11、2401^11的序列反應(yīng)，其間以沸水作用101^11終止反應(yīng)，分別以1000(^/min離心1min，收集各時(shí)間段的待鑒定木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖實(shí)施酶解的產(chǎn)物；
[0025]步驟(3)所述利用熒光輔助糖電泳對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析方法是:
[0026]①分別取步驟(2)制得的待鑒定木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖實(shí)施酶解的產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后分別取制備的焚光標(biāo)記產(chǎn)物0.2yg?5yg點(diǎn)樣，點(diǎn)樣時(shí)最外側(cè)兩個(gè)孔道不點(diǎn)樣以避免邊緣效應(yīng)，其他孔道隔一個(gè)孔道點(diǎn)一個(gè)樣以防止樣品因膠內(nèi)橫向擴(kuò)散使條帶成片，影響定量分析，在冰水浴條件下，以恒流5mA/膠板進(jìn)行熒光輔助糖電泳，時(shí)間3-4h;
[0027]其中，所述熒光輔助糖電泳中聚丙烯酰胺分離膠、濃縮膠中各組分及濃度是:
[0028]聚丙烯酰胺分離膠配方:35 %丙烯酰胺，375mM、pH 8.8Tris_HCl ,0.1%過硫酸銨以及 0.02% TEMED;
[0029]聚丙烯酰胺濃縮膠配方:5%丙烯酰胺，62.5mM、pH 6.8Tris-HCl ,0.1 %過硫酸銨以及 0.02% TEMED;
[°03°]分咼膠加入量為4.1mL/膠板；
[0031 ]其中，所述熒光標(biāo)記中熒光標(biāo)記物配制方法是:
[0032]ANDS: ANDS加入到15%冰醋酸溶液中，終濃度0.2M(71.87mg/ml，過飽和溶液)；
[0033]NaCNBH3:NaCNBH3加入到二甲基亞砜中，終濃度IM;
[0034]其中，所述將玉米芯木聚糖實(shí)施酶解后的產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法是:
[0035]分別取一定體積的待鑒定木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖實(shí)施酶解的產(chǎn)物，分別加入其相同體積的0.2 M A N D S后，室溫避光放置1- 2 h，然后加入與酶解產(chǎn)物相同體積的IMNaCNBH3，42°C孵育12_14h; 8000r/min離心1min，收集溶液，開蓋放置30min，以揮發(fā)掉管內(nèi)的HCN氣體，然后加入3倍酶解產(chǎn)物體積的50% (m/v)蔗糖上樣緩沖液，完成熒光標(biāo)記產(chǎn)物制備;
[0036]其中，所述熒光輔助糖電泳中電泳所需緩沖液內(nèi)液、外液中各組分及濃度是:
[0037]電泳緩沖液內(nèi)液:9.38%三羥甲基氨基甲烷(Tris)、2.422%甘氨酸；
[0038]電泳緩沖液外液:1.23 %三羥甲基氨基甲烷(Tr i s )、6.18 %硼酸、3.72 %EDTA.Na2；
[0039]其中，所述熒光輔助糖電泳中使用Imm膠板，15孔梳子，二十幾個(gè)樣品使用小型垂直凝膠電泳系統(tǒng)，二十幾個(gè)樣品以上使用高通量垂直凝膠電泳系統(tǒng)(B1-Rad，USA);
[0040]②利用熒光成像系統(tǒng)對(duì)熒光輔助糖電泳凝膠掃描，獲得TIF格式圖片，提取圖片中各條帶灰度值以此定量分析待鑒定木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖各時(shí)間段實(shí)施酶解產(chǎn)物中相應(yīng)的各寡糖的量；
[0041 ]步驟(4)所述根據(jù)對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析結(jié)果判定待鑒定木聚糖酶功能的差異的方法是:
[0042]根據(jù)對(duì)玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物分析結(jié)果進(jìn)行判定，若能將玉米芯木聚糖中木寡糖在2min之內(nèi)迅速轉(zhuǎn)化成木糖的即鑒定該木聚糖酶含有β-木糖苷酶;若能將玉米芯木聚糖中木聚糖在2min之內(nèi)迅速降解為木寡糖，而木寡糖在240min內(nèi)被緩慢降解為木糖及短寡糖的即鑒定該木聚糖酶含有內(nèi)切木聚糖酶;若在玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物中檢測(cè)到帶有甲基化葡萄糖醛酸側(cè)鏈的木三糖并且其含量隨時(shí)間序列反應(yīng)逐漸增加后趨于穩(wěn)定的即鑒定該木聚糖酶歸于CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)(http: //www.cazy.0rg/)中糖苷水解酶1家族的木聚糖酶;若在玉米芯木聚糖酶