專利名稱：高血壓風(fēng)險的診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用與高血壓相關(guān)的基因的檢測方法。具體而言，涉及利用與高血壓相關(guān)的多個基因的多態(tài)性的檢測方法以及該方法所使用的試劑盒。可以利用本發(fā)明求出高血壓的發(fā)病風(fēng)險。
背景技術(shù)：
高血壓是多因素疾病，是由個體的遺傳背景以及多種環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的(參考文獻1)。由于高血壓是冠狀動脈疾病、腦卒中、慢性腎病的主要危險因素，因而高血壓的預(yù)防在社會和公共衛(wèi)生學(xué)方面是重要的。預(yù)防高血壓的一種方法是鑒定高血壓易感性基因。通過連鎖分析(參考文獻2-4)以及候選基因的關(guān)聯(lián)分析(參考文獻5-8)對和高血壓相關(guān)的染色體上的多個基因座和候選基因群進行了鑒定。盡管到目前為止通過基因組流行病學(xué)研究，已報道了血管緊張素原(參考文獻5)、α-內(nèi)收蛋白(α-アデユ—シン)(參考文獻6)、G蛋白β3亞單位(參考文獻7)、以及β2腎上腺素受體(參考文獻8)等基因多態(tài)性和高血壓病的關(guān)系，然而，高血壓易感基因仍未被充分鑒定。再者，由于不同人種有著不同的基因組多態(tài)性，因此，針對不同種族，構(gòu)建多態(tài)性和高血壓之間的關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫很重要。
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發(fā)明內(nèi)容
如上所述，到目前為止已進行了為數(shù)眾多的基因多態(tài)性和高血壓之間的關(guān)聯(lián)分析。但是，多數(shù)研究就其意義來說并未取得一定的結(jié)論。其主要原因在于，多數(shù)研究中的對象群體的樣本量不夠，以及除基因多態(tài)性之外環(huán)境因素在人種間也存在差異。進而，例如即使和高血壓之間的關(guān)聯(lián)得到了論證，在大規(guī)模群體的分析中，相對危險度(優(yōu)勢比)一般也較低。
鑒于上述背景，本發(fā)明目的在于提供以高精度和高預(yù)知概率診斷高血壓風(fēng)險基因的手段，為高血壓的一次預(yù)防做貢獻。
本發(fā)明人為達(dá)到上述目的，利用多種公共數(shù)據(jù)庫，挑選出71個被推測為和冠狀動脈硬化、冠狀動脈痙攣、高血壓、糖尿病、高脂血癥等相關(guān)的基因，并圍繞預(yù)想的和基因功能變化相關(guān)，從中選擇了112種多態(tài)性。接著，就心肌梗塞445例和對照464例，進行了這71個基因112種多態(tài)性和心肌梗塞的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，男性19例、女性18例的單核苷酸多態(tài)性(SNPsingle nucleotide polymorphism)和心肌梗塞發(fā)病相關(guān)(Yamada Y，Izawa H，Ichihara S，等Predictionof risk of myocardial infarction from polymorphisms in candidategenes.N Engl J Med.in press.)，這些多態(tài)性群中也包含高血壓的候選基因。因此，就這些SNP和高血壓的關(guān)聯(lián)進行了大規(guī)模的關(guān)聯(lián)分析。其結(jié)果是，在男性4例、女性4例中成功鑒定了和高血壓相關(guān)的SNP。進而，采用多因素logistic回歸分析的逐步向前選擇法(stepwise forward selection method)，將這些多態(tài)組合進行分析，顯示最大相對危險度在男性為5.34，女性為46.86，在過去所報道的關(guān)聯(lián)分析中，其相對危險度最大。由該結(jié)果可知，如果從這些SNP中選擇多個SNP，并將各SNP的分析結(jié)果組合使用，就可以進行可靠性高、預(yù)知概率高的高血壓風(fēng)險診斷。本發(fā)明基于上述見解所成，提供以下構(gòu)成。
包含下述步驟(a)的檢測核酸樣品的基因型的方法，(a)對核酸樣品的選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上多態(tài)性的分析步驟，(1)糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性，(2)趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性，(3)載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性，以及(4)G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性。
包含下述步驟(b)的檢測核酸樣品基因型的方法，(b)對核酸樣品的選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上多態(tài)性的分析步驟，(5)腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性，(6)腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性，(7)胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性，以及(8)糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性。
包含下述步驟(i)～(iii)的高血壓風(fēng)險的診斷方法，(i)對分析核酸樣品的選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上多態(tài)性的分析步驟，(1)糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性(2)趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性，(3)載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性，以及(4)G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性；(ii)由上述步驟所得到的多態(tài)性信息鑒定核酸樣品的基因型的步驟；以及(iii)由所鑒定的基因型求出高血壓遺傳風(fēng)險的步驟。
包含下述步驟(iv)～(vi)的高血壓風(fēng)險的診斷方法，(iv)對核酸樣品選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上多態(tài)性的分析步驟，(5)腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性，(6)腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性，(7)胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性，以及(8)糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性；
(v)由上述步驟所得到的多態(tài)性信息鑒定核酸樣品的基因型的步驟；以及(vi)由所鑒定的基因型求出高血壓遺傳風(fēng)險的步驟。
含有選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上核酸的基因型檢測用試劑盒，(1)用于分析糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性的核酸，(2)用于分析趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性的核酸，(3)用于分析載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(4)用于分析G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性的核酸。
含有選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上核酸的基因型檢測用試劑盒，(5)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性的核酸，(6)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性的核酸，(7)用于分析胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(8)用于分析糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性的核酸。
將選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上核酸固定在不溶性支持體上所形成的固定化核酸，(1)用于分析糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性的核酸，(2)用于分析趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性的核酸(3)用于分析載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(4)用于分析G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性的核酸。
將選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上核酸固定在不溶性支持體上所形成的固定化核酸，
(5)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性的核酸，(6)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性的核酸，(7)用于分析胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(8)用于分析糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性的核酸。


圖1是實施例中的關(guān)聯(lián)分析篩選中所研究的112種基因多態(tài)性的總結(jié)表；圖2同樣是實施例中的關(guān)聯(lián)分析篩選中所研究的112種基因多態(tài)性的總結(jié)表；圖3是實施例中的用于鑒定基因型的引物(從上開始，序列號分別為16、17、18、14、15、11、12、13、8、9、10、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)以及探針(從上開始，序列號分別為31、32、33、34)以及其它條件的總結(jié)表。圖中，F(xiàn)ITC表示異硫氰酸熒光素，TxR表示德克薩斯紅(Texas Red)，Biotin表示生物素；圖4是實施例中的關(guān)聯(lián)分析中所研究的單核苷酸多態(tài)性的總結(jié)表；圖5是實施例中的關(guān)聯(lián)分析中，作為對象的男性1107例和女性833例的背景資料的總結(jié)表，其中，年齡、體重指數(shù)、收縮期血壓、擴張期血壓、血清肌酸酐的各數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，表中*1表示P＜0.0001，2表示P＜0.001，*3表示P＜0.01；圖6是關(guān)聯(lián)分析中作為對象的基因多態(tài)性和多因素logistic回歸分析結(jié)果的總結(jié)表，各SNP中低方的P值以黑體表示；圖7是顯示就和高血壓相關(guān)的某種基因多態(tài)性而言，基因型的分布圖；圖8是顯示對和高血壓相關(guān)的某種基因多態(tài)性進行多因素logistic回歸分析的逐步向前選擇法的結(jié)果的表；圖9是顯示用男性中的4種組合基因多態(tài)性，進行高血壓遺傳風(fēng)險診斷的結(jié)果的表；
