專利名稱：肝移植細(xì)胞、測定及其應(yīng)用的制作方法
介 紹機(jī)體依靠肝臟來發(fā)揮許多重要的功能，包括調(diào)節(jié)、合成以及分泌許多維持機(jī)體正常狀態(tài)的重要物質(zhì)；存儲許多營養(yǎng)物質(zhì)如糖原(葡萄糖)、維生素和礦物質(zhì)；提純、轉(zhuǎn)化和清除廢物質(zhì)、藥物和毒素。然而，它獨(dú)特的特性和功能使得它容易受到許多因素的損害，這樣的損害對于一個人的健康影響甚大。
肝臟中最豐富和代謝最活躍的細(xì)胞是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。肝小葉是六邊形的，在周圍有6個門三聯(lián)體，每個包含一門靜脈分支、肝動脈分支和膽管，它們都由一層肝細(xì)胞緊緊連接在一起。肝細(xì)胞很少分裂，但它們具有對于合適的刺激會反應(yīng)性增殖的獨(dú)特能力，例如取走一部分肝臟。這個過程包括限制性的增生，那通常使得肝臟恢復(fù)到在它原來重量的5-10％之內(nèi)。
肝臟具有在損傷后獨(dú)特的再生能力。這一過程開始是“成熟”肝細(xì)胞的增殖；其他細(xì)胞譜系包括膽管上皮細(xì)胞(BEC)和竇狀隙細(xì)胞稍后增殖。肝再生在部分肝切除術(shù)以及受傷而損害了部分肝臟如病毒、毒素或缺血性損害之后起著重要的作用。然而，過度的損害會達(dá)到“不可逆點(diǎn)”，然后正常組織就被疤痕組織替代。肝臟的再生能力也由于預(yù)先存在的或重復(fù)發(fā)生的肝損害或疾病而削弱。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多表面決定簇是骨髓源性干細(xì)胞和能生長為肝細(xì)胞的細(xì)胞所共有的，包括嚙齒動物中的c-kit、CD34和Thy-1，以及人類中的c-kit和CD34(見Omori等，(1997)Hepatology26720-727；Lemmer等(1998)J.Hepatol29450-454；Peterson等(1998)Hepatology27433-445；ibid(1999)Science2841168-1170；Baumann等(1999)Hepatology30112-117；Lagasse等(2000)Nature Med111229-1234)。這些發(fā)現(xiàn)對于基因治療和肝細(xì)胞移植具有重要的臨床含義，這是兩種治療暴發(fā)性肝衰竭和肝臟遺傳代謝紊亂的新方法。
一些事實(shí)表明一些不成熟的肝細(xì)胞系可以BEC和肝細(xì)胞都不同。例如Fiorino等(1998)In Vitro Cell Dev Biol Anim34(3)247-58報導(dǎo)了分離了有條件轉(zhuǎn)化的肝祖細(xì)胞系。Coleman和Presnell(1996)Hepatology24(6)1542-6討論了增殖肝細(xì)胞培養(yǎng)物中表型的轉(zhuǎn)變，這表明了成熟肝細(xì)胞有兩種不同分化的能力。卵細(xì)胞前體被認(rèn)為位于Herring管或臨近膽管。對于卵細(xì)胞增殖來說膽管細(xì)胞是需要的，表明它要么是前體的來源或它起到支持或誘導(dǎo)的作用。Kubota等，國際專利申請WO02/28997揭示了一種ICAM-1表達(dá)前體細(xì)胞群體。
中間絲蛋白，特別是膽管特異性細(xì)胞角蛋白19(CK19)和肝細(xì)胞特異性HepPar1抗原在肝器官形成過程中限定了肝前體細(xì)胞發(fā)展的進(jìn)程。小管肝細(xì)胞增殖共同含有肝細(xì)胞和BEC的表型特征。在肝細(xì)胞分化的過程中，HepPar1抗原的表達(dá)增加，CK14和CK19的表達(dá)丟失。相比之下，當(dāng)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為管板細(xì)胞時，CK19在分化了的膽管表達(dá)增加，然而CK14和HepPar1抗原的表達(dá)丟失。所以肝前體細(xì)胞分化步驟的標(biāo)志就是獲得或丟失特異性的表型特征。所述前體細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞譜系結(jié)果是導(dǎo)致一種標(biāo)記的表達(dá)和其他標(biāo)記的丟失。早期的報導(dǎo)提出在活體中存在這樣兩種能力的前體細(xì)胞，見于Douarin(1975)Med.Biol.53427-455；Shiojiri等(1991)Cancer Res.512611-2620；Haruna等(1996)Hepatology23(3)476-81；Tateno和Yoshizato(1996)Am J Pathol149(5)1593-605；和Haque等(1996)Lab Invest75(5)699-705。白蛋白和α-胎蛋白的表達(dá)也是肝細(xì)胞有用的標(biāo)記。
肝前體細(xì)胞的討論可見于Susick等(2001)Ann.N.Y.Acad.Sci.944398-419；美國專利第5,576,207號；以及美國專利申請第20020016000號。
為了進(jìn)一步描述肝前體細(xì)胞以及它們來源細(xì)胞的特征，關(guān)鍵是要有很好定義的模型系統(tǒng)，它能夠解釋“環(huán)境”因素和調(diào)節(jié)細(xì)胞更新的內(nèi)在細(xì)胞因素之間復(fù)雜的相互作用，這和特異性細(xì)胞表型的定義能夠使得成熟肝細(xì)胞生長是一樣的。對于調(diào)節(jié)正在發(fā)育和成年肝臟以及膽樹中細(xì)胞譜系的特性和分化因素的確認(rèn)和描述是有重要意義的。對于肝臟移植細(xì)胞的進(jìn)一步描述有重要的科學(xué)和臨床意義。
發(fā)明概述提供了分離和描述肝移植細(xì)胞(LEC)的方法，它是具有移植到肝臟和促進(jìn)分化肝細(xì)胞增長能力的前體細(xì)胞。所述細(xì)胞可根據(jù)前向掃描和自身熒光來分離，和/或通過特異的細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)。所述細(xì)胞在實(shí)驗評價的移植中有用，并可作為譜系和細(xì)胞特異性產(chǎn)物的來源，包括對于確認(rèn)這些細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因有用的mRNA種型，以及作為發(fā)現(xiàn)作用于它們的因子或分子的目標(biāo)。
為肝移植細(xì)胞的增長和分析，包括克隆分析，提供了體外和活體系統(tǒng)。促克隆形成測定可在體外存在一飼養(yǎng)層間質(zhì)細(xì)胞時實(shí)施。所述細(xì)胞也可以在體外不存在飼養(yǎng)層時擴(kuò)增。這些培養(yǎng)系統(tǒng)適合培養(yǎng)和描述肝移植細(xì)胞。在活體中所述細(xì)胞移植到肝臟，這種移植可以通過FAH缺陷型動物肝細(xì)胞的種群恢復(fù)(repopulation)來進(jìn)行實(shí)驗性的測試。
已發(fā)現(xiàn)所述肝移植細(xì)胞在評價和肝特異性病毒相關(guān)的治療中有效，例如肝炎A、B、C、D、E病毒等，尤其是人類肝炎病毒。還發(fā)現(xiàn)所述細(xì)胞在培養(yǎng)肝細(xì)胞增殖的毒理學(xué)測試中有用，并作為一種提供肝代謝副產(chǎn)物的方法，例如肝細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物。
附圖簡述

圖1A顯示了人類胎兒肝細(xì)胞前向掃描、自身熒光和生存力(碘化丙錠)的染色，以及根據(jù)這些特征分為R1和R2群體。圖1B顯示了R2群體中亞群細(xì)胞抗原決定簇5E12和I型HLA的表達(dá)。
圖2A和2B顯示了R2群體白蛋白和CK19的異類表達(dá)，在5E12表達(dá)分類之前。
圖3A-3D顯示了人類胎兒肝細(xì)胞的表型分析。
圖4顯示了來自帶有5E12、EpCAM、CD49f、E-鈣粘著蛋白和HLA的R2群體的細(xì)胞染色。圖4A、4D和4G顯示了5E12對比I型HLA染色。多邊形區(qū)域表明了用來挑選5E12+、HLA低LEC的門。圖4B、4E和4H顯示了分別利用E-鈣粘著蛋白；EpCAM和CD49f相應(yīng)的圖，如x軸。圖4C、4F和4I顯示了在圖4B、4E和4H中門控表達(dá)5E12的群體分析。數(shù)據(jù)表明5E12、EpCAM、E-鈣粘著蛋白和CD49f之間的染色的等價。
圖5A-5F顯示了來源于體外培養(yǎng)兩個星期后的人類胎兒肝LEC群體上白蛋白、α-胎蛋白(afp)和CK19的染色。
圖6A和6B顯示了循環(huán)的人類α-1-抗胰蛋白酶(AAT)(9A)和來自NOD-SCID小鼠的血清白蛋白(ALB)(9B)的水平，其中這些小鼠是接受了總肝細(xì)胞、分選的總肝細(xì)胞或分選的R2 5E12+HLA低細(xì)胞移植6周后的小鼠。這些數(shù)據(jù)表明了來自LEC的功能性肝細(xì)胞的移植和發(fā)生。
圖7A-7F顯示了在接受移植6周后的NOD-SCID小鼠肝臟里移植的人類胎兒肝細(xì)胞中檢測到人類ALB或CK19蛋白質(zhì)。圖10A-10F是來自單個肝臟的連續(xù)部分。這些數(shù)據(jù)顯示LEC能夠產(chǎn)生肝細(xì)胞。人類白蛋白表達(dá)的地方也表達(dá)CK19。
圖8A顯示了人類成年R1和R2群體肝細(xì)胞的染色；以及R2群體5E12、HLA的染色。圖8B顯示了在活體培養(yǎng)后白蛋白和α-1-抗胰蛋白酶的表達(dá)。
圖9A-9H顯示了人成年肝組織的分析，如圖3對于胎兒細(xì)胞的描述。
圖10A-10H顯示了胎兒和成年肝臟中LEC的染色。
圖11顯示了培養(yǎng)兩周后的肝移植細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，其中這些細(xì)胞成長為典型的單層上皮細(xì)胞。
表2顯示了人肝移植細(xì)胞的限制性稀釋。
表3顯示了通過免疫染色對LEC進(jìn)行篩選。
