專利名稱：檢測(cè)阿爾茨海默病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及診斷或預(yù)后阿爾茨海默病的方法。本發(fā)明還涉及用于阿爾茨海默病診斷或預(yù)后的試劑盒。
阿爾茨海默病是一種神經(jīng)變性病，它對(duì)高齡人群的影響比例很高。在臨床方面該病的特征是認(rèn)知功能的喪失，在神經(jīng)病理學(xué)方面其特征是在腦中存在細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維沉積和β淀粉樣多肽(Aβ)的細(xì)胞外沉積，從而形成淀粉斑。淀粉斑主要由包含40或42個(gè)氨基酸的Aβ肽組成，Aβ肽是通過(guò)β淀粉樣前體蛋白(APP)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的。Aβ的細(xì)胞外沉積是阿爾茨海默病特異的。它們代表著包括家族形式在內(nèi)的所有形式阿爾茨海默病的早期的和不變的特征。
該病的家族形式出現(xiàn)相對(duì)較早(在40-60歲之間)。它們至少部分由于APP基因和早老蛋白-1(PS1)和早老蛋白-2(PS2)基因中的突變。在這三種基因中的突變誘導(dǎo)APP蛋白水解發(fā)生改變，導(dǎo)致過(guò)度產(chǎn)生Aβ，過(guò)早出現(xiàn)病理和與散發(fā)性阿爾茨海默病類似的癥狀。
由流行性病學(xué)研究以及現(xiàn)代生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究結(jié)果還已經(jīng)建立起膽固醇與阿爾茨海默病之間的關(guān)系(參見(jiàn)綜述Hartmann，T.(2001)TINS 24S45-48)。成年人的高膽固醇水平以及高動(dòng)脈壓顯著增加了患阿爾茨海默病的危險(xiǎn)性(Kivipelto等，2001 Br Med J.3221447)。
另一方面，觀察到在使用斯特汀類降膽固醇藥治療的人群中患阿爾茨海默病的危險(xiǎn)性大大降低(Wolozin等(2000)Arch Neurol.571439；Jick等(2000)Lancet 3561627)。
近來(lái)已建立起分子水平的關(guān)聯(lián)。在體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)，高膽固醇水平增加Aβ肽的產(chǎn)生，并且加速出現(xiàn)淀粉斑(Sparks等(1994)，Exp.Neurol.12688-94；Refolo等(2000)，Neurobiol.Dis.7321-331；Puglielli等(2001)，Nat.Cell Biol.3905；Shie等(2002)，Neuroreport 13455)，而膽固醇合成途徑的抑制劑使它們減少(Simons等(1998)，PNAS USA，956460-6464；Fassbender等(2001)，PNAS USA，985856；Refolo等(2001)，Neurobiol.Dis.8890-899)。
盡管進(jìn)展很顯著，但醫(yī)藥界仍然面臨缺乏真正有效針對(duì)阿爾茨海默病的分子。這種缺乏的原因之一在于難以找到有效篩選能夠?qū)υ摷膊∑鸬街委熥饔玫姆肿拥陌袠?biāo)。
此外，該疾病的早期檢測(cè)是決定性的，以便在該疾病還沒(méi)有表現(xiàn)出極高使人致殘的首發(fā)癥狀之前就提供治療。
另外，由于該疾病形態(tài)多種多樣，顯然需要首先根據(jù)待治療個(gè)體并且其次根據(jù)該種治療所能使用的分子進(jìn)行靶向治療。這種藥物基因組學(xué)或藥物遺傳學(xué)的方法顯得越來(lái)越重要。
ABCA2蛋白質(zhì)是一種屬于ABC(ATP結(jié)合盒)類膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大家族的蛋白質(zhì)。這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大腦中特異性表達(dá)。
在2000年，Zhao等描述了ABCA2基因的克隆(Biochem.J.，350，865-872)。該序列還是ACTIVEPASS PHARMACEUTICALS公司提出的PCT申請(qǐng)WO 01/14414的主題。該申請(qǐng)就ABCA2作用提出了各種假設(shè)，但沒(méi)有任何結(jié)果能支持這些假設(shè)。
已經(jīng)鑒定了ABCA2基因的不同多態(tài)性。它們的序列特別可以從NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。在這個(gè)庫(kù)中所列出的不同多態(tài)性中，描述了rs908832多態(tài)性。
這個(gè)多態(tài)性的特征在于它是在序列SEQ ID No.2中第348位為鳥(niǎo)嘌呤的高加索人群主要等位基因和在序列SEQ ID No.1中第348位為腺嘌呤的高加索人群次要等位基因。
或者，這種單核苷酸多態(tài)性是用分別與SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的部分互補(bǔ)的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4序列表示。因此，這種多態(tài)性特征在于它是在序列SEQ ID No.4中第201位為胞嘧啶的高加索人群主要等位基因和在序列SEQ ID No.3中第201位為胸腺嘧啶核苷的高加索人群次要等位基因。
這種多態(tài)性是同義的，即它不改變所翻譯蛋白質(zhì)的序列。這種多態(tài)性的兩個(gè)等位基因是編碼天冬氨酸的編碼子的一部分。這種編碼多態(tài)性位于具有序列SEQ ID No.5的轉(zhuǎn)錄物的第14外顯子的第2185位。
令人驚奇地，申請(qǐng)人已經(jīng)證明具有ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的患者有增加的過(guò)早患阿爾茨海默病的危險(xiǎn)性。
這個(gè)發(fā)現(xiàn)是特別重要的，因?yàn)閾?jù)申請(qǐng)人所知，該發(fā)現(xiàn)首次提供了ABCA2蛋白質(zhì)特別是該蛋白質(zhì)編碼基因的多態(tài)性與病理狀態(tài)如阿爾茨海默病之間關(guān)系的證據(jù)。
本發(fā)明能夠證實(shí)和/或預(yù)后已經(jīng)診斷患有阿爾茨海默病的病人所達(dá)到的嚴(yán)重程度以及可能的理想治療效果，以及預(yù)后沒(méi)有表現(xiàn)出阿爾茨海默病癥狀的個(gè)體包括與診斷證實(shí)的病人相關(guān)聯(lián)的個(gè)體出現(xiàn)該疾病的危險(xiǎn)性。
本發(fā)明還能夠證實(shí)ABCA2在阿爾茨海默病的病理生理學(xué)中主要功能作用，這證明為了阿爾茨海默病的治療應(yīng)用而使用篩選能對(duì)ABCA2活性施加刺激或抑制作用的分子的測(cè)試是有根據(jù)的。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是診斷或預(yù)后個(gè)體患阿爾茨海默病的方法。所述方法包括至少一個(gè)ABCA2基因多態(tài)性等位基因的檢測(cè)步驟。有利地，此種多態(tài)性是涉及阿爾茨海默病的多態(tài)性。優(yōu)選地是rs908832多態(tài)性，但可以是與rs908832多態(tài)性遺傳連鎖不平衡的任何其它多態(tài)性。
適宜的個(gè)體例如可以是-未表現(xiàn)阿爾茨海默病癥狀的個(gè)體，-已檢測(cè)出具有發(fā)展成為阿爾茨海默病危險(xiǎn)但還未表現(xiàn)出疾病癥狀的個(gè)體，以及-預(yù)先已診斷患有阿爾茨海默病并希望證實(shí)該診斷的個(gè)體。
