專利名稱：純化病毒的方法
技術領域：
本文描述的發(fā)明屬于病毒純化領域。
背景技術：
現(xiàn)已重新興起使用病毒來治療癌癥(Lancet Oncology Vol.3，January 2002，page 17)。研究最多的病毒可能是腺病毒，而且最近的大部分工作是由McCormick及其同事完成的。他們使用的腺病毒具有E1B基因缺失，該基因編碼的55kd蛋白質可結合腫瘤抑制基因p53并抑制其功能(Science，1996；vol.274page 373)。病毒以缺乏p53功能的腫瘤為目標，而且已經進入人體臨床試驗。經過遺傳工程改造用于治療癌癥的另一種病毒是單純皰疹病毒。已經構建并測試了不同突變體，包括在ICP34.5和ICP6基因中有突變的突變體。前者編碼所謂的神經毒力因子，而后者編碼核糖核苷酸還原酶的大亞基。ICP34.5突變病毒目前正在進行成膠質細胞瘤患者的I期人體臨床試驗(Market J，et al.，Gene Ther，vol.2000；vol.7page 867)。
除了腺病毒和單純皰疹病毒這兩種研究最多的溶瘤病毒以外，已經、而且還將繼續(xù)對具有溶瘤潛力的其它病毒進行大量工作，包括痘苗病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質炎病毒、水泡性口炎病毒和新城疫病毒(Lancet Oncology Vol.3，January 2002，page 17)。
由于再次興起了將病毒作為溶瘤劑或作為投遞疫苗或基因的手段，在實驗室研究規(guī)模培養(yǎng)和純化病毒的方法顯然不適于若病毒用于治療大量患者而會需要的大規(guī)模生產。研究水平的病毒純化一般使用基于密度的超速離心法進行。雖然該方法已經證明作為研究手段使用是有效的，但是它太昂貴、費時且不易放大用于工業(yè)規(guī)模的生產?？赡芴娲匐x心的方法是層析。
單獨的大小排阻層析或與密度梯度離心相聯(lián)合已經用于純化某些植物病毒(Albrechtsen et al.，J Virological Methods 28245-256，1990)以及牛乳頭瘤病毒(Hjorth andMereno-Lopez，JVirological Methods 5151-158(1982))和蜱傳腦炎病毒(Crookset al.，J Chrom 50259-68(1990))。它還已用于生產重組逆轉錄病毒(Mento，S.J.，Viagene，Inc.，1994 WilliamsburgBioprocessing Conference)。
Haruna等人(Virology 13264-267(1961))報導了使用DEAE陰離子交換層析來純化1、3和8型腺病毒，而Klemperer和Pereir(Virology 9536-545(1959))與Philipson(Virology 10459-465(1960))報導了使用相同方法來純化其它類型的腺病毒。另外，BlancheF.等人(Gene Ther 2000 Jun；7(12)1055-62)描述了用于檢測和純化腺病毒顆粒的改進型陰離子交換HPLC法。
除了大小排阻和陰離子交換層析以外，還使用了其它層析方法來純化病毒。例如，已報導了使用單克隆抗體(單抗)的親和層析是純化大豆花葉病毒的有效方法(Diaco et al.，J.Gen.Virol.67345-351.1986)。Fowler(J Virological Methods 1159-74.(1985))使用單抗親和層析與密度梯度離心相偶聯(lián)來純化埃巴二氏病毒。
O′Keeffe R.等人(Biotechnol Bioeng 1999 Mar 5；62(5)537-45)描述了使用cellufine-硫酸鹽和肝素-HP基質對傳染性單純皰疹病毒疫苗的親和吸附回收。
Huyghe等人(Human Gene Therapy 61403-1416(1995))揭示了用于純化重組腺病毒的幾種方法的比較，這些方法包括陰離子交換層析、大小排阻層析、固定化鋅親和層析、超速離心，其結論是用于純化重組腺病毒的優(yōu)選方法是用核酸酶處理細胞裂解物，隨后使用膜濾器過濾，接著進行DEAE層析，然后進行鋅親和層析。
美國專利號4,724,210描述了用于純化流感病毒的方法。
美國專利號4,725,546描述了用于純化日本腦炎病毒的方法。
美國專利號4,725,547描述了用于純化狂犬病病毒的方法。
美國專利號4,855,055描述了通過化學親和層析對含preS2的乙肝病毒表面抗原進行分離和純化。
美國專利號5,602,023描述了用于制備純化的病毒疫苗的方法，包括通過蔗糖梯度超速離心、再水化和凍干來純化病毒的步驟。