具體實(shí)施方案的描述分離和標(biāo)記肝移植細(xì)胞(LEC)，并當(dāng)活體移植時證明是能夠發(fā)展為肝細(xì)胞的前體細(xì)胞。用作肝移植細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體在移植中是有用的，會提供一種恢復(fù)肝臟功能的受體；對于藥物篩選；體外和活體中的肝發(fā)育模型；體外和活體中的篩選分析來限制生長和分化的因素，并標(biāo)記參與肝臟發(fā)育和調(diào)節(jié)的基因；等等。天然的細(xì)胞可以用于這些目的，或它們可被遺傳的修飾而提供改變了的能力。
發(fā)育為再生肝細(xì)胞的能力可以在活體中測定，例如在免疫缺陷的動物，如RAG、SCID、裸鼠(nude)等，在FAH-/-動物中或被擊昏的帶有異源的、同源的或異種供體細(xì)胞的免疫缺陷型動物中，通過這個系統(tǒng)中這些供體細(xì)胞提供功能性的能力。FAH的表達(dá)是一種人類遺傳性障礙的缺陷，酪氨酸血癥類型1。FAH的功能由所移植的肝細(xì)胞提供。或者，也可用體外法來測定生物功能，通過在肝細(xì)胞產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)合適的生長因子和/或細(xì)胞活素。當(dāng)在培養(yǎng)生長時，受試細(xì)胞生長為單層，有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。
所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞可根據(jù)生存力、前向掃描、自身熒光和細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)來富集。例如在用碘化丙錠(PI)染色后死亡的細(xì)胞染色明亮因為它們不能排除染劑。然而有生存能力的細(xì)胞當(dāng)用碘化丙錠染色時是陰性至很低。重要的細(xì)胞在PI低亞群中被發(fā)現(xiàn)，在非常亮和陰性之間，如圖1所示。前向掃描也可以用來對重要細(xì)胞門控，它們有較高的前向掃描，如圖1顯示。
在高前向掃描的群體中，PI低細(xì)胞、肝移植細(xì)胞是陽性和/或陰性選擇性的表達(dá)特異性標(biāo)記物。通過流式細(xì)胞計數(shù)分析和篩分細(xì)胞表面標(biāo)記物，如那些下面描述的，可以分選有生存力的細(xì)胞。一種這樣的重要陽性選擇標(biāo)記物是5E12表位。其他的標(biāo)記物，可以和5E12交換的應(yīng)用來進(jìn)行陽性選擇，包括ep-cam、e-鈣粘著蛋白和CD49f。優(yōu)選的所述細(xì)胞也選擇來低表達(dá)I型HLA抗原，例如HLA-A、HLA-B和HLA-C。其他的標(biāo)記物，可以和I型HLA抗原交換的應(yīng)用，包括CD38和CD54。另外，所述細(xì)胞也可以被陰性選擇或標(biāo)記為陰性的表達(dá)CD117和/或CD14。雖然不通常用來選擇，細(xì)胞質(zhì)蛋白白蛋白和CK19都表達(dá)是LEC的特點(diǎn)。
定 義在對以下提供的標(biāo)記物和細(xì)胞的定義中，所述名詞典型的將按照人類蛋白質(zhì)、細(xì)胞等定義，其中人類細(xì)胞優(yōu)選的是所述發(fā)明的實(shí)施方案。那些文中的技術(shù)員明白其他哺乳動物也可以用作細(xì)胞的來源，將利用那個群體同源的相似物和功能上相關(guān)的標(biāo)記物從這樣的非人類群體選擇細(xì)胞。
肝臟移植。如這里所應(yīng)用的，名詞“肝臟移植細(xì)胞”指一種細(xì)胞群體，當(dāng)移植到動物時，成長為成熟肝細(xì)胞。肝前體細(xì)胞發(fā)育的潛力可以通過功能性和表型的標(biāo)準(zhǔn)來評定。功能上，肝細(xì)胞被特征性的描述為能夠彌補(bǔ)FAH缺陷，并會表達(dá)肝特異性蛋白質(zhì)，包括白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-胎蛋白等等。肝細(xì)胞功能上還特征性的描述為能夠被肝炎病毒感染，例如肝炎病毒A(HAV)；肝炎病毒B(HBV)；肝炎病毒C(HCV)；肝炎病毒D(HDV)；肝炎病毒E(HEV)；等等。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞也能夠成長為BEC，它在功能上被特征性的描述為表達(dá)細(xì)胞角蛋白19，并在單層細(xì)胞間形成多細(xì)胞管道和膽小管。
陽性和陰性染色。所述受試的肝移植細(xì)胞特征性的描述為表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物。雖然在文中提到細(xì)胞的特定標(biāo)記物是“陽性”或“陰性”是很普通的，但實(shí)際的表達(dá)水平是定量的特性。所述細(xì)胞表面分子的數(shù)量可對數(shù)級的變化，但仍特征性的描述為“陽性”。文中那些技術(shù)人員也明白染色為陰性的細(xì)胞，例如一種標(biāo)記物特異性試劑的結(jié)合水平并沒發(fā)現(xiàn)和對照組不同，例如一種同型匹配的對照；會表達(dá)少量標(biāo)記物。染色水平的特性使得細(xì)胞群體之間有微妙的變化。
細(xì)胞的染色密度可以通過流式細(xì)胞計數(shù)法監(jiān)測，其中激光檢測熒光色素的定量水平(它和被特異性試劑結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物的量是成比例的，例如抗體)。流式細(xì)胞計數(shù)，或FACS也可以用來根據(jù)和特異性試劑結(jié)合的密度來分離細(xì)胞群體，和其他的參數(shù)一樣，如細(xì)胞大小和光散射。雖然染色的絕對水平會和特定的熒光色素和反應(yīng)制劑不同，數(shù)據(jù)可以標(biāo)準(zhǔn)化為對照。
為了標(biāo)準(zhǔn)化分類為對照，每個細(xì)胞記錄為擁有特定染色密度的數(shù)據(jù)點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)點(diǎn)根據(jù)對數(shù)范圍顯示，其中測定的單位是任意的染色密度。在一個實(shí)施例中，一個樣品中的最亮染色細(xì)胞的密度會比未染色細(xì)胞多4log。當(dāng)以這種方式顯示時，落在染色密度最高log中的細(xì)胞顯然是明亮的，然而那些在最低密度中的是陰性的。所述“低”陽性染色細(xì)胞有比同型匹配對照亮度高的染色水平，但不及通常在所述群體中發(fā)現(xiàn)的最明亮染色細(xì)胞密集。低陽性細(xì)胞擁有和所述樣品的陰性以及明亮染色陽性細(xì)胞相比的獨(dú)特性質(zhì)。一種可供選擇的對照可利用一種在其表面有限定密度標(biāo)記物的底物，例如一種人造珠或細(xì)胞系，它們提供了密度的陽性對照。
前體細(xì)胞的來源。用作細(xì)胞來源的體外細(xì)胞群體包括新鮮的或冷凍的肝細(xì)胞群體、膽管細(xì)胞群體或胰腺細(xì)胞群體等等，它們是從胚胎、胎兒、兒童或成年人組織獲得的。所述方法還包括細(xì)胞分離的富集或提純步驟，通過對于其他細(xì)胞特異性標(biāo)記物的陽性選擇。所述前體細(xì)胞可從任何哺乳動物物種獲得，例如人類、馬、牛、豬、狗、貓、嚙齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠、靈長類動物等等。
R2群體。包含如上所述肝移植前體細(xì)胞的細(xì)胞群體可以根據(jù)前向掃描、自身熒光和重要染劑(如碘化丙錠，7-AAD等)存在時的生存能力來分離。這里所應(yīng)用的R2群體，指的是活的、高前向掃描、自身熒光的細(xì)胞群體，如圖1顯示。在用重要染劑碘化丙錠(PI)染色后所述重要細(xì)胞染色不是很明亮，例如它們是(PI低)。這個群體的細(xì)胞富集為肝移植前體細(xì)胞，也包含一些污染細(xì)胞，它們可能是成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等等。
5E12。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞對于5E12抗原是陽性表達(dá)的。5E12單克隆抗體最先是制備用來針對人神經(jīng)細(xì)胞的。認(rèn)識到所述抗體是一種大約是125kDa的蛋白質(zhì)。產(chǎn)生5E12單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系已由美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)保藏，登錄號為＿＿(見審理中的專利申請60/119725)。
Ep-cam。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陽性表達(dá)ep-cam。這種抗原也已知為上皮面抗原(ESA)和上皮糖蛋白2(EGP-2)。Ep-cam作為媒介調(diào)節(jié)Ca2+獨(dú)立同型細(xì)胞-細(xì)胞之間的黏附?；铙w中，Ep-CAM的表達(dá)和上皮增殖的增加相關(guān)聯(lián)，并和細(xì)胞分化負(fù)相關(guān)。已經(jīng)證明Ep-CAM對于許多組織都有調(diào)節(jié)上皮組織形成的功能。所述序列由Szala等揭示(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.873542-3546?？贵w是商業(yè)應(yīng)用的，例如來自BD Biosciences，Pharmingen，San Diego，CA，目錄號347197。