可通過(guò)使用生物學(xué)樣品的任何合適的方法，直接或間接開(kāi)展rs908832多態(tài)性次要等位基因存在或缺乏的檢測(cè)步驟(這些步驟可以是同時(shí)進(jìn)行的或者不是同時(shí)進(jìn)行的)。
因此，本發(fā)明還涉及對(duì)取自個(gè)體特別是沒(méi)有表現(xiàn)出阿爾茨海默病癥狀個(gè)體的生物學(xué)樣品進(jìn)行篩選的方法，以便檢測(cè)個(gè)體是否會(huì)極易發(fā)展成阿爾茨海默病。該篩選方法包括在所述生物學(xué)樣品中尋找(可能同時(shí))rs908832多態(tài)性次要等位基因是否存在。
包含待鑒定DNA或蛋白質(zhì)的所述樣品可以是多種來(lái)源的。例如可以是血液、精液、毛發(fā)(帶有發(fā)根)樣品或其它任何包含有核細(xì)胞的樣品。優(yōu)選地，所分析生物學(xué)樣品是血液樣品。在這種情況下，待鑒定的DNA來(lái)自白細(xì)胞。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品”旨在指直接來(lái)自對(duì)其所作診斷或預(yù)后不具有其它轉(zhuǎn)化的個(gè)體的樣品，或經(jīng)歷一個(gè)或多個(gè)制備步驟而僅保存了對(duì)于檢測(cè)步驟有用的組分如粗細(xì)胞提取液的樣品。
檢測(cè)或鑒定是否存在攜帶有rs908832多態(tài)性次要等位基因的DNA的技術(shù)可以是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、雜交、Southern印跡、核酸酶消化、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和/或PCR產(chǎn)物直接順序的技術(shù)的組合。所有這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
一般而言，在本發(fā)明上下文中可以使用的病用于鑒定攜帶有rs908832多態(tài)性次要等位基因的DNA的技術(shù)包括收集包含待鑒定DNA生物學(xué)樣品的預(yù)先步驟和根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如Smith等的方法(The Lancet，1992，339，第1375-7頁(yè))提取基因組DNA的步驟。
此鑒定方法可以包括a)提取所述個(gè)體的DNA，b)使用能夠擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于ABCA2基因rs908832多態(tài)性中每個(gè)等位基因序列的引物擴(kuò)增所述分離DNA，和c)在擴(kuò)增DNA中確定ABCA2基因rs908832多態(tài)性的至少一個(gè)等位基因。
根據(jù)有利的實(shí)施方案，采用了PCR技術(shù)。因此，步驟b)有利地包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟。這種技術(shù)包括首先合成與所限定待擴(kuò)增DNA片段區(qū)序列互補(bǔ)的寡核苷酸(引物)。這些寡核苷酸用作DNA聚合酶的引物。然后，進(jìn)行下列步驟熱變性(92-95℃)以分開(kāi)兩條DNA鏈、借助溫度的降低(50-55℃)與兩個(gè)特異引物雜交以及在70-72℃用聚合酶DNA延長(zhǎng)引物。
此種用于擴(kuò)增ABCA2基因rs908832多態(tài)性中每個(gè)等位基因特別是次要等位基因的引物以及它們的互補(bǔ)序列構(gòu)成了本申請(qǐng)的另一個(gè)主題。有利地，它們具有各自的序列，以致于在DNA分子上它們各自雜交點(diǎn)之間的堿基數(shù)在25-2500個(gè)堿基對(duì)之間，優(yōu)選地在100-500個(gè)堿基對(duì)之間。
有利地，此類引物具有序列SEQ ID No.3或序列SEQ ID No.4的大約15-30個(gè)連續(xù)核苷酸。優(yōu)選地，它們是具有序列SEQ ID No.6和SEQ ID No.7的一對(duì)引物。
根據(jù)有利的實(shí)施方案，本申請(qǐng)的目的是一種方法，其特征在于通過(guò)兩個(gè)探針的特異雜交將攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的擴(kuò)增DNA與不攜帶該等位基因的擴(kuò)增DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)，其中兩個(gè)探針中的每個(gè)探針對(duì)于兩種多態(tài)性形態(tài)中的一種形態(tài)是特異性的。這些探針及其互補(bǔ)序列構(gòu)成了本申請(qǐng)的另外主題。
有利地，這些探針?lè)謩e由序列SEQ ID No.3或序列SEQ ID No.4的大約12-17個(gè)連續(xù)核苷酸組成。優(yōu)選地，它們分別具有SEQ ID No.8和SEQID No.9的序列。
還可以通過(guò)使用DNA聚合酶I(TaqMan)的5’核酸酶活性的技術(shù)將攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的擴(kuò)增DNA與不攜帶該等位基因的擴(kuò)增DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。
根據(jù)有利的實(shí)施方案，本申請(qǐng)的目的是一種方法，其特征在于通過(guò)限制性片段多態(tài)性(RFLP)分析將攜帶rs908832多態(tài)性的擴(kuò)增DNA與不攜帶該多態(tài)性的擴(kuò)增DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。有利地，在用瓊脂糖凝膠遷移、在膜上進(jìn)行Southern印跡和雜交之前，已經(jīng)使用限制酶消化所擴(kuò)增DNA得到了限制性片段。
為了同時(shí)達(dá)到較高的靈敏度和較好的特異性，還可能使用兩對(duì)不同的引物進(jìn)行兩次連續(xù)的PCR(“巢式PCR”)第一對(duì)為外引物，它能夠得到如在通常PCR中擴(kuò)增的DNA片段，第二對(duì)為內(nèi)引物，便于對(duì)第一次PCR得到的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。
為了確定目的區(qū)域的遺傳足紋，還可以將通過(guò)PCR得到的DNA片段通過(guò)電泳按照其大小進(jìn)行分離，并且借助EBT(溴化乙錠)和紫外光顯色。
在這種情況下，特別有利的是能夠使用3’末端具有突變核苷酸序列的第一個(gè)引物和3’末端為野生型核苷酸序列的第二個(gè)引物開(kāi)展PCR。在這兩種情況下變性溫度的不同和因此而來(lái)的擴(kuò)增效率的不同使得能夠?qū)⑼蛔凅wDNA與野生型DNA區(qū)別開(kāi)來(lái)。
根據(jù)另外一種選擇，采用點(diǎn)印跡技術(shù)直接鑒定所擴(kuò)增DNA片段，該技術(shù)包括將PCR得到的DNA片段樣品點(diǎn)于尼龍濾膜上、變性DNA片段、使用放射性的特異探針與其雜交以及洗滌以除去過(guò)量的未結(jié)合放射性產(chǎn)物、以及放射自顯影。還可以使用包含除放射性標(biāo)記外的標(biāo)記物例如染料或熒光標(biāo)記物的特異探針的其它方法進(jìn)行顯示。
根據(jù)另外一種選擇，還可以通過(guò)直接對(duì)全部或部分?jǐn)U增DNA片段進(jìn)行測(cè)序來(lái)檢測(cè)包含rs908832多態(tài)性的DNA中是否存在突變。此方法在于測(cè)定rs908832多態(tài)性核苷酸序列。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法測(cè)序，例如通過(guò)Sanger方法或通過(guò)Maxam和Gilbert方法。