美國專利號5,837,520要求保護用于純化腺病毒的方法，該方法包括用選擇性降解未包裹DNA和RNA二者的酶劑處理含有病毒顆粒的細胞裂解物、將經處理裂解物在第一種樹脂上進行層析、并將第一種樹脂的洗脫物在第二種樹脂上進行層析，其中一種樹脂是陰離子交換樹脂而另一種是固定化金屬離子親和樹脂。
美國專利號6,008,036描述了通過層析用于純化病毒的方法，其中使用陰離子交換層析步驟，隨后進行陽離子交換層析步驟，以及任選地金屬結合型親和層析步驟。
美國專利號6,194,191描述了用于生產純化的腺病毒組合物的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞通過灌注或經由分批補料方法為所述宿主細胞提供養(yǎng)分，用腺病毒感染所述宿主細胞，裂解所述宿主細胞以提供包含腺病毒的細胞裂解物，其中所述裂解是通過受感染細胞的自我裂解而實現(xiàn)的，并由所述裂解物純化腺病毒以提供純化的腺病毒組合物。還要求保護多種層析步驟，包括使用陰離子交換層析。
美國專利號6,261,823中要求保護由病毒制劑純化腺病毒的方法，包括將病毒制劑進行陰離子交換層析、由陰離子交換層析介質洗脫腺病毒、并將陰離子交換洗出液進行大小排阻層析的連續(xù)步驟，其中由大小排阻層析介質洗脫腺病毒。
美國專利號6,383,795要求保護富集腺病毒溶液的方法，該方法使用含有選自下組的結合模塊的陰離子交換層析樹脂以使得腺病毒結合該層析樹脂二甲基氨基丙基、二甲基氨基丁基、二甲基氨基異丁基、和二甲基氨基戊基。然后由樹脂洗脫腺病毒。
美國專利號6,537,793描述了純化腺病毒的方法，包括使生物學培養(yǎng)基接觸含有交聯(lián)瓊脂糖基質和通過柔性臂與交聯(lián)瓊脂糖基質結合的離子交換基團的支持物，以使得生物學培養(yǎng)基與層析支持物之間的接觸將病毒顆粒與生物學培養(yǎng)基分開。
值得注意的是，用于純化病毒的方法的主要特征常常包括陰離子交換層析及隨后的大小排阻層析。最常見的是，在陰離子交換層析之前進行過濾步驟。
就純化的溶瘤病毒或在基因療法中可用作病毒載體的病毒日益增長的需求而言，非常需要有改進的純化方法。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個方面是使用大小排阻層析及隨后的陰離子交換層析的連續(xù)步驟由含有病毒的制劑純化病毒的方法，所述連續(xù)層析步驟的優(yōu)勢在于澄清細胞裂解物制劑、純化病毒、并避免層析緩沖液電導率的調整。
本發(fā)明的另一個方面是使用大小排阻層析和陰離子交換層析的連續(xù)步驟由細胞裂解物制劑純化病毒的方法，其中大小排阻層析包括使用一種或多種不同的多孔層析材料。
本發(fā)明的另一個方面是通過在大小排阻層析前用去污劑溶解細胞裂解物而由含有病毒的細胞裂解物制劑純化病毒的方法。
本發(fā)明的另一個方面是通過在大小排阻層析前用去污劑和核酸酶溶解細胞裂解物而由含有病毒的細胞裂解物制劑純化病毒的方法。
本發(fā)明的特色是在使用大小排阻層析及隨后的陰離子交換層析由細胞裂解物制劑純化病毒時避免了層析緩沖液電導率調整。
本發(fā)明的還有一個特點是涉及可以連續(xù)或串聯(lián)進行的層析從而能夠快速純化的用于純化病毒的方法。
在充分考慮下文所述發(fā)明后，本發(fā)明的這些和其它方面將更為清晰。
附圖簡述附圖證明了本發(fā)明的某些方面，而且通過參照這些附圖中的一幅或多幅圖并聯(lián)合本文所述具體實施方案的詳述可以更好的理解本發(fā)明。


圖1顯示了腺病毒的整個純化工藝的流程圖?！癤AD-7HP”指Amerlite層析步驟；“G-50-Fine”指Sephadex G-50 Fine層析步驟；“AEX”指陰離子交換層析步驟；而UF/DF指超濾步驟。
圖2顯示了由串聯(lián)的Amberlite XAD-7HP/SephadexTMG-50 Fine柱洗脫的病毒制劑洗脫物的層析圖譜。病毒制劑是由受病毒感染的細胞通過用吐溫80和BenzonaseTM裂解細胞而制備的。
圖3顯示了來自Sephadex G-50 Fine柱的洗出液進行Q-Source 30陰離子交換柱的層析圖譜。
發(fā)明詳述收錄在本專利全文中的所有發(fā)表物和專利申請作為參考，其程度與專門和個別指出完整地收錄每一份發(fā)表物或專利/專利申請作為參考相同。
本發(fā)明的實踐采用分子生物學、蛋白質分析和微生物學的技術，這些都屬于本領域熟練從業(yè)人員的范圍之內。這些技術在如CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel et al.，eds.，JohnWiley & Sons，New York，1995中有充分說明。另外，還已經描述了用于轉染細胞、擴增和滴定腺病毒的技術(F.L.Graham et al.，Molecular Biotechnology 3207-220，1995；Crouzet et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 941414-1419，1997；WO 96/25506)。