E-鈣粘著蛋白。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陽性表達(dá)e-鈣粘著蛋白。E-鈣粘著蛋白是一種120kDa的位于上皮細(xì)胞黏附連接處跨膜糖蛋白。它通過5個細(xì)胞外的鈣-結(jié)合重復(fù)區(qū)域形成鈣依賴性細(xì)胞-細(xì)胞黏附。細(xì)胞表面的表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞分選，以及由特異的細(xì)胞外區(qū)域所產(chǎn)生的親同種抗原相互作用特異性。所述的細(xì)胞外區(qū)域?qū)⑺图?xì)胞質(zhì)成分β-連接素或片球蛋白(PG)相連，結(jié)果和α-連接素以及肌動蛋白絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相連?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來自BD Biosciences，Pharmingen，SanDiego，CA，目錄號610181。
CD49f。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陽性表達(dá)CD49f。整合素α-6(CD49f)是150kDa的跨膜蛋白，它是由上皮細(xì)胞主要表達(dá)的整合素雜二聚體的一部分。α-6和整合素β1鏈相連而形成VLA-6，并和整合素β4鏈相連而形成層粘蛋白和韁蛋白受體。CD49f主要表達(dá)于T細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板、上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，周圍神經(jīng)細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞。它的序列見于Tamura等(1990)J.Cell Biol.1111593-1604?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來自BD Biosciences，Pharmingen，San Diego，CA，目錄號557511。
I型HLA.所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞低陰性表達(dá)I型HLA。I型HLA位點(diǎn)的例子為HLA-A、-B和-C。所述I型MHC抗原是多形的2-鏈細(xì)胞表面糖蛋白。I型抗原的輕鏈?zhǔn)铅?2-微球蛋白。重鏈的分子量是44,000，并由90個氨基酸的3N-末端的細(xì)胞外區(qū)域，一個較小的疏水膜-跨越片段和一個較小的親水細(xì)胞內(nèi)C-末端區(qū)域組成，見Malissen等(1982)Proc.Nat.Acad.Sci..79893-897?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來自BD Biosciences，Pharmingen，San Diego，CA，目錄號557349，它與人型主要組織相容性I型抗原的單形抗原決定簇起反應(yīng)。
CD54。由成年肝組織分離而得的肝移植細(xì)胞陰性表達(dá)CD54。從胎兒組織分離來的細(xì)胞可能是陽性或陰性表達(dá)CD54，但通常沒有CD54陽性細(xì)胞明亮，例如5E12-群體中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。CD54也被知道為細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)，90(kDa)。所述CD54抗原是白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(CDlla/CD18)的配體，并同時影響白細(xì)胞LFA-1-依賴黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和包含細(xì)胞-細(xì)胞間接觸的免疫功能。所述CD54抗原可在成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上被誘導(dǎo)。在正常的組織中，CD54抗原的密度在內(nèi)皮中最高，并由于各種因素而增加，例如暴露于細(xì)胞活素、炎癥以及腫瘤轉(zhuǎn)化。ICAM-1的核苷酸序列由Simmons等揭示(1988)Nature331624-627，1988。抗體是商業(yè)上可獲得的，例如來自BD Biosciences，Pharmingen，San Diego，CA，目錄號347977。
CD117。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性表達(dá)CD117。CD117識別酪氨酸激酶c-Kit受體。這個受體已經(jīng)特定的用干細(xì)胞包含進(jìn)來，包括造血干細(xì)胞。同樣也存在多種同源異性的c-Kit，這是由于交替的mRNA拼接、蛋白水解以及在特定的細(xì)胞類型中應(yīng)用隱藏的內(nèi)部助催化劑而導(dǎo)致的結(jié)果。結(jié)構(gòu)上，c-Kit細(xì)胞外包含5個免疫球蛋白樣的區(qū)域，以及一個被細(xì)胞內(nèi)插入的77氨基酸分為兩個部分的催化區(qū)域；所述的序列見于Yarden等(1987)EMBO J.6(11)3341-3351?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來自BD Biosciences，Pharmingen，San Diego，CA，目錄號340529。
CD14。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性表達(dá)CD14。CD14是單-拷貝的基因編碼2種蛋白質(zhì)形式50-至55-kD糖基磷脂酰肌醇-錨著的膜蛋白(mCD14)和單核細(xì)胞或肝來源的缺乏錨的可溶性血清蛋白質(zhì)(sCD14)。兩種分子對于脂多糖(LPS)-依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是關(guān)鍵的，sCD14使得缺乏mCD14的細(xì)胞具有LPS敏感性。所述序列見于Govert等(1988)Science239497-500?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來自BDBiosciences，Pharmingen，San Diego，CA。
CD34。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性或陽性表達(dá)CD34。CD34是選擇性的表達(dá)于人類造血前體細(xì)胞上的分子質(zhì)量大約為110kD的單基因細(xì)胞表面抗原。所述基因除了由造血前體細(xì)胞表達(dá)外還由小管內(nèi)皮表達(dá)，它是單-鏈105-120kDa重O-糖基化跨膜糖蛋白。所述序列見于Simmons等(1992)J.Immun.148267-271?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來自BD Biosciences，Pharmingen，San Diego，CA.，目錄號550760。
CD38。所述發(fā)明的肝移植細(xì)胞陰性或陽性表達(dá)CD38，但通常沒有CD38陽性細(xì)胞明亮，例如5E12-群體中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。CD38是一種帶有一條較短的N-末端細(xì)胞質(zhì)尾和4C-末端細(xì)胞外N-糖基位點(diǎn)的300-氨基酸的型跨膜蛋白。所述序列見于Jackson等(1990)J.Immun.1442811-2815。所述標(biāo)記物通常和淋巴細(xì)胞、原始粒細(xì)胞以及幼紅細(xì)胞相關(guān)聯(lián)?？贵w是商業(yè)上可獲得的，例如來自BDBiosciences，Pharmingen，San Diego，CA，目錄號347680。
肝移植細(xì)胞的分離所述受試的肝移植細(xì)胞，通過用來富集有所述特征細(xì)胞的技術(shù)，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中分離出來。例如，一種群體的細(xì)胞可以選自R2群體，來表達(dá)5E12、e-鈣粘著蛋白、ep-cam和CD49f中的一種或幾種。所述細(xì)胞任選的選擇性的低或陰性表達(dá)HLA I型抗原(這里稱為HLA低)。CD45和CD38可與HLA交換應(yīng)用。
為了將細(xì)胞從組織中分離出來，可應(yīng)用一種合適的溶液來分散或懸浮。這樣的溶液通常是一種平衡鹽溶液，例如生理鹽水、PBS、Hanks平衡鹽溶液等等，合適的用胎兒小牛血清或其他天然的發(fā)生因子補(bǔ)充，和一種可接受的低濃度緩沖液協(xié)同作用，通常是5-25mM。合適的緩沖液包括HEPES、磷酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液等等。
所述的受試細(xì)胞是大的母細(xì)胞，所以初始分離可通過文中所知的各種方法選擇母細(xì)胞，包括淘析、Ficoll-Hypaque或應(yīng)用前面數(shù)據(jù)和鈍散射來門控母細(xì)胞的流式細(xì)胞計數(shù)分析。
所述受試細(xì)胞群體的分離然后將應(yīng)用親合分離以提供相當(dāng)純凈的群體。親合分離的技術(shù)包括應(yīng)用涂上-抗體的磁珠進(jìn)行的磁分離，親合色譜法，與單克隆抗體結(jié)合的細(xì)胞毒試劑或和單克隆抗體聯(lián)合應(yīng)用，例如補(bǔ)體和細(xì)胞毒素，以及用附著在固體基質(zhì)上的抗體“淘選”例如平皿培養(yǎng)或其他合適的技術(shù)。提供精確分離的技術(shù)包括熒光活化細(xì)胞分檢器，它可有不同程度的摻雜，例如多種顏色的通道、小角度和鈍光散射檢測通道、阻抗通道等等?？梢酝ㄟ^應(yīng)用和死亡細(xì)胞相關(guān)的染色(碘化丙錠，7-AAD)來篩選去除死亡細(xì)胞。任何對于所選細(xì)胞的生存能力沒有不合適損害的技術(shù)都可以運(yùn)用。