根據(jù)另外一種選擇，使用Southern印跡技術(shù)來(lái)檢測(cè)攜帶rs908832多態(tài)性的DNA存在與否，該技術(shù)包括用一種或多種限制酶處理后對(duì)所得到的DNA片段進(jìn)行電泳分離。然后將凝膠變性并在尼龍膜上進(jìn)行印跡。將該膜與特異探針雜交。在洗滌除去過(guò)量的未結(jié)合放射性產(chǎn)物后，在該膜上放上一張膠片進(jìn)行曝光。于是可以檢測(cè)到相應(yīng)于通過(guò)探針識(shí)別的DNA片段的一條或多條條帶。
還可以使用RFLP技術(shù)與Southern印跡和/或PCR技術(shù)的聯(lián)合檢測(cè)是否存在rs908832多態(tài)性。RFLP能夠用于比較多種個(gè)體的DNA，并能夠用于研究是否產(chǎn)生了能使限制位點(diǎn)出現(xiàn)或消失的點(diǎn)突變。用限制酶處理具有相同序列的兩個(gè)DNA會(huì)得到相同的片段，并且從這些片段得到的Southern印跡因此是相同的。相反，如果限制位點(diǎn)在突變后消失或出現(xiàn)，則這些片段不再會(huì)有相同大小，并且這可在放射自顯影圖上看到。如果在突變后出現(xiàn)新限制位點(diǎn)，也同樣如此。
通過(guò)測(cè)定編碼ABCA2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物的第2185位的核苷酸，也可以檢測(cè)ABCA2基因的rs908832多態(tài)性。
所有上述技術(shù)都是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的?？梢圆捎靡阎乙策m于測(cè)定是否有rs908832多態(tài)性的其它任何技術(shù)。在這方面，可以提到例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄依賴擴(kuò)增等技術(shù)。有利地，按照參考文獻(xiàn)描述的方法(見(jiàn)例如Gugh等，Nature，1990，347，第773頁(yè)；Kagimoto等，J.Biol.Chem.，1990，265，第17209頁(yè)；Wolf等，The Lancet，1990，336，第1452頁(yè)；Hayashi等，Nucleic Acids Res.，1991，19，第4797頁(yè)；Daly等，Pharmacogenetics，1991，1，第33頁(yè)；Spurr等，Methods Enzymol.，1991，206，第149頁(yè)；Armstrong等，The Lancet，1992，339，第1017頁(yè)；Kurth等，Am.J.of Med.Genet.，1993，48，第166頁(yè)；McCann等，J.Neurol.Sci.，1997，153，第50頁(yè)；Stroombergen等，Hum.& Exper.Toxicol.，1999，18，第141頁(yè))，通過(guò)PCR、RFLP、Southern印跡和/或這些技術(shù)的組合開(kāi)展所述檢測(cè)步驟。
因?yàn)樗羞@些檢測(cè)方法構(gòu)成了確定一個(gè)個(gè)體是否可能患阿爾茨海默病或表現(xiàn)出發(fā)展成阿爾茨海默病增加危險(xiǎn)的基礎(chǔ)，所以所有這些檢測(cè)方法都是特別有用的。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于分析來(lái)自個(gè)體的生物學(xué)樣品的方法，該方法包括a)確定所述個(gè)體ABCA2基因的基因型，b)轉(zhuǎn)換在a)得到的資料，以便預(yù)后所述個(gè)體發(fā)展成阿爾茨海默病的危險(xiǎn)性和該疾病的預(yù)想治療效果。
根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及用于診斷和預(yù)后個(gè)體阿爾茨海默病的一組試劑或試劑盒。
此類試劑盒可以是分格包裝形式，以容納多種容器例如小瓶或管。其中每個(gè)容器包含檢測(cè)攜帶rs908832多態(tài)性的DNA存在與否所需要的多種成分。
能夠開(kāi)展檢測(cè)反應(yīng)的所述成分選自前面所述的那些成分。它們例如-與ABCA2基因限定區(qū)雜交的一對(duì)引物，和任選地進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所必需的工具，或
-任選地固定于支持物上并包含可檢測(cè)標(biāo)記的寡核苷酸探針，以及任選地進(jìn)行雜交反應(yīng)所必需的試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療阿爾茨海默病的方法，其包括-至少一個(gè)檢測(cè)個(gè)體是否存在rs908832多態(tài)性次要等位基因的步驟，和-向表現(xiàn)出rs908832多態(tài)性次要等位基因的個(gè)體施用已知對(duì)阿爾茨海默病有活性的化合物或化合物混合物。
優(yōu)選地，該疾病是早期阿爾茨海默病。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是選擇化合物的方法，該化合物旨在向表現(xiàn)出ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因相關(guān)疾病的個(gè)體施用，其包括a.至少一個(gè)檢測(cè)所述個(gè)體生物學(xué)樣品是否存在ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的步驟，和b.如果存在所述等位基因，則選擇適當(dāng)?shù)幕衔铩?br> 本發(fā)明的另一個(gè)目的是選擇化合物的方法，該化合物旨在向表現(xiàn)出阿爾茨海默病的個(gè)體施用，其包括a.至少一個(gè)檢測(cè)所述個(gè)體生物學(xué)樣品是否存在ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的步驟，和b.如果存在所述等位基因，則選擇適當(dāng)?shù)幕衔铩?br> 本申請(qǐng)還涉及已知對(duì)阿爾茨海默病有活性的化合物或其化合物混合物在生產(chǎn)用于治療患有阿爾茨海默病的個(gè)體的藥物中的用途，在對(duì)該個(gè)體進(jìn)行治療以前已經(jīng)檢測(cè)到存在rs908832多態(tài)性次要等位基因。
已知對(duì)阿爾茨海默病有活性的所述化合物例如乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchEI，例如杜尼匹次(愛(ài)麗賽)、加蘭他敏(加蘭他明)或雷司替明(雷法斯的明))、NMDA受體通道拮抗劑(例如美金剛胺(美金剛))、淀粉樣多肽產(chǎn)生的抑制劑例如BMS 299897或者ABCA2活性調(diào)節(jié)劑。
這些組合的化合物可以采用口服、腸胃外、經(jīng)皮或直腸方式同時(shí)或分開(kāi)施用，或者以在一段時(shí)間內(nèi)分散的方式施用。
這些化合物可以配制成包含一種或多種上述定義的化合物與可藥用媒介物組合的藥物組合物的形式。
作為口服施用的固體組合物可以是片劑、丸劑、粉劑(明膠膠囊、扁囊劑)或顆粒劑。對(duì)于這些組合物，在氬氣流下，將這些活性組分與一種或多種惰性稀釋劑混合，惰性稀釋劑例如淀粉、纖維素、糖、乳糖或二氧化硅。這些組合物還可以包含除稀釋劑之外的物質(zhì)，例如一種或多種潤(rùn)滑劑諸如硬脂酸鎂或滑石、著色劑、糖衣(糖衣片)或涂劑。
作為口服施用的液體組合物可以是可藥用的溶液、懸浮液、乳液、糖漿和酏劑，它們含有惰性稀釋劑例如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油。這些組合物可以含有除稀釋劑外的物質(zhì)例如潤(rùn)濕劑、甜味劑、增稠劑、調(diào)味劑或穩(wěn)定劑。