本發(fā)明的修改和變化對于本領域熟練技術人員而言將是顯然的。本文所述具體實施方案只是作為范例提供的，而且本發(fā)明不應解釋為僅限于此。
本發(fā)明涉及用于由含有病毒的制劑純化病毒的方法?！安《局苿币庵负胁《镜娜魏稳芤海约坝写兓《镜钠渌牧??？梢酝ㄟ^許多方法來生成病毒制劑，包括在體外在宿主細胞中進行培養(yǎng)，包括分批培養(yǎng)、灌注、或細胞工廠法中任一種，或者在合適動物宿主體內進行培養(yǎng)。在前一種情況中，可以由生長培養(yǎng)基收獲、分離受病毒感染的細胞，并且通過裂解細胞釋放病毒、由細胞碎片分離病毒。在后一種情況中，可以切下含有病毒的組織或器官，同樣通過裂解組織或器官所含細胞來釋放病毒，并由細胞/組織碎片分離病毒。還可以由體液純化病毒。
術語“病毒”包括野生的、突變的、和重組的病毒，尤其是腺病毒、單純皰疹病毒、甲肝病毒、慢病毒、痘苗病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質炎病毒、腮腺炎病毒、水皰性口炎病毒、細小病毒B19、和新城疫病毒，但不排除其它病毒。本領域熟練從業(yè)人員將領會到可以使用本發(fā)明的方法通過針對待純化的病毒適當調整其某些方面來純化其它病毒。優(yōu)選的病毒是使用純化方法中的層析步驟即陰離子交換層析易于純化的那些病毒。這些病毒將包括腺病毒、在0.5-1M NaCl之間作為大型寬峰洗脫的慢病毒、在100-125mM NaCl鹽濃度洗脫的傳染性胰腺壞死病毒、甲肝病毒、和細小病毒B19。
“裂解”指通過化學或物理手段或者作為病毒生命周期的一部分打開受病毒感染的細胞從而能夠收集病毒的方法。后一種方法稱為自我裂解。
“澄清”指使用多孔層析材料由病毒制劑純化病毒中的步驟，該步驟在陰離子交換層析步驟之前進行。澄清可以柱層析或分批形式進行。
“澄清層析”指使用多孔層析材料由病毒制劑純化病毒中的澄清步驟。
“多孔層析材料”事實上指常用于主要基于分子大小、較少程度地基于疏水性和電荷來分離分子的任何類型材料。正如本文中例示的，“多孔層析材料”包括葡聚糖(如SephadexTM樹脂)，或是可以由多種材料構成的其它多孔材料，包括瓊脂糖、聚苯乙烯、二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯、硅石、脂族丙烯酸聚合物(如AmberliteTM樹脂)，它們具有多種表面衍生化(如親水的、離子的、疏水性的、等等)，使得雜質得以保留但病毒不停留。
“大小排阻層析”指使用多孔層析材料、優(yōu)選多孔珠來分離分子的方法。大小排阻層析可以由在單一步驟中使用的一種或多種不同類型的多孔層析材料或者在多個分離步驟中使用的一種或多種不同類型的多孔層析材料組成，它們在陰離子交換層析前進行。在用于本文時，使用超過一種多孔層析材料的“大小排阻層析”的范例是AmberliteTMXAD7HP和SephadexTMG-50。
下文討論的層析可以作為單獨的各個步驟、或連續(xù)、或串聯(lián)進行?！按?lián)”指將來自前一次層析的洗出液直接施加到下一次層析而沒有中斷的洗脫物收集步驟。
澄清圖1顯示了用于純化病毒的常規(guī)純化方案。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案包括使用大小排阻層析的澄清，其優(yōu)選由兩種多孔層析材料組成。優(yōu)選的第一種多孔層析材料是由非離子型脂族樹脂構成的，更優(yōu)選地，這些樹脂可以是未經衍生的非離子型脂族丙烯酸聚合樹脂。更優(yōu)選的是由Rhom & Hass制造的Amberlite系列樹脂，包括AmberliteXAD-7HP。最優(yōu)選的是Amberlite XAD-7HP，如實施例中所述以柱形式使用。
需要注意的是，在由某些細胞裂解物純化病毒時，根據存在的細胞聚集體的量，可能需要使用單一多孔層析材料來進行大小排阻層析，并且省略上文所述的大小排阻層析。在這些情況中，采用下文討論的預澄清(即過濾)步驟、接著進行使用單一多孔層析材料(優(yōu)選由葡聚糖制成，更優(yōu)選某些SephadexTM樹脂)的大小排阻層析可能就足夠了。
下文討論的使用SephadexTM樹脂的大小排阻層析和陰離子交換層析步驟在本領域是眾所周知的，而且描述于美國專利號5,837,520、6,194,191、和6,261,823，但不像本發(fā)明一樣作為連續(xù)步驟。
通常，將通過本領域眾所周知的和下文將要描述的方法獲得的細胞裂解物進行澄清。將來自大小排阻層析柱的含有病毒的洗脫物施加到陰離子交換柱上。然后由陰離子交換柱洗脫病毒?？梢酝ㄟ^本領域知道的技術監(jiān)控病毒的洗脫，包括光密度或光散射。另外，可以使用充分建立的測定法測定純化前后的病毒的生物學特性，包括噬斑測定法。