所述親和劑可以是上述細(xì)胞表面分子特定的受體或配體?？贵w配制的詳細(xì)情況以及它們合適的應(yīng)用為特定結(jié)合成分對于文中的那些技術(shù)員來說是熟知的。
將抗體應(yīng)用為親和試劑有特定的意義。合適的，這些抗體作為標(biāo)記物在分離中應(yīng)用。標(biāo)記物包括可以用于直接分離的磁珠，可以用和載體結(jié)合的親和素或鏈霉親和素去除的生物素，可以用于熒光活化細(xì)胞分檢器的熒光色素等等，使得可以方便的分離特定的細(xì)胞類型。有用的熒光素包括藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍(lán)蛋白、熒光黃和德克薩斯紅。每種抗體常常用一種不同的熒光素標(biāo)記，這使得可以獨(dú)立的分檢每種標(biāo)記物。
所述抗體加入到細(xì)胞懸浮液，保溫一段時間足以結(jié)合所應(yīng)用的細(xì)胞表面抗原。通常保溫至少大約5分鐘，少于大約30分鐘。理想的在反應(yīng)混合物中含有足夠濃度的抗體，使得分離的效率不為抗體的缺乏而限制。通過滴定決定合適的濃度。細(xì)胞分離的培養(yǎng)基可以是任何維持細(xì)胞生存能力的培養(yǎng)基。一種優(yōu)選的培養(yǎng)基是包含0.1-0.5％BSA的磷酸緩沖鹽溶液。多種培養(yǎng)基是商業(yè)上可獲得的，并可根據(jù)細(xì)胞的特性應(yīng)用，包括Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(dMEM)、Hank’堿性鹽溶液(HBSS)、Dulbecco磷酸緩沖鹽溶液(dPBS)、RPMI、Iscove培養(yǎng)基、含有5mM EDTA的PBS等等，常常用小牛胎兒血清、BSA、HSA等等補(bǔ)充。
所述標(biāo)記的細(xì)胞然后根據(jù)上述的表型分離。所述分離出來的細(xì)胞可以在任何合適的保持細(xì)胞生存能力的培養(yǎng)基中收集，通常在收集試管的底部有一墊層血清。多種培養(yǎng)基是商業(yè)上可獲得的，并可根據(jù)細(xì)胞的特性應(yīng)用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove培養(yǎng)基等等，常常用小牛胎兒血清補(bǔ)充。
高度富集肝移植活性的組合物以這種方式獲得。所述受試的群體是細(xì)胞組合物的50％或更多，通常是細(xì)胞組合物的90％或更多，可以大約是肝細(xì)胞群體的95％或更多。所述富集的細(xì)胞群體可以直接應(yīng)用，或可以在液態(tài)氮溫度冷凍并存儲長時間，解凍并能再使用。所述細(xì)胞通常存儲在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培養(yǎng)基。一旦解凍，所述細(xì)胞可以通過應(yīng)用生長因子和/或間質(zhì)細(xì)胞繁殖和分化來擴(kuò)增。
所述方法在肝細(xì)胞功能的體外或活體模型的發(fā)展中是有用的，在基因治療和人工器官的構(gòu)建的實(shí)驗中也是有用的。發(fā)育中的肝細(xì)胞作為一種新的生長因子和藥物的寶貴來源，也充當(dāng)病毒或疫苗(例如肝炎病毒)產(chǎn)物，也用作研究肝寄生蟲或在肝中有一發(fā)展階段的寄生蟲，(例如瘧疾生物)，也用作藥物和工業(yè)化合物的體外毒性和代謝實(shí)驗，也用作基因治療實(shí)驗(由于肝臟是機(jī)體最大的脈管器官)，也用作構(gòu)建人工移植的肝臟，也用作肝誘變和癌發(fā)生的研究。
功能測定一項用來測定肝祖細(xì)胞在活體中能力的重要分析是遺傳性酪氨酸血癥1型的動物模型，這是一種嚴(yán)重的常染色體隱性代謝疾病，它會影響肝臟和腎臟，它的病因是缺乏延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)。用2-(2-硝基-4-三氯-甲苯基)-1，3-環(huán)己二酮(NTBC)處理小鼠純合子被破壞的FAH基因(FAH-/-)消除了新生致死氯并恢復(fù)了肝和腎的功能。所述的動物模型，例如由Grompe等描述(1995)Nature Genetics10453-460；Overturf等(1996)Nat.Genet.12(3)266-73；等等。
在所述發(fā)明的一種實(shí)施方案中，用肝移植細(xì)胞重構(gòu)FAH小鼠，可以用肝祖細(xì)胞或包含檢測標(biāo)記物的小鼠細(xì)胞。例如所述細(xì)胞可以導(dǎo)入小鼠，它可以是用放射線處理過的小鼠，使得初始重構(gòu)肝臟，然后為了選擇性的肝臟重構(gòu)將NTBC取出。或者，NTBC可以在導(dǎo)入肝移植細(xì)胞后立即取出。所述的重構(gòu)動物對于篩選疫苗和抗肝炎病毒的藥物是有用的，例如肝炎病毒A、B、C、D、E；生物活性藥物的代謝和毒性試驗；等等。
體外細(xì)胞培養(yǎng)所述富集的細(xì)胞群體在體外可以在各種培養(yǎng)條件下生長。當(dāng)在培養(yǎng)生長時，所述受試細(xì)胞生長為單層，有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)基可以是液態(tài)或半液態(tài)的，例如包含瓊脂、甲基纖維素等等。所述細(xì)胞群體可以合適的懸浮在適當(dāng)營養(yǎng)的培養(yǎng)基中，例如Iscove改進(jìn)的DMEM或RPMI-1640，常常用小牛胎兒血清(大約5-10％)、L-谷氨酰胺、硫醇、特定的是2-巰基乙醇以及抗體例如青霉素和鏈霉素來補(bǔ)充。
所述受試細(xì)胞可以在含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的共培養(yǎng)基中生長。適合應(yīng)用為飼養(yǎng)層細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞包括骨髓間質(zhì)細(xì)胞例如SYS-1細(xì)胞系，F(xiàn)FS-1成纖維細(xì)胞系等等。其他可以用作飼養(yǎng)層細(xì)胞的包括來源于人類或其他動物的成纖維細(xì)胞；來源于相同物種如肝，通過原始培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞；STO成纖維細(xì)胞系；等等。這些細(xì)胞層為培養(yǎng)基提供了未定義的成分，并會抑制多能細(xì)胞的分化。存在飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)對于無性培養(yǎng)特別有用，例如其中單個祖細(xì)胞擴(kuò)增為一群體。
可應(yīng)用體外培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是克隆產(chǎn)生培養(yǎng)的細(xì)胞，進(jìn)行功能性測定。例如，評定培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)肝特異性蛋白的能力，包括白蛋白和α-1抗胰蛋白酶。表達(dá)可利用任何合適的形式，包括培養(yǎng)物上層清液中蛋白質(zhì)存在的RT-PCR、ELISA，等等。也可以評定培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)膽道蛋白的能力，例如CK19。
所述培養(yǎng)物包括細(xì)胞有反應(yīng)的生長因子。生長因子如這里定義的，是在培養(yǎng)物中或在完整的組織中，通過特異性的作用于跨膜受體能夠提高細(xì)胞生存、生長和/或分化的分子。生長因子包括多肽和非-多肽因子。可以應(yīng)用于培養(yǎng)受試細(xì)胞的特異生長因子括但不局限于肝細(xì)胞生長因子/散射因子(HGF)、EGF、TGFα、酸性FGF(見Block等；J.Biol Chem，1996 1321133-1149)。選擇特定的培養(yǎng)條件來達(dá)到特定的目的，例如保持祖細(xì)胞的活性，等等。另外，除了生長因子，所述受試細(xì)胞可以在含有間質(zhì)或飼養(yǎng)層細(xì)胞的共培養(yǎng)物中生長。適合應(yīng)用于祖細(xì)胞生長的飼養(yǎng)層細(xì)胞在文中是已知的。
所述受試共培養(yǎng)細(xì)胞可以用于多種途徑。例如，營養(yǎng)培養(yǎng)基，它是一種有條件的培養(yǎng)基，可以在不同的階段和成分分析時分離。分離可通過HPLC、反相-HPLC、凝膠電泳、等電子聚焦、透析或其他非-降解技術(shù)來完成，可通過分子量、分子體積、電荷、它們的組合等來分離?？梢越M合一種或多種這些技術(shù)來進(jìn)一步富集特定的提高祖細(xì)胞活性的部分。
所述受試細(xì)胞可以在間質(zhì)細(xì)胞-自由基培養(yǎng)物中擴(kuò)增，例如如Suzuki等描述的(2000)Hepatology321230-1239。這樣的培養(yǎng)物優(yōu)選的生長在提供一層細(xì)胞外基質(zhì)成分的培養(yǎng)基上，例如層粘蛋白、IV型膠原、I型膠原、纖維連結(jié)蛋白等等。所述培養(yǎng)基通常包括生長因子，例如HGF、EGF等等。
所述肝移植細(xì)胞可以和一種培養(yǎng)系統(tǒng)聯(lián)合應(yīng)用于分離和評價與肝細(xì)胞及BEC分化和成熟相關(guān)的因素。因此，可以應(yīng)用所述細(xì)胞來測定培養(yǎng)基的活性，例如有條件的培養(yǎng)基，評價液體所含生長因子的活性，包括形成特定的結(jié)構(gòu)，等等。培養(yǎng)法也可以作為用來處理藥物和其他化合物的方法，來測定肝代謝對于重要藥物的作用。例如，可以分離和測試肝代謝的產(chǎn)物的毒性和效力。