圖10是顯示用女性中的4種組合基因多態(tài)性，進行高血壓遺傳風(fēng)險診斷的結(jié)果的表；圖11是表示高血壓風(fēng)險診斷中的累積相對危險度和單核苷酸多態(tài)性的關(guān)系的圖。(A)表示在男性中的關(guān)系，(B)表示在女性中的關(guān)系。(A)中的各SNP分別是SNP1GP1a(1648A→G)多態(tài)性，SNP2CCR2(190G→A)多態(tài)性，SNP3ApoC-III(1100C→T)多態(tài)性，SNP4GPβ3(825C→T)多態(tài)性。(B)中的各SNP分別是SNP1TNFα(-850C→T)多態(tài)性，SNP2TNFα(-238G→A)多態(tài)性，SNP3IRS-1(3494G→A)多態(tài)性，SNP4GP1bα(1018C→T)多態(tài)性。
具體實施例方式
本發(fā)明的第一方面涉及核酸樣品的基因型的檢測方法，它的一種實施方式的特征在于，包含分析選自下面(1)～(4)中的2種或2種以上多態(tài)性的步驟。它的另一種實施方式的特征在于，包含分析選自下面(5)～(8)中的2種或2種以上多態(tài)性的步驟。此外，通過由以上步驟的結(jié)果所得到的多態(tài)性信息鑒定核酸樣品的基因型，可以求得高血壓遺傳風(fēng)險。
(1)糖蛋白1a(Glycoprotein 1a)基因的第1648位堿基的多態(tài)性1648A→G(以下，也稱作“GP1a(1648A→G)多態(tài)性”)(2)趨化因子受體2(Chemokine receptor 2)基因的第190位堿基的多態(tài)性190G→A(以下，也稱作“CCR2(190G→A)多態(tài)性”)(3)載脂蛋白C-III(apolipoprotein C-III)基因的第1100位堿基的多態(tài)性1100C→T(以下，也稱作“ApoC-III(1100C→T)多態(tài)性”)(4)G蛋白β3亞單位(G-protein β3 subunit)基因的第825位堿基的多態(tài)性825C→T(以下，也稱作“GPβ3(825C→T)多態(tài)性”)(5)腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α)的基因的第-850位堿基的多態(tài)性-850C→T(以下，也稱作“TNFα(-850C→T)多態(tài)性”)(6)腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α)的基因的第-238位堿基的多態(tài)性-238G→A(以下，也稱作“TNFα(-238G→A)多態(tài)性”)(7)胰島素受體底物1(Insulin receptor substrate-1)基因的第3494位堿基的多態(tài)性3494G→A(以下，也稱作“IRS-1(3494G→A)多態(tài)性”)(8)糖蛋白1bα(Glycoprotein 1bα)基因的第1018位堿基的多態(tài)性1018C→T(以下，也稱作“GP1bα(1018C→T)多態(tài)性”)以上1648A→G等標(biāo)記代表該堿基號位置的多態(tài)性是由箭頭前面或后面的堿基所代表的2個基因型構(gòu)成。
各基因中的堿基號是以公共數(shù)據(jù)庫GenBank(NCBI)中所登記的公知序列為基準(zhǔn)來標(biāo)示的。此外，在序列號1的堿基序列(登錄號X17033M28249人整合蛋白α-2亞單位mRNA)中，第1648位堿基相當(dāng)于糖蛋白1a基因的1648位堿基。同樣地，在序列號2的堿基序列(登錄號U95626Homo sapiens ccr2b(ccr2)，ccr2a(ccr2)，ccr5(ccr5)和ccr6(ccr6)基因，完整cds，和乳鐵結(jié)合蛋白基因，部分cds，完整序列(但是，序列號2的序列是指截止到第50,000位堿基的序列))中，第46295位堿基相當(dāng)于趨化因子受體2基因的190位堿基；在序列號3的堿基序列(登錄號XO1392人載脂蛋白CIII基因和apoAI-apo CIII基因間)中，第1100位堿基相當(dāng)于載脂蛋白C-III基因的1100位堿基；在序列號4的堿基序列(登錄號M31328人鳥嘌呤結(jié)合蛋白基因-3單位mRNA，完整cds.)中，第831位堿基相當(dāng)于G蛋白β3亞單位基因的825位堿基；序列號5的堿基序列(登錄號L11698人腫瘤壞死因子α基因啟動子區(qū)域)中，第203位堿基相當(dāng)于腫瘤壞死因子α基因的-850位堿基；序列號5的堿基序列(登錄號L11698人腫瘤壞死因子α基因啟動子區(qū)域)中，第816位堿基相當(dāng)于腫瘤壞死因子α基因的-238位堿基；序列號6的堿基序列(登錄號S85963hIRS-1＝大鼠胰島素受體底物-1同系物[人，細(xì)胞系FOCUS，Genomic，6152 nt].)中，第3494位堿基相當(dāng)于胰島素受體亞單位1基因的3494位堿基；序列號7的堿基序列(登錄號J02940人血小板糖蛋白1bα鏈mRNA，完整cds.)中，第524位堿基相當(dāng)于糖蛋白1bα基因的1018位堿基。
本發(fā)明中，“多態(tài)性分析”指的是針對分析對象的基因多態(tài)性研究核酸樣品具有哪個基因型，和研究多態(tài)性區(qū)域的堿基(堿基序列)同義。典型地，若以GP1a(1648A→G)多態(tài)性的分析為例，指的是研究核酸樣品中的糖蛋白1a的基因型為AA(1648位堿基在兩序列都為A的純合體)、AG(1648位堿基是A的序列和G的序列的雜合體)、以及GG(1648位堿基在兩序列都為G的純合體)中的哪種。
上述(1)～(4)的多態(tài)性，如后述實施例中所顯示的那樣，被認(rèn)為是在以日本男性為對象的分析中用于判定高血壓遺傳風(fēng)險的特別有效的多態(tài)性。因而，以這些多態(tài)性為分析對象，在以男性(尤其是日本男性)為受試者時，能夠進行高精度和高預(yù)知概率的高血壓風(fēng)險的診斷。
同樣地，上述(5)～(8)的多態(tài)性，如后述實施例中所顯示的那樣，被認(rèn)為是在以日本女性為對象的分析中用于判定高血壓遺傳風(fēng)險的特別有效的多態(tài)性。因而，以這些多態(tài)性為分析對象，在以女性(尤其是日本女性)為待檢者時，能夠進行高精度和高預(yù)知概率的高血壓風(fēng)險的診斷。
此處，原則上講，和分析的多態(tài)性的數(shù)目的增加成比例，核酸樣品的基因型分類更為詳細(xì)，可以進行預(yù)知概率更高的高血壓遺傳風(fēng)險診斷。從這些觀點看，上述(1)～(4)的多態(tài)性中，優(yōu)選對更多的多態(tài)性進行分析來檢測基因型。因而，更加優(yōu)選分析(1)～(4)中的所有多態(tài)性。在將3種或3種以下的多態(tài)性進行組合來檢測基因型時，優(yōu)選先選擇使用后述實施例所示的相對危險度高的多態(tài)性。例如若將3種多態(tài)性組合使用時，優(yōu)選相對危險度高的3種多態(tài)性，即(2)、(3)和(4)。同樣地，例如若將2種多態(tài)性組合使用時，優(yōu)選(2)和(4)。
在對從(5)～(8)的多態(tài)性選擇的2種或2種以上多態(tài)性進行分析的時候，同樣地，最優(yōu)選對全部多態(tài)性，即4種多態(tài)性進行分析。將3種或3種以下的多態(tài)性組合來檢測基因型時，優(yōu)選先選擇使用后述實施例所示的相對危險度高的多態(tài)性。例如，若將3種多態(tài)性組合使用時，優(yōu)選(5)、(7)和(8)。同樣地，若將2種多態(tài)性組合使用時，優(yōu)選(5)和(7)。
分析各基因多態(tài)性的方法沒有特別限定，例如使用等位基因特異性引物(以及探針)?？梢圆捎美肞CR擴增、并根據(jù)熒光或發(fā)光分析擴增產(chǎn)物的多態(tài)性的方法，利用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))法的PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)法、PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法(Orita，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，86，2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(特異序列寡核苷酸)法、將PCR-SSO法和點雜交法組合而成的ASO(等位基因特異性寡核苷酸)雜交法(Saiki，Nature，324，163-166(1986)等)、或者TaqMan-PCR法(Livak，KJ，Genet Anal，14，143(1999)，Morris，T.等，J.Clin.Microbiol.，34，2933(1996))、Invader法(Lyamichev V等，Nat Biotechnol，17，292(1999))、采用了引物延伸法的MALDI-TOF/MS(matrix)方法(Haff LA，Smirnov IP，Genome Res 7，378(1997))、RCA(循環(huán)擴增)法(Lizardi PM等，Nat Genet 19，225(1998))、使用DNA芯片或微陣的方法(Wang DG等，Science 280，1077(1998)等)、引物延伸法、Southern blot雜交法、點雜交法(Southern，E.，J.Mol.Biol.98，503-517(1975))等公知的方法。還可以通過直接測序?qū)Ψ治鰧ο蟮亩鄳B(tài)性進行分析。此外，可以將這些方法任意組合進行多態(tài)性分析。
核酸樣品少的時候，從檢測靈敏度和精度方面考慮，優(yōu)選利用PCR法的方法(例如PCR-RFLP法)進行分析。此外，以PCR法或應(yīng)用了PCR法的方法等的基因擴增法預(yù)先對核酸樣品進行擴增(包含核酸樣品的部分區(qū)域的擴增)后，上述任何分析方法都可適用。
另一方面，分析多個核酸樣品時，尤其優(yōu)選使用等位基因特異性PCR法、等位基因特異性雜交法、TaqMan-PCR法、Invader法、采用引物延伸法的MALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(循環(huán)擴增)法、或使用DNA芯片或微陣的方法等在較短時間可以對多個檢測對象進行分析的分析方法。
以上方法中，使用各方法所對應(yīng)的引物或探針等的核酸(本發(fā)明中，也稱作“多態(tài)性分析用核酸”)。作為多態(tài)性分析用核酸，可舉出，含有與包含分析對象的多態(tài)性的基因中含該多態(tài)性位點的一定區(qū)域(部分DNA區(qū)域)互補的序列的核酸。還可舉出，含有與包含分析對象的多態(tài)性的基因中的含該多態(tài)性位點的一定區(qū)域(部分DNA區(qū)域)互補的序列、并且能夠特異性擴增包含該多態(tài)性位點的DNA片段的核酸(引物)。作為這樣的核酸，例如可以是在以糖蛋白1a基因的1648位堿基的多態(tài)性為分析對象的情況下，含有與1648位堿基為A(腺嘌呤)的糖蛋白1a基因中含1648位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸；或含有于1648位堿基為G(鳥嘌呤)的糖蛋白1a基因中的含1648位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸。