還需要注意的是，本發(fā)明的一項新穎特色是使用大小排阻層析，及隨后的陰離子交換層析。本領域熟練從業(yè)人員使用的現(xiàn)有方法顛倒了這兩個層析步驟的順序。見例如美國專利號6,261,823。
不欲限于任何特定理論，有關在純化過程中在陰離子交換層析前使用大小排阻層析所獲得的有利結果方面，推測它將有助于通過將病毒與低分子量物質和至少部分由脂類物質組成的分子量大得多的聚集體分開來純化病毒。病毒純化領域的熟練從業(yè)人員尚未意識到大小排阻層析的這后一種特性。因此，發(fā)明人出乎意料的發(fā)現(xiàn)了純化病毒的新穎方法。
本發(fā)明由連續(xù)使用大小排阻層析和陰離子交換層析產生的另一項特色是它大大降低了或消除了在層析步驟之間進行緩沖液電導率調整的需要。正如下文更多討論的，為了實現(xiàn)陰離子交換層析的最大效能，用于病毒層析的緩沖液的電導率迄今為止通常需要在各純化步驟之間根據所采用的陰離子交換劑的類型和病毒外殼的電荷性質調整至可接受的范圍之內。本發(fā)明本質上消除了在陰離子交換層析前進行緩沖液調節(jié)的需要，因為大小排阻層析同時將病毒交換到陰離子交換平衡緩沖液中，同時減少了微粒和較低分子量雜質。因此，病毒洗脫物可以直接施加到陰離子交換柱上。
更具體的說，正如本文所特別指出的，大小排阻層析包括使用多孔層析材料或球形珠子形式的樹脂主要基于分子的大小、但也基于疏水性和電荷來分離分子，所述樹脂優(yōu)選惰性凝膠介質，它可以是交聯(lián)多糖的合成物，如交聯(lián)瓊脂糖和/或葡聚糖。交聯(lián)程度決定了膨脹凝膠珠中存在的孔的尺寸。大于某一尺寸的分子不進入凝膠珠，因而最快移動通過層析床。病毒就是如此。較小分子，諸如去污劑、蛋白質、DNA諸如此類，它們根據各自的尺寸和形狀而以不同程度進入凝膠珠，在它們通過柱床時得以駐留。因此，分子通常以分子大小減小的順序洗脫出來。病毒因尺寸大而不進入孔，通常在外水體積中洗脫。如上所述，由于影響緩沖液電導率的分子大多被清除了，因此這一步驟得到的病毒洗脫物處于與陰離子交換層析相容的緩沖液中，從而無需改變緩沖液的電導率。這樣，可以將病毒洗脫物直接施加到陰離子交換柱上。
病毒相對于蛋白質而言是大型分子實體。例如，腺病毒的直徑為大約80nm，因而不能進入珠孔。如上所述，在病毒純化中使用大小排阻層析的另一項有利特色是，如上所述，預計不進入珠子、因而與病毒一起在外水體積中洗脫的、由細胞物質組成的大分子量聚集體和顆粒事實上得到停留，這降低了它們由柱子洗脫的速率。其結果是出乎預料地將病毒與這類物質分離開了。這一結果可能是由于聚集體/顆粒在多孔層析材料之間的空隙即多孔珠之間的空間(其尺寸與填塞在柱床中的微粒的直徑成正比)時變成駐留，或是由于這些聚集體所具有的與大小排阻層析多孔材料的親和力。
適于病毒的大小排阻層析的優(yōu)選多孔層析樹脂由葡聚糖制成，更優(yōu)選由交聯(lián)葡聚糖制成。最優(yōu)選的是可以由Amersham Biosciences以商品名“SEPHADEX”購買的那些樹脂。SEPHADEX或所用的其它大小排阻層析樹脂的類型是待純化病毒類型和含有該病毒的細胞培養(yǎng)物裂解物的性質的函數。Sephadex G-50-Fine顆粒尺寸的范圍是20-80um，可以保持和/或遲滯小于30kD的雜質。這一微粒和孔尺寸的聯(lián)合能夠較好的保留顆粒和低分子量雜質，而且以小于40％(v/v)平衡和加樣時，能夠緩沖液交換到下一個層析步驟即陰離子交換，無需任何額外的電導率調節(jié)。它還容許高分子量病毒迅速流過。
來自不同構造材料的其它大小排阻支持物也是合適的，例如Toyopearl 55F(聚甲基丙烯酸酯，Tosoh Bioscience，Montgomery PA)和Bio-Gel P-30 Fine(BioRad Laboratories，Hercules，CA)。
陰離子交換層析在本發(fā)明純化病毒的澄清過程中在大小排阻層析之后的層析步驟是“陰離子交換層析”。后者使用與惰性聚合物主鏈共價交聯(lián)的帶正電荷有機部分。后者用作樹脂的支持物。代表性的有機部分是從伯、仲、叔、和季氨基衍生的，諸如三甲基氨基乙基(TMAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二甲基氨基乙基(DMAE)、以及諸如聚乙烯亞胺(PEI)等在大約5-大約9的pH范圍內早就具有或將要具有表面正電荷的其它基團。