移 植肝臟衰竭包括和嚴(yán)重的肝損傷及功能不良相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)并發(fā)癥。它可能在沒有預(yù)先存在肝疾病的病人中發(fā)生或是在慢性肝損傷上繼發(fā)的。急性肝臟衰竭的診斷需要存在癥狀，包括黃疸和腦病。爆發(fā)性肝衰竭損害所有的肝臟功能，導(dǎo)致膽紅素代謝減少，氨和腸源性蛋白質(zhì)的清除減少，凝血因子產(chǎn)物減少。它也會導(dǎo)致腎臟衰竭、休克和膿毒病。沒有肝移植，超過50％的病人將死亡，病因通常是來自以上疾病的組合。即使在最好的環(huán)境中死亡率超過50％。處理的方法包括一般的支持療法直至肝可以再生和恢復(fù)功能。在沒有預(yù)先存在疾病的急性肝衰竭中，肝移植是可以救命的。
所述受試細(xì)胞可以用來恢復(fù)受者的肝臟功能。同種異體的細(xì)胞可以用于分離祖細(xì)胞和接下來的移植。肝功能不良的多數(shù)臨床表現(xiàn)來源于細(xì)胞損害和正常肝容量的損害。例如，病毒性肝炎導(dǎo)致肝細(xì)胞的損害和死亡。在這種情況下，表現(xiàn)可包括出血的增加、黃疸和循環(huán)中肝細(xì)胞酶的水平增加。由于肝功能不良起源于疾病如腫瘤，所述受試細(xì)胞可以從自體同源的肝組織分離，并在治療后應(yīng)用來恢復(fù)肝功能。
肝疾病有許多原因，從微生物感染和贅生物(腫瘤)到代謝和循環(huán)的問題。肝炎包括肝細(xì)胞炎癥和損害。這種類型的損傷可來自損害性藥物、毒素或免疫攻擊。然而，肝炎最普通的原因是病毒感染。在美國三種主要的病毒導(dǎo)致肝炎肝炎病毒A、B和C。它們每年總共感染將近500,000美國人。另外，細(xì)菌、真菌和原生動物可感染肝臟，而且肝臟在某種程度上幾乎不可避免的卷入所有的血源性感染中。
許多藥物可損害肝臟，從肝臟化學(xué)輕微無癥狀的改變到肝衰竭和死亡。肝毒性可是或不是劑量相關(guān)的。羥苯基乙酰胺(Acetominophen)是一種肝毒性的藥物；二苯乙內(nèi)酰脲(抗驚厥藥)和異煙肼(抗結(jié)核藥)就是能引起“病毒樣”肝炎的藥物例子。環(huán)境和工業(yè)毒素可導(dǎo)致肝臟廣泛的改變。肝損害不一定是劑量依賴的，可以是從輕微無癥狀的炎癥到爆發(fā)性的衰竭或進(jìn)行性的纖維化和硬化。
肝代謝過程的問題可以是先天的或后天獲得的。這些病癥中的一些，如威爾遜病(肝豆?fàn)詈瞬?和血色沉著病可表現(xiàn)為肝炎或硬化。威爾遜病是少見的遺傳性疾病，其特點(diǎn)為不能將銅分泌入膽汁，導(dǎo)致肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)中銅的毒性聚積。血色沉著病是一種鐵超負(fù)荷綜合癥導(dǎo)致鐵沉積和隨之發(fā)生的各種器官的損害，包括肝、心臟、胰腺和垂體腺。這個疾病可能是腸道吸收鐵增加或多次輸血引起的，因為常常在循環(huán)紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)鐵。
肝可受許多疾病的影響，尤其是自身免疫的病癥，其中免疫系統(tǒng)攻擊機(jī)體自身正常組織。一些例子包括風(fēng)濕病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及感染性腸疾病，例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病(節(jié)段性回腸炎)。
為了多種目的可將基因在培養(yǎng)或移植前導(dǎo)入細(xì)胞，例如預(yù)防或減少易感性，取代失去轉(zhuǎn)變功能的基因，等等?；蛘?，表達(dá)反義mRNA或核糖酶的載體被導(dǎo)入，因此阻斷了表達(dá)不想表達(dá)的基因。其他基因治療的方法是導(dǎo)入藥物抗性基因來使得正常祖細(xì)胞有一優(yōu)勢并受選擇性壓力的支配，例如多種藥物抗性基因(MDR)，或抗細(xì)胞凋亡基因如bcl-2。文中所知的多種技術(shù)可用來轉(zhuǎn)染所述靶細(xì)胞，例如電穿孔、鈣沉淀DNA、融合、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染等等。所述DNA特殊的導(dǎo)入方式對于所述發(fā)明的實(shí)施不是關(guān)鍵的。
許多對于將外源性基因轉(zhuǎn)入到哺乳動物細(xì)胞中去有用的載體可以利用。所述載體可以是游離基因，例如質(zhì)粒、病毒源性載體如巨細(xì)胞病毒、腺病毒等等，或可以整合入靶細(xì)胞基因組，通過同源重組或隨機(jī)整合，例如反轉(zhuǎn)錄病毒源性的載體，例如MMLV、HIV-1、ALV等等。祖代和干細(xì)胞遺傳改變見Svendsen等，(1999)TrendsNeurosci.22(8)357-64；Krawetz等(1999)Gene234(1)1-9；Pellegrini等，MedBoil Eng Comput.36(6)778-90；以及Alison(1998)Curr Opin Cell Biol.10(6)710-5。
或者，所述肝祖代可以是終生免疫-非終生免疫的例如見Kobayashi等(2000)Science2871258-1262 。在這樣的操作中，將終生免疫的基因序列，例如癌基因，以可以將其容易去除的方法導(dǎo)入細(xì)胞，例如利用位點(diǎn)特異性的重組酶如cre-lox系統(tǒng)。
為了證明擁有遺傳修飾的祖細(xì)胞，可以運(yùn)用各種方法。所述細(xì)胞的基因組可以用限制性酶消化，應(yīng)用或不應(yīng)用DNA擴(kuò)增。聚合酶鏈反應(yīng)；凝膠電泳；限制性分析；Southern、Northern和Western印跡；測序等等都可以被運(yùn)用。所述細(xì)胞可以在各種環(huán)境下生長，來保證所述細(xì)胞在保持表達(dá)導(dǎo)入DNA的能力同時也能夠分化?？梢赃\(yùn)用各種體外和活體的試驗來確保保持所述細(xì)胞的多種能力。
所述細(xì)胞可以以任何生理上可接受的方法給藥，通常是血管內(nèi)，包括靜脈內(nèi)，例如通過肝臟門靜脈；脾臟內(nèi)給藥等，然而它們也可以導(dǎo)入其他合適的位點(diǎn)，所述細(xì)胞可以因此找到合適的再生和分化的位點(diǎn)。通常，至少施用1×103/Kg的細(xì)胞，更通常的是至少大約1×104/Kg的細(xì)胞，優(yōu)選1×106/Kg或更多。所述細(xì)胞可以通過注射、導(dǎo)管或其他方法導(dǎo)入。
所述受試細(xì)胞可用作培養(yǎng)細(xì)胞，可以產(chǎn)生作為生物人工肝生物反應(yīng)器的肝細(xì)胞，其中肝細(xì)胞通過膜或其他生理屏障從灌注液分離。四種在中空-纖維膜中利用肝培養(yǎng)細(xì)胞的裝置(Circe Biomedical HepatAssist、Vitagen ELADTM、GerlachBELS和Excorp Medical BLSS)現(xiàn)在正處于臨床評價階段。雖然生物人工肝的發(fā)展協(xié)助裝置(BLADs)治療急性肝衰竭，然而慢性肝衰竭的炎癥或急性失代償，很重要，它卻很難完成，部分是因為肝細(xì)胞在培養(yǎng)基中很難生存。通過培養(yǎng)受試的肝移植細(xì)胞，對這樣的裝置持續(xù)提供肝細(xì)胞。
生物人工肝生物反應(yīng)器提供一種或多種功能氧化解毒(主要通過細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng))；生物轉(zhuǎn)化(例如尿素合成、糖尿化(gluconuridation)和硫酸鹽化作用)；分泌(通過膽汁系統(tǒng))；蛋白質(zhì)和大分子合成；中間代謝(糖原異生、脂肪酸和氨基酸)；以及免疫和激素系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。
現(xiàn)在臨床評價中的BLADs是以應(yīng)用中空-纖維筒裝肝細(xì)胞(hollow-fibercartridge housing hepatocyte)，它在中空纖維腔外部位培養(yǎng)。灌注通過所述中空纖維筒腔內(nèi)部分是全血，或是血漿流?？梢詫⒁环N氧合器放置在生物反應(yīng)器前來提高灌注流中可利用氧的水平，并用柱或過濾器在到達(dá)肝細(xì)胞前減少毒素。
其他的裝置可以以軸向流動途徑越過和/或通過非紡織聚酯纖維灌注血漿；通過處于高度多孔的用肝細(xì)胞接種的聚氨酯泡沫結(jié)構(gòu)中心的通道；通過微孔多聚砜中空-纖維膜；微孔聚乙烯形式的樹脂材料；等等。所述祖細(xì)胞和/或后代肝細(xì)胞可以裝入膠囊。
表達(dá)試驗檢查肝移植細(xì)胞中基因的表達(dá)是特別重要的。所述的表達(dá)組基因可以和許多重要的細(xì)胞相比較，例如如文中所知的成年肝祖細(xì)胞、干細(xì)胞、造血細(xì)胞等等。例如，可以進(jìn)行實(shí)驗來測定在發(fā)展過程中被調(diào)節(jié)的基因。
任何文中所知的用來檢測特異mRNAs的合適的定量和定性的方法都可以應(yīng)用。mRNA可以被檢測，通過例如和微陣列雜交，在組織中原位雜交，通過反轉(zhuǎn)錄酶-PCR，或在包含多聚A+mRNA的Northern印跡中。本文中的一項技術(shù)可以容易的應(yīng)用這些方法來測定兩個樣品之間mRNA轉(zhuǎn)錄物的大小和量的不同。例如，祖細(xì)胞中特定mRNA的水平和參考樣品中mRNAs的表達(dá)相當(dāng)，例如肝細(xì)胞或其他分化細(xì)胞。
任何適合檢測和比較樣品中mRNA表達(dá)水平的方法都可以和所述發(fā)明的方法聯(lián)合應(yīng)用。例如，樣品中mRNA的表達(dá)水平可以通過從樣品中產(chǎn)生的一庫表達(dá)序列標(biāo)記(ESTs)測定?；驇熘蠩STs相關(guān)表達(dá)的列舉可以用來估計初始樣品中基因轉(zhuǎn)錄物的相關(guān)表達(dá)。實(shí)驗樣品EST分析的結(jié)果然后可以和參考樣品的EST分析作比較，后者是用來測定選擇性多聚核苷酸相關(guān)表達(dá)水平，尤其是和這里描述的一種或多種分化表達(dá)基因相關(guān)的多聚核苷酸。
