專利名稱：測定構(gòu)成肝素的特殊基團(tuán)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是一種分析構(gòu)成肝素或低分子量肝素的特殊基團(tuán)的方法。
在使用純肝素制備依諾肝素(Lovenox)(US5,389,618)的方法中，在含水相中進(jìn)行堿性解聚的方法步驟使低聚糖鏈還原末端的葡糖胺發(fā)生了部分而特征性的轉(zhuǎn)化。
這種轉(zhuǎn)化的第一個步驟包括葡糖胺甘露糖胺的差向異構(gòu)作用(T.Toida等人，《碳水化合物化學(xué)雜志(J.Carbohydrate Chemistry)》，15(3)，351-360(1996))；第二個步驟是葡糖胺的6-O脫硫作用，其結(jié)果是生成了稱之為“1，6-脫水”衍生物的產(chǎn)物(國際專利申請WO01/29055)。
只是其末端葡糖胺被6-O-硫酸化的那些低聚糖鏈才得到這類衍生物。其末端用1，6-脫水鍵改性的低聚糖鏈的百分比是依諾肝素低聚糖混合物的結(jié)構(gòu)特征，因此應(yīng)該能夠進(jìn)行測定。
因此，本發(fā)明涉及分析肝素、低分子量肝素、更具體地是依諾肝素的方法。
本發(fā)明的分析方法如下通過肝素酶的作用使待測定樣品解聚，然后必要的話，將得到的解聚產(chǎn)物還原，再采用高效液相層析進(jìn)行分析。
因此，如前面定義方法的特征在于鑒定末端用1，6-脫水鍵改性的低聚糖鏈的存在(“1，6-脫水基團(tuán)”)。
具體而言，首先使用肝素酶混合物、特別是使用肝素酶1(EC4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC4.2.2.8.)(這些酶是GrampianEnzymes公司銷售的)的混合物，使待測定樣品徹底地解聚。
因此，本發(fā)明的目的是一種分析肝素或低分子量肝素的方法，其特征在于進(jìn)行下述步驟1)通過肝素酶的作用使樣品解聚，2)如果適當(dāng)，還原解聚產(chǎn)物，3)采用高效液相層析法測定。
更具體地講，本發(fā)明的目的是如前面定義的方法，其特征在于所述肝素酶呈肝素酶1(EC4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC4.2.2.8.)混合物形式。
優(yōu)選將如此制備的解聚產(chǎn)物再使用NaBH4在乙酸鈉中的溶液進(jìn)行處理。這后一步驟可以特異性地減少沒有呈1，6-脫水形式的還原末端(在專利申請WO01/72762中描述的產(chǎn)物)。最后，為了能夠定量測定下面描述的二糖1和2，應(yīng)該通過例如NaBH4還原劑的作用使采用肝素酶解聚的低分子量肝素樣品進(jìn)行還原。
所以，更具體而言，本發(fā)明的目的是如前面定義的方法，其特征在于然后還原解聚的肝素。
非常具體地講，本發(fā)明的目的還是如前面定義的方法，其特征在于所述還原劑是NaBH4。任選使用其它堿金屬的硼氫化物，例如硼氫化鋰或鉀。
然后采用HPLC(高效液相層析法)、特別是采用陰離子交換層析法進(jìn)行1，6-脫水端的測定。
本發(fā)明的測定方法能夠很好地將依諾肝素與其它不含有1，6-脫水衍生物的低分子量肝素區(qū)分開來。相反，本發(fā)明的測定方法能夠保證這些低分子量肝素不滿足依諾肝素的物理-化學(xué)特性，因此具有不同的性質(zhì)。
本發(fā)明的測定方法能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程，在生產(chǎn)過程中對樣品進(jìn)行監(jiān)控，以保證依諾肝素生產(chǎn)過程的標(biāo)準(zhǔn)化，達(dá)到均一的質(zhì)量。
在酶解聚作用和還原末端的還原后，依諾肝素的1，6-脫水衍生物呈四種基本形態(tài)。因此，本發(fā)明再一個目的是如前面描述的方法，其特征在于當(dāng)解聚反應(yīng)是如下反應(yīng)時，得到如下所示的1，6-脫水殘留物 二糖1 二糖2 二糖1 四糖1在末端二糖單元有1，6-脫水末端，在所述末端二糖的糖醛酸沒有2-O硫酸酯基的所有這些低聚糖或多聚糖，完全被所述肝素酶解聚，并呈二糖1和2形式。然而，當(dāng)所述的末端二糖在糖醛酸有2-O硫酸酯基，并且它呈甘露糖胺形式時，這種1，6-脫水衍生物呈四糖1形式(耐肝素酶的形式)。
這種混合物中也存在三糖1(見下面)。它來自于其它的降解過程，具有下面的結(jié)構(gòu)(依諾肝素化學(xué)解聚時觀察到的剝離現(xiàn)象)。
三糖1
該混合物的其它組分不是依諾肝素的特有特征。肝素鏈中有8個基本二糖。Sigma公司特別銷售這8個基本二糖。
采用本發(fā)明的方法可鑒定出混合物中的其它二糖ΔIIsgal和ΔIVsgal二糖，它們的來源是-IdoA(2S)-GlcNS(6S)-和-IdoA(2S)-GlcNS-的堿性2-O脫硫作用，并由此生成2種半乳糖醛酸。它通常不存在于肝素的原始結(jié)構(gòu)中(U.M.Desai及其同事，《Arch.Biochem.Biophys.》，306(2)461-468(1993))。
