專利名稱：埃坡霉素b的制備、分離和純化的方法,及埃坡霉素b的x－射線晶體結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及埃坡霉素(epothilone)B的生產(chǎn)、分離和純化的改進(jìn)方法。例如，這些方法包括生產(chǎn)埃坡霉素B的發(fā)酵過程、通過在樹脂上吸附的分離以及隨后的純化過程。
背景技術(shù)：
埃坡霉素是一類較新的大環(huán)內(nèi)酯化合物，最初由粘細(xì)菌(纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum))發(fā)酵獲得。由于這類化合物具有抗真菌的性質(zhì)最初它們是作為植物保護(hù)劑進(jìn)行研究。然后由于它們對動物細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性埃坡霉素變得引人注意，后來將這種細(xì)胞毒活性表征為微管蛋白聚合劑。現(xiàn)在知道埃坡霉素能發(fā)揮類似于紫杉醇(TAXOLR)的穩(wěn)定微管效應(yīng)和抗快速增殖細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞或其它過度增殖細(xì)胞的疾病的細(xì)胞毒活性。埃坡霉素作為化療劑的用途在Bollaget等，Cancer Research 55，2325，1995中有描述。
埃坡霉素A和B(分別為epo A或epo B)具有下面的結(jié)構(gòu)， 埃坡霉素AR＝H埃坡霉素BR＝Me
獲得埃坡霉素的示意圖由Hofle等在WO93/10121中揭示。Hofle在含碳源、氮源和無機(jī)鹽的介質(zhì)中培養(yǎng)了纖維堆囊菌的菌株。在該菌株的培養(yǎng)過程中加入了吸附劑樹脂。用溶劑從吸附樹脂上洗脫埃坡霉素。通過反相色譜法分離各種埃坡霉素并使其結(jié)晶。然而，Hofle等承認(rèn)這種方法只能生產(chǎn)低數(shù)量的埃坡霉素B，以及在發(fā)酵中埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例也低。這種埃坡霉素B相對于埃坡霉素A的低比例使得純埃坡霉素B的回收困難。因此，在技術(shù)上需要生產(chǎn)埃坡霉素B優(yōu)于埃坡霉素A的改進(jìn)的發(fā)酵方法，以及分離和純化埃坡霉素B的改進(jìn)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)埃坡霉素B的改進(jìn)的發(fā)酵方法。
本發(fā)明還包括用于埃坡霉素生產(chǎn)的通過誘變獲得的纖維堆囊菌新菌株。
本發(fā)明還包括通過對發(fā)酵提供添加劑來提高纖維堆囊菌的新菌株生產(chǎn)的埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例的方法。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，添加劑為丙酸鹽、調(diào)節(jié)至合適的pH的丙酸或另一丙酸鹽前體。
本發(fā)明還包括一種用于使用樹脂從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離埃坡霉素B的改進(jìn)的萃取方法。還包括減少雜質(zhì)含量和改進(jìn)下游處理的洗滌富含埃坡霉素樹脂的方法。
本發(fā)明還包括一種純化埃坡霉素B的改進(jìn)方法。在一實(shí)施方案中，利用結(jié)晶實(shí)現(xiàn)純化。在另一實(shí)施方案中，通過色譜法實(shí)現(xiàn)純化，其中色譜法包括正相色譜法或反相色譜法。在另一實(shí)施方案中，通過結(jié)晶與色譜分離法純化樣品相結(jié)合實(shí)現(xiàn)純化，其中色譜分離法包括正相和反相色譜法。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，樹脂萃取物僅通過結(jié)晶處理。
埃坡霉素B(″e(cuò)po B″)作為中間體用于衍生物1(″D1″)的制備中，(在美國專利6,262,094中作了描述，在此引入作為參考)，其中噻唑環(huán)上的2-甲基被胺取代
衍生物1埃坡霉素B也用于衍生物2(″D2″)的制備中(這種將埃坡霉素B內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成衍生物2內(nèi)酰胺的方法在Borzilleri等，J.Amer.Chem.Soc.122，8890，2000以及WO9902514中作了描述，在此引入作為參考) 衍生物2此外，埃坡霉素B(″e(cuò)po B″)還用于衍生物3(埃坡霉素D，″D3″)的制備中(在美國專利6,320,045作了描述，在此引入作為參考) 衍生物3本發(fā)明還包括利用本文中描述的方法和材料生產(chǎn)的埃坡霉素B的晶形。
應(yīng)當(dāng)理解以上概述和以下的詳細(xì)說明為本發(fā)明的示例，而不是限制本發(fā)明。
附圖簡述本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)、特性和各種特點(diǎn)似乎更充分地體現(xiàn)在附圖上。附圖中
圖1顯示的是晶形epoB-EAβ的單斜晶胞中的分子結(jié)構(gòu)，在該單斜晶胞的客通道(guest channel)中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的乙酸乙酯。
圖2顯示的是晶形epoB-ANβ的單斜晶胞中的分子結(jié)構(gòu)，在該單斜晶胞的客通道中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的乙腈。
圖3顯示的是晶形epoB-Ipβ的單斜晶胞中的分子結(jié)構(gòu)，在該單斜晶胞的客通道中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的異丙醇。
圖4顯示的是晶形epoB-Toβ的單斜晶胞中的分子結(jié)構(gòu)，在該單斜晶胞客通道中含兩分子的埃坡霉素B和兩分子的甲苯。
圖5顯示的是埃坡霉素B的乙酸乙酯溶劑合物(晶形epoB-EAβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖5中，模擬圖是根據(jù)-33℃下單斜晶結(jié)構(gòu)中提煉的原子參數(shù)計(jì)算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖6顯示的是埃坡霉素B的甲苯溶劑合物(晶形epoB-TOβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖6中，模擬圖是根據(jù)-33℃下單斜晶結(jié)構(gòu)中提煉的原子參數(shù)計(jì)算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖7顯示的是埃坡霉素B的乙氰溶劑合物(晶形epoB-ANβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖7中，模擬圖是根據(jù)-40℃下單斜晶結(jié)構(gòu)中提煉的原子參數(shù)計(jì)算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖8顯示的是埃坡霉素B的異丙醇溶劑合物(晶形epoB-IPβ)的PXRD觀察圖(上部)和PXRD模擬圖(底下)。在圖8中，模擬圖是根據(jù)-3℃下單斜晶結(jié)構(gòu)中提煉的原子參數(shù)計(jì)算出的，觀察圖是在+23℃下測量得出的。
圖9顯示的是按照實(shí)施例7步驟A中描述的方法生產(chǎn)的含甲苯的初級的埃坡霉素B溶劑合物的PXRD觀察圖。
圖10顯示的是對于圖9中含甲苯的初級的溶劑合物進(jìn)行的熱分析(DSC和TGA)。
圖11顯示的是按照實(shí)施例7步驟B中描述的方法生產(chǎn)的含甲苯的再結(jié)晶的埃坡霉素B的溶劑合物的PXRD觀察圖。
圖12顯示的是對于圖11中含甲苯的再結(jié)晶的溶劑合物進(jìn)行的熱分析(DSC和TGA)。
圖13顯示的是按照實(shí)施例7步驟C中描述的方法生產(chǎn)的含乙酸乙酯的埃坡霉素B的溶劑合物的PXRD觀察圖。
圖14顯示的是對于圖13中含乙酸乙酯的溶劑合物進(jìn)行的熱分析(DSC和TGA)。
圖15顯示的是按照實(shí)施例7C描述的方法制備的含甲苯的溶劑合物的PXRD觀察圖(上部)，連同室溫下埃坡霉素B的甲苯溶劑合物的PXRD模擬圖(底下)。
圖16顯示的是對于圖15中含甲苯的溶劑合物進(jìn)行的熱分析(DSC和TGA)。
應(yīng)當(dāng)理解這些圖是為了說明本發(fā)明的構(gòu)思，本質(zhì)上不是限制本發(fā)明。為了清楚在圖1-4中埃坡霉素所有的甲基和亞甲基的氫原子都被忽略。在圖1-4中，分子間氫鍵以虛線條顯示在圖的右下和左上部分，且氫鍵長(埃)是指分子間的氧-氧距離。
發(fā)明詳述本發(fā)明描述具體的處理方法和纖維堆囊菌的新突變株，這些突變株一起或單獨(dú)地產(chǎn)生增加埃坡霉素B濃度的發(fā)酵，這主要是通過減少在發(fā)酵過程中埃坡霉素A產(chǎn)生的相對量實(shí)現(xiàn)的。例如，纖維堆囊菌或其它合適的微生物的細(xì)胞經(jīng)一個(gè)或多個(gè)最初的成長期培養(yǎng)擴(kuò)增，于是用于為產(chǎn)埃坡霉素發(fā)酵提供接種物。在發(fā)酵的第一時(shí)段期間，例如大約24-72小時(shí)，當(dāng)細(xì)胞利用介質(zhì)中的營養(yǎng)素時(shí)發(fā)生細(xì)胞生長。此后，將營養(yǎng)素，如維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物和氨基酸(或其它碳或氮源如氨基酸前體)以有助于埃坡霉素產(chǎn)生的量加入到介質(zhì)中。在一實(shí)施方案中，將營養(yǎng)素如維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物和氨基酸以維持發(fā)酵過程中埃坡霉素A或埃坡霉素B的最大生產(chǎn)率的量加入。在一實(shí)施方案中，埃坡霉素A或埃坡霉素B的最大生產(chǎn)率是這樣的生產(chǎn)率與不加入添加劑或營養(yǎng)素相比產(chǎn)生更大量的埃坡霉素A或埃坡霉素B，也比添加劑或營養(yǎng)素以低于最佳的量加入時(shí)產(chǎn)生更大的生產(chǎn)率。在發(fā)酵過程中，將丙酸、其前體或其鹽以有效增加埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例(″產(chǎn)物比例″)的量加入。
本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)埃坡霉素的纖維堆囊菌的新菌株。這些新菌株，尤其是菌株SC16408，已經(jīng)通過誘變繼之以隨機(jī)選擇獲得。
纖維堆囊菌最初是1985年從南非Zambesi河的堤岸收集的土樣中分離得到的。Hofle等首先描述了該生物產(chǎn)生埃坡霉素的特征(上面有引用)。Hofle等使用的菌株稱為So ce90，并保藏在Deutsche Sammiungvon Mikroorganismen(German Collection of Microorganisms，DSM)，保藏號為6773。So ce90菌株經(jīng)過UV誘變繼之以隨機(jī)選擇產(chǎn)生Soce90B2菌株。So ce90B2菌株(也稱為SC16224)生產(chǎn)的埃坡霉素B在振搖燒瓶(例如每個(gè)燒瓶中含1.8w/v％樹脂)中的滴度為約50mg/L或2.8mg/g樹脂例如可為3.5或4.5mg/g)，且埃坡霉素B/A的比例為約0.6。