作為多態(tài)性分析用核酸的其它的具體例子，可以舉出，只有當(dāng)分析對象的多態(tài)性位點為任何基因型時，是為特異性擴增包含該多態(tài)性位點的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對。更為具體些，是為特異性擴增包含該多態(tài)性位點的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，例如可舉出，由正義引物和反義引物所組成的核酸對，其中，上述正義引物可與多態(tài)性位點是任意基因型的反義鏈中包含該多態(tài)性位點的部分DNA區(qū)域特異性雜交，上述反義引物可與正義鏈的部分區(qū)域特異性雜交。作為這樣的核酸對，在以糖蛋白1a基因的1648位堿基的多態(tài)性為分析對象時，是為特異性擴增糖蛋白1a基因的包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，可以是與1648位堿基為A(腺嘌呤)的糖蛋白基因的反義鏈中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域特異性雜交的正義引物、和與正義鏈的部分區(qū)域特異性雜交的反義引物構(gòu)成的核酸對，或者是與1648位堿基為G(鳥嘌呤)的糖蛋白基因的反義鏈中的包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域特異性雜交的正義引物、和與正義鏈的部分區(qū)域特異性雜交的反義引物構(gòu)成的核酸對。此處，被擴增的部分DNA區(qū)域的長度可在適于其檢測的范圍內(nèi)適宜地設(shè)定，例如50bp～200bp，優(yōu)選80bp～150bp。更具體些，例如，作為GP1a(1648A→G)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸。此外，以下序列的下劃線表示對應(yīng)于多態(tài)性的部分。序列中的N指的是A、T、C和G中的任意一種。
正義引物GAGTCTACCTGTTTACTATCAANAA序列號8，或GAGTCTACCTGTTTACTATCAANGA序列號9反義引物ACCAGTACTAAAGCAAATTAAACT序列號10同樣地，作為CCR2(190G→A)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸反義引物GCAGTTTATTAAGATGAGGNCG序列號11，或TTGCAGTTTATTAAGATGAGGNTG序列號12正義引物
GGTGCTCCCTGTCATAAATTTGA序列號13同樣地，作為ApoC-III(1100C→T)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸正義引物CCTTCTCAGCTTCATGCAGG序列號14反義引物GTCTTGGTGGCGTGCTTCA序列號15同樣地，作為GPβ3(825C→T)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸正義引物TCTGCGGCATCACGTNCG序列號16，或TCTGCGGCATCACGTNTG序列號17反義引物GAATAGTAGGCGGCCACTGA序列號18同樣地，作為TNFα(-850C→T)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸反義引物TCTACATGGCCCTGTCTTNGT序列號19，或CTCTACATGGCCCTGTCTTNAT序列號20正義引物CTCTACATGGCCCTGTCTTTAT序列號21同樣地，作為TNFα(-238G→A)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸反義引物CCCCATCCTCCCTGCTNCG序列號22，或CCCCATCCTCCCTGCTNTG序列號23正義引物AGTCAGTGGCCCAGAAGACC序列號24同樣地，作為IRS-1(3494G→A)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸正義引物GGGCCCTGCACCTCCNGG序列號25，或
GGGCCCTGCACCTCCNAG序列號26反義引物GGGTAGGCCTGCAAATGCTA序列號27同樣地，作為GP1bα(1018C→T)多態(tài)性分析用核酸引物，可以舉出具有如下序列的核酸正義引物CCCAGGGCTCCTGNCG序列號28，或CCCCAGGGCTCCTGNTG序列號29反義引物TGAGCTTCTCCAGCTTGGGTG序列號30另一方面，作為探針的具體例子，可以舉出下面的核酸，作為ApoC-III(1100C→T)多態(tài)性分析用探針CAGCTTCATGCAGGGCTACA序列號31，或CAGCTTCATGCAGGGTTACA序列號32；作為TNFα(-850C→T)多態(tài)性分析用探針ACATGGCCCTGTCTTNGTTAAG序列號33，或ACATGGCCCTGTCTTNATTAAG序列號34；作為IRS-1(3494G→A)多態(tài)性分析用探針CACCTCCNGGGGCTGCTAG序列號35，或CACCTCCNAGGGCTGGTAG序列號36。
以上核酸引物、核酸探針僅僅是一個例子，若是核酸引物，只要在不阻礙目的擴增反應(yīng)進行的限度內(nèi)，若是核酸探針，只要在不阻礙目的雜交反應(yīng)進行的限度內(nèi)，都可以是一部分堿基序列發(fā)生了改變的核酸。此處的“一部分改變”指的是一部分堿基被缺失、取代、插入和/或添加。發(fā)生改變的堿基數(shù)例如是1～7個、優(yōu)選是1～5個、更優(yōu)選是1～3個。此外，這種改變以在多態(tài)性位點對應(yīng)的堿基以外的區(qū)域發(fā)生為原則。
根據(jù)分析方法，將適宜的DNA片段或RNA片段用作多態(tài)性分析用核酸(探針、引物)。多態(tài)性分析用核酸的堿基長度只要是使各自的功能可得到發(fā)揮的長度就可以了，用于引物時的堿基長度，例如是10～50bp左右，優(yōu)選是15～40bp左右，更優(yōu)選是15～30bp左右。
此外，用作引物時，只要可以和擴增對象特異性雜交、可擴增目的DNA片段，對模板序列，也可以有一些錯配。用作探針時，同樣地，只要和檢測對象序列特異性雜交可以進行，對檢測對象序列，也可以有一些錯配。錯配的程度為1～幾個，優(yōu)選為1～5個，更優(yōu)選為1～3個。
多態(tài)性分析用核酸(引物、探針)，可以以磷酸二酯酶法等公知方法合成。此外，有關(guān)多態(tài)性分析用核酸的設(shè)計合成等，可以參考現(xiàn)有的書籍(例如，Molecular Cloning.Third Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)。
可以將本發(fā)明中的多態(tài)性分析用核酸可以預(yù)標(biāo)物標(biāo)記。通過使用這種標(biāo)記核酸，例如可以將擴增產(chǎn)物的標(biāo)記量作為指標(biāo)進行多態(tài)性分析。此外，若事先將2種引物以互不相同的標(biāo)記物標(biāo)記，根據(jù)由擴增產(chǎn)物檢測到的標(biāo)記物和標(biāo)記量，可以判別核酸樣品的基因型，其中，上述2種引物是為分別特異性擴增構(gòu)成多態(tài)性的各基因型的基因中的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的。作為使用這種標(biāo)記引物的檢測方法的具體例子，可以舉出如下方法，即，分別以異硫氰酸熒光素和德克薩斯紅標(biāo)記可分別和構(gòu)成多態(tài)性的各基因型的正義鏈雜交的2種核酸引物(等位基因特異性正義引物)，再以這些標(biāo)記引物和可特異性與反義鏈雜交的反義引物擴增包含多態(tài)性位點的部分DNA區(qū)域，通過測定得到的擴增產(chǎn)物中的各熒光物質(zhì)的標(biāo)記量來檢測多態(tài)性。此外，例如若以生物素標(biāo)記此處的反義引物，可以利用和生物素以及親和素的特異結(jié)合來進行擴增產(chǎn)物的分離。
作為用于標(biāo)記多態(tài)性分析用核酸的標(biāo)記物，例如可以舉出，32P等放射性同位素、異硫氰酸熒光素、四甲基羅丹明異硫氰酸酯、德克薩斯紅等熒光物質(zhì)；作為標(biāo)記方法，例如可以舉出，使用堿性磷酸酶和T4多聚核苷酸酶的5’末端標(biāo)記法，使用T4DNA聚合酶或Klenow片段的3’末端標(biāo)記法，nectranslation、隨機引物法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 9，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)等。
也可以將上述多態(tài)性分析用核酸固定在不溶性支持物上使用。若將用于固定的不溶性支持物事先加工成芯片狀、珠狀等，則使用這些固定化核酸可以進行更為簡便的多態(tài)性分析。
核酸樣品可以采用從待檢者的血液、皮膚細(xì)胞、粘膜細(xì)胞、毛發(fā)等提取、純化等公知方法進行配制。如果是包含多態(tài)性分析對象的基因的核酸，可以使用任意長度的基因組DNA作為核酸樣品。此外，并不一定要使用分析對象的全部基因都存在于同一核酸的核酸樣品。即，作為本發(fā)明的核酸樣品，可以使用分析對象的全部基因都存在于一個核酸的核酸樣品，或者分析對象的基因分散存在于2個或2個以上核酸的核酸樣品。此外，核酸樣品中分析對象的基因即使不是完全狀態(tài)(即，基因全長存在的狀態(tài))，只要是至少存在有被分析的多態(tài)性位點，也可以是片段或部分的狀態(tài)。
各基因多態(tài)性分析，可以對基因多態(tài)性逐個、或多個、或全部同時進行。作為前者的情況，例如，對應(yīng)于分析對象的多態(tài)性的數(shù)目，分別注入由待檢者得到的核酸樣品，分別進行各多態(tài)性分析。作為后者的情況，例如，可以采用DNA芯片或微陣進行分析。此外，此處所說的同時并不是僅指分析過程的全部操作同時進行，而是也包含部分操作(例如，核酸擴增操作、探針的雜交或檢測)同時進行的情況。
利用分析對象的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA也可以進行各基因的多態(tài)性分析。例如，從待檢者的血液、尿等將作為分析對象的基因的mRNA提取、純化后，采用Northern blot法(Molecular Cloning，ThirdEdition，7.42，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)，點印跡法(Molecular Cloning，Third Edition，7.46，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)，RT-PCR法、使用DNA芯片(DNA排列)的方法等，可以進行以mRNA為初始材料的多態(tài)性分析。
進而，針對上述多態(tài)性中伴隨氨基酸變化的情況，也可以用分析對象的基因的表達(dá)產(chǎn)物進行多態(tài)性分析。此時，只要是包含多態(tài)性位點對應(yīng)的氨基酸，即使是部分蛋白質(zhì)、部分肽，也可以作為分析用樣品使用。
作為這種使用基因的表達(dá)產(chǎn)物進行分析的方法，可以舉出，直接分析多態(tài)性位點的氨基酸的方法、或利用立體結(jié)構(gòu)變化進行免疫學(xué)分析的方法等。作為前者，可以使用眾所周知的氨基酸序列分析法(采用了Edman法的方法)。作為后者，可以采取使用了對具有構(gòu)成多態(tài)性的任何基因型的基因表達(dá)產(chǎn)物具有特異性結(jié)合活性的單克隆抗體或多克隆抗體的ELISA法(酶聯(lián)免疫吸附定量法)、放射免疫分析、免疫沉降法、免疫擴散法等。