含有3-O硫酸化葡糖胺的低聚糖可抗肝素酶的裂解作用，因此可以四糖形式存在。
在大多數(shù)低分子量肝素的情況下，肝素是從豬粘液中提取的，而這些主要的四糖表示如下。它們抗酶解聚，并且反映了對抗凝血酶III的親合順序。它們可表征如下ΔIIa-IIsglu和ΔIIa-IVsglu。(S.YAMADA，K.YOSHIDA，M.SUGIURA，K.SUGAHARA，K-H KHOO，H.R.MORRIS，A.DELL，《J.Biol.Chem.》；270(7)，4780-4787(1993)。
ΔUA-GlcNAc-GlcA-GlcNS(3，6S)或ΔIIa-IIsglu ΔUA-GlcNAc-GlcA-GlcNS(3S)或ΔIIa-IVsglu通過肝素酶裂解從混合物中分離的后一組分是葡糖絲氨酸(glycosérine)端基ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser(K.SUGAHARA，H.TSUDA，K.YOSHIDA，S.YAMADA，《J.Biol.Chem.》；270(39)，22914-22923(1995)；K.SUGAHARA，S.YAMADA，K.YOSHIDA，P.de WAARD，J.F.G.VLIEGENTHART；《J.Biol.Chem.》；267(3)，1528-1533(1992))。在依諾肝素中幾乎沒有后者(參見實施例5的NMR)。
本發(fā)明的另一個方面是用于測定1，6-脫水基團(tuán)的層析方法。首先，涉及使解聚和采用還原劑(例如NaBH4)處理后得到的不同多糖分離。
陰離子交換層析(SAX)是一種最適合于這樣復(fù)雜的混合物分離的方法。
可以使用裝有Spherisorb SAX型固定相的柱進(jìn)行分離，其固定相粒度為5μm，柱長度為25cm?？墒褂弥睆綖?mm-4.6mm的任何柱。
使用的設(shè)備可以是能形成洗脫梯度的任何層析儀，有UV檢測器，更優(yōu)選地裝有一組二極管，以便能夠得到這些組分的UV譜并記錄復(fù)雜的信號，從而得到在2個不同波長的吸收差，并能專門檢測出乙?；途厶恰榱四軐崿F(xiàn)這類檢測，最好使用直到200nm UV區(qū)都能透光的移動相。這就排除了通常使用的NaCl基移動相，這種移動相還有一個缺陷是需要進(jìn)行鈍化層析，以便能夠耐氯化物腐蝕。這里使用的移動相優(yōu)選地是高氯酸鈉基的，然而也可以使用甲磺酸鹽或磷酸鹽基的。
分離的pH可以是2-6.5。優(yōu)選采用pH約3?？梢酝ㄟ^加鹽進(jìn)行控制，例如使用在pH＝3具有緩沖能力的磷酸鹽優(yōu)于高氯酸鹽。
作為實例，在下面給出層析分離的標(biāo)準(zhǔn)條件溶劑A2.5mM NaH2PO4，加H3PO4可調(diào)到pH2.9，溶劑B1N NaClO4-2.5mM NaH2PO4，加H3PO4可調(diào)到pH3.0，洗脫梯度如下T＝0min％B＝3；T＝40min％B＝60；T＝60min％B＝80。
因此，本發(fā)明再一個目的是如前面定義的采用陰離子交換層析進(jìn)行分離的分析方法，其特征在于使用直到200nM UV都能透光的移動相。
更特別地講，本發(fā)明還有一個目的是如前面定義的以高氯酸鈉、甲磺酸鹽或磷酸鹽為基的移動相的分析方法。
另一個非常重要方面是檢測方法。
為了提高UV檢測的專一性，申請人研制了一種方法。由于未乙?；嗵窃谝欢ǖ膒H有十分相似的UV譜，所以有可能取2個波長的吸收差作為信號，選擇性地檢測這些乙?；?，使得未乙?；遣划a(chǎn)生吸收率。
在下述情況下，選擇202nm和230nm進(jìn)行檢測并作為參比波長，優(yōu)選記錄202-230nm處的信號。這種選擇當(dāng)然取決于移動相的pH(要優(yōu)化所述條件可能需要調(diào)整幾個nm)。最適合于這種技術(shù)的檢測器是AgilentTechnologies公司的DAD 1100檢測器。在這種情況下，在234nm與在202-230nm進(jìn)行雙檢測。下面的圖說明了乙?；途厶堑倪x擇性檢測原理，圖中δ硫酸化二糖UV譜Is與δ硫酸化二糖UV譜Ia進(jìn)行比較。
本發(fā)明還有一個目的是如前面定義的采用陰離子交換層析進(jìn)行分離的分析方法，其特征在于這種檢測方法能夠選擇性檢測乙?；恰?br> 非常特別地講，本發(fā)明還有一個目的是如前面定義的采用陰離子交換層析進(jìn)行分離的分析方法，其特征在于選擇2個波長的吸收差作為信號，選擇性檢測乙?；?，對波長進(jìn)行選擇使未乙?；遣划a(chǎn)生吸收率。
上述4個1，6-脫水殘留物的定量分析要求層析法系統(tǒng)對混合物中的所有其它組分具有足夠的選擇性。然而，與ΔIIa相比，2個二糖1和2(一般共洗脫的)的分辨率很差，尤其后一種呈2個端基異構(gòu)體α和β形態(tài)時更是如此。
2個二糖1和2的同一性可以容易地得到證實，因為在室溫下，在加入NaOH將ΔIIa水溶液的pH調(diào)節(jié)到13時，在幾小時內(nèi)它們就生成了。但是，如果采用雙檢測方法，這些乙酰基化低聚糖ΔIVa、ΔIIa、ΔIIIa、ΔIa、ΔIIa-IVsglu和ΔIIa-IIsglu是很容易鑒定的。