本發(fā)明中，So ce90B2菌株或其衍生物經(jīng)歷用亞硝基胍(NTG)誘變、繼之以隨機(jī)選擇產(chǎn)生SC16408菌株(以ATCC編號PTA-3880保藏)和SC16449(以ATCC編號PTA-3881保藏)。后面的兩種菌株作為按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定的專利保藏由美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫保藏。選擇過程的詳述在實(shí)施例中闡述。
在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生(例如，在以下定義的生產(chǎn)條件)下每升肉湯體積至少約100mg埃坡霉素B的纖維堆囊菌菌株。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在生產(chǎn)埃坡霉素B的同等條件下產(chǎn)生每升肉湯體積至少80mg埃坡霉素B且埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例為至少1的纖維堆囊菌菌株。在一實(shí)施方案中本發(fā)明提供產(chǎn)生5mg埃坡霉素B/g樹脂的埃坡霉素B、或產(chǎn)生5mg/g樹脂的埃坡霉素B且埃坡霉素B/A的比例為至少1.0的菌株。在另一實(shí)施方案中，埃坡霉素B/A的比例為至少1.5。在另一實(shí)施方案中，埃坡霉素B/A的比例為至少1.5至4.0。
本發(fā)明還涉及通過對發(fā)酵供給添加劑提高纖維堆囊菌生產(chǎn)的埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例的方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，添加劑包括丙酸鹽，在細(xì)胞已經(jīng)生長直到96小時(shí)、但優(yōu)選約24-48小時(shí)之后加入。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，在加入丙酸鹽之前讓細(xì)胞生長大約34小時(shí)。早期GBF的研究探查了，在影響發(fā)酵的其它因素中，丙酸鹽加入到介質(zhì)中的時(shí)間對于埃坡霉素B/埃坡霉素A(B/A)比例增加的改進(jìn)產(chǎn)生0.1％的影響。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)通過供給丙酸鹽或丙酸鈉能明顯提高埃坡霉素尤其是埃坡霉素B的滴度、以及在振搖燒瓶、14L發(fā)酵罐和生產(chǎn)發(fā)酵罐中產(chǎn)生的B/A比例是本發(fā)明的特點(diǎn)之一。供給丙酸鹽或丙酸鈉引起埃坡霉素B的滴度明顯提高。例如，埃坡霉素B的燒瓶生產(chǎn)可通過以下方式提高一旦開始供給就定期地(例如，每天)補(bǔ)充丙酸鈉至優(yōu)選范圍0.05到0.80mg/ml(0.005-0.08％)內(nèi)，更優(yōu)選在0.005-0.04％的范圍內(nèi)，這可在培養(yǎng)物中進(jìn)行監(jiān)測。在一實(shí)施方案中，培養(yǎng)物中丙酸鹽的量定在0.02％或更低。此外，還發(fā)現(xiàn)其它丙酸鹽相關(guān)的化合物包括但不限于丙酸甲酯和丙酸乙酯能提高埃坡霉素B生產(chǎn)量和B/A比例。
在一實(shí)施方案中，尤其是用于燒瓶中的發(fā)酵，加入含磷酸二氫鹽和磷酸氫鹽混合物的其它進(jìn)料，磷酸二氫鹽和磷酸氫鹽所選擇的比例能維持合適的pH?？蓪⑦@種進(jìn)料摻入到丙酸鹽進(jìn)料中或分開加入。
本發(fā)明中，描述了大規(guī)模的埃坡霉素純化的方法，該方法成功地利用了樹脂的加入。發(fā)現(xiàn)這種樹脂的摻入對于埃坡霉素的分離和純化是有用的，它能顯著地提高埃坡霉素的滴度。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樹脂為苯乙烯/二乙烯基苯聚合樹脂，如XAD樹脂，優(yōu)選XAD-16或同等物(可以Amberlite XAD-16的商品名購自Sigma-Aldrich，St Louis，MO或Rohm和Haas公司，Philadelphia，PA)。其它帶有疏水性表面的Amberlite樹脂也可用于本發(fā)明中，如基于苯乙烯的XAD 4、XAD-1180或XAD-1600(Rohm和Haas公司)，還有樹脂如基于苯乙烯的XD-207、HP20、HP21、SP825、SP850、SP700或SP207(由于加入溴基團(tuán)疏水性更強(qiáng))(這些樹脂由Mitsubishi，Tokyo，Japan或Mitsubishi Chemical America，Inc.White Plains，NY生產(chǎn))。可將樹脂以較寬的含量范圍摻入介質(zhì)中，如0.2w/v％至5.0w/v％，優(yōu)選1.5w/v％至4.0w/v％。
含源自發(fā)酵的埃坡霉素的樹脂任選地用水與20-30％乙腈水溶液或甲醇水溶液洗滌以除去極性雜質(zhì)，或用含洗滌劑和一定量的胺的溶液洗滌(以堿形式加入到溶液中)，其中洗滌劑優(yōu)選離子型洗滌劑如基于烷基硫酸鹽的洗滌劑。選擇各成分的量以提高后面的由樹脂中獲得的埃坡霉素萃取物的質(zhì)量。一種優(yōu)選的水洗滌劑使用了0.5w/v％十二烷基硫酸鈉和0.5w/v％氨。在最后的實(shí)施方案中，在溶劑萃取之前優(yōu)選地將樹脂用水洗滌一次或多次。
優(yōu)選地將含發(fā)酵獲得的埃坡霉素用與水相不混溶的(不發(fā)生相分離的)溶劑如乙酸乙酯或甲基叔丁基醚(MTBE)萃取以移去吸附在樹脂上的埃坡霉素?？捎糜谳腿“Ｆ旅顾谺的其它溶劑包括正丁醇、乙酸異丙酯、乙酸正丙酯、乙酸正丁酯和乙酸叔丁酯。優(yōu)選地將富溶劑萃取物濃縮，并將埃坡霉素B從濃縮物中結(jié)晶。在一實(shí)施方案中，將富溶劑用水洗滌，并將水洗滌過的富溶劑濃縮和任選地研磨過濾。當(dāng)溶劑合適時(shí)，如為乙酸乙酯，通過將蒸鎦溶劑交換到反溶劑中從而使埃坡霉素B結(jié)晶出來。換而言之，將相對高沸點(diǎn)的第二種溶劑(埃坡霉素B基本上不溶于其中)加入到富溶劑中，并將富溶劑蒸發(fā)至足以產(chǎn)生結(jié)晶。可用真空推進(jìn)或促進(jìn)蒸餾。在一實(shí)施方案中，將溶劑濃縮并加入適量的反溶劑。適用的反溶劑包括甲苯、己烷和庚烷?？蓪⑺玫臐{液加熱、并冷卻至所選擇的設(shè)定溫度以提高產(chǎn)生的晶體的質(zhì)量?？勺兓瘻囟纫蕴岣呔w的純度、使粉末減至最少、和產(chǎn)生更快的過濾漿液。對于其它的溶劑，如MTBE，蒸鎦濃縮富溶劑能產(chǎn)生冷卻時(shí)的有效結(jié)晶環(huán)境(不使用反溶劑)。優(yōu)選地將所得的晶體過濾生產(chǎn)初級的埃坡霉素B。
在萃取和最初的結(jié)晶過程中埃坡霉素B與存在于初始萃取物中的大多數(shù)雜質(zhì)尤其是埃坡霉素A分離。初級的埃坡霉素B通常含有埃坡霉素A，它是一種主要雜質(zhì)。通常還存在由發(fā)酵產(chǎn)生的兩種其它的結(jié)構(gòu)相似的雜質(zhì)，即下面的噁唑類似物和乙基噻唑類似物 噁唑 乙基噻唑隨后使用的本文中描述的用于埃坡霉素B純化的方法(包括再結(jié)晶和色譜分離步驟)尤其包括除去這兩種化合物至它們的含量不再顯著。
然后可將初級的埃坡霉素B(即含甲苯的晶形epo B，初級)，優(yōu)選按上述方法獲得的埃坡霉素B，通過在乙酸乙酯中加熱接著加入甲苯并繼續(xù)加熱再結(jié)晶。然后冷卻該混合物，將所得的結(jié)晶漿液過濾并用甲苯洗滌濾餅得曾經(jīng)再結(jié)晶的埃坡霉素B(即含甲苯的晶形epoB，再結(jié)晶的)。另外，可將初級的埃坡霉素B經(jīng)實(shí)施例中描述的制備型高效反相色譜(例如，在RP/C-18柱上)步驟處理。任選地，在將埃坡霉素樣品裝入柱子之前，預(yù)先加入一定體積的合適的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物以減少埃坡霉素沉淀。在一實(shí)施方案中，有機(jī)溶劑為諸如二甲亞砜(DMSO)的有機(jī)溶劑。任選地，加入痕量的合適的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物以減少埃坡霉素沉淀。然后用合適的有機(jī)溶劑、有機(jī)溶劑的混合物或有機(jī)溶劑的水溶液洗脫。在一實(shí)施方案中，用乙腈和水的混合物洗脫埃坡霉素。例如，使用這類溶劑的洗脫圖可以是線性的或梯度的，對其進(jìn)行選擇以獲得低的雜質(zhì)含量。將含埃坡霉素B的部分合并、濃縮、并用包括但不限于乙酸乙酯的溶劑萃取。然后將該富溶劑的萃取物濃縮和結(jié)晶(例如通過加入低極性溶劑如正庚烷或庚烷)，任選地冷卻。過濾漿液，用溶劑/反溶劑(所選擇的比例和量不致溶解大量的埃坡霉素B)如比例為2∶1的乙酸乙酯/正庚烷洗滌。將洗滌過的晶體干燥得高質(zhì)量的埃坡霉素B。
也可使用其它的提純方法，例如在正相(如硅土、或以硅土為基礎(chǔ)的正相等)色譜分離法。例如，可應(yīng)用高效正相色譜分離法?？蓪悠芬暂^低極性的溶劑如二氯甲烷裝在柱子上，并用較高極性的溶劑如乙酸乙酯和庚烷的混合物洗脫埃坡霉素。例如，使用這類溶劑的洗脫圖可以是線性的或梯度的，對其進(jìn)行選擇以獲得低的雜質(zhì)含量。將該需要的部分合并、濃縮和結(jié)晶，例如通過加入低極性溶劑如正庚烷、庚烷或甲苯從乙酸乙酯中結(jié)晶。過濾漿液，用溶劑/反溶劑(所選擇的比例和量不致溶解大量的埃坡霉素B)如比例為2∶1的乙酸乙酯/正庚烷或乙酸乙酯/甲苯洗滌。將洗滌過的晶體干燥得高質(zhì)量的埃坡霉素B。
在某些情況下不需要除去乙基噻唑或噁唑類似物，如在D1的合成中，可通過單獨(dú)結(jié)晶純化埃坡霉素B。例如，將固體埃坡霉素B物溶解在溫?zé)岬囊宜嵋阴ブ胁⑼ㄟ^冷卻至環(huán)境溫度或通過冷卻器結(jié)晶(或再結(jié)晶)，接著過濾并干燥(例如，在真空中)?？芍貜?fù)結(jié)晶以獲得所需的純度，如結(jié)晶2至3次。
例如，用于使產(chǎn)埃坡霉素的微生物生長的生長培養(yǎng)基可配制如下
1也可以其它脫脂乳、豆粉、酵母萃取物和Maltrin淀粉替換使用取得同等的結(jié)果。
例如用于使產(chǎn)埃坡霉素的微生物生長和用于生產(chǎn)埃坡霉素的生產(chǎn)培養(yǎng)基，尤其是振搖燒瓶中的培養(yǎng)基，可按上述配方進(jìn)行配制，只是甘油有如下的差異、以及有下述的樹脂的加入
有效的營養(yǎng)料液，尤其是用于振搖燒瓶中的營養(yǎng)料液，含有
這種營養(yǎng)料液可進(jìn)一步含如下的磷酸二鈉和磷酸一鈉的混合物
選擇磷酸二鈉與磷酸一鈉的比例以使加料時(shí)培養(yǎng)物偏離所需的pH的pH變化最小。
為了在發(fā)酵罐中使用，優(yōu)選地將如上所述的除HEPES(優(yōu)選地將HEPES除掉)之外的營養(yǎng)組分與消泡劑(例如源自Dow Corning，AFEmulsion，食品級)一起使用，消泡劑的加入如下
可將苛性堿(氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液)加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中以維持有效的pH范圍。樹脂可加入如下