由實施以上說明的本發(fā)明的檢測方法所得到的多態(tài)性信息，可用于高血壓的遺傳風(fēng)險診斷。即，本發(fā)明包含由以上檢測方法得到的多態(tài)性信息鑒定核酸樣品的基因型的步驟、以及由所鑒定的核酸樣品的基因型求得遺傳風(fēng)險的步驟，也提供高血壓風(fēng)險的診斷方法。此處的基因型的鑒定，典型地，是針對檢測對象的多態(tài)性，鑒定核酸樣品的兩等位基因分別具有哪個基因型。例如，以GP1a(1648A→G)為檢測對象時，典型地，是鑒定核酸樣品中的GP1a的基因型是AA(1648位堿基是兩等位基因都為A的純合體)、AG(1648位堿基是等位基因A和等位基因G的雜合體)、以及GG(1648位堿基是兩等位基因都為G的純合體)之中的哪一種。
若考慮后述實施例中所得到的結(jié)果，為能夠進行高精度和高預(yù)知概率的高血壓風(fēng)險的診斷，例如若是GP1a(1648A→G)多態(tài)性，則鑒定核酸樣品的基因型是GG，還是AA或AG中的哪一種。同樣地，若是CCR2(190G→A)多態(tài)性，則鑒定是AA，還是GG或GA中的哪一種；若是ApoC-III(1100C→T)多態(tài)性，則鑒定是TT，還是CC或CT中的哪一種；若是GPβ3(825C→T)多態(tài)性，則鑒定是CT或TT中的哪一種，或者是不是CC；若是TNFα(-850C→T)多態(tài)性，則鑒定是TT，還是CC或CT中的哪一種；若是TNFα(-238G→A)多態(tài)性，則鑒定是GA或AA中的哪一種，或者是不是GG；若是IRS-1(3494G→A)多態(tài)性，則鑒定是GG或AA中的哪一種，或者是不是GG；若是GP1bα(1018C→T)多態(tài)性，則鑒定是CT或TT中的哪一種，或者是不是CC。
通過診斷高血壓遺傳風(fēng)險，能夠預(yù)測將來患高血壓的傾向程度(容易發(fā)病性)，即發(fā)病風(fēng)險(發(fā)病脆弱性)，此外，基于所說的基因型客觀指標(biāo)，可進行高血壓的確診或病情的把握。換而言之，采用本發(fā)明的診斷方法，可以進行高血壓發(fā)病風(fēng)險的評價、患高血壓的確診或癥狀把握。其中，可以進行發(fā)病風(fēng)險的評價在臨床上極其有意義。事先知道發(fā)病風(fēng)險，可以采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施，因而有助于高血壓的一次預(yù)防。
由本發(fā)明的診斷方法所得到的信息，可以用于適當(dāng)?shù)闹委煼椒ǖ倪x擇或預(yù)后的改善、或患者的QOL(生活質(zhì)量)的提高、或發(fā)病風(fēng)險的降低等。
通過實施本發(fā)明的診斷方法，可以監(jiān)控高血壓的發(fā)病風(fēng)險等。這種監(jiān)控結(jié)果可以認(rèn)為是，如果確認(rèn)了某些外部因子(環(huán)境因子、藥物的給予等)和發(fā)病風(fēng)險等的增加之間的相關(guān)關(guān)系，則可將該外部因子認(rèn)定為危險因子，以該信息為基礎(chǔ)可謀求發(fā)病風(fēng)險等的降低。
本發(fā)明中得到的高血壓發(fā)病的相關(guān)遺傳信息可用于高血壓的治療(包括預(yù)防處理)。例如，實施本發(fā)明的診斷方法的結(jié)果是，在分析對象是能增高高血壓的發(fā)病風(fēng)險的遺傳型時，如果將具有發(fā)病風(fēng)險低的基因型的基因?qū)氲缴矬w內(nèi)并使其表達(dá)，通過表達(dá)該基因，病癥的減輕、發(fā)病的抑制、發(fā)病風(fēng)險的降低等都是可以期待的。通過導(dǎo)入與具有發(fā)病風(fēng)險高的基因型的基因的mRNA對應(yīng)的反義鏈，以抑制該mRNA表達(dá)的方法，也可期待同樣的治療效果。
基因或反義鏈的導(dǎo)入，例如可以通過使用了基因?qū)胗觅|(zhì)粒或病毒載體的方法、電穿孔(Potter，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.81，7161-7165(1984))、超聲微泡(Lawrie，A.，等Gene Therapy7，2023-2027(2000))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Felgner，P.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))、微注射(Graessmann，M.&Graessmann，A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，366-370(1976))等方法進行。利用這些方法，可以將所希望的基因等直接導(dǎo)入(生物體內(nèi)法)或間接導(dǎo)入(來自體內(nèi)法)進體內(nèi)。
本發(fā)明的第二個方面是提供上述本發(fā)明的檢測方法或診斷方法中所使用的試劑盒(基因型檢測用試劑盒或高血壓診斷用試劑盒)。這樣的試劑盒中包含用于分析選自上述(1)～(4)的多態(tài)性中選擇2種或2種以上多態(tài)性的核酸(多態(tài)性分析用核酸)。作為其他的實施方式，可以構(gòu)建包含用于分析來自上述(5)～(8)的多態(tài)性中的2種或2種以上多態(tài)性的核酸(多態(tài)性分析用核酸)的試劑盒。
多態(tài)性分析用核酸被設(shè)計為，在適用于該核酸的分析方法(利用使用上述等位基因特異性核酸等的PCR法的方法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP、TaqMan-PCR法、Invader法等)中，可以特異性擴增或特異性檢測包含分析對象的多態(tài)性位點的DNA區(qū)域或與其對應(yīng)的mRNA的引物或探針。以下顯示本發(fā)明所提供的試劑盒的具體例子。
包含選自下面(1)～(4)中的2種或2種以上核酸的基因型檢測用試劑盒，(1)具有與1648位堿基是A的糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與1648位堿基是G的糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，(2)具有與190位堿基是G的趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與190位堿基是A的趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，(3)具有與1100位堿基是C的載脂蛋白C-III基因中包含1100位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與1100位堿基是T的載脂蛋白C-III基因中包含1100位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，(4)具有與825位堿基是C的G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與825位堿基是T的G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸。
可以從上面的(1)～(4)所組成的組中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(1)～(4)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(2)～(4)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。
包含從下面(5)～(8)所組成的組中選擇的2種或2種以上核酸的基因型檢測用試劑盒，(5)具有與-850位堿基是C的腫瘤壞死因子α基因中包含-850位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與-850位堿基是T的腫瘤壞死因子α基因中包含-850位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，(6)具有與-238位堿基是G的腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與-238位堿基是A的腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，(7)具有與3494位堿基是G的胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與3494位堿基是A的胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，(8)具有與1018位堿基是C的糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸，或具有與1018位堿基是T的糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域互補的序列的核酸。
可以從上面的(5)～(8)所組成的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(5)～(8)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(5)、(7)和(8)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒。
包含選自下面(1)～(4)中的2種或2種以上核酸對的基因型檢測用試劑盒，(1)僅在核酸樣品中的糖蛋白1a基因的1648位堿基是A的情況下，為特異性擴增該糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的糖蛋白1a基因的1648位堿基是G的情況下，為特異擴增該糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，(2)僅是在核酸樣品中的趨化因子受體2基因的190位堿基是G的情況下，為特異性擴增該趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的趨化因子受體2基因的190位堿基是A的情況下，為特異性擴增該趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，(3)僅是在核酸樣品中的載脂蛋白C-III基因中1100位堿基是C的情況下，為特異性擴增該載脂蛋白C-III基因中包含1100位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的載脂蛋白C-III基因的1100位堿基是T的情況下，為特異性擴增該載脂蛋白C-III基因中包含1100位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，(4)僅是在核酸樣品中的G蛋白β3亞單位基因的825位堿基是C的情況下，為特異性擴增該G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的G蛋白β3亞單位基因的825位堿基是T的情況下，為特異性擴增該G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，可以從上面的(1)～(4)所組成的組中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(1)～(4)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(2)～(4)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。