支持物材料應當是易于衍生化的類型，并且具有優(yōu)良的機械強度。該材料可以是天然聚合物、合成聚合物或共聚物、或者是天然與合成聚合物的混合物。支持物可以采取多孔或非多孔微粒、珠、膜、盤、或片的形狀。這些支持物包括硅石、親水聚合物(MonoBeadsTM，Amersham Corporation，Piscataway，N.J.)、交聯(lián)纖維素(如SephacelTM)、交聯(lián)葡聚糖(如SephadexTM)、交聯(lián)瓊脂糖(如SepharoseTM)、聚苯乙烯、或共聚物，諸如聚苯乙烯-二乙烯基苯或是由寡聚乙二醇、縮水甘油基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、和五赤醇二甲基丙烯酸酯構成且其中移植了丙烯酰胺衍生物聚合鏈的共聚物。
優(yōu)選使用由DMAE、TMAE、DEAE、或季銨基團組成的陰離子交換樹脂。以商品名Fractogel(Novagen)銷售的許多陰離子交換樹脂使用TMAE、DEAE、DMAE作為帶正電荷部分和甲基丙烯酸酯共聚物背景。更優(yōu)選的是使用季銨樹脂的那些樹脂，最優(yōu)選的是以商品名QSOURCE-30(Amersham Biosciences)銷售的季銨樹脂類型。QSOURCE-30具有由以二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯制成的支持物。
陰離子交換層析樹脂可用于傳統(tǒng)(重力)柱層析、或使用輻流或軸流的高壓液相層析裝置、流態(tài)化柱床、或漿液中，例如分批方法。在后一種方法中，通過傾析或離心或過濾或上述方法的聯(lián)合將樹脂與樣品分開。來自大小排阻層析柱的含有病毒的洗脫物可以直接施加到陰離子交換樹脂上，然后通過提高的鹽梯度由該樹脂上洗脫，優(yōu)選梯度，更優(yōu)選氯化鈉分步梯度。
離子交換層析的原理是帶電荷分子可逆地吸附在離子交換劑上，從而能夠通過改變離子環(huán)境而使分子結合或洗脫。離子交換劑上的分離常常以兩個階段來實現(xiàn)首先，使用產生穩(wěn)定且牢固結合的條件使待分離物質與交換劑結合；然后，根據待純化物質的性質用不同pH或離子強度的緩沖液洗脫該物質。
更具體的說，在應用于本發(fā)明時，離子交換層析的基本原理是病毒對交換劑的親和力取決于病毒外殼的電性質以及溶劑中其它帶電荷物質的相對親和力二者。因此，可以通過改變pH從而改變病毒的電荷或者通過添加例如鹽等競爭物來洗脫已結合的病毒。因為不同物質具有不同的電性質，用于釋放的條件隨每一種結合的分子種類而變化。一般而言，為了獲得較好的分離，所選擇的方法或是連續(xù)離子強度梯度洗脫或是分步洗脫。對于陰離子交換劑而言，或是降低pH并提高離子強度，或是僅僅提高離子強度。對于陽離子交換劑而言，可以提高pH和離子強度二者。洗脫工序的實際選擇常常是嘗試和錯誤的結果，并考慮待純化病毒的穩(wěn)定性。
本領域熟練從業(yè)人員將領會用于結合和洗脫病毒的陰離子交換劑、緩沖液、和鹽的類型也將是待純化病毒類型的函數。
最后，可以用由聚偏氟乙烯(PVDF)制成的0.45um或更小的除菌濾器過濾來自陰離子交換柱的洗脫物，并將濾出液濃縮。優(yōu)選的濃縮方法是使用聚醚砜(polyethersulfon，PES)膜的超濾，優(yōu)選500kD聚醚砜(PES)膜。優(yōu)選濾器屬于可以由Millipore公司購買的BioMax盒式系列，或購自AG公司的中空纖維型濾器。合適的超濾濾器也可以由Sartorius和Pall公司購買。
細胞裂解物的制備可以由上文提及的許多來源制備的細胞裂解物純化病毒，包括細胞系、組織、體液、器官等等。常常由受病毒感染的細胞制備的細胞裂解物制劑純化病毒，其中細胞已經使用細胞培養(yǎng)方法進行了培養(yǎng)。例如，可以由受病毒感染的細胞諸如293細胞、HeLa細胞等分離腺病毒?？梢砸愿吒腥緩蛿?MOI)感染細胞以優(yōu)化產量。
可以采用適于由受感染細胞釋放病毒的任何方法來制備含有病毒的細胞裂解物。可以使用本領域知道的技術或者通過自我裂解由受感染細胞釋放病毒。裂解受病毒感染細胞的優(yōu)選方法包括使用低滲液、高滲液、超聲處理、壓力、或去污劑。優(yōu)選技術是使用去污劑，更優(yōu)選的是，根據樣品中DNA和RNA的量，聯(lián)合使用去污劑和核酸酶。
許多去污劑可用于溶解細胞，包括非離子型或離子型去污劑。優(yōu)選的去污劑是非離子性質的，因為它們趨于不破壞病毒結構，因而純化的病毒能維持其生物學活性。此外，它們具有結合病毒外部表面疏水區(qū)的有益特性，而這些區(qū)域與不利的病毒聚集有關。由此，這些去污劑可降低病毒聚集，從而提高純化方法的效率和產量。
廣泛使用的一類非離子型去污劑是TweenTM。TweenTM去污劑是由脂肪酸的聚氧乙烯山梨聚糖酯構成的非變性、非離子型去污劑。TweenTM去污劑通常作為封閉劑用于防止蛋白質與疏水材料諸如塑料或硝酸纖維素的非特異結合，特別是TweenTM20和TweenTM80。在用于本發(fā)明時，這種特性可降低病毒聚集。通常，這些去污劑以0.01-1.0％的濃度使用。