在生產(chǎn)發(fā)酵過程中，優(yōu)選地將丙酸鹽和營養(yǎng)素根據(jù)需要分開加入。例如，丙酸鹽進(jìn)料可含80至150g/L丙酸鈉，所加入的最優(yōu)選的量應(yīng)將丙酸鹽含量維持(例如，由HPLC測定)在0.05至0.20mg/mL?？稍趯⑵鹗寂囵B(yǎng)物加入到發(fā)酵罐20-40小時(shí)之后開始加入丙酸鹽。補(bǔ)充營養(yǎng)素，例如補(bǔ)充下述的無菌原料
對于較長時(shí)期的發(fā)酵，優(yōu)選地加入其它營養(yǎng)素，例如加入下述無菌的原料，與前述的原料相比其加入量較大
可對上述兩種營養(yǎng)素進(jìn)行選擇以防止引發(fā)生長期。
本發(fā)明包括生產(chǎn)埃坡霉素B的方法，其中埃坡霉素B(″e(cuò)po B″)被轉(zhuǎn)化為下式的衍生物1(″D1″)(在美國專利6,262,094中有記載，在此引入作為參考)
衍生物1本發(fā)明還包括生產(chǎn)埃坡霉素B的方法，其中埃坡霉素B被轉(zhuǎn)化為下式的衍生物2(″D2″)(在Borzilleri等，J.Amer.Chem.Soc.122，8890，2000和WO99/02514中有記載，在此引入作為參考)
衍生物2
本發(fā)明還包括生產(chǎn)epothiione B的方法，其中epothiione B(″e(cuò)poB″)被轉(zhuǎn)化為下式的衍生物3(埃坡霉素D，″D3″)(在美國專利6,320,045中有記載，在此引入作為參考) 衍生物3埃坡霉素B的晶形申請人還利用本發(fā)明的方法和本文中描述的物質(zhì)已經(jīng)獲得多種埃坡霉素B的晶形。利用不同的溶劑和溶劑體系獲得了多種埃坡霉素B晶體。例如，中請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了含甲苯的埃坡霉素B溶劑合物晶形，本文中稱為epoB-Toβ，該晶形具有下面的表1所報(bào)告的晶胞數(shù)據(jù)。埃坡霉素B含甲苯的溶劑合物的晶形進(jìn)一步用本文中的圖9-12和圖15和16說明。申請人還利用乙腈(即epoB-ANβ)、乙酸乙酯(即epoB-Eaβ)、和異丙醇(即epoB-Ipβ)、以及在下面的實(shí)施例中所述的溶劑體系獲得了多種埃坡霉素B晶體。這些結(jié)晶學(xué)的異構(gòu)形式具有單斜晶籠形結(jié)構(gòu)，其中P21晶架群含有親脂性溶劑通道，這些通道沿b軸貫穿整個(gè)晶體(1個(gè)通道/晶胞)。每個(gè)通道可容納最高達(dá)兩個(gè)溶劑分子如甲苯、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇、或MTBE(理想地產(chǎn)生1∶1的埃坡霉素B溶劑合物)。從甲苯/乙酸乙酯的溶劑混合物(例如，1∶1混合物)中結(jié)晶導(dǎo)致甲苯優(yōu)先摻入到籠形結(jié)構(gòu)的通道中(即，獲得晶形epoB-TOβ，而不是epoB-EAβ)。埃坡霉素的氫鍵給體(羥基)包含于埃坡霉素間的氫鍵中，不能有效地與客溶劑結(jié)合，而是抑制這種結(jié)合。
晶形epoB-TOβ、epoB-ANβ、epoB-EAβ和epoB-IPβ顯示出表1所示的晶胞數(shù)據(jù)獲得這些含甲苯、乙腈、乙酸乙酯和異丙醇的晶形的結(jié)晶結(jié)晶條件在下面的實(shí)施例中給出。利用實(shí)施例7中描述的方法制備的晶體的PXRD圖顯示在圖9、11和13中，在下面還作了進(jìn)一步的描述。
制成表的這些晶形的具體示例性的參數(shù)如下，如表1所示
epoB-ANβ、epoB-EAβ、epoB-IPβ和epoB-Toβ的部分原子坐標(biāo)分別如表2、3、4和5所示。圖9、11和13顯示的PXRD圖由下面的表6、7和8中所列的數(shù)據(jù)表征。
表1晶胞數(shù)據(jù)
1計(jì)算的理想密度，假設(shè)1∶1溶劑占有率表2埃坡霉素B乙腈溶劑合物的部分原子坐標(biāo)EpoB-ANβ晶形(大部分氫原子被忽略)原子XY ZC1 0.4422 0.23800.3076C2 0.5619 0.28820.3165C3 0.6422 0.18330.3013C4 0.7565 0.22630.2807C5 0.8531 0.28470.3800C6 0.8409 0.41800.4193C7 0.8968 0.42180.5419C8 0.8360 0.33450.5975C9 0.7205 0.39350.6018C10 0.6345 0.29470.6184C11 0.5287 0.36090.6355C12 0.4328 0.27220.6397C13 0.3118 0.26740.5573C14 0.2626 0.34350.4562C15 0.2748 0.27890.3613O16 0.3977 0.30840.3684C16 0.7197 0.31940.1878C17 0.8080 0.10510.2508C18 0.9083 0.51120.3717C19 0.9258 0.30480.7095C20 0.4763 0.15720.7109C21 0.1833 0.32700.2580C22 0.1927 0.46560.2359C23 0.1008 0.24580.1993C24 -0.0043 0.26760.1034C25 -0.0708 0.17280.0409C26 -0.1519 0.3799-0.0163C27 -0.2252 0.4942-0.0664S -0.1936 0.2297-0.0595N -0.0507 0.38730.0719O1 0.3897 0.15010.2552O2 0.6748 0.10450.3926O5 0.9464 0.22780.4266O7 0.8893 0.54850.5778O12 0.3313 0.33590.6550H3 0.5936 0.12830.2313H6 0.7466 0.44260.3937H7 0.9913 0.39420.5683H8 0.8117 0.24710.5514H13 0.2618 0.17940.5410H15 0.2633 0.17780.3662
H3O0.66910.01540.3705H7O0.96360.59940.5825N270.46090.50490.0188(乙腈)C280.39630.40800.0038(乙腈)C290.33790.2975-0.0775(乙腈)
表3埃坡霉素B乙酸乙酯溶劑合物的部分原子坐標(biāo)晶形EpoB-EAβ(大部分氫原子被忽略)原子X Y ZC1 0.44000.24380.3107C2 0.56050.29430.3190C3 0.64160.19040.3056C4 0.75590.23270.2857C5 0.85320.29130.3822C6 0.84100.42280.4212C7 0.89570.42750.5404C8 0.83190.34050.5928C9 0.71640.40000.5966C10 0.62980.30420.6134C11 0.52310.37170.6266C12 0.42660.28440.6321C13 0.30660.27800.5503C14 0.25810.35260.4526C15 0.27060.28670.3589O16 0.39400.31480.3668C16 0.72030.32720.1940C17 0.80790.11210.2559C18 0.90920.51600.3757C19 0.92270.30990.7056C20 0.46670.17030.7040C21 0.18000.33350.2576C22 0.18870.46880.2331C23 0.09620.25060.2011C24 -0.0076 0.26870.1042C25 -0.0762 0.17060.0472C26 -0.1515 0.3743-0.0242C27 -0.2158 0.4821-0.0821S -0.1923 0.2232-0.0566N -0.0487 0.38470.0652O1 0.38780.15590.2575O3 0.67490.11370.3972O6 0.94640.23370.4280O7 0.88890.55260.5755O12 0.32570.34840.6457H3 0.59270.13460.2372H6 0.74630.44780.3947H7 0.98840.39920.5620H8 0.80800.25330.5499H13 0.25730.19110.5357H15 0.25750.18630.3624
H3O0.67130.01500.3759H7O0.97450.59940.5930O280.52420.57940.0077(乙酸乙酯)O310.41790.43260.0063(乙酸乙酯)C280.47310.50980.0256(乙酸乙酯)C290.42650.47050.0892(乙酸乙酯)C310.36100.3621-0.0408 (乙酸乙酯)C300.25480.3272-0.0460 (乙酸乙酯)
表4埃坡霉素B，異丙醇溶劑合物，EPoB-IPβ晶形的部分原子坐標(biāo)(大部分氫原子被忽略)原子 X Y ZC10.44180.25480.3104C20.56090.30550.3186C30.64290.20090.3049C40.75650.24620.2851C50.85410.30180.3837C60.84100.43570.4229C70.89770.43900.5415C80.83450.34930.5940C90.71840.41070.5972C10 0.63250.31110.6156C11 0.52610.37930.6303C12 0.42920.28920.6329C13 0.30870.28420.5528C14 0.26070.36300.4551C15 0.27360.29320.3613O16 0.39500.32410.3669C16 0.71790.33800.1935C17 0.80840.12500.2541C18 0.90980.52900.3774C19 0.92690.32220.7069C20 0.47420.17360.7031C21 0.18070.33870.2590C22 0.18790.47800.2352C23 0.10280.25300.2009C24 -0.0041 0.27240.1029C25 -0.0678 0.17120.0456C26 -0.1517 0.3781-0.0198C27 -0.2289 0.4888-0.0775S -0.1896 0.2262-0.0575N -0.0526 0.38930.0653O10.39030.16570.2594O30.67630.12390.3954O50.94850.24590.4293O70.88980.56420.5781O12 0.32830.35390.6476H30.59460.14570.2365H60.74640.45970.3977H70.99150.41150.5668H80.81110.26250.5504H13 0.25820.19710.5380H15 0.26400.19270.3679
H3O0.67310.02600.3733H7O0.95990.62230.5696O280.43440.21220.0495 (異丙醇)C280.36010.2863-0.0462 (異丙醇)C300.43510.3798-0.0762 (異丙醇)C290.24600.3279-0.0487 (異丙醇)