腸胃外施用的無(wú)菌組合物優(yōu)選地是含水或不含水的溶液、懸浮液或乳液。作為溶劑或媒介物可以是水、丙二醇、聚乙二醇、植物油特別是橄欖油、可注射用有機(jī)酯如油酸乙酯或其它適宜的有機(jī)溶劑。這些組合物還可以含有輔料特別是潤(rùn)濕劑、等滲劑、乳化劑、分散劑和穩(wěn)定劑。滅菌的方式有多種例如過(guò)濾除菌、將滅菌劑摻入到組合物中、照射或加熱。它們還可以制成無(wú)菌固體組合物的形式，在使用時(shí)可以將它們?nèi)苡跍缇谢蛉魏纹渌勺⑸涞臏缇橘|(zhì)中。
直腸施用的組合物是栓劑或直腸用膠囊劑，它們除活性產(chǎn)品外還含有賦形劑如可可脂、半合成甘油酯或聚乙二醇。
含有如前面定義組合的藥物組合物通常包含0.1-500mg化合物。
劑量取決于目的效果、治療持續(xù)時(shí)間和所使用的施用途徑；一般而言，其劑量是成人口服每天0.1-500mg化合物。
通常，內(nèi)科醫(yī)生應(yīng)根據(jù)待治療個(gè)體的年齡、體重和所有其它個(gè)體特異因素確定適當(dāng)?shù)膭┝俊?br> 本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中在其基因組中插入至少一種攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的外源DNA序列以致于ABCA2基因的功能被修飾了。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”旨在指具有人工修飾基因組的任何非人動(dòng)物?；蚪M修飾可以是通過(guò)“敲入”或“敲除”(通過(guò)同源重組導(dǎo)致的基因失活/修飾)使一個(gè)或多個(gè)基因改變或修飾的結(jié)果，或者是處于神經(jīng)元細(xì)胞類型特異啟動(dòng)子(例如ThyI、PDGF或朊病毒)或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型特異啟動(dòng)子(例如膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP))控制下人類基因在小鼠內(nèi)超表達(dá)的結(jié)果。這種修飾可能是由于常規(guī)的改變或誘變劑作用的結(jié)果，或通過(guò)穩(wěn)定插入一種能夠表達(dá)雜種基因的表達(dá)盒進(jìn)行這種修飾的。特別地，例如可以按照與申請(qǐng)WO 01/02552或WO 01/13176描述的相同或類似方法進(jìn)行。
還可通過(guò)在其野生型或突變形式中插入或替換一個(gè)或多個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)基因組的修飾。
有利地，對(duì)生殖干細(xì)胞進(jìn)行修飾。
由于只有具有定居于小鼠胚胎生殖系的能力的干細(xì)胞(術(shù)語(yǔ)“ES”細(xì)胞)是可得的，因此，當(dāng)前使用“敲入”或“敲除”技術(shù)的基因組修飾僅限于作為模型的小鼠。當(dāng)可以得到其它物種的ES細(xì)胞系時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易將這些技術(shù)應(yīng)用于其它的物種以產(chǎn)生敲除(KO)和/或敲入(KI)模型。此外，可以使用基于單獨(dú)的或與DNA/RNA修飾酶相結(jié)合的寡核苷酸(DNA、RNA或雜化物)的方法在基因組的特定部位引入限定的修飾/突變。如果誘導(dǎo)基因組發(fā)生隨機(jī)修飾的輻射和化學(xué)誘變劑能夠與一組有效的生物標(biāo)記物(表型)和高通量定位克隆方法結(jié)合，則甚至可以采用輻射和化學(xué)誘變劑。
但是，修飾實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(小鼠、大鼠、牛、豬、綿羊等)基因組的最直接的方法是通過(guò)在單細(xì)胞階段(優(yōu)選地為了避免產(chǎn)生嵌合體動(dòng)物，雖然在兩細(xì)胞或更多細(xì)胞階段也能實(shí)施注入)將線性化DNA微注射進(jìn)入受精卵母細(xì)胞的一個(gè)或兩個(gè)原核中使轉(zhuǎn)基因發(fā)生隨機(jī)整合。按照常規(guī)，轉(zhuǎn)基因是由兩部分組成的控制DNA所編碼RNA時(shí)空表達(dá)的調(diào)節(jié)元件和所述的并列放置的DNA(cDNA或基因組片段)。該兩個(gè)元件(調(diào)節(jié)元件和編碼目的蛋白質(zhì)的DNA)可以是與靶基因組同源的或異源的。有關(guān)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一般選自非人的哺乳動(dòng)物。例如可以是鼠(即小鼠、大鼠和豚鼠)、兔、貓、狗、綿羊或牛。優(yōu)選地，它們是按照常規(guī)轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到的小鼠、大鼠或兔。本發(fā)明的另一個(gè)目的是干細(xì)胞系和由這些干細(xì)胞系分化的細(xì)胞系，在這些細(xì)胞系的基因組中插入了至少一個(gè)攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的外源基因組DNA序列。
簡(jiǎn)言之，通過(guò)采用同源重組將編碼ABCA2蛋白質(zhì)的外源基因組DNA插入動(dòng)物的相應(yīng)基因中(在動(dòng)物基因的啟動(dòng)子后立刻插入轉(zhuǎn)基因，以便強(qiáng)迫轉(zhuǎn)基因進(jìn)入正確地的表達(dá)模式并阻止動(dòng)物的內(nèi)源基因表達(dá)敲除)、或者通過(guò)將本發(fā)明描述的對(duì)應(yīng)于人ABCA2基因的另一個(gè)異形體的特異突變插入動(dòng)物的內(nèi)源基因(在干細(xì)胞中通過(guò)同源重組進(jìn)行修飾敲入)、或者通過(guò)攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的ABCA2基因的超表達(dá)來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，產(chǎn)生了本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、干細(xì)胞系和分化細(xì)胞系。
在小鼠的情況下，這些動(dòng)物有利地可以與攜帶有阿爾茨海默類型突變的人APP基因并發(fā)展成為淀粉斑的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。如此得到的雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物再現(xiàn)了在患有阿爾茨海默病或處于其危險(xiǎn)中的病人中所觀察到的基因型。然后采用前面已經(jīng)描述的技術(shù)，特別是采用擴(kuò)增反應(yīng)(PCR)和/或Southern印跡，可以控制所得到的新生動(dòng)物的rs908832多態(tài)性基因型。
此類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是特別有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈優(yōu)槔斫獍柎暮Ｄ√峁┯欣哪Ｐ?，該模型非常真?shí)地再現(xiàn)了阿爾茨海默病的特征。與已知的模型相比，該模型尤其能夠用來(lái)證實(shí)特別適合治療阿爾茨海默病特別是所述的人阿爾茨海默病的化合物。這些化合物可以是化學(xué)分子、肽或蛋白質(zhì)分子、抗體、嵌合體分子以及反義DNA或核酶。