一方面，產(chǎn)生峰分裂的原因是由于存在端基異構(gòu)體，并且當(dāng)它們位于低聚糖鏈的端位時，在一定程度上產(chǎn)生了葡糖胺甘露糖胺差向異構(gòu)作用，部分呈現(xiàn)ΔIIs、ΔIIIs和ΔIs。
為了能夠定量分析二糖1和2，可通過NaBH4的作用使用肝素酶解聚的低分子量肝素樣品還原。
α端基異構(gòu)體+β端基異構(gòu)體這種還原的好處在于通過打開末端低聚糖環(huán)可消除αβ端基異構(gòu)現(xiàn)象。因為消除了端基異構(gòu)現(xiàn)象，所以得到的層析圖比較簡單，尤其是ΔIia的還原降低了在柱中的保留時間，因此可以容易地測定二糖1和2。
下面

圖1和2描述的層析圖實例清楚地說明了這些現(xiàn)象和這種方法的優(yōu)點。
最后，本發(fā)明還有一個目的是通過實施解聚和還原方法所得到的新糖類衍生物，它們選自二糖1、二糖2、二糖3和三糖1。
下面的實施例非限制性地說明了本發(fā)明。
實施例1將50μl 20mg/ml待測定的低分子量肝素溶液、含有2mM乙酸鈣的200μl 100mM乙酸/NaOH(pH7.0)溶液和1mg/ml BSA與50μl 3種肝素酶儲存液混合，在室溫下進(jìn)行酶解聚反應(yīng)48小時。
向臨時制備的100mM乙酸鈉中添加10μl 30g/lNaBH4溶液，對60μl使用所述肝素酶的解聚產(chǎn)物進(jìn)行還原反應(yīng)。注意，肝素酶應(yīng)該保存在-30℃下。所述肝素酶是在緩沖溶液中，它們的效價是0.5UI/ml(緩沖液組成0.01摩爾/1 KH2PO4pH7水溶液，補(bǔ)充了2mg/ml胎牛血清(BSA))。
實施例2根據(jù)前面描述的方法所得到二糖3的NMR。
在D2O中質(zhì)子譜，400MHz，T＝298K，以ppm表示的δ3.34(1H，dd，J＝7和2Hz，H2)，3.72(1H，t，J＝8Hz，H6)，3.90(1H，m，H3)，4.03(1H，s，H4)，4.20(1H，d，J＝8Hz，H6)，4.23(1H，t，J＝5Hz，H3′)，4.58(1H，m，H2′)，4.78(1H，m，H5)，5.50(1H，s，H1)，5.60(1H，dd，J＝6和1Hz，H1′)，6.03(1H，d，J＝5Hz，H4′)]。
實施例3根據(jù)前面描述的方法所得到四糖1的NMR。
在D2O中質(zhì)子譜，400MHz，T＝298K，以ppm表示的δ3.15(1H，s，H2)，3.25(1H，m，H2″)，3.60(1H，m，H3″)，3.70-4.70(14H，未拆分，H3/H4/H6，H2′/H3′/H4′/H5′，H4″/H5″/H6″，H2/H3)，4.75(1H，m，H5)，5.20-5.40(2H，m，H1′和H1″)，5.45(1H，m，H1)，5.56(1H，m，H1)，5.94(1H，d，J＝5Hz，H4)。
實施例4根據(jù)前面描述的方法所得到三糖1的NMR。
在D2O中譜，600MHz，(以ppm表示的δ)3.28(1H，m)，3.61(1H，t，7Hz)，3.79(1H，t，7Hz)，3.95(1H，d，6Hz)，4.00(1H，s)，4.20(1H，m)，4.28(2H，m)，4.32(1H，d，4Hz)，4.41(1H，s)，4.58(1H，s)，4.61(1H，s)，4.90(1H，寬s)，5.24(1H，s)，5.45(1H，s)，5.95(1H，s)。
實施例5ΔGlcA-Gal-Gal-Xyl-Ser的NMR在D2O中譜，500MHz(以ppm表示的δ)3.30(1H，t，7Hz)，3.34(1H，t，8Hz)，3.55(1H，t，7Hz)，3.60(1H，t，7Hz)，3.63-3.85(10H，m)，3.91(2H，m)，3.96(1H，dd，7和2Hz)，4.02-4.10(3H，m)，4.12(1H，d，2Hz)，4.18(1H，m)，4.40(1H，d，6Hz)，4.46(1H，d，6Hz)，4.61(1H，d，6Hz)，5.29(1H，d，3Hz)，5.85(1H，d，3Hz)。
實施例6定量分析原理在本發(fā)明的方法中，廣泛接受這樣一個假設(shè)，混合物中含有的所有不飽和低聚糖都具有同樣的摩爾吸收率，它等于5500摩爾-1.l.cm-1。
因此有可能測定低分子量肝素的解聚混合物中的所有組分的重量百分?jǐn)?shù)。對于相應(yīng)于峰7、8、13和19的4個1，6-脫水衍生物，得到下述重量百分?jǐn)?shù)
面積7、面積8、面積13和面積19分別相應(yīng)于峰7、8、13和19的面積。這四種化合物的摩爾質(zhì)量分別是443、443、545和1210?！苭x·面積x相應(yīng)于層析圖中各個峰的面積與相應(yīng)產(chǎn)物的摩爾質(zhì)量比。
如果Mw是所研究低分子量肝素的平均質(zhì)量，則可以下述方式得到以1，6-脫水環(huán)為末端的低聚糖鏈的百分?jǐn)?shù)所述組分的分子量如下