表5埃坡霉素B乙腈溶劑合物的部分原子坐標(biāo)晶形EpoB-TOβ，(大部分氫原子被忽略)原子X Y ZC1 0.43140.22110.3158C2 0.55810.27390.3228C3 0.63950.17040.3110C4 0.75060.20810.2888C5 0.85090.27460.3880C6 0.84140.40430.4212C7 0.89760.40530.5382C8 0.83720.32340.5911C9 0.72040.38120.5930C10 0.63120.27900.6075C11 0.52550.34940.6227C12 0.43020.25880.6250C13 0.30140.25370.5473C14 0.25380.33610.4501C15 0.26430.26400.3626O16 0.38770.29640.3648C16 0.71580.31230.2026C17 0.80820.09070.2610C18 0.90610.49610.3806C19 0.93230.29510.6989C20 0.47030.14470.6945C21 0.17020.31700.2598C22 0.17090.44860.2391C23 0.08980.22300.2030C24 -0.0145 0.24620.1060C25 -0.0811 0.14300.0546C26 -0.1432 0.3561-0.0251C27 -0.2089 0.4563-0.0926S -0.1987 0.1985-0.0555N -0.0507 0.36320.0580O1 0.38380.13030.2676O3 0.67420.09560.3983O5 0.94680.21690.4313O7 0.89120.53290.5727012 0.32540.32550.6408H3 0.58160.10620.2496H6 0.74570.42640.3944H7 0.99190.37190.5628H8 0.81410.22970.5521
H130.28710.15290.5221H150.25670.15890.3722H3O0.6633-0.0000.3785H7O0.96630.57560.5776C280.42580.43170.0030(甲苯)C290.35260.39960.0429(甲苯)C300.25860.32390.0126(甲苯)C310.22450.2386-0.0713(甲苯)C320.29840.2800-0.1182(甲苯)C330.39230.3496-0.1016(甲苯)C340.50430.4979-0.0119(甲苯)
表6埃坡霉素B含甲苯的溶劑合物的PXRD數(shù)據(jù)，利用實(shí)施例7的方法步驟A生產(chǎn)如圖9所示
表7埃坡霉素B含甲苯的溶劑合物的PXRD數(shù)據(jù)，利用實(shí)施例7的方法步驟B生產(chǎn)，如圖11所示
表8埃坡霉素B含乙酸乙酯的溶劑合物的PXRD數(shù)據(jù)，利用實(shí)施例7的方法步驟C生產(chǎn)，如圖13所示
定義就本申請而言，下列術(shù)語有如下所述的各自的含義“埃坡霉素B比較生產(chǎn)條件?！睘榱藴y量埃坡霉素B相對于埃坡霉素A的生產(chǎn)量，或菌株之間埃坡霉素B的凈生產(chǎn)量，需要標(biāo)準(zhǔn)的條件。埃坡霉素B比較生產(chǎn)條件″的含義如下。應(yīng)當(dāng)注意標(biāo)準(zhǔn)條件可以按實(shí)施例中的描述進(jìn)行適當(dāng)?shù)負(fù)Q算(例如，按照實(shí)施例2中的125mL生產(chǎn)燒瓶換算)1)F1階段將1mL冷凍的小瓶或維持燒瓶轉(zhuǎn)入125mL裝有約(ca.)10mL培養(yǎng)基E(如下所述的組合物)的燒瓶中。將F1燒瓶在30℃和160rpm下保溫3-4天。
2}F2階段將F1燒瓶(約10mL)中的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)入(10％)250mL含90mL培養(yǎng)基E的燒瓶中。將該F2燒瓶同樣在30℃和160rpm下保溫3-4天。
3)生產(chǎn)階段
將生產(chǎn)燒瓶(250mL裝有90mL培養(yǎng)基E的燒瓶，參見下面的培養(yǎng)基配方)以F2階段培養(yǎng)物灌輸至10％的量(10mL)。另外，可以運(yùn)用″固定燒瓶″，這些固定燒瓶由常規(guī)燒瓶每3-4天移植5％至10％的量而來。生產(chǎn)階段摻入至少15g/L的樹脂。一旦接種，生產(chǎn)燒瓶就在30℃和160rpm下保溫14天。摻入進(jìn)料以提高埃坡霉素B/A的比例。進(jìn)料從接種后72小時(shí)開始加入如下每個(gè)生產(chǎn)燒瓶(100mL培養(yǎng)物容量)每天加入1mL進(jìn)料，從3-11天開始，需要時(shí)繼續(xù)加入直到第14天。
含丙酸鹽的進(jìn)料裝有10％Maltrin-M040、4％丙酸鈉、和3％Tastone-154，這樣當(dāng)按所述方式以100倍稀釋倍數(shù)加入時(shí)，每天在培養(yǎng)肉湯中的最終濃度變成0.1％Maltrin-M040、0.04％丙酸鈉、和0.03％Tastone-154(不包括先前加入的剩余含量)。通常采集燒瓶用于接種后14天的分析。
“丙酸前體”是指可以有效產(chǎn)生丙酸的量加入到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)物中的任何化合物，其中丙酸的量能有效增加埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例。例如，丙酸可以用不穩(wěn)定的酯通過細(xì)胞的酶作用自然產(chǎn)生。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能識別用于產(chǎn)生丙酸或用于增加埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例易于試驗(yàn)的侯選化合物。例子包括丙酸的甲酯和乙酯。
“進(jìn)料，”是指將至少一種或多種營養(yǎng)素或添加劑，如丙酸鹽、丙酸鈉、含丙酸鈉的混合物或溶液、維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物源或氨基酸源，在發(fā)酵過程期間不只一種場合加入，例如定時(shí)地、通過脈動進(jìn)料、通過基本上連續(xù)進(jìn)料等等。應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語“不只一次加入”的含義包括在整個(gè)發(fā)酵期間連續(xù)進(jìn)料。
“含甲苯”是指一種主要含一定量的甲苯溶劑合物，甲苯的量可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員運(yùn)用分析技術(shù)進(jìn)行測量，其中含甲苯的溶劑合物可含有也可不含有一種或多種其它溶劑。
“含乙酸乙酯”是指一種主要含一定量的乙酸乙酯的溶劑合物，乙酸乙酯的量可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員運(yùn)用分析技術(shù)進(jìn)行測量，其中含乙酸乙酯的溶劑合物可含有也可不含有一種或多種其它溶劑。
實(shí)施例以下實(shí)施例是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的，除另有詳細(xì)的說明外。這些實(shí)施例是示例性的，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1通過突變和選擇制備SC16408菌株，以及制備細(xì)胞庫SC16408菌株由亞硝基胍(NTG)處理So ce90B2菌株(SC16224)、繼之以隨機(jī)選擇而產(chǎn)生。這樣，將S16224懸浮在10mMTris-HCl緩沖液中并在pH8.2下經(jīng)受1mg/mL NTG處理60分鐘。用NTG處理后，通過菌落選擇獲得菌落細(xì)胞系并試驗(yàn)其埃坡霉素B的生產(chǎn)能力、和B/A的比例。將分離的菌落轉(zhuǎn)入燒瓶中培養(yǎng)8-14天，接著在生長培養(yǎng)基(培養(yǎng)基E)每隔3-4天轉(zhuǎn)移一次用于振搖燒瓶的生長培養(yǎng)基E
將上述組分加入到蒸餾水中并用10％NaOH(或KOH)將pH調(diào)至pH7.2后在121℃下滅菌30分鐘。
研究細(xì)胞庫的制備將10mL SC16408菌株的3天培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入裝有90mL培養(yǎng)基E的250mL燒瓶中。然后將燒瓶在30℃、160rpm下保溫2天。在2天結(jié)束時(shí)，從燒瓶中取出1.8mL試樣量并轉(zhuǎn)入低溫的小瓶中，然后在-70℃下冷凍。
原始細(xì)胞庫的制備將2小瓶源自研究細(xì)胞庫的培養(yǎng)物解凍并轉(zhuǎn)入裝有10mL培養(yǎng)基E的2×125mL的燒瓶中，然后在30℃、160rpm下保溫4-5天。下一步，將2×10mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入裝有90mL培養(yǎng)基E的2×250mL的燒瓶中，然后在30℃、160rpm下保溫2-4天。最后，合并這兩個(gè)燒瓶并將1.8mL試樣量轉(zhuǎn)入低溫的小瓶中，并在冷凍箱中于-70℃下貯存。
工作細(xì)胞庫的制備將5小瓶源自原始細(xì)胞庫工作單元庫的培養(yǎng)物解凍并轉(zhuǎn)入裝有10mL培養(yǎng)基E的2×125mL的燒瓶中，然后在30℃、16rpm下保溫3-6天。下一步，將5×10mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入裝有90mL培養(yǎng)基E的5×250mL的燒瓶中，然后在30℃、160rpm下保溫2-4天。用這5個(gè)燒瓶內(nèi)的細(xì)胞接種裝有90mL培養(yǎng)基E的12×250mL燒瓶，將其再一次在30℃、160rpm下保溫2-4天。最后，將這些燒瓶一起合并，并將1.8mL試樣量轉(zhuǎn)入低溫的小瓶中并在冷凍箱中于-70℃下貯存。產(chǎn)生約500-600小瓶供工作細(xì)胞庫之用。
實(shí)施例2通過振搖燒瓶發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)埃坡霉素將來自冷凍小瓶(1.5mL)中的細(xì)胞接種到125mL燒瓶內(nèi)的45mL培養(yǎng)基E中并使其在30℃和160rpm下生長4-8天(F1階段)。然后，將5mL F1階段的細(xì)胞轉(zhuǎn)入裝有45mL培養(yǎng)基E的125mL新燒瓶中并使其生長3-4天(F2階段)。然后將F2階段的細(xì)胞用作埃坡霉素B發(fā)酵的接種物。將百分之十的接種物(5.0mL)轉(zhuǎn)入裝有45mL生產(chǎn)培養(yǎng)基的125mL燒瓶中。然后將這些燒瓶在振蕩器(160rpm)內(nèi)于30℃保溫2周。生產(chǎn)培養(yǎng)基為改良的培養(yǎng)基E，其中含1.6％(0.8g)XAD-16樹脂。用于振搖燒瓶的生產(chǎn)培養(yǎng)基的組合物顯示如下用于振搖燒瓶的埃坡霉素B生產(chǎn)培養(yǎng)基
將上述組分溶解于蒸餾水中并用10％NaOH(或KOH)將pH調(diào)至pH7.2后在121℃下滅菌30分鐘。
用于振搖燒瓶埃坡霉素B發(fā)酵的料液組合物為4％丙酸鈉、10％Maltrin-M040和3％Tastone-154。將進(jìn)料(100mL在250mL燒瓶中)用NaOH調(diào)至pH6.8-7.0并于121℃下滅菌30分鐘。從接種后第3天到第14天，每天向每個(gè)發(fā)酵燒瓶中加入0.5mL料液。另外，還發(fā)現(xiàn)雙倍進(jìn)料并在第3、5、7和10天加入時(shí)可取得同樣的結(jié)果。也可通過以下方式取得改進(jìn)的結(jié)果通過用磷酸鹽(以1.5％磷酸二鈉和0.5％磷酸一鈉的形式)進(jìn)一步補(bǔ)充上述料液，這樣當(dāng)進(jìn)入培養(yǎng)基中稀釋100倍時(shí)，最終含量分別為0.015％和0.005％，排除先前加入的剩余含量。加入磷酸鹽的增加的優(yōu)點(diǎn)是不需進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。另外通過補(bǔ)充磷酸鹽可提高產(chǎn)率(對于埃坡霉素B)達(dá)到10-20％。