TweenTM20與TweenTM80之間的差異是脂肪酸鏈的長度。TweenTM80衍生自油酸，具有18碳鏈尾，而TweenTM20衍生自月桂酸，具有12碳鏈尾。脂肪酸鏈較長使得TweenTM80去污劑的親水性較TweenTM20低，但兩種去污劑都能溶于水。
另一類非離子型去污劑是TritonTMX去污劑。這類去污劑(TritonTMX-100、X114、和NP-40)具有某些相似的基本特征，但是在它們的特定疏水性-親水性性質上有所不同。這些異類去污劑具有分支的8碳鏈，附著于芳香環(huán)上。分子的這部分對去污劑的疏水性質貢獻最大。TritonTMX-100和NP40在結構和疏水性方面非常相似，而且在大多數應用中可以互換，包括在本發(fā)明中可用于細胞裂解。
另一類非離子型去污劑BrijTM在結構上與TritonTMX去污劑相似，即它們具有附著于疏水鏈上的不同長度的聚氧乙烯鏈。然而，與TritonTMX去污劑不同，BrijTM去污劑沒有芳香環(huán)，而且碳鏈的長度可以變化。BrijTM58在其疏水/親水特征上與TritonTMX-100相似。
還有一類非離子型去污劑由辛基吡喃葡糖苷和辛基硫代吡喃葡糖苷組成。它們是可用于溶解細胞的非變性、可透析去污劑。
用于裂解受病毒感染細胞并由此純化病毒的去污劑的優(yōu)選實施方案是TweenTM20、TweenTM80、NP-40TM、Brij-58TM、Triton XTM-100、或辛基葡糖苷。更優(yōu)選TweenTM-20和TweenTM80。最優(yōu)選以大約1％(v/v)終濃度使用的TweenTM80。
由一種或多種酶組成的酶劑可以用于處理細胞裂解物，優(yōu)選RNA酶和/或DNA酶，或是內切核酸酶的混合物，正如普通熟練技術人員所知道的。眾所周知，核酸可以附著于細胞物質上，它們可通過引起細胞或病毒聚集而干擾本發(fā)明的層析純化方案，導致回收的病毒很少(如果有的話)。優(yōu)選用于此實施方案的酶劑是BenzonaseTM(AmericanInternational Chemicals)，這是一種可快速切割RNA和DNA二者的重組非特異性核酸酶。其它例示性核酸酶包括PulmozymeTM或本領域常用的任何其它DNA酶或RNA酶。
BenzonaseTM快速水解核酸的能力使其成為降低細胞裂解物粘性的理想酶。BenzonaseTM非常適于在純化過程中降低長鏈核酸負荷，從而提高產量。
制備受病毒感染細胞的細胞裂解物的最優(yōu)選方法包括在存在核酸酶、優(yōu)選BenzonaseTM時用去污劑(優(yōu)選Tween 80TM)裂解細胞。
可以通過本領域知道的多種技術來鑒定和/或量化病毒，特別是腺病毒，包括陰離子交換(AEX)HPLC，與Huyghe，et al，Human GeneTherapy 61403-1416(November 1995)中所述相似。在上文所述陰離子交換層析步驟后的任意時間點，也可以通過本領域知道的多種技術鑒定和/或量化病毒，包括測量純化級分的吸光度，優(yōu)選260nm處的吸光度，或者通過光散射觀察病毒顆粒，分別如美國專利號5,837,520和6,316,185中所述。
還有，可以通過感染合適宿主細胞系來測定特定純化步驟后傳染性病毒的回收。例如，可以通過噬斑測定法來鑒定和滴定傳染性腺病毒?；蛘?，可以對受感染細胞進行豐產腺病毒六鄰體蛋白染色。這種染色可以如下進行，即在感染后將細胞用丙酮甲醇固定7天，然后用多克隆FITC標記抗六鄰體抗體(Chemicon，Temecula，加州)進行染色?？梢酝ㄟ^比較層析前后的傳染性來測定純化級分的活性。
預澄清在澄清步驟前，可以對通過去污劑或(如果優(yōu)選的話)去污劑和核酸酶處理得到的細胞裂解物制劑進行處理以除去大顆粒物。這可以通過許多工序來完成，包括低速離心或過濾。優(yōu)選過濾，而且所用濾器的類型(即組成和孔徑)屬于特定病毒純化領域熟練從業(yè)人員的知識范圍之內?？梢允褂糜删郾?、聚砜、PVDF、或醋酸纖維素制成的濾器。優(yōu)選聚丙烯濾器。濾器的優(yōu)選孔隙通常是≤5um。
下列實施例意圖演示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域熟練從業(yè)人員根據本公開書將領會可以在具體實施方案中做出許多變化而得到相似結果，并不違背本發(fā)明的精神和范圍。
實施例實施例1腺病毒的純化圖1顯示了常規(guī)純化方案。在此實施例中描述的純化過程的某些步驟監(jiān)測病毒。該方法包括通過AEX-HPLC測量病毒濃度，與Huyghe，et al，Human Gene Therapy 61403-1416(November 1995)中所述相似。概括的說，用含有300mM NaCl和20mM磷酸鹽緩沖液pH 7.5的緩沖液平衡1ml Resource-Q柱。運行300mM→600mM NaCl線性梯度洗脫病毒，并監(jiān)測260和300nm處的UV吸光度。整合病毒峰的面積，并與經氯化銫純化的參照標準進行比較。