或者，實(shí)驗樣品中的基因表達(dá)可以應(yīng)用基因表達(dá)(SAGE)方法連續(xù)分析實(shí)施(Velculescu等Science(1995)270484)。SAGE包括從單個轉(zhuǎn)錄物中特異性位點(diǎn)分離出短小獨(dú)特的序列標(biāo)記物。所述序列標(biāo)記物被連接、克隆和排序。初始樣品中特定轉(zhuǎn)錄物的頻率通過相關(guān)序列標(biāo)記物和所述序列群體相遇的次數(shù)反映。
試驗樣品中的基因表達(dá)也可以應(yīng)用差別顯示(DD)方法分析。在DD中，由特異性多聚核苷酸序列(限制性酶位點(diǎn))限定的片段應(yīng)用為獨(dú)特的基因標(biāo)識符，它和所表達(dá)基因中關(guān)于片段長度或片段部位的信息相聯(lián)系。樣品中表達(dá)基因的相關(guān)表達(dá)然后可以在所有可能的片段庫中根據(jù)和那個基因相關(guān)聯(lián)片段的相關(guān)表達(dá)來估計。開展DD的方法和組合物在文中是熟知的，見例如U.S.5,776,683；和U.S.5,807,680。
或者，在樣品中基因表達(dá)中應(yīng)用雜交分析，它是以核苷酸相互作用的特異性為基礎(chǔ)。寡核苷酸或cDNA可以用來選擇性的識別或俘獲特異性序列組合物的DNA或RNA，對和已知俘獲的序列雜交的RNA或cDNA的量進(jìn)行定性或定量的測定，以提供關(guān)于樣品中的細(xì)胞信息庫中特定信息相關(guān)表達(dá)的信息?？稍O(shè)計雜交分析使得同時篩選成百至上千基因的相關(guān)表達(dá)，通過應(yīng)用，例如，有高密度形式的陣列-基礎(chǔ)技術(shù)，包括過濾器、顯微鏡載物片或微芯片或應(yīng)用光譜分析的液體-基礎(chǔ)技術(shù)(例如質(zhì)譜分析)。下面詳細(xì)敘述了在所述發(fā)明診斷方法中應(yīng)用陣列的例子。
可以實(shí)施和陣列雜交，其中所述陣列可根據(jù)文中所知的任何合適的方法制造。例如，U.S.5,134,854中描述的制造大寡核苷酸陣列的方法，以及U.S.5,455,934中描述的應(yīng)用光-控合成技術(shù)。應(yīng)用計算機(jī)控制系統(tǒng)，單體異質(zhì)陣列通過同時在大量反應(yīng)位點(diǎn)連接轉(zhuǎn)換為聚合物異質(zhì)陣列。或者，微陣列通過將合成前的寡核苷酸沉積在固體底物上而產(chǎn)生，例如PCT出版的申請?zhí)朩O 95/35505中描述的。
收集來自帶有陣列的樣品的雜交數(shù)據(jù)的方法在文中也是熟知的。例如應(yīng)用一種檢測熒光標(biāo)記物創(chuàng)造細(xì)胞樣品的多聚核苷酸，通過掃描微陣列檢測可察覺的標(biāo)記物的存在來檢測樣品中多聚核苷酸的雜交。用來檢測裝置上熒光標(biāo)記目標(biāo)的方法和裝置在文中是已知的。通常，這樣的檢測裝置包括顯微鏡和用來將光對準(zhǔn)底物的光源。光子計數(shù)器檢測來自底物的熒光，然而x-y轉(zhuǎn)化步驟變化了底物的位置。一種可以應(yīng)用于所試方法的共焦檢測裝置描述于美國專利號5,631,734。一種掃描激光顯微鏡描述于Shalon等，Genome Res.(1996)6639。應(yīng)用合適的激發(fā)線，對每個應(yīng)用的熒光團(tuán)進(jìn)行掃描。然后為了接下來的分析結(jié)合來自掃描的數(shù)字圖象。對于任何特定的陣列成分，將來自一個樣品的熒光信號的比例和來自另外一個樣品的熒光信號作比較，并測定相關(guān)的信號密度。
分析從和陣列雜交收集數(shù)據(jù)的方法在文中也是熟知的。例如，當(dāng)雜交檢測包括熒光標(biāo)記物時，數(shù)據(jù)分析可包括從所收集的數(shù)據(jù)測定熒光密度的步驟，熒光密度是底物位置的函數(shù)，去除無關(guān)項，即背離預(yù)先確定的統(tǒng)計分布的數(shù)據(jù)，并可從剩余數(shù)據(jù)計算靶物的相對結(jié)合力。所得的數(shù)據(jù)可以顯示為一張每個區(qū)域密度根據(jù)靶物和探針之間結(jié)合力而變化的圖。
模式匹配可以手工實(shí)施，或應(yīng)用計算機(jī)程序?qū)嵤Ｅ渲频孜锞仃?例如陣列)的方法，設(shè)計寡核苷酸應(yīng)用于這樣的矩陣，探針的標(biāo)記、雜交條件、雜交矩陣的掃描以及產(chǎn)生模式的分析，包括對比分析，例如描述于U.S.5,800,992。
在另外一種篩選方法中，所述試驗樣品在蛋白質(zhì)水平分析?？梢詰?yīng)用任何方法測定試驗樣品中分化表達(dá)的多肽的缺失或存在或改變的量來完成診斷。例如，檢測可以利用帶有標(biāo)記抗體的細(xì)胞或組織切片染色(例如來自活組織切片檢查)，依照傳統(tǒng)的方法實(shí)施。細(xì)胞可以被滲透而沾染胞質(zhì)分子。通常，將特異結(jié)合所述發(fā)明分化表達(dá)多肽的抗體加入樣品中，保溫一段時間而足以使得結(jié)合抗原決定簇，通常至少大約10分鐘。所述抗體可以為了直接檢測而標(biāo)記(例如應(yīng)用放射性同位素、酶、熒光素、化學(xué)熒光物等)，或可以和第二抗體或試劑聯(lián)合應(yīng)用來檢測結(jié)合(例如生物素和辣根過氧化物酶結(jié)合的親和素，和熒光化合物結(jié)合的第二抗體，例如熒光素、羅丹明、得克薩斯紅等等)?？梢酝ㄟ^許多方法測定是否存在抗體結(jié)合，包括游離細(xì)胞的流式細(xì)胞計數(shù)法、顯微鏡方法、放射攝影術(shù)、閃爍計數(shù)等等?？梢詰?yīng)用任何合適的可供選擇的定量或定性測試分化表達(dá)多肽水平或量的方法，例如ELISA、western印跡、免疫沉淀反應(yīng)、放射性免疫測定等等。
篩選試驗所述受試細(xì)胞對于體外試驗和篩分是有用的，可以檢測到作用于肝移植細(xì)胞和由所述肝移植細(xì)胞產(chǎn)生的肝細(xì)胞的試劑。很多的試驗可以用于這個目的，包括毒理學(xué)試驗、蛋白質(zhì)結(jié)合的免疫測定；細(xì)胞生長、分化和功能活性的測定；激素的制造；等等。
在生物活性試劑、病毒等的篩選試驗中，所述受試細(xì)胞，通常是包含受試細(xì)胞的培養(yǎng)物，和重要的試劑接觸，并通過監(jiān)測輸出參數(shù)估計試劑的效果，例如標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞生存能力等等。所述細(xì)胞可以是如上述的新近分離、培養(yǎng)和遺傳改變的等。所述細(xì)胞可以環(huán)境誘導(dǎo)克隆培養(yǎng)物的變異體例如分離為獨(dú)立的培養(yǎng)物并在不同的條件下生長，例如和或不和病毒一起；存在或不存在其他細(xì)胞活素及它們的化合物。細(xì)胞對于試劑，特別是藥物試劑反應(yīng)的方式，包括反應(yīng)的時間是對于所述細(xì)胞生理狀態(tài)的重要反應(yīng)。
參數(shù)是細(xì)胞可計量的成分，尤其是可以精確測定的成分，理想的用高通量系統(tǒng)。一種參數(shù)可以是任何細(xì)胞成分或細(xì)胞產(chǎn)物，包括細(xì)胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或構(gòu)象或遺傳翻譯后的修飾，脂類、糖類、有機(jī)或無機(jī)分子、核酸例如mRNA、DNA等，或來自這樣的細(xì)胞成分或它們的化合物的一部分。雖然大多數(shù)參數(shù)將提供定量的讀出，但在一些例子中，半-定量或定性的結(jié)果是可以接受的。讀出的信息可包括單個確定的值，或可包括平均值、中位數(shù)或方差等。特征性的，對于每個由于相同試驗的多樣性產(chǎn)生的參數(shù)將獲得一個參數(shù)讀出值范圍。變異性是期望的，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計方法加用以提供單一值的普通統(tǒng)計方法將獲得每組試驗參數(shù)值的范圍。
篩選用的重要試劑包括已知或不知的化合物，包括許多化學(xué)種類，主要是有機(jī)分子，包括有機(jī)金屬分子、無機(jī)分子、基因序列等等。所述發(fā)明的一個重要方面就是評價候選藥物，包括毒性試驗來測試肝炎病毒的作用，例如肝炎A、B、C、D、E病毒；抗病毒藥物；等等。
除了復(fù)雜的生物試劑外，例如病毒，候選試劑包括包含對于結(jié)構(gòu)相互作用，特別是氫鍵結(jié)合，必需的功能基團(tuán)的無機(jī)分子，典型的包括至少一種胺、羰基、羥基或羧基，常常至少兩個功能性化學(xué)基團(tuán)。候選試劑常常包括環(huán)碳或被以上一個或多個基團(tuán)取代的雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香或聚芳香結(jié)構(gòu)。候選試劑也見于生物分子，包括肽、多聚核苷酸、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或它們的化合物。
藥物活性的藥物、遺傳活性的分子等包括在內(nèi)。重要的化合物包括化療藥物、激素或激素拮抗劑等等。適合這項發(fā)明的示例藥物試劑是那些在“療法的藥理學(xué)基礎(chǔ)”(The Pharmacological Basis of Therapeutics)中描述的，Goodman和Gilman，McGraw-Hill，紐約(1996)，第九版，選自以下章節(jié)水、鹽和離子(Water，Salts andIons)；影響腎臟功能和電解質(zhì)代謝的藥物(Drugs Affecting Renal Function andElectrolyte Metabolism)；影響胃腸道功能的藥物(Drugs AffectingGastrointestinal Function))；微生物疾病的化學(xué)療法(Chemotherapy ofMicrobial Diseases)；腫瘤疾病的化學(xué)療法(Chemotherapy of NeoplasticDiseases)；作用于血液形成器官的藥物(Drugs Acting on Blood-Forming organs)；激素和激素拮抗劑(Hormones and Hormone Antagonists)；維生素，皮膚病學(xué)(Vitamins，Dermatology)和毒理學(xué)(Toxicology)，這里都包含進(jìn)來作參考。還包括毒素和生物及化學(xué)競爭試劑，例如見Somani，S.M.(編)，“化學(xué)競爭試劑”(ChemicalWarfare Agents)，學(xué)術(shù)出版社，紐約(1992)。