至于埃坡霉素的分析，采集樹脂樣品(0.8g)并通過HPLC分析。在第14天振搖燒瓶中的埃坡霉素產(chǎn)物能產(chǎn)生以下的滴度埃坡霉素A5.0-7.0mg/g樹脂埃坡霉素B8.0-12.0mg/g樹脂B/A比例1.1-2.0與先前的菌株相比，SC16408培養(yǎng)顯然在振搖燒瓶中產(chǎn)生更多的埃坡霉素B。
實(shí)施例3在14L發(fā)酵罐中培養(yǎng)生產(chǎn)埃坡霉素
利用培養(yǎng)基E形成用于14L發(fā)酵罐的接種物。振搖燒瓶和抽氣瓶階段的高壓滅菌時(shí)間分別是30和60分鐘。至于發(fā)酵罐，將生產(chǎn)培養(yǎng)基在121℃下滅菌60分鐘。14L發(fā)酵罐生產(chǎn)培養(yǎng)基為改良的振搖燒瓶生產(chǎn)培養(yǎng)基(如上所述)，其中HEPES已經(jīng)被除掉并加入了2.5g/L的消泡劑(Antifoam AF，來自Dow Corning)。在14L發(fā)酵罐中配制六升生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH調(diào)至7.2-7.4)并滅菌。下表對14L發(fā)酵罐規(guī)模的過程參數(shù)進(jìn)行了匯總實(shí)驗(yàn)臺的最高發(fā)酵罐工藝參數(shù)
14L發(fā)酵罐內(nèi)的埃坡霉素B滴度范圍總結(jié)如下埃坡霉素B滴度，mg/g樹脂 B/A比例5-12 1.0-30實(shí)施例4埃坡霉素的生產(chǎn)方法50L發(fā)酵罐接種期對于F1階段，配制培養(yǎng)基E(2L)并將其分配到17個(gè)單獨(dú)的250mL燒瓶中，各90mL。然后將燒瓶在121℃下通過高壓滅菌法滅菌30分鐘。將來自一個(gè)冷凍小瓶中的細(xì)胞接種到每個(gè)燒瓶中并使其在大約在約30℃和160rpm下生長4-8天。
對于F2階段，配制27L的培養(yǎng)基E并將其分配到17個(gè)單獨(dú)的4L燒瓶中，各1.5L，然后按上述方法滅菌。用來自F1階段的燒瓶中的全部內(nèi)容物接種每個(gè)4L燒瓶，然后使其在約30℃和160rpm下生長2-4天。
對于F3階段，配制80L的培養(yǎng)基E并分到兩個(gè)50L不銹鋼的種發(fā)酵罐中，每個(gè)50L發(fā)酵罐用來自F2階段的三個(gè)4L燒瓶中的內(nèi)容物接種。使這些50L的發(fā)酵罐在30-33℃下生長2-4天，然后合并并用于接種800L的發(fā)酵罐。
培養(yǎng)基E*是
800L的發(fā)酵罐接種期使接種物在800L的不銹鋼發(fā)酵罐中生長直到細(xì)胞群足以接種下一個(gè)接種期(5,000L發(fā)酵罐)。
將這批培養(yǎng)基E*轉(zhuǎn)入去離子水(400L)中配制并將該混合物，pH8.7-8.9，在17磅/平方英寸、124℃下滅菌60分鐘。將培養(yǎng)基從殺菌器轉(zhuǎn)移到800L的發(fā)酵罐中，并將pH調(diào)至pH7.1-7.3。然后用80L來自F3階段培養(yǎng)物接種該發(fā)酵罐。該批在以下控制設(shè)定值下進(jìn)行
根據(jù)需要，加入苛性堿(氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液)使pH從無菌的補(bǔ)充物到維持在7.1-7.3范圍內(nèi)。每隔一段時(shí)間對該批取樣并分析其無菌狀態(tài)、pH、沉積以及葡萄糖濃縮。并監(jiān)測出口氣CO2和O2。在大約48-60小時(shí)時(shí)，當(dāng)葡萄糖濃縮開始下降時(shí)，將800L發(fā)酵罐(大約440-480L)中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)入5,000L的發(fā)酵罐中。
5.000L的發(fā)酵罐接種期在此階段接種物的處理中使用5,000L的不銹鋼發(fā)酵罐。使接種物在該發(fā)酵罐中生長直到細(xì)胞群足以接種40,000L的生產(chǎn)發(fā)酵罐。
將按上述方法制備的培養(yǎng)基E(轉(zhuǎn)入到去離子水中，2,600L)轉(zhuǎn)入5,000L的發(fā)酵罐中，然后用大約440-480L來自800L的發(fā)酵罐中的接種物接種。該批在調(diào)控設(shè)定值下進(jìn)行并進(jìn)行如上所述的監(jiān)測。再將pH維持在7.1-7.3的范圍內(nèi)。在約48-72小時(shí)，當(dāng)葡萄糖濃縮開始下降時(shí)，將5,000L發(fā)酵罐中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)入40,000L的發(fā)酵罐中。
40,000L的發(fā)酵罐生產(chǎn)階段在該埃坡霉素的生產(chǎn)階段中使用40,000L的不銹鋼發(fā)酵罐。一旦將發(fā)酵罐滅菌和裝入無菌培養(yǎng)基后，就用在5,000L發(fā)酵罐中制備的接種物接種。一旦達(dá)到特定的生產(chǎn)參數(shù)，就采集生產(chǎn)發(fā)酵罐中的內(nèi)容物。
用于生產(chǎn)發(fā)酵罐的培養(yǎng)基分為兩部分滅菌。將樹脂加入到2,800L的水中并將該混合物在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘
為獲得18,000L的培養(yǎng)基，將下列組分加入到去離子水(15,000L)中并將pH調(diào)至7.1-7.3。培養(yǎng)基在連續(xù)式殺菌機(jī)于150℃下滅菌(持續(xù)時(shí)間100秒，出口溫度60℃)
將培養(yǎng)基和樹脂轉(zhuǎn)入生產(chǎn)發(fā)酵罐中，然后用約3,100L來自5,000L的發(fā)酵罐中的接種物接種。將該批在如上所述的控制設(shè)定值下進(jìn)行，除氣流為0.2-0.4wm外。根據(jù)需要，用苛性堿上調(diào)pH(在0和80小時(shí)之間)。在80小時(shí)之后，用硫酸下調(diào)pH。根據(jù)需要，用消泡劑調(diào)節(jié)起泡。至少一天一次對該發(fā)酵罐取樣分析其無菌狀態(tài)、pH、沉積、葡萄糖、丙酸鹽和埃坡霉素B的濃度。監(jiān)測并記錄出口氣的CO2。在大約30-60小時(shí)時(shí)開始進(jìn)料，一直到CO2不低于0.3％。
用1.9L/注(范圍為1.5-3.0)的注料量給發(fā)酵罐供給丙酸鈉(102g/L)。注料的時(shí)間間隔開始時(shí)為60分鐘，每隔12小時(shí)遞減，至最短的12分鐘。將丙酸鹽加入到2,800L的去離子水中并將該溶液在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，丙酸鈉進(jìn)料與含其它培養(yǎng)基組分的進(jìn)料分開。
給該發(fā)酵罐進(jìn)料Maltrin-M040和Tastone-154，注料量為14.5L。注料的時(shí)間間隔開始時(shí)為60分鐘，在104小時(shí)時(shí)變化到40分鐘。將各組分加入到去離子水(3,000L)中并在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘。進(jìn)料含
在該過程中，一些培養(yǎng)基組分如脫脂奶粉、Maltrin-M040和甘油被耗盡。在大約115小時(shí)開始，先前的進(jìn)料被中止，將下述混合物以14.5L的注料量每隔40分鐘加入到生產(chǎn)發(fā)酵罐中。將各組分加入到去離子水(3,000L)中，并將該混合物，pH8.7-8.9，在17磅/平方英寸、124℃下滅菌75分鐘。
當(dāng)達(dá)到所需的埃坡霉素B的濃度時(shí)(通常在9-21天之后)，采集容器中的內(nèi)容物。埃坡霉素B滴度在大約5-24mg/g樹脂之間變化，B/A比例大約為1.5-4。
實(shí)施例5用MTBE從XAD-16樹脂中萃取埃坡霉素B并結(jié)晶得到固體埃坡霉素B；用反相色譜分離純化；最后分離高質(zhì)量的埃坡霉素B將所收集的并水洗過的含埃坡霉素(大約5.03kg埃坡霉素B)的XAD-16樹脂(大約550kg)與甲醇的水溶液混合并以漿液的形式裝入萃取柱。將該填充的樹脂用甲醇的水溶液(先用30％MeOH然后用50％MeOH各1柱床體積)洗滌以除去不需要的高極性物質(zhì)。用MTBE洗滌(大約4柱床體積)脫掉埃坡霉素。收集富洗脫液并研磨過濾。在重力沉降除去任何水相之后，濃縮富MTBE液。重力沉降濃縮液，移去水相，向該批中另外加入MTBE(2柱床體積)。將該批再濃縮至大約每升5至15g埃坡霉素B的濃度。通過5-6小時(shí)逐漸冷卻至約0℃使該批結(jié)晶。將結(jié)晶固體過濾、洗滌并干燥。將所得的產(chǎn)物濾餅溶解于溫?zé)岬囊宜嵋阴ブ胁⒀心ミ^濾。將富濾液在真空下濃縮至大約每升20至45g埃坡霉素B的濃度。加熱至70℃后，然后將該批緩慢冷卻至大約0℃得到結(jié)晶漿液，將結(jié)晶漿液過濾、用冷的EtOAc洗滌、并在低于40℃下干燥得到分離的再結(jié)晶的埃坡霉素B(以樹脂中的量計(jì)產(chǎn)率為84％)。然后將該產(chǎn)物通過反相色譜分離法純化。
將填充有反相固定栽體RP/C-18的色譜柱(11cm直徑×40cm層床長度)用乙腈的水溶液(30-50％v/v)平衡。將再結(jié)晶的產(chǎn)物溶解于二甲亞砜(DMSO，每公斤1-1.5L)，過濾該混合物以除去不溶物，然后裝在柱子上，裝柱前先加入等份的100％DMSO，追加等體積的DMSO以減少在含水流動相加入時(shí)樣品的沉淀。使用乙腈的水溶液(30-50％v/v)從柱中洗脫樣品，并通過UV檢測器在290nm處監(jiān)測流出物。收集若干部分的埃坡霉素B產(chǎn)物峰。以HPLC分析各部份的埃坡霉素A和B及其它相關(guān)的雜質(zhì)。
將所需的合并柱部份裝入蒸餾箱，并將該批在低于40℃的溫度下真空濃縮以除去乙腈。將產(chǎn)生的水相用乙酸乙酯萃取高達(dá)三次，并將該有機(jī)溶液在低于40℃的溫度下真空濃縮得到濃度為0.1至0.2g/mL的埃坡霉素B。在40℃下向該批中加入正庚烷(或庚烷)，然后將該批緩慢冷卻到2至-10℃并維持至少2小時(shí)。過濾結(jié)晶漿液并用乙酸乙酯/正庚烷溶液洗滌，然后將最終的埃坡霉素B濾餅在35-40℃下真空干燥得到3.367kg，效能為91.7％。相當(dāng)于3.09kg的埃坡霉素B活性。從樹脂中得到的產(chǎn)率為61.4％。HPLC顯示埃坡霉素B占面積的99.6％、埃坡霉素A占面積的0.4％，沒有面積＞0.1％的其它雜質(zhì)。
實(shí)施例6用乙酸乙酯從XAD-16樹脂中萃取埃坡霉素B并用甲苯作為反溶劑結(jié)晶得到固體埃坡霉素B；用反相色譜法分離純化；最后分離出高質(zhì)量的埃坡霉素B在振動篩(SWECO TM)上用水洗滌含埃坡霉素B的XAD-16樹脂以凈化該樹脂。將該樹脂的一部分(大約6.6L，含15.6g埃坡霉素B，經(jīng)檢測每克樹脂2.36mg埃坡霉素B)使用大約5L的水轉(zhuǎn)入20L的容器中以用水沖冼該樹脂。然后將乙酸乙酯(大約2柱床體積(BV)的進(jìn)料樹脂)加入到容器中。將漿液攪拌約一小時(shí)，并使用600mL螺帽離心容器在3,500rpm下離心5分鐘以分層。傾出第一份富乙酸乙酯的上清液，并測量其體積。接下來，將傾斜的含多水樹脂的底層在容器中合并并向該容器中加入乙酸乙酯(2BV)。將該漿液攪拌約1小時(shí)然后離心分層。傾出第二份富乙酸乙酯的上清液，并測量其體積。