細胞裂解物的制備如Johnson，et al.，Cancer Cell.2002 May；1(4)325-37所述，用腺病毒Onyx 411感染可以由American Type Culture Collection，Accession No.ATCC CCL-2.2獲得的Hela-S3細胞。將70升細胞培養(yǎng)收獲物用0.65um中空纖維過濾系統(tǒng)濃縮大約3倍，添加甘油至終濃度10％(v/v)，將細胞凍結并保持于-70℃。將細胞保持凍結直至使用。取一部分凍結收獲物(大約2,946g物質，體積大約2,860ml)進行純化。恰在純化病毒前，將細胞于2-8℃放置12小時，隨后將細胞在37℃水浴中融化30分鐘，時而攪動直至細胞達到25℃。接著，在用葉輪和帶檔板的容器劇烈攪動融化的溶液時，添加TweenTM80和BenzonaseTM至終濃度分別達到1％和100U/ml。添加了大約320ml 10％TweenTM80溶液和大約1，272ul 250U/ul BenzonaseTM溶液。終體積大約3,182ml。將混合物于室溫繼續(xù)保溫90分鐘，同時以500rpm攪動，此時大多數細胞物質都溶解了。
將溶解的物質用預先清洗過的Profile II，孔度5um的聚丙烯濾器Pall No.PCFY1Y050808過濾。然后，如下所述，將該物質用Amberlite和G50柱進一步澄清和實現(xiàn)緩沖液交換。
澄清通過大小排阻層析用連續(xù)運行的Amberlite XAD-7HP柱(Rhom &Haas)和Sephadex G-50 Fine柱將如上所述制備的大約2797ml溶解物質澄清并實現(xiàn)緩沖液交換。Amberlite柱直徑7cm，床高19.5cm，橫截面積38.5cm2，體積750ml。如下填柱，即將凝膠懸浮于1.5-2倍體積的水中，使樹脂具有漿狀稠度。接著，用2個柱床體積的1N NaOH流過柱子以清潔柱子。在加載細胞裂解物前，用3個柱床體積的水清洗柱子，隨后用含有300mM NaCl，20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的陰離子交換緩沖液(AEX)平衡緩沖液進行平衡。G-50柱直徑20cm，床高26.8cm，橫截面積314.2cm2，體積8420ml。如下制備樹脂，即將其懸浮于20倍(w/v)含有2％苯甲醇的300mM NaCl溶液。為了提高苯甲醇的溶解度，將NaCl溶液加熱至45-50℃。將漿狀G-50樹脂填充到柱子中。在對過濾后的細胞裂解物進行層析前，用3個柱床體積(CV)的陰離子交換緩沖液(AEX)平衡緩沖液平衡柱子。以459ml/分的流速串聯(lián)運行柱子。圖2顯示了層析圖譜。監(jiān)測280nm處的UV吸光度，合并含有病毒的峰，得到大約3608ml，病毒濃度為1.59×1011顆粒/ml。
表1串聯(lián)Amberlite XAD-7HP和Sephadex G-50 Fine層析的工藝(In-Process)和操作參數的概述Amberlite柱尺寸7cm直徑，19.5cm床高，750ml床體積
G-50柱尺寸20cm直徑，26.8cm床高，8420ml床體積
陰離子交換層析(AEX)填充了Source 30-Q(Amersham Corporation)的陰離子交換柱直徑15cm，床高15.5cm，橫截面積176.7cm2，柱床體積2,739ml。由制造商處提貨時，樹脂保存在20％乙醇溶液中。將樹脂重懸于乙醇溶液中，并填充到柱子中。使用前，用大約8,218ml含300mM NaCl，20mMTris(pH 7.5)和2mM MgCl2的AEX平衡緩沖液平衡柱子。以457ml/分的流速進行平衡18分鐘。
接著，將體積3,608ml的G-50洗脫物經由裝有0.5um醋酸纖維素前濾器的0.45um PVDF Durapore-XL(Millipore Corporation)10incapsule filter以457ml/分流速加載到柱子上，隨后用2,739ml含有300mM NaCl、20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的平衡緩沖液進行清洗。然后將柱子清洗兩遍，第一次用含有100mM甘氨酸、20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的溶液，而第二次用含有370mM NaCl、20mM Tris(pH 7.5)和2mM MgCl2的溶液。兩次清洗的體積都是8,218ml，而且以457ml/分的流速運行總計18分鐘。接著，用含有500mM NaCl、20mM Tris(pH7.5)和2mM MgCl2的洗脫緩沖液由陰離子交換樹脂洗脫病毒。