所證實(shí)的化合物可以用作醫(yī)藥產(chǎn)品，為了得到藥物組合物這些化合物可以是原來(lái)形式的或與可藥用媒介物組合的形式。它們特別是無(wú)菌等滲鹽溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或這些鹽的混合物)，或干燥組合物特別是凍干組合物，在干燥組合物的情況下，當(dāng)加入適量的滅菌水或生理鹽水后可以配制成可注射溶液?？梢圆捎萌S立體定位、局部、經(jīng)口、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、經(jīng)皮方法注射。
對(duì)前述化合物的證實(shí)基于通過(guò)如注射施用將本發(fā)明的動(dòng)物模型與推測(cè)具有作用的化合物或化合物混合物接觸、和測(cè)定化合物特別是在模型的腦內(nèi)對(duì)多種生物化學(xué)和/或組織學(xué)變化的影響。
這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物除了能夠用于活體測(cè)試預(yù)防、減弱或治愈阿爾茨海默病的治療化合物外，還可以提供阿爾茨海默病動(dòng)物模型，其中所述的動(dòng)物模型用于篩選誘導(dǎo)或加速發(fā)病的環(huán)境因素、研究疾病發(fā)展過(guò)程中的行為和研究其中所涉及的多種生物學(xué)機(jī)制，其目的是研究新的醫(yī)藥產(chǎn)品或者確定醫(yī)藥產(chǎn)品的有效量和毒性。因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如前面所描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、干細(xì)胞系或分化細(xì)胞系在測(cè)試旨在預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的化合物或方法的活性中的用途。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及從例如前面描述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提取的細(xì)胞，以及它在證實(shí)旨在治療阿爾茨海默病的化合物中的用途。
證實(shí)上述化合物是基于將從本發(fā)明動(dòng)物模型提取的細(xì)胞與推測(cè)具有作用的化合物或化合物混合物接觸、和測(cè)定化合物對(duì)全細(xì)胞、細(xì)胞勻漿液或亞細(xì)胞組分的多種參數(shù)例如細(xì)胞死亡的影響。
除了前面所列出的以外，本發(fā)明還包括由下面實(shí)施例和附圖
得出的其它特征和優(yōu)點(diǎn)，并且這些實(shí)施例和附圖應(yīng)看作是說(shuō)明本發(fā)明而不是限制其保護(hù)范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1研究病人樣品中ABCA2基因rs908832多態(tài)性的基因型經(jīng)同意后，使用了來(lái)自患阿爾茨海默病的高加索血統(tǒng)病人和對(duì)照個(gè)體的DNA。
通過(guò)確定Coriell研究所(美國(guó))銷售的一份47個(gè)個(gè)體樣品的基因型確定了多態(tài)性的頻率。
為了確定患阿爾茨海默病的病人和對(duì)照的基因型，基于它們?cè)诨蛑械奈恢眉捌漕l率選擇了十個(gè)多態(tài)性(其中包括rs908832多態(tài)性)。
通過(guò)5’核酸酶分析方法(來(lái)自Applied Biosystems公司(Foster City，美國(guó))的區(qū)分等位基因的技術(shù))確定基因型，然后通過(guò)測(cè)試阿爾茨海默病中這些標(biāo)記物中每一個(gè)的關(guān)聯(lián)開(kāi)展了卡方檢驗(yàn)(Chi2)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。為了分析，按照疾病出現(xiàn)年齡(早期出現(xiàn)(65歲以前或65歲)或晚期出現(xiàn)(65歲以后))和其來(lái)源(散發(fā)性(第一例已知病例)或家族性(在同一家族中已有其它病例))分組。
所得到的rs908832多態(tài)性結(jié)果如下
-病人(440個(gè)基因型)中次要等位基因的頻率(T)7.4-對(duì)照(519個(gè)基因型)中次要等位基因的頻率(T)3.4。
證實(shí)了病人和對(duì)照的哈代-溫伯格比例沒(méi)有觀察到顯著偏差，這證實(shí)了沒(méi)有基因型誤差。
在表現(xiàn)出疾病早期形式(65歲以前或65歲)的病人中開(kāi)展測(cè)試的結(jié)果-136例散發(fā)性病例對(duì)272例對(duì)照-異質(zhì)性檢驗(yàn)chi2(1ddl)＝22.69p＝2×10-6-等位基因檢驗(yàn)(頻率(T)對(duì)頻率(C))chi2(1ddl)＝21.27p＝4×10-6-104例家族性病例對(duì)272例對(duì)照-異質(zhì)性檢驗(yàn)chi2(2ddl)＝7.80p＝0.02-等位基因檢驗(yàn)(頻率(T)對(duì)頻率(C))chi2(1ddl)＝7.27p＝7×10-3。
通過(guò)對(duì)表現(xiàn)早期形態(tài)的240個(gè)病人進(jìn)行邏輯回歸估計(jì)了近似值比值比(odd ratio)(關(guān)于性別和APOE-∈4狀態(tài)的調(diào)整)。結(jié)果也是顯著的OR＝3.97IC＝[2.23-7.09]。
甚至通過(guò)Bonferroni方法進(jìn)行相關(guān)性的多重檢驗(yàn)后，所得到值仍然是顯著的(閾值固定在0.05)。
這些結(jié)果表明，ABCA2基因是阿爾茨海默病病因?qū)W中重要的基因。
用危險(xiǎn)性一詞來(lái)講，該結(jié)果與載脂蛋白E4所賦予的危險(xiǎn)性是同一數(shù)量級(jí)的，迄今已知載脂蛋白E4是阿爾茨海默病的最高危險(xiǎn)因子。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生1.表達(dá)人ABCA2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生通過(guò)使用如SculptorTM(Amersham，法國(guó))體外誘變系統(tǒng)進(jìn)行人的ABCA2蛋白質(zhì)的誘變。將ABCA2的編碼區(qū)亞克隆進(jìn)入Bluescript類型克隆載體(stratagene)，并且根據(jù)制造商提供的方法使用包含目的突變的寡核苷酸引入了突變。突變的序列通過(guò)序列分析證實(shí)。
2.ABCA2轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生和鑒定為了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，將編碼ABCA2并表現(xiàn)出人rs908832多態(tài)性次要等位基因的基因組DNA亞克隆入載體的多位點(diǎn)接頭，其中所述的載體用于轉(zhuǎn)基因在一定組織/細(xì)胞類型特異表達(dá)，例如對(duì)于神經(jīng)元細(xì)胞類型特異的THYI(Lüthi等，J.Neuroscience，17，4688-99頁(yè))、PDGF或朊病毒或者對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型特異的GFAP。使用質(zhì)粒制備試劑盒(Qiagen)制備超螺旋DNA。為了微注射，必須使用限定的限制酶消化去除載體序列，留下完整的轉(zhuǎn)基因并從不需要的克隆載體序列中分離出來(lái)。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化包含表達(dá)盒的片段。