包含選自下面(5)～(8)中的2種或2種以上核酸對的基因型檢測用試劑盒，(5)僅是在核酸樣品中的腫瘤壞死因子α基因的-850位堿基是C的情況下，為特異性擴增該腫瘤壞死因子α基因中包含-850位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的腫瘤壞死因子α基因的-850位堿基是T的情況下，為特異性擴增該腫瘤壞死因子α基因中包含-850位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，(6)僅是在核酸樣品中的腫瘤壞死因子α基因的-238位堿基是G的情況下，為特異性擴增該腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的腫瘤壞死因子α基因的-238位堿基是A的情況下，為特異性擴增該腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，(7)僅是在核酸樣品中的胰島素受體亞單位1基因的3494位堿基是G的情況下，為特異性擴增該胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的胰島素受體亞單位1基因的3494位堿基是A的情況下，為特異性擴增該胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，(8)僅是在核酸樣品中的糖蛋白1bα基因的1018位堿基是C的情況下，為特異性擴增該糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，或僅是在核酸樣品中的糖蛋白1bα基因的1018位堿基是C的情況下，為特異性擴增該糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，可以從上面的(5)～(8)所組成的組中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(5)～(8)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(5)、(7)和(8)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。
包含選自下面(1)～(4)中的2種或2種以上核酸對的基因型檢測用試劑盒，(1)為特異性擴增糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，它是由特異性與1648位堿基是A的糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物和/或特異性與1648位堿基是G的糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物，以及特異性與糖蛋白1a基因的部分區(qū)域雜交的反義引物構(gòu)成的核酸對，(2)為特異性擴增趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，它是由特異性與190位堿基是G的趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的反義引物和/或特異性與190位堿基是A的趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的反義引物，以及特異性與趨化因子受體2基因的部分區(qū)域雜交的正義引物構(gòu)成的核酸對，(3)為特異性擴增載脂蛋白C-III基因中包含1100位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，以及(4)為特異性擴增G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，它是由特異性與825位堿基是C的G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物和/或特異性與825位堿基是T的G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物，以及特異性與G蛋白β3亞單位基因的部分區(qū)域雜交的反義引物構(gòu)成的核酸對，可以從上面的(1)～(4)所組成的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(1)～(4)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(2)～(4)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒。
包含從下面(5)～(8)所組成的組中選擇的2種或2種以上核酸對的基因型檢測用試劑盒，(5)為特異性擴增腫瘤壞死因子α基因中包含-850位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，它是由特異性與-850位堿基是C的腫瘤壞死因子α基因中包含-825位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的反義引物和/或特異性與-850位堿基是T的腫瘤壞死因子α基因中包含-850位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的反義引物，以及特異性與腫瘤壞死因子α基因的部分區(qū)域雜交的正義引物構(gòu)成的核酸對，(6)為特異性擴增腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，它是由特異性與-238位堿基是G的腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的反義引物和/或特異性與-238位堿基是A的腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的反義引物，以及特異性與腫瘤壞死因子α基因的部分區(qū)域雜交的正義引物構(gòu)成的核酸對，(7)為特異性擴增胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，它是由特異性與3494位堿基是G的胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物和/或特異性與3494位堿基是A的胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物，以及特異性與胰島素受體亞單位1基因的部分區(qū)域雜交的反義引物構(gòu)成的核酸對，以及(8)為特異性擴增糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的核酸對，它是由特異性與1018位堿基是C的糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物和/或特異性與1018位堿基是T的糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域雜交的正義引物，以及特異性與糖蛋白1bα基因的部分區(qū)域雜交的反義引物構(gòu)成的核酸對。
可以從上面的(5)～(8)所組成的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(5)～(8)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(5)、(7)和(8)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。
包含選自下面(1)～(4)中的2種或2種以上核酸對的基因型檢測用試劑盒，(1)與包含在1648位堿基是A的糖蛋白1a基因的反義鏈中1648位堿基相對應(yīng)的堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第1核酸，和與包含在1648位堿基是G的糖蛋白1a基因的反義鏈中1648位堿基相對應(yīng)的堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第2核酸，以及可以與糖蛋白1a基因的正義鏈的部分區(qū)域特異性雜交，并且與所述第1核酸或所述第2核酸同時使用的，可以特異性擴增糖蛋白1a基因中包含1648位堿基的部分DNA區(qū)域的第3核酸構(gòu)成的核酸對，(2)與包含在190位堿基是G的趨化因子受體2基因的正義鏈中190位堿基相對應(yīng)的堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第1核酸，和與包含在190位堿基是A的趨化因子受體2基因的正義鏈中190位堿基相對應(yīng)的堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第2核酸，以及可以與趨化因子受體2基因的反義鏈的部分區(qū)域特異性雜交并且與所述第1核酸或所述第2核酸同時使用的，可以特異性擴增趨化因子受體2基因中包含190位堿基的部分DNA區(qū)域的第3核酸構(gòu)成的核酸對，(3)為特異性擴增載脂蛋白C-III基因中包含1100位堿基的部分DNA區(qū)域而設(shè)計的第1核酸和第2核酸，以及與以1100位堿基是C的載脂蛋白C-III基因作為模板、用所述第1核酸和第2核酸擴增得到的核酸特異性雜交、并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第3核酸，以及與以1100位堿基是T的載脂蛋白C-III基因作為模板、用所述第1核酸和第2核酸擴增得到的核酸特異性雜交、并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第4核酸構(gòu)成的核酸對，(4)與在825位堿基是C的G蛋白β3亞單位基因的反義鏈中包含825位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第1核酸，和與在825位堿基是T的G蛋白β3亞單位基因的反義鏈中包含825位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第2核酸，以及可以與G蛋白β3亞單位基因的正義鏈的部分區(qū)域特異性雜交并且與所述第1核酸和所述第2核酸同時使用的，可以特異性擴增G蛋白β3亞單位基因中包含825位堿基的部分DNA區(qū)域的第3核酸構(gòu)成的核酸對。
可以從上面的(1)～(4)所組成的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(1)～(4)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(2)～(4)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。