糖類命名，與圖1、2峰相對應(yīng)IdoAα-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸；GlcAβ-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸；ΔGlcA4，5-不飽和酸4-脫氧-α-L-蘇式(threo)吡喃己-4-烯糖基糖醛酸；GalD-半乳糖；Xyl木糖；GlcNAc2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖；GlcNS2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖；2S2-O硫酸酯；3S3-O硫酸酯；6S6-O硫酸酯；1ΔGlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-Ser24-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡糖基鈉鹽；3ΔGlcAβ1-3Galβ1-3Galβ1-4Xylβ1-O-CH2-COOH；44-脫氧-α-L-蘇式己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖二鈉鹽；54-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基二鈉鹽；64-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基二鈉鹽；
74-脫氧-α-L-蘇式吡喃己-4-烯糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脫水-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖二鈉鹽(二糖1)；84-脫氧-α-L-蘇式吡喃己-4-烯糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脫水-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃甘露糖二鈉鹽(二糖2)；94-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基二鈉鹽；104-脫氧-α-L-蘇式己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-吡喃葡萄糖三鈉鹽；114-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基三鈉鹽；124-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2--磺酰氨基-α-D-吡喃葡萄糖基三鈉鹽；134-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己-4-烯糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脫水-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖三鈉鹽(二糖3)；144-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基三鈉鹽；154-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1-→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基)五鈉鹽；164-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基四鈉鹽；174-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3，6-二-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基)六鈉鹽；184-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸六鈉鹽；194-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脫水-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-吡喃甘露糖七鈉鹽(四糖1)；204-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-葡糖醇鈉鹽；214-脫氧-α-L-蘇式己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-β-D-葡糖醇二鈉鹽；224-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