對(duì)進(jìn)行微注射的等分試樣在浮式過(guò)濾器(Millipore；膜類型VS；0.025μm)上用TE緩沖液(10mM Tris pH7.4；0.1mM EDTA)透析，然后過(guò)濾(Spin-X；Costar；聚乙酸膜；0.22μm)。為了微注射，將DNA稀釋到終濃度1-2ng/μl。將純化的片段注射入小鼠受精卵母細(xì)胞的兩個(gè)原核之一。將存活胚胎立刻移植到母鼠(假孕)輸卵管中?；蛘咄ㄟ^(guò)PCR或者通過(guò)使用特異探針/序列的Southern分析，確定了新生小鼠中轉(zhuǎn)基因的存在。借助于所有這些分析，可以排除建立者及其后代中轉(zhuǎn)基因的任何較大的重排或缺失。
3.在其基因組中含有人ABCA2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生使用干細(xì)胞同源重組技術(shù)，將具有人rs908832多態(tài)性次要等位基因的ABCA2基因?qū)胄∈蠡虻念A(yù)先確定的目的位置。使用本發(fā)明所述的引物和樣品可以容易地篩選純合小鼠基因組文庫(kù)(λ、BAC、YAC等文庫(kù))以便分離和克隆相應(yīng)的小鼠基因。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(限制位點(diǎn)制圖、測(cè)序、生物分析工具)，可以表征所述小鼠基因的基因組組織結(jié)構(gòu)和其序列，以便確定人DNA應(yīng)該插入的確切位置，通過(guò)該種插入獲得人DNA的目的表達(dá)模式同時(shí)最終打斷小鼠基因的表達(dá)。一旦鑒定出確切位置，可以構(gòu)建用于干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)靶向載體(即具有用于選擇預(yù)期插入事件的標(biāo)記的載體，所有的所述標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的)。迅速地，將選擇盒(用于抵抗抗生素的基因)置于小鼠基因組DNA片段(2-6kb)3’和5’末端的界限內(nèi)，這等同于立即位于插入所選擇位點(diǎn)的鼠ABCA2基因序列序列的3’和5’延伸部分。
在對(duì)鼠基因認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上，為了使高流量篩選方法優(yōu)化并有效，產(chǎn)生了篩選重組干細(xì)胞的陽(yáng)性對(duì)照載體(一旦成功整合，載體就復(fù)制出鼠基因的基因座)。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法，純化DNA用于靶向?qū)嶒?yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)化的電穿孔技術(shù)把靶向載體導(dǎo)入干細(xì)胞中，此后，將細(xì)胞克隆進(jìn)行連續(xù)的篩選過(guò)程(抗生素)以促進(jìn)攜帶目的重組的干細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。一般而言，篩選進(jìn)行大約2周。通過(guò)PCR和/或Southern篩選具有抗性的干細(xì)胞克隆。
將具有目的重組而在其基因組中沒(méi)有任何其它可檢測(cè)修飾的干細(xì)胞克隆生長(zhǎng)以便得到足夠的細(xì)胞。然后，將所述細(xì)胞注射到由自然排卵母體得到的3天半胚胎中。將存活的胚細(xì)胞(含有干細(xì)胞)植入接受母體中，胚細(xì)胞在其中發(fā)育完全并產(chǎn)生新生的小鼠，該小鼠是由起源于宿主胚細(xì)胞和干細(xì)胞克隆的細(xì)胞組成的。該類動(dòng)物稱作“嵌合體動(dòng)物”。
這些嵌合體(優(yōu)選雄性的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)干細(xì)胞系是從雄性小鼠得到的)與野生類小鼠“交配”以便得到所述修飾為雜合的動(dòng)物。飼養(yǎng)雜合子動(dòng)物以產(chǎn)生純合子動(dòng)物。
4.在其相應(yīng)基因中含有人ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生以與前面所描述相同方式，分離鼠基因并進(jìn)行表征。對(duì)于這類修飾，有必要對(duì)人基因和鼠基因進(jìn)行比較，以便鑒定出將人基因點(diǎn)突變必須引入到的鼠基因中的確切位置。在該階段，生物分析是必需的。最后，以與上述相同的方式，開(kāi)發(fā)并裝配靶向載體。在成功同源重組之后，在鼠基因的編碼序列中只存在目的點(diǎn)突變。一些選擇標(biāo)記可以仍保留在內(nèi)含子中，但它們一般對(duì)基因表達(dá)沒(méi)有任何影響。如果必要，可以使用包含重組酶識(shí)別元件的第二代靶向載體去除它們。一旦構(gòu)建體已經(jīng)裝配完畢，則以后的步驟與前面所述方法步驟相同。
通常，為了促進(jìn)淀粉斑的沉積，將這些ABCA2轉(zhuǎn)基因小鼠與表達(dá)攜帶有阿爾茨海默病家族形式突變的APP基因的轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。
5.神經(jīng)組織病理學(xué)腦組織制備將小鼠深度麻醉(戊巴比妥腹腔注射60mg/ml/kg，氯胺酮腹腔注射40mg/ml/kg)，然后先用生理鹽水后用多聚甲醛(4％，溶于PBS)經(jīng)心臟灌注。接著取出大腦并用相同固定液于4℃下后固定24小時(shí)。固定后，將腦分成左半腦和右半腦，并使用標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行石蠟包埋。
將轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠的左半腦進(jìn)行石蠟包埋，將患有阿爾茨海默病和對(duì)照病人的死后人腦組織(額前皮層)塊也用石蠟包埋，并使用切片機(jī)(LEICA RM 2155，法國(guó))將其切成6μm厚度的切片(連續(xù)切片)。轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小鼠右半腦的組織塊切成25μm的厚度。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所描述，檢測(cè)了淀粉樣多肽Aβ的免疫反應(yīng)性。
序列表<110>安萬(wàn)特醫(yī)藥股份有限公司<120>檢測(cè)阿爾茨海默病的方法<130>PRJ03027<160>9<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>562<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1ttcatcacct gcgggtgggc caggggcttg gggcaggccc cggggaggac gccgcccctc 60cctgccagcc cgcgcctcca gggagagtcc cggcccgcgc acctccttga gccggtgctc120cttctccgcc acgatgtgct ggatggtcat ggccacggag tagacccagg agatcaccat180gcacagcggc atcatgtgct caatgacaaa caggaagctg cggggaggcc gcgctcaggc240gccactcagc cccagcccca gccccagccc cgggcgccca gcactcactc atcgcgtgtg300tagcaggggt aggggaacat ctgcacgtag ctgcctggct