然后將水(～0.3BV進(jìn)料樹脂)加入到合并的第一份和第二份富乙酸乙酯餾份中并攪拌大約5分鐘。讓各層靜置大約30分鐘。接下來，下面的水層與上面的富乙酸乙酯層分離。將洗滌過的富乙酸乙酯層在低于45℃的溫度下濃縮至濃度為大約每升10g的埃坡霉素活度。然后將濃縮的富乙酸乙酯溶液研磨過濾并濃縮至20-25g/L的埃坡霉素B。
濃縮后，加入甲苯并利用真空在低于50℃下再濃縮至加入甲苯之前該批的體積。使該批經(jīng)大約1小時(shí)冷卻至約18℃，然后在此溫度下攪拌大約16小時(shí)以得到產(chǎn)物晶體。接下來，將該批結(jié)晶過濾并用甲苯(～0.2BV)洗滌，干燥所得的固體得大約30.4g含13.5g埃坡霉素B活度的固體。從起始樹脂中計(jì)算活性產(chǎn)率為87％。
將利用以上處理從樹脂中萃取的固體埃坡霉素B以反相色譜法進(jìn)行純化。柱子(Phenomenex Luna，15，C18(2)，5.0cm×25cm，柱BV400mL)用3BV的40％(v/v)乙腈-水預(yù)平衡。將大約4-6g的固體埃坡霉素B在約40℃下溶解于大約6mL的DMSO中，然后將混合物經(jīng)濾膜過濾以除去微粒。將大約1.5mL的DMSO注入到樣品環(huán)中以防止埃坡霉素在管中沉淀。然后富含埃坡霉素的濾液注入到樣品環(huán)注入之后，用約0.5mL的DMSO洗滌埃坡霉素濾液容器并隨之注入約1mL的DMSO到樣品環(huán)中。注入埃坡霉素樣品后注射DMSO可防止在管中產(chǎn)生沉淀。以大約5mL/分鐘的流速將樣品環(huán)的內(nèi)容物裝在柱上。
將埃坡霉素裝在柱上后，然后向柱中泵入40％乙腈水溶液。3-4分鐘后，流速增至大約60ml/分鐘。收集若干部分的埃坡霉素A和B峰。含富含埃坡霉素B的部份一般在2.5L和3.25L洗脫體積之間的餾分中獲得(通常埃坡霉素B峰在約6和8柱床體積之間流出)。該合并的部份的體積為大約0.75L。埃坡霉素B峰幾乎達(dá)到基線(＜10％的峰高)后向柱中泵入100％乙腈。當(dāng)色譜顯示在290nm處的吸收基本上回到基線時(shí)，向柱中泵入40％乙腈-水溶液再平衡該柱以進(jìn)行下一次色譜。通常使用2BV的100％乙腈和3BV40％乙腈洗滌和再平衡柱子。
利用HPLC分析對各部份進(jìn)行分析以測定純度，并將所需要的部份合并。通常產(chǎn)率為90-98％。
將合并的埃坡霉素B部份在低于0℃下真空濃縮至大約50％的初始體積。該濃縮部份用乙酸乙酯萃取兩次。將合并的乙酸乙酯extracts在約40℃的浴溫下濃縮至大約0.1g/mL埃坡霉素B。在約15分鐘內(nèi)邊攪拌邊加入正庚烷(或庚烷)(使用一定量的50％乙酸乙酯溶液)。將萃取物冷卻至5℃并在該溫度下保持至少2小時(shí)。將產(chǎn)物晶體過濾并用1∶2(v∶v)的正庚烷∶乙酸乙酯溶液洗滌。最后，將晶體在約40℃下真空干燥大約12小時(shí)。HPLC顯示各批中埃坡霉素B占面積的99.5-99.7％，埃坡霉素A占面積的0.3-0.5％。
實(shí)施例7用乙酸乙酯從XAD-16樹脂中萃取埃坡霉素B并用甲苯作為反溶劑結(jié)晶，繼之以重結(jié)晶得到初級的埃坡霉素B；用正相色譜法分離純化；最后分離出高質(zhì)量的埃坡霉素B步驟A，使用EtOAc萃取-甲苯結(jié)晶制備初級的埃坡霉素B將水洗過的富含埃坡霉素B的樹脂(1350g)裝在柱上。用水(2700mL)裝柱和沖冼柱子。以9450mL(7柱床體積)的乙酸乙酯過柱洗脫活性的埃坡霉素。讓乙酸乙酯洗脫液沉降至少一小時(shí)。除去棕褐色水層和乳劑層。將富乙酸乙酯溶液在真空下濃縮至目標(biāo)濃度為大約每升20g埃坡霉素B。讓濃縮液靜置2小時(shí)并冷卻至20℃。將冷卻了的濃縮液研磨過濾，并用乙酸乙酯(36mL)洗滌過濾器。將合并的濾液和沖洗液濃縮至大約每升80g埃坡霉素B并加熱至65℃。加入等體積的甲苯，攪拌10-15分鐘以上，同時(shí)將溫度保持在60℃以上。將溫度維持在65℃30分鐘，接著在1.5小時(shí)內(nèi)降溫至40℃，然后在2小時(shí)內(nèi)降溫至1℃。將產(chǎn)生的結(jié)晶漿液在1℃下攪拌至少60分鐘。濾出固體物并用甲苯(漿液體積的20％)洗滌。(在該方法的多次重復(fù)中，母液通常含2-6％的進(jìn)料的埃坡霉素B活度)。在烘箱中于40-45℃下將固體物真空干燥至少4小時(shí)。另外，也可以在烘箱中在40℃和室溫之間的溫度下將固體物真空干燥至少4小時(shí)。
該干燥的原始的埃坡霉素B濾餅的重量范圍在8.4至20g之間，埃坡霉素B效能范圍在650至713μg/mg之間。濾餅中還含有12％至26％的埃坡霉素A(面積百分比)。殘留溶劑含0.7％(w/w)EtOAc和13％(w/w)甲苯。
對于5批的計(jì)算如下
分離過程中總損失平均為9.4％。對于原始濾餅從樹脂中得到的埃坡霉素A峰相對于埃坡霉素B峰的百分比平均從49％降至19％。在此步驟所述的方法之后得到的晶體溶劑合物的PXRD圖和熱分析分別顯示在圖9和10中。圖9的PXRD圖進(jìn)一步由上面的表6報(bào)告的數(shù)據(jù)表征。
步驟B，埃坡霉素B的再結(jié)晶將EtOAc(0.14L)加入到15g初級的埃坡霉素B(710μg/mg)中并邊攪拌邊加熱到65-68℃。(埃坡霉素B的目標(biāo)濃度為每升75-80g活度)。在20分鐘內(nèi)將甲苯(0.14L)加入同時(shí)將溫度維持在60℃以上。將產(chǎn)生的漿液保持在65℃下0.25小時(shí)至1小時(shí)。然后將該批在3小時(shí)內(nèi)冷卻至40℃。將該批在2小時(shí)內(nèi)繼續(xù)冷卻至0-2℃。然后將該批保持在0-2℃下12小時(shí)。然后過濾所得的結(jié)晶漿液并用甲苯(2×0.028L)洗滌濾餅。通常，不到3％的進(jìn)料埃坡霉素B活度損失到合并的母液和沖洗液中。在真空烘箱中于42℃和29英寸Hg的壓力下將濾餅干燥2小時(shí)。另外，也可以在真空烘箱中在40℃和室溫之間的溫度和29英寸的壓力下將濾餅真空干燥2小時(shí)。該干燥的濾餅重量為13.6g，效能為764μg/mg。殘留的溶劑包括EtOAc(0.9wt％)和甲苯(13.2％)。通常，EtOAc和甲苯以13-14wt％的總含量存在。再結(jié)晶的濾餅的埃坡霉素A峰相對于埃坡霉素B峰的面積百分比降至平均6.9％。
在此步驟所述的方法之后得到的晶體溶劑合物的PXRD圖和熱分析分別顯示在圖11和12中。圖11的PXRD圖進(jìn)一步由上面的表7報(bào)告的數(shù)據(jù)表征。
正相色譜分離配制下列流動相20％(v/v)乙酸乙酯/正庚烷溶液(～10L)，40％乙酸乙酯/正庚烷(～10L)，和100％乙酸乙酯(～10L)。
安裝以下設(shè)備Waters Delta Prep 4000；檢測器UV定在290nm；柱Phenomenex Luna，10微米，硅土(2)，5.0cm×25cm(柱體積～490mL)。
在注射埃坡霉素溶液之前用3柱床體積的20％(v/v)乙酸乙酯/正庚烷溶液平衡柱子。
將埃坡霉素B濾餅(5.5g)溶解于55mL的二氯甲烷中。將該批通過1微米的PTFE濾膜過濾以除去任何可能存在的微粒。用二氯甲烷(2-5mL)沖冼該濾膜。將富二氯甲烷濾液注入柱中，最初的30秒內(nèi)的初始流速為5mL/分鐘，接著將流速增至20mL/分鐘直到樣品完全裝上。用二氯甲烷(2-5mL)沖洗含埃坡霉素濾液的容器，將沖冼液也輸入柱中。
用20％EtOAc/庚烷開始洗脫，同時(shí)將流速增加至118mL/分鐘。在流速達(dá)到118mL/分鐘之后，運(yùn)用泵程序控制器運(yùn)行期望的的泵程序。應(yīng)用下述泵程序
收集各部份洗脫液并用HPLC分析純度。
在5批中，所收集的部份中埃坡霉素B的面積百分比為99.59-99.93％，產(chǎn)率平均為91％。
任選地，類似地應(yīng)用等濃度的40％乙酸乙酯/正庚烷洗脫步驟、類似的100％乙酸乙酯沖洗柱步驟繼之以40％乙酸乙酯再平衡進(jìn)行色譜分離。使用同樣的色譜分離設(shè)備，其中使用直徑較小的柱1.0cm×25cm。在中心餾份中埃坡霉素B的色譜分離產(chǎn)率為86％且所收集的部份中埃坡霉素B的面積百分比為99.4％。上述等濃度方法還可在11cm軸向壓縮柱上進(jìn)行，其中中心餾份中洗脫的epoB為31-35gm，色譜的產(chǎn)率為90-94％。所收集的中心餾份中埃坡霉素B的面積百分比為99.6-99.9％。柱子可重復(fù)行使多次。
步驟C，最后的結(jié)晶將需要的中心部餾份合并得到1.62-1.73L的批量體積。在40-45℃下真空除去溶劑。目標(biāo)蒸餾體積為25-28mL(埃坡霉素B的濃度為大約200-210g/L)。向濃縮液中加入溫?zé)岬?大約40℃)庚烷(50mL)。另外，也可以在此步驟將溫?zé)岬?約40℃)EtOAc(50mL)加入到濃縮液中。將產(chǎn)生的漿液在約40℃下攪拌約2小時(shí)，然后在約5小時(shí)內(nèi)冷卻至約0℃并在約0℃下再攪拌至少5小時(shí)。在整個(gè)結(jié)晶期間應(yīng)用中等速度的機(jī)械攪拌。將結(jié)晶漿液過濾并用冷的1∶1 EtOAc/庚烷(25mL)洗滌。在真空烘箱中于40-45℃下將固體物干燥5-6小時(shí)。另外，也可以在真空烘箱中在40℃和室溫之間的溫度下將固體物干燥5-6小時(shí)。自再結(jié)晶的(一次)埃坡霉素B分離得到的埃坡霉素B的重量(對于5批)為大約4.2-5.0g(83.5-85.6％活度產(chǎn)率)，其HPLC純度為99.78至99.93％面積百分比(平均99.80％)。對于色譜分離的埃坡霉素B活度進(jìn)料而言損失到母液中的埃坡霉素B為大約4％。濾餅中殘留的溶劑為EtOAc(5.8-6.0％w/w)和庚烷(0.6-0.7％v/v)。最終的埃坡霉素B濾餅的效能范圍為91.5至92.7％w/w。HPLC純度在99.7面積百分比以上。使用此步驟所述的方法得到的晶體溶劑合物的PXRD圖和熱分析分別顯示在圖13和14中。從圖14可以看出，按照上述操作制備和干燥所得的乙酸乙酯溶劑合物的熔點(diǎn)為約102℃。圖13的PXRD圖進(jìn)一步由上面的表8報(bào)告的數(shù)據(jù)表征。
另外，也可以將合并的含4.83Kg EpoB中心餾份(1790L)在＜30℃下真空濃縮至目標(biāo)濃度為200-210g/L，然后加入正庚烷(60kg)。重復(fù)該濃縮操作然后另外加入60kg庚烷。將漿液在三小時(shí)內(nèi)冷卻至20℃，然后收集并用30Kg庚烷洗滌。將所得固體物在真空下于20-36℃干燥16小時(shí)?？偣搏@得5.141Kg固體，其HPLC純度＞99.6面積％。濾餅中的殘留溶劑為10.6％乙酸乙酯和1.4％庚烷。
實(shí)施例7A從樹脂中萃取埃坡霉素B，接著重復(fù)再結(jié)晶將水洗過的含估計(jì)量4.10Kg埃坡霉素B活度(面積％埃坡霉素B＝58.0％；埃坡霉素A＝29.2％)富含埃坡霉素的樹脂(549.8kg)用水勻漿并裝柱(700L)。排去柱中液體并用氮?dú)獯抵?。然后用乙酸乙?2969Kg)洗脫，以每小時(shí)～1柱床體積的速率通過柱子，總共～6柱床體積。讓合并的富含乙酸乙酯的洗脫液重力沉降～1小時(shí)，然后除去下層的水相。然后將富乙酸乙酯濃縮至～574kg。然后將濃縮的富乙酸乙酯在研磨過濾之前于～20℃下靜置～2天。將濾膜和管道用乙酸乙酯(總共～115kg)洗滌。然后將研磨濾液和沖洗液濃縮至體積為～64L，然后溫?zé)嶂痢?5℃。然后邊攪拌邊加入等體積溫?zé)岬募妆讲⑺梦锉３衷凇?5℃下～30分鐘。然后將該批在～4小時(shí)內(nèi)緩慢冷卻至～40℃，接著在～2.5小時(shí)內(nèi)冷卻至0℃。然后將冷漿液在～0℃下保持～1小時(shí)。然后過濾所得的結(jié)晶漿液并用甲苯(～64L)洗滌濾餅。將產(chǎn)生的濾餅在真空下略微干燥，然后用溫?zé)岬囊宜嵋阴?200kg)從過濾干燥裝置將其再溶解。