包含從下面(5)～(8)所組成的組中選擇的2種或2種以上核酸對的基因型檢測用試劑盒，(5)與在-850位堿基是C的腫瘤壞死因子α基因的正義鏈中包含-850位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第1核酸，和與在-850位堿基是T的腫瘤壞死因子α基因的正義鏈中包含-850位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第2核酸，以及可以與腫瘤壞死因子α基因的反義鏈的部分區(qū)域特異性雜交并且與所述第1核酸和所述第2核酸同時使用的，可以特異性擴增腫瘤壞死因子α基因中包含-850位堿基的部分DNA區(qū)域的第3核酸構(gòu)成的核酸對，(6)與在-238位堿基是G的腫瘤壞死因子α基因的正義鏈中包含-238位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第1核酸，和與在-238位堿基是A的腫瘤壞死因子α基因的正義鏈中包含對應(yīng)于-238位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第2核酸，以及可以與腫瘤壞死因子α基因的反義鏈的部分區(qū)域特異性雜交并且與所述第1核酸和所述第2核酸同時使用的，可以特異性擴增腫瘤壞死因子α基因中包含-238位堿基的部分DNA區(qū)域的第3核酸構(gòu)成的核酸對，(7)與在3494位堿基是G的胰島素受體亞單位1基因的反義鏈中包含3494位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第1核酸，和與在3494位堿基是A的胰島素受體亞單位1基因的反義鏈中包含3494位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第2核酸，以及可以與胰島素受體亞單位1基因的正義鏈的部分區(qū)域特異性雜交并且與所述第1核酸和所述第2核酸同時使用的，可以特異性擴增胰島素受體亞單位1基因中包含3494位堿基的部分DNA區(qū)域的第3核酸構(gòu)成的核酸對，(8)與在1018位堿基是C的糖蛋白1bα基因的反義鏈中包含1018位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第1標(biāo)記物標(biāo)記了的第1核酸，和與在1018位堿基是T的糖蛋白1bα基因的反義鏈中包含1018位堿基的部分區(qū)域特異性雜交并且以第2標(biāo)記物標(biāo)記了的第2核酸，以及可以與糖蛋白1bα基因的正義鏈的部分區(qū)域特異性雜交并且與所述第1核酸和所述第2核酸同時使用的，可以特異性擴增糖蛋白1bα基因中包含1018位堿基的部分DNA區(qū)域的第3核酸構(gòu)成的核酸對。
可以從上面的(5)～(8)所組成的組中選擇2種或2種以上核酸構(gòu)成試劑盒，也可以從(5)～(8)中任意選擇2種或2種以上構(gòu)成組，再從這樣的組中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。例如，可以由(5)、(7)和(8)所組成的組(在后述實施例中，用于分析相對危險度截止到第3位的多態(tài)性的核酸)中選擇2種或2種以上的核酸構(gòu)成試劑盒。
對于上面的各試劑盒，也可以和試劑盒的使用方法相應(yīng)的1種或2種或2種以上試劑(緩沖劑、反應(yīng)試劑、檢測試劑等)等組合使用。
下面，以實施例對本發(fā)明作更詳細(xì)明。
<實施例1>基因多態(tài)性的選擇使用PubMed[National Center for Biological Information(NCBI)]，online Mendelian inheritance in Men(NCBI)，SingleNucleotide Polymorphism(NCBI)等多種公知數(shù)據(jù)庫，從到目前為止報告過的基因中挑選出71個基因，從血管生物學(xué)、血小板·白細(xì)胞生物學(xué)、凝固纖溶體系、脂質(zhì)·糖·其他代謝因子等的綜合側(cè)面考慮，上述71個基因被推定和冠狀動脈硬化、冠狀動脈痙攣、高血壓、糖尿病、高脂血癥等相關(guān)。進而在這些基因中存在的多態(tài)性中，以存在于啟動子區(qū)域或外顯子區(qū)域的多態(tài)性，或位于剪切供體部位或受體部位的被預(yù)想和基因產(chǎn)物的功能變化相關(guān)的多態(tài)性為中心，挑選出112種多態(tài)性(圖1及圖2)。
<實施例2>基因多態(tài)性的鑒定對象為從1994年7月到2001年12月之間參加接受15設(shè)施治療(或住院)的日本人1940例(男性1107例、女性833例)。高血壓例為1067例(男性574例、女性493例)，為收縮壓≥140mmHg或舒張壓≥90mmHg或兩者都滿足，并且正在服用降壓藥的病例。患有冠狀動脈疾病、心臟泵疾病、先天性心血管疾病、或腎病·內(nèi)分泌疾病等造成繼發(fā)性高血壓的疾病的病例除外。對照是正常血壓(收縮壓＜140mmHg、舒張壓＜90mmHg) 873例(男性533例、女性340例)，雖然攜帶以往的冠狀動脈疾病危險因子，即，吸煙(10根或10根以上/日)、肥胖(體重指數(shù)＞26kg/m2)、糖尿病(空腹血糖＞126mg/dL或血紅蛋白Alc＞6.5％或兩者都有)、高脂血癥(血清總膽固醇＞220mg/dL)、高尿酸血癥(男性血清尿酸＞7.7mg/dL、女性血清尿酸＞5.5mg/dL)中的至少一種，但是并未患冠狀動脈疾病的病例。這些對照，安靜時心電圖正常，即使在運動負(fù)荷試驗中也未觀察到心肌的缺血性變化。血壓是依據(jù)美國心臟協(xié)會的指南，以坐姿測定(PerloffD，Grim C，F(xiàn)lack J，F(xiàn)rohlich ED，Hill M，McDonald M，MorgensternBZ.Human blood pressure determination by sphygmomanometry.Circulation.1993；882640-2470.)。
從各自對象采靜脈血7mL于裝有50mmol/L EDTA-2Na的試管中，使用DNA提取試劑盒(Qiagen，Chatsworth，CA)提取基因組DNA。通過根據(jù)熒光/發(fā)光法的等位基因特異性引物/探針測定系統(tǒng)(東洋紡基因阿那利希斯(ジ一ンアナリシス)、敦賀、日本)鑒定單核苷酸多態(tài)性的基因型(圖3)。包含多態(tài)性位點的DNA片段，通過使用在5’末端以異硫氰酸熒光素(FITC)或德克薩斯紅(TxR)標(biāo)記了的2種等位基因特異性正義(或反義)引物和以生物素標(biāo)記了5’末端的反義(或正義)引物，以多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進行擴增。此外，作為別的方法，包含多態(tài)性位點的DNA片段，通過使用2種等位基因特異性正義(或反義)引物和以生物素標(biāo)記了5’端的反義(或正義)引物，或者使用正義引物和以生物素標(biāo)記了5’末端的反義引物，以PCR法進行擴增。反應(yīng)溶液(25μl)中，含有20ng的DNA、5pmol的各種引物、0.2mmol/L的各種脫氧核苷三磷酸、1～4mmol/L的氯化鎂、1U的DNA聚合酶(rTaq或KODplus；東洋紡、大阪、日本)，使用各自的DNA聚合酶緩沖液。擴增控制采取，95℃初期變性5分鐘，接著進行35～45個循環(huán)的95℃變性30秒、55～67.5℃退火30秒、72℃延伸30秒，然后在72℃最后延伸2分鐘。
在以熒光法鑒定基因型中，將擴增后的DNA加入96孔板的各孔內(nèi)的含有結(jié)合鏈霉親和素的磁珠的溶液中，于室溫孵育。然后將該板置于磁條上，從各孔收集上清，轉(zhuǎn)移到含有0.01M NaOH的96孔板的各孔中之后，采用微平板讀出器(microplate reader)，對于FITC，激發(fā)和發(fā)射光波長分別是485和538nm，對于TxR，激發(fā)和發(fā)射光波長分別是584和612nm，測定熒光。此外，在以發(fā)光法鑒定基因型時，將擴增后的DNA以0.3M NaOH變性，在含有固定于96孔板的各孔的底面的任何等位基因特異性互補探針和35～40％甲酰胺的雜交緩沖液中，于37℃雜交30分鐘。將各孔充分洗凈后，在各孔內(nèi)加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的鏈霉親和素，將96孔板于37℃振蕩15分鐘。再將各孔洗凈，加入含有0.8mM的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二硫苯基)-2H-四唑(單鈉鹽)和0.4mM的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯對甲苯胺鹽的溶液中，測定450nm的吸光度。
為鑒定根據(jù)本方法鑒定的基因型的精度，隨機選取50個人的DNA樣品，實施PCR-限制酶片段長度多態(tài)性分析法或PCR產(chǎn)物的直接堿基序列鑒定法。在所有的樣品中，以等位基因特異性引物·探針測定系統(tǒng)所鑒定的基因型和以PCR-限制酶片段長度多態(tài)性分析法或PCR產(chǎn)物的直接堿基序列鑒定法所鑒定的基因型相同。
以下關(guān)聯(lián)分析中的統(tǒng)計分析如下進行。臨床數(shù)據(jù)，在高血壓例和對照之間使用unpaired Student’s試驗或Mann-Whitney U試驗進行比較。定性數(shù)據(jù)以chi-square試驗測定。堿基化程度以基因計數(shù)法推定，從Hardy-Weinberg平衡偏離與否以chi-square試驗測定。本發(fā)明人進行了較正危險因子后的多因素logistic回歸分析。將高血壓作為從屬因子，以年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙狀況(0＝不吸煙，1＝吸煙)、代謝因子(0＝無糖尿病·高膽固醇血癥·高尿酸血癥的經(jīng)歷，1＝有經(jīng)歷)、各多態(tài)性的基因型作為獨立因子。以dominant(顯性)、recessive(隱性)、additive(附加性)的遺傳模型對各自的基因型進行分析，計算P值、相對危險度、95％可信區(qū)間。在組合基因型分析中，采用logistic回歸分析的逐步向前選擇法計算各自的基因型的相對危險度。
<實施例3>高血壓相關(guān)的多態(tài)性的選擇、以及高血壓風(fēng)險診斷法的開發(fā)本發(fā)明人，在以前的報告中，針對男性451(心肌梗塞219例、對照232例)和女性458例(心肌梗塞226、對照232例)，進行了71個候選基因的112種多態(tài)性和心肌梗塞的關(guān)聯(lián)分析(Yamada Y，IzawaH，Ichihara S，等Prediction of risk of myocardial infarction frompolymorphisms in candate genes.N.Engl.J.Med.In press.)。通過該研究發(fā)現(xiàn)男性中有19種、女性中有18種單核苷酸多態(tài)性和心肌梗塞發(fā)病相關(guān)，但這些多態(tài)性群中也包含有高血壓的候選基因(參考圖1、圖2、圖4)。在本實施例中，針對這些單核苷酸多態(tài)性和高血壓的關(guān)聯(lián)，進行了1940例的大規(guī)模關(guān)聯(lián)分析。
探討過的全部對象1940例(男性1107例、女性833例)的背景資料示于圖5。在男性中，年齡、BMI、高尿酸血癥的頻率、血清肌酸酐濃度以及收縮·擴張壓和對照比較，在高血壓例中顯著增高；吸煙頻率和對照比較，在高血壓例中顯著變低。在女性中，年齡、BMI、高膽固醇血癥和高尿酸血癥的頻率、以及收縮·擴張壓和對照比較，在高血壓例中顯著增高。
在男性19種多態(tài)性、女性18種多態(tài)性和高血壓之間的關(guān)聯(lián)分析中，通過較正年齡、BMI、以及吸煙、糖尿病、高膽固醇血癥、高尿酸血癥的頻率后的多因素logistic回歸分析，顯示男女各自有4種多態(tài)性和高血壓疾病顯著相關(guān)(顯性或隱性遺傳模型都是P＜0.05)(圖6)。這些多態(tài)性的基因型分布示于(圖7)。
本發(fā)明人實施了多因素logistic回歸分析的逐步向前選擇法(圖8)。在本法中，根據(jù)圖6所示的各種多態(tài)性和高血壓之間的關(guān)聯(lián)中的P值(較低P值)，采用顯性或隱性遺傳模型。這些基因在染色體上的基因座示于(圖8)。