試驗化合物包括上面描述的所有種類的分子，還進(jìn)一步包括未知內(nèi)容的樣品。來自天然資源如植物的自然出現(xiàn)化合物的混合物是有重要意義的。雖然許多樣品包含溶液化合物，可以溶解在合適溶劑中的固體樣品也可以被測定。有意義的樣品包括環(huán)境樣品，例如地面水、海水、礦廢物等等；生物樣品，例如由農(nóng)作物配制的溶解產(chǎn)物，組織樣品等等；人造樣品，例如在藥物配制過程中的時間進(jìn)程；以及配制作分析之用化合物庫等等。有意義的樣品包括評定潛在治療值的化合物，例如藥物候選物。
術(shù)語“樣品”也包括上面所述的液體，并在其中加入如了附加的成分，例如影響離子強(qiáng)度、pH、總蛋白濃度等的成分。此外，所述樣品也通過處理而完成至少部分化學(xué)分離或濃縮。可以將生物樣品保存，如果照看它而減少化合物的降解，例如在氮下、冷凍或它們的聯(lián)合。應(yīng)用的樣品體積要足夠而使得測量可以察覺，通常是大約0.1μl-1ml的生物樣品就足夠了。
包括候選試劑的化合物從許多來源獲得，包括合成或天然化合物庫。例如，可利用許多方法任意和有指導(dǎo)的合成多種有機(jī)化合物，包括生物分子，包括任意寡核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘?，自然化合物文庫，以細(xì)菌、真菌、植物和動物浸出物的形式是可利用或容易制造的。此外，天然或合成制造的文庫和化合物通過傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生化方法很容易被修飾，并可以用來制造組合文庫。已知的藥物試劑可接受指導(dǎo)的或任意的化學(xué)修飾，例如?；?、烴化、酯化、酰胺化等等，來制造結(jié)構(gòu)類似物。
通過將所述試劑加入到至少一種，通常大量細(xì)胞樣品，通常和缺少試劑的細(xì)胞聯(lián)合，對生物活性進(jìn)行篩選。測定對所述試劑反應(yīng)的參數(shù)變化，通過和參考培養(yǎng)物的比較評價結(jié)果，例如存在和不存在所述試劑，用其他試劑獲得等等。
所述試劑可方便的以溶液的形式或容易的以可溶解的形式加入培養(yǎng)物中的細(xì)胞培養(yǎng)基。所述試劑可以流通系統(tǒng)加入，為流注，間歇或連續(xù)的，或者將化合物藥丸(bolus)逐一或遞增的加入至其他靜止的溶液，并且其他的溶液和加入的試驗化合物是相同的。第一液體流通過所述細(xì)胞，接著是第二。在單一溶液方法中，將試驗化合物藥丸加入至細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基體積中。所述培養(yǎng)基的成分總濃度不應(yīng)該在加入藥丸后明顯變化，或處于流通方法中兩種溶液之間。
優(yōu)選的試劑制劑不包括附加成分，例如防腐劑，它可能對制劑總體有明顯的影響。因此優(yōu)選的制劑基本上包括生物活性化合物和生理上可接受的載體，例如水、乙醇、DMSO等等。然而，如果化合物是沒有溶劑的液體，所述制劑本質(zhì)上包括所述化合物本身。
大量的試驗可以根據(jù)不同的試劑濃度而同時實(shí)施，來獲得對于不同濃度的不同反應(yīng)。正如文中所知的，測定試劑的有效濃度典型的應(yīng)用濃度范圍是1∶10，或其他粗材測定，稀釋液。所述濃度如果需要，可進(jìn)一步用第二組稀釋液限定。典型的，這些濃度之一充當(dāng)陰性對照，例如零濃度或低于所述試劑發(fā)現(xiàn)的水平或處于或低于不產(chǎn)生表型可察覺變化的試劑濃度。
可以利用各種方法定量測試所選擇標(biāo)記物的存在。為了測定存在的分子的量，一種便利的方法就是用可檢測的部分標(biāo)記分子，可以是熒光的、發(fā)光的、放射性的、酶活性的等等，特別是一種對于高親合結(jié)合參數(shù)有特性的分子。熒光部分事實(shí)上容易用來標(biāo)記任何生物分子、結(jié)構(gòu)或細(xì)胞類型。免疫熒光部分可以指導(dǎo)結(jié)合的不光是特異的蛋白質(zhì)，也可以是特異的結(jié)構(gòu)、分裂產(chǎn)物或位點(diǎn)修飾，如磷酸化。單個肽和蛋白質(zhì)可以設(shè)計為自發(fā)熒光，例如通過表達(dá)它們?yōu)榧?xì)胞內(nèi)部綠色熒光的蛋白質(zhì)嵌合體(回顧見Jones等(1999)Trends Biotechnol.17(12)477-81)。因此，抗體可以被基因修飾而提供熒光染劑作為它們結(jié)構(gòu)的一部分。依賴所選的標(biāo)記物，可以應(yīng)用除熒光標(biāo)記物的方法測定參數(shù)，應(yīng)用例如免疫測定技術(shù)，如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，同種酶免疫測定和相關(guān)非-酶技術(shù)。核酸的數(shù)量，尤其是信使RNAs，也是有意義的參數(shù)。這些可以通過依賴核酸核苷酸序列的雜交技術(shù)測定。所述技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)，基因陣列技術(shù)。見分子生物學(xué)的現(xiàn)代議定書，Ausubel等編，John Wiley&Sons，紐約，NY，2000；Freeman等(1999)Biotechniques26(1)112-225；Kawamoto等(1999)Genome Res9(12)1305-12；和Chen等(1998)Genomics51(3)313-24。
實(shí)施例下面實(shí)施例的給出是為了向文中那些普通的技術(shù)人員提供如何進(jìn)行和應(yīng)用所試發(fā)明的完整揭示和描述，不是為了限制所述發(fā)明所認(rèn)定的范圍。已經(jīng)做了努力來保證所應(yīng)用數(shù)字的精確性(例如數(shù)量、溫度、濃度等等)但一些實(shí)驗錯誤和偏差是允許的。除非另外表明，部分是重量區(qū)分的，分子量是平均分子量，溫度是攝氏溫度；壓力是處于或接近大氣壓。
在這個說明書中引用的所有出版物和專利申請這里包含進(jìn)來做參考，好象每個單獨(dú)出版物或?qū)＠暾埵翘厥夂蛦为?dú)表明包含做參考。任何出版物的引用是為了在填寫日期前揭示它，不應(yīng)該認(rèn)為承認(rèn)所述發(fā)明沒有利用先前發(fā)明早于這樣出版物的權(quán)利。
已經(jīng)明白這項發(fā)明不限于所述的特定方法、協(xié)定、細(xì)胞系、動物種或類，這些都是可以變化的。同樣明白了這里應(yīng)用的術(shù)語僅僅是為了描述特定的實(shí)施方案，而不是為了限制所述發(fā)明的范圍，它的范圍只有被附屬的權(quán)利要求所限制。
如這里所應(yīng)用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“這種”包括復(fù)數(shù)對象除非上下文另外明確規(guī)定。因此，例如提及“一個細(xì)胞”就包括大量這樣的細(xì)胞，提及“蛋白質(zhì)”就包括一種或多種蛋白質(zhì)以及為文中的技術(shù)員所知的等價物，等等。這里所應(yīng)用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與所述發(fā)明的文中一個普通技術(shù)員通常明白的有相同意義，除非另外明確規(guī)定。
實(shí)施例1人類肝細(xì)胞流式細(xì)胞分選雙重激光流式細(xì)胞分析以及將人類肝細(xì)胞從胎兒和成年組織中分選出來在Becton Dickinson FACSVantage SE上實(shí)施。一種氬離子激光和氦氖激光應(yīng)用為主要和次要刺激源分別在488nm波長發(fā)射150mW，633nm波長發(fā)射30mW。前向光散射和直角被線形放大，并通過48nm帶通過濾器測定，在前向掃描檢測器前運(yùn)用0.6OD中性密度過濾器，為了衰減來自較大細(xì)胞群體的高水平前向角度散射信號。在這種裝置中，前向掃描軸上有足夠的動力范圍來捕獲和測量來自肝組織中發(fā)現(xiàn)的多種大小范圍細(xì)胞的前向角度散射信號，在單個線性十倍程中。典型的前向掃描放大器放大設(shè)置的范圍是8-16。FITC、PE和PI熒光色素在488nm處都被激發(fā)，分別應(yīng)用530/30、585/42、610/20nm帶通過濾器測定熒光發(fā)射。APC和APCCy7熒光素在633nm處被激發(fā)，并分別應(yīng)用660/20帶通和750長通過濾器測定熒光發(fā)射。所有的免疫熒光測定都用對數(shù)放大。
每個熒光通道的電壓設(shè)置應(yīng)用Spherotech RFP30-5參考粒子校準(zhǔn)。校準(zhǔn)后，應(yīng)用單色對照經(jīng)驗性的產(chǎn)生補(bǔ)償設(shè)置。
流式細(xì)胞儀上的流體學(xué)裝置的結(jié)構(gòu)為了肝衍生組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞獨(dú)特大小的分布和特征而最優(yōu)化。應(yīng)用一種傳統(tǒng)制造的口徑為130μm的油嘴以及一種10psi的鞘壓裝置。所述鞘儲器、樣品存放器和接受管架都通過冷卻回流器保持在4℃。