類似地通過將富乙酸乙酯濃縮至～65L進(jìn)行第一次再結(jié)晶。在溫?zé)嶂?5℃之后邊攪拌邊加入等體積的甲苯并將所得物保持在～65℃下～30分鐘。類似地按照上述方法將該批冷卻，并使用上述同樣的操作和設(shè)備過濾和洗滌所產(chǎn)生著結(jié)晶漿液。
如上所述再進(jìn)行兩次類似的再結(jié)晶得到埃坡霉素B結(jié)晶濾餅(4.384Kg)(81.5％w/w)(3.573kg埃坡霉素B)(HPLC面積％埃坡霉素B＝97.18；埃坡霉素A＝1.40；埃坡霉素F＝0.30；噁唑類似物＝0.30和乙基噻唑類似物＝0.56)。沒有可檢測的(＞HPLC 0.1面積％)別的雜質(zhì)。產(chǎn)物中含13.8％w/w甲苯和0.8％w/w乙酸乙酯。從樹脂到分離純化的埃坡霉素B總活度產(chǎn)率為87％。
實(shí)施例7B從母液流回收EpoB將MTBE或EtOAc萃取物EpoB結(jié)晶后的母液合并，母液每升溶液中含2.2gEpoB和4.8g EpoA。在50℃下將十升該溶液真空濃縮至濃度為每升11-15g Epo B。加入1體積的甲苯開始形成固體物；繼續(xù)蒸餾直至達(dá)到11-15g Epo B/L的濃度。再加入1體積的甲苯，并將蒸餾再重復(fù)一次至達(dá)到11-15g Epo B/L。在1小時(shí)內(nèi)將漿液冷卻至室溫，然后攪拌90分鐘。然后將混合物再加熱至～50℃，攪拌1小時(shí)并在1小時(shí)內(nèi)冷卻至室溫。在攪拌至少3小時(shí)之后，通過過濾收集固體物，用甲苯洗滌然后在～40℃下真空干燥得到～92％ Epo B活度的回收率。對固體物進(jìn)行分析42.9％w/w Epo B，16％w/w甲苯。母液中含66％的進(jìn)料埃坡霉素A并僅含5％的進(jìn)料埃坡霉素B。
實(shí)施例7C按實(shí)施例7中所述的正相色譜分離操作合并的中心餾份(200mL)含646mg Epo B，將其緩慢加入到43mL的甲苯中同時(shí)在水套內(nèi)冷卻水溫度為～65℃下真空濃縮至～43ml。在真空的條件下加入甲苯(43mL)，同時(shí)在水套內(nèi)冷卻水溫度為～65℃下繼續(xù)蒸餾。將所得漿液濃縮至～43mL然后讓其在～3小時(shí)內(nèi)冷卻至～20℃。收集所得晶體，用2×5mL甲苯洗滌并在～40℃下真空干燥(29″Hg)30分鐘得到729mg的分離出的結(jié)晶濾餅85.3％w/w Epo B)。HPLC純度為99.77面積％(不包括甲苯的面積％)。濾餅中殘留的溶劑為15.3％w/w甲苯和0.3％w/w EtOAc。母液和沖洗液僅含0.5％的埃坡霉素B進(jìn)料活度。
按此步驟中描述的方法得到的晶體溶劑合物PXRD觀察圖顯示在圖15中(上圖)，伴有一幅室溫下甲苯溶劑合物的PXRD模擬圖(下圖)。該晶體溶劑合物的熱分析如圖16所示實(shí)施例8特定晶形的制備實(shí)施例8AepoB-TOβ的制備埃坡霉素B甲苯溶劑合物的制備將Epo B在～40℃下溶解于～13mL的乙酸乙酯中。加入1體積的甲苯接著在浴溫＜40℃下濃縮至9mL。將其再加熱至～55℃，接著再加入1體積的甲苯。然后濃縮至～10mL并讓其冷卻至18℃。所得漿液用于X射線結(jié)構(gòu)測定。
按照上述方法得到的epoB-Toβ單斜晶胞的分子結(jié)構(gòu)和epoB-Toβ的PXRD圖分別如圖4和6所示。
實(shí)施例8BepoB-ANβ的制備埃坡霉素B乙腈溶劑合物的制備讓基本純的埃坡霉素B在乙腈水溶液中的溶液(由實(shí)施例5中反相色譜分離產(chǎn)生的柱餾份合并而成)在室溫下緩慢蒸發(fā)得到乙腈-水結(jié)晶漿液。直接通過X射線衍射檢測該結(jié)晶漿液。
按照上述方法得到的epoB-ANβ單斜晶胞的分子結(jié)構(gòu)和epoB-ANβ的PXRD圖分別如圖2和7所示。
實(shí)施例8CepoB-EAβ的制備埃坡霉素B EtOAc溶劑合物的制備將埃坡霉素B在1∶1 EtOAc/庚烷中的溶液濃縮至目標(biāo)濃度為～190195g/L。在～40℃下向該埃坡霉素B的稠漿液中邊攪拌邊加入10體積的EtOAc。將產(chǎn)生的漿液在40℃下攪拌2小時(shí)，在5小時(shí)內(nèi)冷卻至約0℃并在0℃下再攪拌至少5小時(shí)。然后將結(jié)晶漿液過濾并用冷的1∶1EtOAc/庚烷洗滌濾餅。將濾餅在真空烘箱中干燥5-6小時(shí)得到最終的含～5-14％EtOAc的埃坡霉素B濾餅。
按照上述方法得到的epoB-EAβ單斜晶胞的分子結(jié)構(gòu)和epoB-EAβ的PXRD圖分別如圖1和5所示。
實(shí)施例8DepoB-IPβ的制備埃坡霉素B IPA溶劑合物的制備通過溶液加熱將埃坡霉素B(70mg)溶解于4mL的IPA中直至形成透明的溶液。將該溶液冷卻至環(huán)境溫度。通過過濾除去剛形成的任何固體。將清濾液置于小型的小瓶中并用帶有若干針孔的鋁箔覆蓋。讓溶劑在環(huán)境溫度下若干天內(nèi)慢慢地蒸發(fā)直至觀察到相當(dāng)?shù)木w成長。晶體以濕漿液送去X射線分析。
按照上述方法得到的epoB-IPβ單斜晶胞的分子結(jié)構(gòu)和epoB-IPβ的PXRD圖分別如圖3和8所示。
實(shí)施例9由埃坡霉素B(內(nèi)酯)形成衍生物2(內(nèi)酰胺)通過將四丁銨氯化物和疊氮化鈉在THF/DMF中混合制備四丁銨疊氮化物(TBA疊氮化物)溶液。通過過濾除去NaCl晶體回收所產(chǎn)生的TBA疊氮化物溶液。將催化量的試劑如三(二亞芐基丙酮)-二鈀或該催化劑的氯仿加合物(選擇這類試劑以穩(wěn)定烯丙基陽離子、氯化銨、埃坡霉素B和THF/DMF溶液)在攪拌下加入燒瓶中。通過在0-5℃下通入氮?dú)饧s25分鐘除去漿液中的氧氣。在0-5℃下加入三甲基膦。將反應(yīng)混合物加熱至32-38℃并持續(xù)攪拌4-16小時(shí)由于酯官能鍵的斷裂而生成氨基酸中間體。將反應(yīng)混合物冷卻至18-24℃并過濾除去固體物。用THF洗滌固體物并將該濾液與富濾液合并。在30-37℃下將該溶液在9-10小時(shí)內(nèi)滴加至1-羥基苯并三唑水合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽和碳酸鉀的THF-DMF漿液中。將所得的混合物冷卻至0-12℃、用水熄滅同時(shí)將溫度保持＜10℃。將混合物用乙酸乙酯萃取三至四次，并將合并的乙酸乙酯層用環(huán)己烷(3∶1的乙酸乙酯-環(huán)己烷比例)稀釋，反過來用水萃取。將有機(jī)層再用環(huán)己烷進(jìn)一步稀釋至2∶1的乙酸乙酯-環(huán)己烷比例并通過充滿活性炭的筒如Zeta PadR51 SP或R53SP中以峰低殘留的Pd量。將三乙胺(1％)加入到有機(jī)濾液中并將該溶液用短硅膠以含1％三乙胺的2∶1乙酸乙酯-環(huán)己烷過濾純化。收集富洗脫液并在＜37℃下濃縮至最終濃度為11-14mL/g。加入另外的環(huán)己烷并將該漿液在67-78℃下加熱45-60分鐘。將漿液緩慢冷卻至約21℃、過濾并用1∶1乙酸乙酯-環(huán)己烷洗滌結(jié)晶固體。將濕濾餅在＜45℃下真空干燥得到埃坡霉素B的晶體內(nèi)酰胺類似物，產(chǎn)率為約56M％。
實(shí)施例10由埃坡霉素B形成氨基取代的埃坡霉素衍生物(衍生物1)通過酶在埃坡霉素B噻唑環(huán)上2-甲基的羥基化作用將埃坡霉素B轉(zhuǎn)化為埃坡霉素F。通過放線菌菌株在埃坡霉素B上的作用實(shí)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化。用于此步驟中的放線菌菌株公開于2002年12月17日申請的美國專利申請序號10/321,88和WO00/39276，這兩篇文獻(xiàn)都在此引入作為參考。
將埃坡霉素B的乙醇溶液(5％v/w)加入微生物中，使其在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中于16-18℃下生長，并用50％w/v氫氧化鈉或30w/v硫酸將pH維持在6.9和7.1之間。繼續(xù)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化直至埃坡霉素B的濃度降低至其初始值的3-5％。將能吸附埃坡霉素F的樹脂如XAD-16或SP207加入到發(fā)酵罐中(5％v/w)并在10-18℃下攪拌16-72小時(shí)。傾出發(fā)酵肉湯并用水(2∶1水-樹脂的比例)洗滌該樹脂。重復(fù)洗滌兩次以上。通過在布氏漏斗上過濾除去大部分殘留的水。
將預(yù)先吸附了埃坡霉素F的XAD-16樹脂用水漿液并上柱。用乙酸乙酯萃取樹脂柱并收集富洗脫液。放出水層然后用5％碳酸氫鈉溶液和水洗滌富乙酸乙酯部份以脫色。在減壓下濃縮富有機(jī)部份，然后通過硅土預(yù)涂的濾膜，接著進(jìn)行10μM研磨過濾。然后將產(chǎn)物真空蒸餾并通過在攪拌下加入作為反溶劑的甲苯使最初的埃坡霉素F結(jié)晶。將富甲苯混合物進(jìn)一步濃縮以減少乙酸乙酯含量并加入更多的甲苯。過濾所得的結(jié)晶漿液并用甲苯洗滌。
將埃坡霉素F溶解于二氯甲烷或二氯甲烷/乙酸乙酯的混合物中，然后裝在填充有高效液相色譜級硅土的色譜柱上，色譜柱已經(jīng)用60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷混合物(v/v)平衡。
將產(chǎn)物用等濃度的或逐步梯度的60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷混合物(v/v)、繼之以60-80∶40-20乙酸乙酯∶正庚烷(v/v)從柱上洗脫。通過在290nm處的UV檢測對樣品和過程監(jiān)測。把埃坡霉素F產(chǎn)物峰分成幾部分以使洗脫出的雜質(zhì)減至最少。將合并的富部份真空蒸餾至目標(biāo)濃度為約100g/L。向埃坡霉素F的漿液中邊攪拌邊加入等體積的正庚烷。將該批再真空蒸餾至目標(biāo)濃度為大約100g/L，加入乙酸乙酯，并將該漿液維持在40℃。將該批冷卻至2至-10℃并在該溫度下維持至少5小時(shí)以使產(chǎn)物從溶液中結(jié)晶。將產(chǎn)生的漿液過濾并用冷的1∶1乙酸乙酯/正庚烷溶液洗滌。將最終的埃坡霉素F濾餅在35-40℃下真空干燥。
將1，8-二氮雜二環(huán)|5.4.0|十一碳-7-烯(DBU，1.8當(dāng)量)緩慢加入到埃坡霉素F和二苯基磷酰疊氮(1.5當(dāng)量)在四氫呋喃(預(yù)先在3A MS上干燥)的混懸液中，并將該反應(yīng)物在15-25℃下攪拌12-24小時(shí)。將三甲基膦/四氫呋喃溶液(1.0M，1.1當(dāng)量)緩慢加入到反應(yīng)混合物中。加入水和氫氧化銨并將混合物再攪拌30分鐘。將反應(yīng)混合物用水稀釋并將水相用三份二氯甲烷萃取。然后將有機(jī)相用稀氨水和半飽和的氯化鈉溶液洗滌、并蒸干得到粗制的在噻唑的甲基上功能化的氨基衍生物(衍生物1)。
將粗制品用以2.5％甲醇-0.2％三乙胺-二氯甲烷預(yù)處理的硅膠通過柱色譜法純化。將適宜質(zhì)量的部份合并、微米濾網(wǎng)過濾并蒸干得到色譜分離的衍生物1。將所得物加入到乙酸乙酯中并將產(chǎn)生的混懸液在72-75℃下加熱得到溶液。緩慢加入反溶劑正庚烷，并讓混合物在晶種存在的情況下緩慢冷卻同時(shí)于15-25℃下攪拌。冷卻并保持在～5℃后，通過過濾分離出產(chǎn)生的固體，接著真空干燥得到純化的晶體氨基衍生物(衍生物1)，埃坡霉素F的平均產(chǎn)率為約70M％。