ccaccacatc gtgccccaca360aaagtgtcga tgatggcgcg ctccatcatg tctgtgggtg ggggcagcca tcaggtgccg420ggcaggccct ctcgtcctca cacctgtcct cccccatgaa tcctccagcc ggtcttccgg480gcctgctcct caccctggat ccagacgaag ccgtagagga agtagaagcg gccgccagta540ttgggcccag gccgccagta gg 562<210>2<211>562<212>DNA<213>人<400>2ttcatcacct gcgggtgggc caggggcttg gggcaggccc cggggaggac gccgcccctc 60cctgccagcc cgcgcctcca gggagagtcc cggcccgcgc acctccttga gccggtgctc120cttctccgcc acgatgtgct ggatggtcat ggccacggag tagacccagg agatcaccat180gcacagcggc atcatgtgct caatgacaaa caggaagctg cggggaggcc gcgctcaggc240
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<211>8154<212>DNA<213>人<400>5ggggcggagc cagcgcggat cgggtcccgg acgcccgagc gccccgcccc cgcgcgggcg 60atgcccagcg gcgcggcggg ctgcggggcc cggcggggcg cgcagaggag cgggccgcgg 120cgctgaggcg gcggagcgtg gccccgccat gggcttcctg caccagctgc agctgctgct 180ctggaagaac gtgacgctca aacgccggag cccgtgggtc ctggccttcg agatcttcat 240ccccctggtg ctgttcttta tcctgctggg gctgcgacag aagaagccca ccatctccgt 300gaaggaagtc cccttctaca cagcggcgcc cctgacgtct gccggcatcc tgcctgtcat 360gcaatcgctg tgcccggacg gccagcgaga cgagttcggc ttcctgcagt acgccaactc 420cacggtcacg cagctgcttg agcgcctgga ccgcgtggtg gaggaaggca acctgtttga 480cccagcgcgg cccagcctgg gctcagagct cgaggcccta cgccagcatc tggaggccct 540cagtgcgggc ccgggcacct cggggagcca cctggacaga tccacagtgt cttccttctc 600tctggactcg gtggccagaa acccgcagga gctctggcgt ttcctgacgc aaaacttgtc 660gctgcccaat agcacggccc aagcactctt ggccgcccgt gtggacccgc ccgaggtcta 720ccacctgctc tttggtccct catctgccct ggattcacag tctggcctcc acaagggtca 780ggagccctgg agccgcctag ggggcaatcc cctgttccgg atggaggagc tgctgctggc 840tcctgccctc ctggagcagc tcacctgcac gccgggctcg ggggagctgg gccggatcct 900cactgtgcct gagagtcaga agggagccct gcagggctac cgggatgctg tctgcagtgg 960gcaggctgct gcgcgtgcca ggcgcttctc tgggctgtct gctgagctcc ggaaccagct1020ggacgtggcc aaggtctccc agcagctggg cctggatgcc cccaacggct cggactcctc1080gccacaggcg ccacccccac ggaggctgca ggcgcttctg ggggacctgc tggatgccca1140gaaggttctg caggatgtgg atgtcctgtc ggccctggcc ctgctactgc cccagggtgc1200ctgcactggc cggacccccg gacccccagc cagtggtgcg ggtggggcgg ccaatggcac1260tggggcaggg gcagtcatgg gccccaacgc caccgctgag gagggcgcac cctctgctgc1320agcactggcc accccggaca cgctgcaggg ccagtgctca gccttcgtac agctctgggc1380cggcctgcag cccatcttgt gtggcaacaa ccgcaccatt gaacccgagg cgctgcggcg1440gggcaacatg agctccctgg gcttcacgag caaggagcag cggaacctgg gcctcctcgt1500gcacctcatg accagcaacc ccaaaatcct gtacgcgcct gcgggctctg aggtcgaccg1560
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1.診斷或預(yù)后個(gè)體阿爾茨海默病的方法，其包括至少一個(gè)檢測(cè)ABCA2基因多態(tài)性存在的步驟。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其包括至少一個(gè)檢測(cè)與阿爾茨海默病遺傳相關(guān)的ABCA2基因多態(tài)性次要等位基因存在的步驟。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其包括至少一個(gè)檢測(cè)ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因存在的步驟。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用生物學(xué)樣品進(jìn)行所述的檢測(cè)步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的診斷或預(yù)后個(gè)體阿爾茨海默病的方法，其中所述生物學(xué)樣品是包含具核細(xì)胞的樣品。
6.如權(quán)利要求4或5所述的診斷或預(yù)后個(gè)體阿爾茨海默病的方法，其中所述生物學(xué)樣品是血液樣品、精液樣品或毛發(fā)樣品。
7.如權(quán)利要求1所述的診斷或預(yù)后個(gè)體阿爾茨海默病的方法，其中檢測(cè)攜帶多態(tài)性DNA存在或缺乏的所述步驟是通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、雜交、在膜上進(jìn)行Southern印跡、核酸酶消化、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)或直接測(cè)序技術(shù)或其組合進(jìn)行的。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其包括a.提取所述個(gè)體的DNA，b.使用能夠擴(kuò)增相應(yīng)于ABCA2基因rs908832多態(tài)性序列的引物擴(kuò)增所述分離DNA，c.確定所擴(kuò)增DNA中至少一種ABCA2基因rs908832多態(tài)性等位基因的存在。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中擴(kuò)增步驟b)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中通過(guò)使用DNA聚合酶I(TaqMan)的5’核酸酶活性的技術(shù)將攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的擴(kuò)增DNA與不攜帶該等位基因的擴(kuò)增DNA相區(qū)別。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析將攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的擴(kuò)增DNA與不攜帶該等位基因的擴(kuò)增DNA相區(qū)別。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中在用瓊脂糖凝膠遷移、在膜上進(jìn)行Southern印跡和雜交之前，已經(jīng)通過(guò)使用限制酶消化所擴(kuò)增DNA得到了限制性片段。