通過監(jiān)測280nm處的UV吸光度，合并Q Source-30柱洗脫物，得到404ml合并液，病毒濃度7.33×1011顆粒/ml。圖3顯示了洗脫圖譜。
添加80％(v/v)甘油溶液使得合并液含10％甘油，終體積462ml。將該物質用0.45um Millipore Durapore，PVDF，Millipak-20濾器進行過濾。
表3Q Source-30陰離子交換層析的工藝和操作參數的概述柱尺寸15cm直徑，15.5cm床高，2,739ml柱床體積
通過超濾/透濾濃縮最后，將由陰離子交換柱得到的洗脫物用裝有0.1sqm 500kD膜的Millipore BioMax膜進行濃縮和透濾。以入口壓力5psi和出口壓力Opsi、入口流速700ml/min運行系統(tǒng)，產生65ml/min的流速。將甘油化的陰離子交換洗脫物首先濃縮約2倍至1.2×1012vp/ml，然后用5倍透析體積(diavolume)的含有10mM Tris(pH 8.0)、20mM NaCl、10％甘油和0.01％Tween 80的配方緩沖液進行緩沖液交換。然后將此配制物凍存于-70℃。
至此已充分描述了本發(fā)明，本領域普通技術人員顯然可以對此進行許多變化和修改而不違背所附權利要求的精神或范圍。
權利要求
1.由含有所述病毒的制劑純化所述病毒的方法，包括下列連續(xù)層析步驟a)將病毒制劑進行大小排阻層析，并由所述大小排阻層析儀洗脫病毒；和b)將步驟a的洗脫物進行陰離子交換層析，并由所述陰離子交換層析儀洗脫病毒。
2.權利要求1的方法，其中所述大小排阻層析由單一多孔層析材料組成。
3.權利要求2的方法，其中所述單一多孔層析材料包含葡聚糖。
4.權利要求3的方法，其中所述單一多孔層析葡聚糖材料是SephadexTM。
5.權利要求1的方法，其中所述陰離子交換層析包括選自下組的層析樹脂三甲基氨基乙基(TMAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二甲基氨基乙基(DMAE)、或季銨。
6.權利要求5的方法，其中所述陰離子交換層析包括季銨層析樹脂Q Source-30。
7.權利要求6的方法，其中在所述陰離子交換層析后接著進行過濾步驟。
8.權利要求7的方法，其中所述過濾步驟是超濾。
9.權利要求1的方法，其中所述病毒制劑包括細胞裂解物。
10.權利要求9的方法，其中所述細胞裂解物是通過下列步驟制備的用病毒感染細胞；在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞；和裂解所述細胞。
11.權利要求10的方法，其中裂解所述細胞包括將所述細胞培養(yǎng)足以容許自我裂解的一段時間。
12.權利要求10的方法，其中裂解所述細胞包括由生長培養(yǎng)基分離細胞并使所述細胞接觸其濃度足以裂解所述細胞的去污劑。
13.權利要求12的方法，其中所述去污劑是非離子型去污劑。
14.權利要求13的方法，其中所述去污劑是Tween80。
15.權利要求10的方法，其中裂解所述細胞還包括用核酸酶處理所述細胞裂解物。
16.權利要求15的方法，其中所述核酸酶包括DNA酶、RNA酶、或二者。
17.權利要求16的方法，其中所述DNA酶包括Benzonase。
18.用于由細胞裂解液純化病毒的方法，所述方法包括兩個步驟第一個步驟包括澄清所述細胞裂解液，其中所述第一步驟產生含有在所述第二步驟中能夠進一步純化的病毒的溶液，所述第二步驟包括將由第一步驟得到的所述溶液進行陰離子交換層析而不調整所述溶液的電導率。
19.權利要求18的方法，其中所述第一步驟包括將所述細胞裂解液進行大小排阻層析。
20.權利要求19的方法，其中所述陰離子交換層析包括使用選自下組的層析樹脂三甲基氨基乙基(TMAE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二甲基氨基乙基(DMAE)、或季銨。
21.權利要求20的方法，其中所述陰離子交換層析包括季銨層析樹脂Q Source-30。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于由細胞裂解物制劑純化病毒的方法，其優(yōu)選由兩個連續(xù)層析步驟組成；第一個是澄清步驟，其中利用大小排阻層析，而第二個是病毒捕獲和釋放步驟，其中使用陰離子交換層析，所述連續(xù)層析步驟具有純化病毒且避免層析緩沖液電導率調整的優(yōu)勢。
文檔編號C12N7/02GK1816619SQ200480016844
公開日2006年8月9日 申請日期2004年6月14日 優(yōu)先權日2003年6月18日
發(fā)明者P·克斯特爾, K·亞納吉馬奇, C·奧爾森 申請人:昂尼克斯藥物公司