腫瘤壞死因子α的-850C→T和-238G→A多態(tài)性沒有連鎖不平衡[pairwise linkage disequilibrium coefficient，D’(D/Dmax)，of-0.310，standardized linkage disequilibrium coefficient，r，of -0.020；P＝0.613，chi-square test]。以逐步向前選擇法算出的組合基因型所致的高血壓疾病的相對危險度，男性示于圖9和圖11(A)中，女性示于圖10和圖11(B)中。在男性中，根據(jù)4種多態(tài)性的組合基因型(GP1a(1648A→G)多態(tài)性，CCR2(190G→A)多態(tài)性，ApoC-III(1100C→T)多態(tài)性，GPβ3(825C→T)多態(tài)性)，最大相對危險度為5.34(圖9、圖11(A))。在女性中，根據(jù)4種多態(tài)性的組合基因型(TNFα(-850C→T)多態(tài)性，TNFα(-238G→A)多態(tài)性，IRS-1(3494G→A)多態(tài)性，GP1bα(1018C→T)多態(tài)性)，最大相對危險度為46.86(圖10、圖11(B))。
如上面，根據(jù)多因素logistic回歸分析，男性的4種、女性的4種單核苷酸多態(tài)性和高血壓相關(guān)。即，本發(fā)明人，針對男性的19種、女性的18種單核苷酸多態(tài)性和高血壓之間的關(guān)聯(lián)，進行了1940例大規(guī)模關(guān)聯(lián)分析。在男女中分別鑒定各4種和高血壓相關(guān)的多態(tài)性。進而，開發(fā)了利用組合基因型的高血壓的遺傳風(fēng)險診斷法，其中，上述組合基因型，根據(jù)多因素logistic回歸分析的逐步向前選擇法，呈現(xiàn)在男性中最大危險度比為5.34，在女性中最大危險度比為46.86。
血壓不僅通過對血管的結(jié)構(gòu)、緊張性以及體液的量和組成進行調(diào)節(jié)的多種生物體系的總和進行調(diào)節(jié)，而且通過對這些體系的連續(xù)變化的生理必要性的適應(yīng)進行調(diào)節(jié)(Lalouel J-M，Rohrwasser A.Development of genetic hypotheses in essential hypertension.JHum Genet.2001；46299-306)。本發(fā)明人基于包括血管生物學(xué)、血小板·白細(xì)胞生物學(xué)、纖溶系統(tǒng)、脂質(zhì)·糖·其他代謝因子等的觀點，針對男性19種、女性18種單核苷酸多態(tài)性和高血壓之間的關(guān)聯(lián)，進行了探討。實際上，和高血壓相關(guān)的基因群在其病理狀態(tài)下起著多種作用。即，血管生物學(xué)(G蛋白β3亞單位)、血管炎癥(腫瘤壞死因子α)、單核·淋巴細(xì)胞生物學(xué)(趨化因子受體2)、血小板功能(糖蛋白1a糖蛋白1bα)、脂質(zhì)代謝(載脂蛋白C-III)、胰島素·糖代謝(胰島素受體亞單位-1)。本發(fā)明人所開發(fā)的遺傳風(fēng)險診斷系統(tǒng)，高血壓疾病的最大相對危險度呈現(xiàn)男性為5.34，女性為46.86，尤其是對于女性，在目前為止所報道的大規(guī)模關(guān)聯(lián)分析中，顯示了最大相對危險度。在和高血壓相關(guān)的8種多態(tài)性中，腫瘤壞死因子α基因的-850C→T多態(tài)性和-238G→A多態(tài)性，作為女性的高血壓風(fēng)險，顯示了最大相對危險度。已報道，腫瘤壞死因子α基因座在法裔加拿大人中和伴隨肥胖的高血壓有關(guān)聯(lián)(Pausova Z，Deslauriers B，Gaudet D，TremblayJ，Kotchen TA，Larochelle P，Cowley AW，Hamet P.Role of tumornecrosis factor-α gene locus in obesity and obesity-associatedhypertension in French Canadians.Hypertension.2000；3614-19)。此外，腫瘤壞死因子α基因的-308A→G多態(tài)性雖然無統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，但是已確認(rèn)和本原性高血壓相關(guān)的傾向(Frossard PM，Gupta A，Pravica V，Perry C，Hutchinson IV，Lukic ML.A studyof five human cytokine genes in human essential hypertension.Mol Immunol.2002；38969-976)。已報道，在加拿大土著人中，血清腫瘤壞死因子α的濃度和收縮壓與胰島素抵抗相關(guān)(Zinman B，Hanley AJG，Harris SB，Kwan J，F(xiàn)antus IG.Circulating tumornecrosis factor-α concentrations in a native Canadianpopulation with high rates of type 2 diabetes mellitus.J ClinEndocrinol Metab.1999；84272-278)。腫瘤壞死因子α進而促進強血管收縮物質(zhì)內(nèi)皮素-1的生成(Kahaleh MB，F(xiàn)an PS.Effect ofcytokines on the production of endothelin by endothelial cells.Clin Exp Rheumatol.1997；15163-167)，血清中的這兩種物質(zhì)濃度正相關(guān)已在肥胖例中顯示(Winkler G，Lakatos P，Salamon F，NagyZ，Speer G，Kovacs M，Harmos G，Dworak O，Cseh K.Elevated serumTNF-αlevel as a link between endothelial dysfunction and insulinresistance in normotensive obese patients.Diabetes Med.1999；16207-211)。由這些發(fā)現(xiàn)以及本發(fā)明人的上述結(jié)果，腫瘤壞死因子α基因是高血壓敏感性基因座的候補。已報道，在其他的6種多態(tài)性中，G蛋白β3亞單位基因的825C→T多態(tài)性和高血壓相關(guān)(Siffert W，Rosskop D，Siffert G，Busch S，Moritz A，Erbel R，Sharma AM，Ritz E，Wichmann H-E，Jakobs KH，Horsthemke B.Association ofa human G-protein β3 subunit variant with hypertension.Nat Genet.1998；1845-48)。此外，已報道，載脂蛋白C-III基因多態(tài)性關(guān)系到血壓(Tas S，Abdella NA.Blood pressure，coronary arterydisease，and glycaemic control in type 2 diabetes mellitusrelation to apolipoprotein-CIII gene polymorphism.Lancet.1994；3431994-1995)。顯示，趨化蛋白受體2基因和胰島素受體底物1基因和高血壓的病理狀態(tài)有關(guān)聯(lián)(Bush E，Maeda N，Kuziel WA，Dawson TC，Wilcox JN，Deleon H，Taylor WR.CC chemokine receptor2 is requried for macrophage infiltration and vascularhypertrophy in angiotension II-induced hypertension.Hypertension.2000；36360-363.Abe H，Yamada N，Tamemoto H，Ishibashi S，Yazaki Y，Makuuchi M.Hypertension，hypertriglyceridemia，and impaired endothelium-dependentvascular relaxation in mice lacking insulin receptor substrate-1.J Clin Invest.1998；1011784-1788.)。進而，已報道，血小板的激活在原發(fā)性高血壓的病例狀態(tài)中發(fā)揮作用(AndrioliG，OrtolaniR，F(xiàn)ontana L，Gaino S，Bellavite P，Lechi C，Minuz P，ManzatoF，Tridente G，Lechi A.Study of platelet adhesion in patientswith uncomplicated hypertension.J Hypertens.1996；141215-1221.Dockrell ME，Walker BR，Noon JP.Watt GC，Williams BC，Webb DJ.Platelet aggregation in young men contrasting predisposition tohigh blood pressure.Am J Hypertens.1999；12115-119.BereczkiC，Tur S，Nemeth I，Sallai E，Torday C，Nagy E，Haszon I，PappF.The roles of platelet function，thromboxane，blood lipids，and nitric oxide in hypertension of children and adolescents.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids.2000；62293-297.)。已報道，糖蛋白1a和糖蛋白1bα基因的多態(tài)性和冠狀動脈疾病有關(guān)聯(lián)(Kroll H，Gardemann A，F(xiàn)echter A，Haberbosch W，Santoso S.The impact of the glycoprotein 1a collagen receptor subunitA1648G gene polymorphism on coronary artery disease and acutemyocardial infarction.Thromb Haemost.2000；83392-396.MurataM，Matsubara Y，Kawano K，等Coronary artery disease andpolymorphisms in a receptor mediating shear stress-dependentplatelet activation.Circulation.1997；963281-6)，但未見這兩種多態(tài)性和高血壓相關(guān)的報道。
本實施例探討過的多態(tài)性中，有幾個可能和其附近所存在的與高血壓發(fā)病確實相關(guān)的基因的多態(tài)性存在連鎖不平衡。然而，作者的結(jié)果顯示，在日本男性中，糖蛋白1a、趨化因子受體2基因、載脂蛋白C-III基因、G蛋白β3亞單位基因是高血壓敏感性基因座；在日本女性中，腫瘤壞死因子α基因、胰島素受體亞單位1基因、糖蛋白1bα基因是高血壓敏感性基因座。進而，也顯示，這些基因多態(tài)性的組合基因型在高血壓的遺傳診斷中是有用的。本發(fā)明人的遺傳診斷法可認(rèn)為，不僅對高血壓的一次預(yù)防，而且對高血壓所致的心血管疾病、腦卒中、腎病等的預(yù)防有用。