13.檢測(cè)ABCA2基因rs908832多態(tài)性的方法，其包括確定編碼ABCA2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物中第2185位的核苷酸。
14.分析來(lái)自個(gè)體生物學(xué)樣品的方法，其中a.確定ABAC2基因的基因型，和b.轉(zhuǎn)換所得資料，以便預(yù)后所述個(gè)體發(fā)展成阿爾茨海默病的危險(xiǎn)性和該疾病的預(yù)想治療效果。
15.擴(kuò)增rs908832多態(tài)性次要等位基因的引物。
16.如權(quán)利要求15所述的引物，其具有序列SEQ ID No.3中的大約15-30個(gè)之間的連續(xù)核苷酸。
17.如權(quán)利要求16所述的引物，其具有SEQ ID No.6的序列。
18.如權(quán)利要求15所述的引物，其具有與SEQ ID No.3互補(bǔ)的序列中的大約15-30個(gè)之間的連續(xù)核苷酸。
19.如權(quán)利要求18所述的引物，其具有SEQ ID No.7的序列。
20.探針，其具有與SEQ ID No.3互補(bǔ)的序列中的大約12-17個(gè)之間的連續(xù)核苷酸。
21.如權(quán)利要求20所述的探針，其具有SEQ ID No.8的序列。
22.探針，其具有與SEQ ID No.4互補(bǔ)的序列中的大約12-17個(gè)之間的連續(xù)核苷酸。
23.如權(quán)利要求22所述的探針，其具有SEQ ID No.9的序列。
24.與權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的引物和探針互補(bǔ)的引物和探針。
25.診斷和預(yù)后阿爾茨海默病的一組試劑或試劑盒，其包含開(kāi)展檢測(cè)攜帶rs908832多態(tài)性次要等位基因的DNA存在或缺乏所需要的多種成分。
26.如權(quán)利要求25所述的一組試劑，其包含如權(quán)利要求15-19中任意一項(xiàng)所述的一對(duì)引物。
27.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、干細(xì)胞系和由該干細(xì)胞系分化的細(xì)胞系，其中向其基因組中插入至少一個(gè)攜帶ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的外源基因組DNA序列。
28.如權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其選自非人哺乳動(dòng)物。
29.獲得如權(quán)利要求27和28兩者之一所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、干細(xì)胞系和由該干細(xì)胞系分化的細(xì)胞系的方法，其包括產(chǎn)生包含人ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、干細(xì)胞系和由該干細(xì)胞系分化的細(xì)胞系。
30.如權(quán)利要求27和28兩者之一所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、干細(xì)胞系和由該干細(xì)胞系分化的細(xì)胞系的用途，其用于檢測(cè)旨在預(yù)防和/或治療阿爾茨海默病的試劑或方法的活性。
31.從如權(quán)利要求27和28兩者之一所述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提取的細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求31所述的細(xì)胞在證實(shí)旨在治療阿爾茨海默病的化合物中的用途。
33.已知對(duì)阿爾茨海默病有活性的化合物或化合物混合物用于生產(chǎn)治療患有阿爾茨海默病個(gè)體的醫(yī)藥產(chǎn)品的用途，其中在治療前已經(jīng)在所述個(gè)體內(nèi)檢測(cè)到ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的存在。
34.如權(quán)利要求33所述的用途，其中疾病是早期阿爾茨海默病。
35.選擇旨在向個(gè)體施用的化合物的方法，其中所述個(gè)體表現(xiàn)出與ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因相關(guān)的疾病，其中所述方法包括a.至少一個(gè)確定在所述個(gè)體生物學(xué)樣品中存在ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的步驟，和b.如果存在所述等位基因，則選擇適當(dāng)?shù)幕衔铩?br> 36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中與rs908832多態(tài)性次要等位基因相關(guān)的疾病是阿爾茨海默病。
37.選擇旨在向表現(xiàn)出阿爾茨海默病的個(gè)體施用的化合物的方法，其包括a.至少一個(gè)確定在所述個(gè)體生物學(xué)樣品中存在ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的步驟，和b.如果存在所述等位基因，則選擇適當(dāng)?shù)幕衔铩?br> 38.治療阿爾茨海默病的方法，其包括a.至少一個(gè)檢測(cè)個(gè)體存在rs908832多態(tài)性次要等位基因的步驟，和b.向具有ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的個(gè)體施用已知對(duì)阿爾茨海默病有活性的化合物或化合物混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及診斷或預(yù)后個(gè)體阿爾茨海默病的方法。本發(fā)明的方法至少具有一個(gè)檢測(cè)ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因存在或缺乏的步驟。ABCA2基因rs908832多態(tài)性次要等位基因的存在表明個(gè)體可能會(huì)患有阿爾茨海默病或者目前正處于發(fā)展成阿爾茨海默病的日益增加的危險(xiǎn)之中。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1809645SQ200480017275
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月20日
發(fā)明者S·馬賽, S·里卡德, E·庫(kù)贊, L·普拉迭爾, J·貝納維德, J-F·德勒茲 申請(qǐng)人:安萬(wàn)特醫(yī)藥股份有限公司