實(shí)施例11由埃坡霉素B制備埃坡霉素D(衍生物3) [[4S-[4R*，7S*，8R*，9R*，15R*(E)]]-4，8-二羥基-5，5，7，9，13-五甲基-16-[1-甲基-2-(2-甲基-4-噻唑基)乙烯基]-1-氧雜-13(Z)-環(huán)十六碳二烯-2，6-二酮[埃坡霉素D，衍生物3]在-78℃氬氣氛圍下向無水THF(5ml)中加入WCl6(198mg，0.5mmol)接著加入nBuLi(0.625ml的1.6M在己烷中的溶液，1.0mmol)。將反應(yīng)物在20分鐘內(nèi)溫?zé)嶂潦覝?。取出一部分?0.50ml，0.05mmol)鎢試劑并在氬氣的氛圍下加入到埃坡霉素B(9.0mg，0.018mmol)中，將該反應(yīng)混合物攪拌15分鐘，然后通過加入飽和NaHCO3(1ml)熄滅反應(yīng)。用EtOAc(3×1ml)萃取該反應(yīng)混合物，將合并的萃取液干燥(Na2SO4)、過濾，并在真空下除去揮發(fā)物。將殘留物用35％EtOAc/己烷色譜分離得到發(fā)明名稱的化合物(7.0mg，0.014mmol)。MS m/z 492.3(M++H)。
權(quán)利要求
1.一種從產(chǎn)埃坡霉素的微生物中分離埃坡霉素B的方法，該方法包括(a)在樹脂存在的情況下使產(chǎn)埃坡霉素的微生物菌株發(fā)酵，其中樹脂通過疏水作用吸附埃坡霉素B；(b)收集水基介質(zhì)中的樹脂；(c)用選擇用來萃取埃坡霉素B且使其與水基介質(zhì)分離的溶劑萃取樹脂；和(d)在色譜步驟之前使埃坡霉素B從萃取相中結(jié)晶出來。
2.權(quán)利要求1的方法，其中由步驟(d)結(jié)晶的埃坡霉素B基本上是純的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中樹脂用極性溶劑萃取。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的發(fā)酵步驟還包括進(jìn)料能夠提高產(chǎn)出的埃坡霉素B量的添加劑，這是與產(chǎn)出的埃坡霉素A量相比較而言的。
5.權(quán)利要求4的方法，其中添加劑為TASTONETM、maltrin或甘油。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的發(fā)酵步驟包括連續(xù)進(jìn)料能夠提高埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例的添加劑。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述添加劑為丙酸鹽或丙酸酯。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述添加劑為丙酸鈉、丙酸甲酯或丙酸乙酯。
9.權(quán)利要求1的方法，其中結(jié)晶將埃坡霉素A的量減少至萃取步驟(c)之后存在的埃坡霉素A量的約55％或更少。
10.權(quán)利要求9的方法，該方法還包括(e)至少另一次結(jié)晶步驟，該結(jié)晶步驟能將埃坡霉素A的量有效地減少至結(jié)晶步驟(d)之后存在的埃坡霉素A量的約55％或更少。
11.權(quán)利要求1的方法，其中產(chǎn)埃坡霉素的微生物是纖維堆囊菌。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述微生物是纖維堆囊菌菌株ATCC號PTA 3880。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述微生物是纖維堆囊菌菌株ATCC號PTA 3881。
14.權(quán)利要求1的方法，其中樹脂是基于苯乙烯/二乙烯基苯的聚合物。
15.權(quán)利要求14的方法，其中樹脂為XAD-16。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(d)包括(i)加入另一種埃坡霉素B在其中不溶或微溶的溶劑；(ii)除去至少一部分萃取溶劑；和(iii)將所得溶劑或溶劑混合物的溫度轉(zhuǎn)變至埃坡霉素B結(jié)晶的溫度。
17.權(quán)利要求16的方法，其中萃取溶劑為乙酸乙酯或MTBE，且所述的另一種溶劑為甲苯。
18.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括(f)在步驟(c)之前，用乙腈的水溶液、或甲醇水溶液、或含洗滌劑和以堿形式添加的胺試劑的水介質(zhì)洗滌樹脂，所選擇的水介質(zhì)不洗脫埃坡霉素B。
19.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)還包括研磨過濾含埃坡霉素B的溶劑。
20.權(quán)利要求1的方法，還包括將埃坡霉素B或其溶劑合物轉(zhuǎn)化成下式的衍生物2或其溶劑合物 衍生物2
21.權(quán)利要求1的方法，還包括將埃坡霉素B或其溶劑合物轉(zhuǎn)化成下式的衍生物1或其鹽或溶劑合物 衍生物1
22.權(quán)利要求1的方法，還包括將埃坡霉素B或其溶劑合物轉(zhuǎn)化成下式的衍生物3或其溶劑合物 衍生物3
23.一種培養(yǎng)產(chǎn)埃坡霉素A或埃坡霉素B的微生物的方法，該方法包括給在選擇用來促進(jìn)埃坡霉素產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)的微生物培養(yǎng)物進(jìn)料丙酸、其前體或一種上述物質(zhì)的鹽，其中選擇丙酸、其前體或一種上述物質(zhì)的鹽的進(jìn)料時(shí)間和量以使埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例相對于在沒有進(jìn)料丙酸、其前體或一種上述物質(zhì)的鹽的情況下培養(yǎng)該微生物培養(yǎng)物所產(chǎn)生的埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例增加至少兩倍；和從培養(yǎng)物中分離埃坡霉素B。
24.權(quán)利要求23的方法，其中選擇丙酸、其前體或一種上述物質(zhì)的鹽的接觸時(shí)間和量以使埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例增加至少三倍。
25.權(quán)利要求23的方法，其中選擇丙酸、其前體或一種上述物質(zhì)的鹽的接觸時(shí)間和量以使埃坡霉素B與埃坡霉素A的比例增加到至少1.5。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述微生物為纖維堆囊菌的菌株。
27.權(quán)利要求23的方法，其中在培養(yǎng)物的生長期期間或之后加入丙酸、其前體或一種上述物質(zhì)的鹽。
28.權(quán)利要求27的方法，該方法還包括給培養(yǎng)物進(jìn)料一定量的維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物源或氨基酸源，其中相對于沒有進(jìn)料時(shí)埃坡霉素B的產(chǎn)量，所進(jìn)料的一定量的所述物質(zhì)能增加埃坡霉素B的產(chǎn)量。
29.權(quán)利要求27的方法，還包括給培養(yǎng)物進(jìn)料磷酸二氫鹽和磷酸氫鹽的混合物。
30.權(quán)利要求23的方法，還包括將埃坡霉素B或其溶劑合物轉(zhuǎn)化成下式的衍生物1或其鹽或溶劑合物 衍生物1
31.權(quán)利要求23的方法，還包括將埃坡霉素B或其溶劑合物轉(zhuǎn)化成下式的衍生物2或其溶劑合物 衍生物2
32.權(quán)利要求23的方法，還包括將埃坡霉素B或其溶劑合物轉(zhuǎn)化成下式的衍生物3或其溶劑合物 衍生物3
33.一種纖維堆囊菌的菌株，其在埃坡霉素B比較生產(chǎn)條件下生產(chǎn)至少5mg埃坡霉素B/g樹脂。
34.權(quán)利要求33的菌株，其生產(chǎn)的埃坡霉素中埃坡霉素B/A的比例為至少1.0。
35.以ATCC號PTA-3880保藏的纖維堆囊菌的菌株。
36.以ATCC號PTA-3881保藏的纖維堆囊菌的菌株。
37.一種通過反相高效液相色譜法(HPLC)純化按照權(quán)利要求1的方法分離的埃坡霉素的方法，該方法包括(a)用有機(jī)溶劑的水溶液或有機(jī)溶劑混合物的水溶液平衡含分離樹脂的反相高效液相色譜柱；(b)提供溶解于合適的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物中的裝載樣品(c)將裝載樣品和能有效減少裝載容量中埃坡霉素沉淀的痕量的合適的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物注入柱中；和(d)用有機(jī)溶劑的水溶液或有機(jī)溶劑混合物的水溶液洗脫柱子，開始時(shí)用低有機(jī)溶劑含量的溶劑，此后增加有機(jī)溶劑含量至超過平衡步驟使用的混合物中有機(jī)溶劑的含量，得到埃坡霉素。
38.權(quán)利要求37的方法，其中使用包含插在注射口和分離柱之間的裝載容量的儀器進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)。
39.權(quán)利要求37的方法，其中步驟(b)中的有機(jī)溶劑為二甲亞砜。
40.權(quán)利要求37的方法，其中步驟(c)中的有機(jī)溶劑為二甲亞砜。
41.權(quán)利要求37的方法，其中步驟(d)中的有機(jī)溶劑為乙腈的水溶液或甲醇的水溶液。
42.權(quán)利要求37的方法，其中注入步驟包括使用一定體積的臨時(shí)預(yù)加的二甲亞砜以有效減少裝載容量中的埃坡霉素沉淀。
43.權(quán)利要求37的方法，其還包括(e)使埃坡霉素結(jié)晶以得到純化的埃坡霉素B。
44.一種通過正相高效液相色譜法(HPLC)純化按照權(quán)利要求1的方法分離的埃坡霉素的方法，其包括(a)用有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物平衡含分離凝膠或樹脂的正相高效液相色譜柱；(b)提供溶解于有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物中的裝載樣品；(c)將裝載樣品注入柱中；和(d)用有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物洗脫柱子，開始時(shí)用低含量的極性溶劑，此后增加至極性溶劑含量超過平衡步驟中使用的極性溶劑混合物中極性溶劑含量，得到埃坡霉素。
45.權(quán)利要求44的方法，其中步驟(b)中的有機(jī)溶劑為二氯甲烷。
46.權(quán)利要求44的方法，其中步驟(d)中的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯或正庚烷。
47.權(quán)利要求44的方法，其還包括(e)使埃坡霉素結(jié)晶以得到純化的埃坡霉素B。
全文摘要
本發(fā)明涉及埃坡霉素B的生產(chǎn)、分離和純化的改進(jìn)方法。例如，這些方法包括生產(chǎn)埃坡霉素B的發(fā)酵過程、通過在樹脂上吸附的分離以及隨后的純化過程。
文檔編號C12P17/14GK1705662SQ03822662
公開日2005年12月7日 申請日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月23日
發(fā)明者D·貝尼尼, R·斯坦卡瓦格, 蔣樹仁, 侯信雄, B·伊甘, D·古, D·侯, L·明茨邁爾, T·P·圖利, B·L·達(dá)維斯, I·哈格羅, M·馬斯卡里, G·加爾文, G·施泰因, C·W·麥康羅格, F·T·卡姆佐格盧 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司