本發(fā)明并不限定于上述發(fā)明的實施方式和實施例中的說明。在未超出權(quán)利要求所記載的范圍，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到的范圍內(nèi)所做的改變，均包含在本發(fā)明中。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明，可以分析高血壓相關(guān)的基因多態(tài)性，因而，可檢測核酸樣品的基因型。通過使用由該基因型檢測得到的多態(tài)性信息，能夠進行高精度和高預(yù)知概率的高血壓風(fēng)險的診斷。因此，本發(fā)明將成為事先預(yù)知高血壓發(fā)病風(fēng)險的有效手段，對高血壓的一次預(yù)防的貢獻是不言而喻，而且可期待用于預(yù)防高血壓所致的心血管疾病、腦卒中、腎病等。此外，根據(jù)本發(fā)明，可得到對高血壓診斷有用的輔助信息，使更適當(dāng)?shù)闹委煶蔀榭赡?，并可期待預(yù)后的改善等。進而，由于本發(fā)明在闡明高血壓的發(fā)病機制的基礎(chǔ)上，提供了有效信息，因此，也將成為用于確立高血壓的預(yù)防法的一種極其重要的手段。
序列表<110>NAGOYA INDUSTRIAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTEGIFU INTERNATIONAL INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGYYAMADA，YoshijiYOKOTA，Mitsuhiro<120>高血壓風(fēng)險的診斷方法<130>C0200701<150>JP P2002-280034<151>2002-09-25<160>36<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5373<212>DNA<213>人源<400>1gaattcctgc aaacccagcg caactacggt cccccggtca gacccaggat ggggccagaa 60cggacagggg ccgcgccgct gccgctgctg ctggtgttag cgctcagtca aggcatttta120aattgttgtt tggcctacaa tgttggtctc ccagaagcaa aaatattttc cggtccttca180agtgaacagt ttgggtatgc agtgcagcag tttataaatc caaaaggcaa ctggttactg240gttggttcac cctggagtgg ctttcctgag aaccgaatgg gagatgtgta taaatgtcct300gttgacctat ccactgccac atgtgaaaaa ctaaatttgc aaacttcaac aagcattcca360aatgttactg agatgaaaac caacatgagc ctcggcttga tcctcaccag gaacatggga420actggaggtt ttctcacatg tggtcctctg tgggcacagc aatgtgggaa tcagtattac480acaacgggtg tgtgttctga catcagtcct gattttcagc tctcagccag cttctcacct540
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<223>人工序列描述引物<220>
<221>misc_feature<222>(23)..(23)
<223>n代表任意堿基<400>9gagtctacct gtttactatc aanga 25<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<220>
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<221>misc_feature<222>(22)..(22)<223>n代表任意堿基<400>12ttgcagttta ttaagatgag gntg 24<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物<220>
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<223>人工序列描述引物<220>
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<223>人工序列描述探針<220>
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<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>n代表任意堿基
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<221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>n代表任意堿基<400>36cacctccnag ggctgctag 19
權(quán)利要求
1.檢測核酸樣品的基因型的方法，其包含下述步驟(a)(a)分析核酸樣品中選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上多態(tài)性的步驟，(1)糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性，(2)趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性，(3)載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性，以及(4)G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性。
2.檢測核酸樣品的基因型的方法，其包含下述步驟(b)(b)分析核酸樣品中選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上多態(tài)性的步驟，(5)腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性，(6)腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性，(7)胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性，以及(8)糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性。
3.高血壓風(fēng)險的診斷方法，其包含下述步驟(i)～(iii)(i)分析核酸樣品中選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上多態(tài)性的步驟，(1)糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性(2)趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性，(3)載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性，以及(4)G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性；(ii)由上述步驟所得到的多態(tài)性信息鑒定核酸樣品的基因型的步驟；以及(iii)由所鑒定的基因型求出高血壓的遺傳風(fēng)險的步驟。
4.高血壓風(fēng)險的診斷方法，其包含下述步驟(iv)～(vi)(iv)分析核酸樣品中選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上多態(tài)性的步驟，(5)腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性，(6)腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性，(7)胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性，以及(8)糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性。(v)由上述步驟所得到的多態(tài)性信息鑒定核酸樣品的基因型的步驟；以及(vi)由所鑒定的基因型求出高血壓的遺傳風(fēng)險的步驟。
5.基因型檢測用試劑盒，其含有選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上的核酸，(1)用于分析糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性的核酸，(2)用于分析趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性的核酸，(3)用于分析載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(4)用于分析G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性的核酸。
6.基因型檢測用試劑盒，其含有選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上的核酸，(5)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性的核酸，(6)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性的核酸，(7)用于分析胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(8)用于分析糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性的核酸。
7.固定化核酸，其是由選自下述(1)～(4)中的2種或2種以上的核酸固定在不溶性支持體上而形成，(1)用于分析糖蛋白1a基因的第1648位堿基的多態(tài)性的核酸，(2)用于分析趨化因子受體2基因的第190位堿基的多態(tài)性的核酸(3)用于分析載脂蛋白C-III基因的第1100位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(4)用于分析G蛋白β3亞單位基因的第825位堿基的多態(tài)性的核酸。
8.固定化核酸，其由選自下述(5)～(8)中的2種或2種以上的核酸固定在不溶性支持體上而形成，(5)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-850位堿基的多態(tài)性的核酸，(6)用于分析腫瘤壞死因子α基因的第-238位堿基的多態(tài)性的核酸，(7)用于分析胰島素受體底物1基因的第3494位堿基的多態(tài)性的核酸，以及(8)用于分析糖蛋白1bα基因的第1018位堿基的多態(tài)性的核酸。
全文摘要
提供以高精度高預(yù)知概率進行的高血壓風(fēng)險診斷。通過包含下面(i)～(iii)的步驟的方法，進行高血壓風(fēng)險的診斷(i)分析選自已被確認(rèn)和高血壓相關(guān)的4個多態(tài)性中的2個或2個以上的多態(tài)性的步驟；(ii)由上述步驟所得到的多態(tài)性信息鑒定核酸樣品的基因型的步驟；(iii)由鑒定的基因型預(yù)測高血壓的遺傳風(fēng)險的步驟。
文檔編號C12Q1/68GK1685041SQ0382293
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月25日
發(fā)明者山田芳司, 橫田充弘 申請人:財團法人名古屋產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究所