-葡糖醇二鈉鹽；234-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇二鈉鹽；244-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-α-D-葡糖醇二鈉鹽；254-脫氧-α-L-蘇式己-4-烯吡喃半乳糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-β-D-葡糖醇三鈉鹽；264-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇三鈉鹽；274-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-α-D-葡糖醇三鈉鹽；284-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇三鈉鹽；294-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3-O-磺基-α-D-葡糖醇)五鈉鹽；304-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-葡糖醇四鈉鹽；314-脫氧-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-乙酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-3，6-二-O-磺基-α-D-葡糖醇)六鈉鹽；324-脫氧-2-O-磺基-α-L-蘇式吡喃己烯糖基糖醛酸-(1→4)-2-脫氧-2-磺酰氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-吡喃艾杜糖基糖醛酸六鈉鹽(用NaBH4還原)。
圖1在用NaBH4還原前后，使用肝素酶解聚的依諾肝素的層析分離圖(細(xì)黑信號在234nmUV；粗黑信號在202-234nmUV)圖2在用NaBH4還原前后，使用肝素酶解聚的肝素的層析分離圖(細(xì)黑信號在234nmUV；粗黑信號在202-234nmUV)。
權(quán)利要求
1.一種分析肝素或低分子量肝素的方法，其特征在于進(jìn)行下述步驟1)通過肝素酶的作用使樣品解聚，2)如果適當(dāng)，還原解聚產(chǎn)物，3)采用高效液相層析法測定。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于鑒定末端用1，6-脫水鍵改性的低聚糖鏈的存在。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述肝素酶呈肝素酶1(EC4.2.2.7.)、肝素酶2(肝素裂解酶II)和肝素酶3(EC4.2.2.8.)混合物形式。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使通過肝素酶作用解聚的肝素(解聚產(chǎn)物)再受到還原劑的作用。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述還原劑是NaBH4或硼氫化物陰離子的堿金屬鹽。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中采用的層析法是陰離子交換層析法。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于使用一種直到200nmUV都透光的移動相。
8.如權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于使用的移動相是高氯酸鈉、甲磺酸鹽或磷酸鹽基的。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于采用了能夠選擇性檢測乙?；堑臋z測方法。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于取2個波長的吸收差作為信號，選擇性檢測乙?；?，所選擇的波長使得未乙酰基化糖不產(chǎn)生吸收。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于解聚反應(yīng)時得到的1-6脫水殘留物如下
12.下式的1，6-脫水衍生物(二糖1)
13.下式的1，6脫水衍生物(二糖2)
14.下式的1，6脫水衍生物(二糖3)
15.下式的三糖衍生物
全文摘要
本發(fā)明涉及分析肝素或低分子量肝素方法，其特征在于待測定樣品使用肝素酶進(jìn)行解聚，如果必要的話，再還原所得到的解聚產(chǎn)物。然后進(jìn)行高效液相層析分析。
文檔編號C12Q1/34GK1703519SQ03822562
公開日2005年11月30日 申請日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月23日
發(fā)明者P·穆里耶, C·維斯科夫 申請人:安萬特醫(yī)藥股份有限公司