肝衍生細(xì)胞的培養(yǎng)亞群可以通過在細(xì)胞懸浮液中加入PI而確認(rèn)，對所述細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)，并分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)是前向掃描與PI熒光的繪圖?？筛鶕?jù)以下的特征溶解三種不同群體；表現(xiàn)為低前向掃描、低水平熒光(R1)的小細(xì)胞簇；表現(xiàn)為高前向掃描和中度熒光(R2)的大細(xì)胞簇，以及包含第三種不同簇的死亡細(xì)胞，這種簇帶有連續(xù)的低至中等水平的前向掃描信號和非常高水平的熒光。結(jié)果在圖1中顯示。所述R2亞群通過進(jìn)行如上所述的缺乏PI的分析證明了是自發(fā)熒光的?？筛鶕?jù)以下的特征溶解兩種不同群體；表現(xiàn)為低前向掃描、低水平熒光的小細(xì)胞簇；表現(xiàn)為高前向掃描和中度熒光的大細(xì)胞簇。
聚集物的區(qū)別是應(yīng)用脈沖處理，通過描繪前向掃描峰的高度對寬度，后者形成了第三區(qū)域的基礎(chǔ)。一種分選的門定義為這三個區(qū)域交叉點(diǎn)。所述靶群體的初步富集在第一輪分選中完成。所述富集產(chǎn)物然后再被分選為相關(guān)純度。產(chǎn)物的純度總是通過再分析而校驗。
實(shí)施例2肝祖細(xì)胞的分離先前冷凍的肝細(xì)胞或新近分離的肝細(xì)胞用5E12染色。所述細(xì)胞通過應(yīng)用5E12Ab的MACS柱富集5E12，然后分選5E12+的細(xì)胞。或者，5E12+的細(xì)胞在染色后直接分選。為了分選，細(xì)胞在R1和R2門之間分離。R2/5E12+細(xì)胞代表了體外或活體試驗中的大多數(shù)肝移植細(xì)胞。所述細(xì)胞的特征被描述為在相同的細(xì)胞中表達(dá)ck19和白蛋白(如圖2A和2B顯示)。除了5E12外，對于較低水平I型HLA表達(dá)的選擇為肝移植富集，應(yīng)用和人類I型HLA A、B、C起反應(yīng)的抗體(W6-32抗體)。當(dāng)門控R2細(xì)胞時，三種不同簇亞群的細(xì)胞可以通過分析5E12對比I型HLA的熒光，如二維密度或等值線圖而溶解(圖1)。一種亞群表現(xiàn)為5E12和HLA-I型HLA都是陰性染色(5E12-HLA-)；第二種亞群表現(xiàn)為較低相關(guān)水平的5E12熒光和較高水平的I型HLA熒光(5E12-HLA+)；以及一種第三亞群表現(xiàn)為較高水平的5E12熒光和較低水平的I型HLA熒光(5E12+HLA低)。
然而單染色分析，例如一種顏色，不必然提供明顯的群體差別，圖中明顯的是，在兩種顏色的圖中細(xì)胞分為不同的亞群。
結(jié)果提供一種方法來富集肝祖代群落，通過分選細(xì)胞表面的抗原表達(dá)。從分選的人類胎兒肝細(xì)胞促克隆形成試驗所得的結(jié)果通過生存能力(PI)、大小(FS)和自身熒光分選細(xì)胞，然后進(jìn)一步通過表面抗體分離，并用FFS或BMS-6平皿培養(yǎng)。在分選(ck19/白蛋白或僅僅ck19)后產(chǎn)生的所述肝群落的繁殖能力2周后在培養(yǎng)物中比較。只有R2門控的細(xì)胞(FS+PI低)產(chǎn)生群落。
所述5E12抗體富集人類胎兒和成年肝祖細(xì)胞。圖1舉例說明了用5E12單克聾抗體對人類胎兒肝細(xì)胞(16g.w.)染色。包括在R2門中的細(xì)胞用5E12或同型匹配的對照mAb染色。
表1和表2顯示了分選的5E12肝細(xì)胞限制性稀釋分析的結(jié)果。人類胎兒肝細(xì)胞應(yīng)用MACS柱富集為5E12陽性細(xì)胞。LR2、5E12陽性細(xì)胞在BMS-6基質(zhì)上的96孔培養(yǎng)皿中分選，每孔1-500細(xì)胞。通過ELISA監(jiān)測人類白蛋白的表達(dá)，為了檢測培養(yǎng)孔中祖細(xì)胞集落。
表1分選的5E12陽性細(xì)胞的限制性分析應(yīng)用ACDU分選的5E12+肝細(xì)胞和8種稀釋點(diǎn)(1、5、10、25、50、125、250、500細(xì)胞)進(jìn)行分析。在第7天、第14天、第21天和第28天通過ELISA檢測到了白蛋白陽性的孔。
實(shí)施例3肝移植細(xì)胞表型特征獲得人類胎兒肝細(xì)胞和成年肝細(xì)胞并維持在4℃。為了制造細(xì)胞懸浮液，將組織切碎，重新懸浮在Ca2+自由的緩沖鹽溶液中，在37℃透明質(zhì)酸酶存在的條件下用膠原酶消化30分鐘。任選的，所述細(xì)胞懸浮液另外在37℃用胰蛋白酶/EDTA消化20分鐘。所述細(xì)胞懸浮液通過70μm尼龍過濾器過濾并在包含2％FBS、2mM EDTA的IMDM中重懸浮。在試樣量的細(xì)胞中加入兩種或多種預(yù)先滴定過的抗體化合物，如圖3和4顯示。對所有染色利用同型匹配對照。如實(shí)施例1和實(shí)施例2所描述的通過流式細(xì)胞計數(shù)分析所述細(xì)胞。
數(shù)據(jù)(圖3A)顯示CD14不對LEC細(xì)胞染色(R2，5E12+HLA低)。CD54、CD38和CD34陽性沾染所述LEC(圖3B-3D)。圖4A、4D、4G顯示了LEC典型的染色式樣。圖4B、4E和4H顯示了E-鈣粘著蛋白、EpCam和CD49f與5E12相比在R2群體上有相似的染色形態(tài)。圖4C、4F和4I顯示了所述LEC群體選擇E-鈣粘著蛋白、EpCam或CD49f一律是5E12陽性的。這些數(shù)據(jù)證明5E12、E-鈣粘著蛋白、EpCam和CD49f可以在選擇LEC中交換應(yīng)用。
實(shí)施例4人類肝細(xì)胞的體外試驗肝細(xì)胞包括肝祖細(xì)胞顯示在應(yīng)用為飼養(yǎng)物的間質(zhì)細(xì)胞上生存和繁殖。這些細(xì)胞的體外培養(yǎng)可以使得從肝臟分離和評定祖細(xì)胞。兩種不同的飼養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞系應(yīng)用為飼養(yǎng)物，BMS-6，一種骨髓間質(zhì)系和FFS-1，一種胎兒成纖維細(xì)胞。這個試驗是以飼養(yǎng)細(xì)胞獨(dú)立的共培養(yǎng)系統(tǒng)和肝祖細(xì)胞的性質(zhì)為基礎(chǔ)的，后者應(yīng)該是帶有肝移植能力的高繁殖細(xì)胞。
材料和方法飼養(yǎng)層配制和培養(yǎng)環(huán)境FFS-1鼠成纖維細(xì)胞(來源于STO)用絲裂霉素處理5小時(10μg/ml，Sigma，St Louis，MO)并以5×104細(xì)胞/cm2平皿培養(yǎng)。BMS-6鼠骨髓間質(zhì)以1.6×104/cm2Y平皿培養(yǎng)。所述飼養(yǎng)層在1∶1的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基和含10％FCS的培養(yǎng)基-199混合物中培養(yǎng)。
應(yīng)用流式細(xì)胞計數(shù)分離富集的肝細(xì)胞成分應(yīng)用典型的組織消化步驟和單細(xì)胞懸浮液配制肝細(xì)胞制劑，并通過多-參數(shù)的流式細(xì)胞計數(shù)分析它。特異的肝細(xì)胞亞群分離是通過應(yīng)用熒光激活的細(xì)胞分選器而完成的，這種分選器(FACSTM)由BectonDickinson免疫細(xì)胞計數(shù)系統(tǒng)制造。特別的，F(xiàn)ACSVantage SE配置了氬、氪和氦-氖離子激光，它們提供了三種空間上分離的激發(fā)源。這個步驟使得我們可運(yùn)用很多商業(yè)上可利用的熒光探針來分析獨(dú)立的細(xì)胞特征。在這個儀器中配置特殊的亞系統(tǒng)使得可以將編號的單細(xì)胞沉積物直接加到先前用飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的組織培養(yǎng)皿單孔中。計算機(jī)輔助的高速數(shù)據(jù)獲得系統(tǒng)使得可從每個單一細(xì)胞收集到總共9個獨(dú)立的數(shù)據(jù)參數(shù)?？梢允占斜硇问降陌嘤谝话偃f事件數(shù)據(jù)文檔的能力使得可以方便的區(qū)分十分低頻率的亞群。數(shù)據(jù)參數(shù)以列表形式數(shù)據(jù)文檔收集并用軟件程序Flowjo(www.Treestar.com)分析。將純凈的肝細(xì)胞群體直接分選入先前用飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)過的96-孔或24-孔培養(yǎng)皿的單孔中。
冷凍細(xì)胞的規(guī)定在IMDM+10％FCS和40％FCS中的重懸浮肝細(xì)胞放在冰上5分鐘，然后以1∶1和IMDM+10％FCS和15％DMSO混合。然后在-80℃液態(tài)氮中冷凍細(xì)胞。
肝炎感染的規(guī)定帶有包含肝炎的人類血清的溫育肝細(xì)胞放在冰上一小時，然后將細(xì)胞放在間質(zhì)上平皿培養(yǎng)并培養(yǎng)細(xì)胞2周。
結(jié)果通過MACS或分選或兩者，將肝細(xì)胞群體分離進(jìn)入R2/5E12+對比R2/5E12-中。然后將所述細(xì)胞培養(yǎng)2周，并通過在正在形成的集落中的白蛋白和ck19的表達(dá)來評定CFC-LBC(形成細(xì)胞-肝多能集落的集落)，如圖8所示。所述肝集落頻率通過應(yīng)用3種不同細(xì)胞濃度的限制性稀釋液計算。數(shù)據(jù)在表3和圖8中顯示(人類成年肝細(xì)胞)。
限制性的稀釋試驗可以利用細(xì)胞分選和ELISA的聯(lián)合來測定限制性稀釋液。例如，細(xì)胞可根據(jù)R2門、5E12的表達(dá)和HLA抗原的表達(dá)分選。所述分選細(xì)胞如上所述稀釋入96孔的平皿中，并在體外培養(yǎng)14天，然后通過ELISA分析α-胎蛋白、白蛋白和α-1-抗胰蛋白酶的表達(dá)。
實(shí)施例5肝炎感染的體外模型為通過肝炎病毒體外感染肝集落提供一種方法。分離包含肝移植祖細(xì)胞的胎兒肝細(xì)胞(18g.w.)并用肝炎病毒D(HDV)感染，培養(yǎng)2周。將細(xì)胞培養(yǎng)2周，固定并對白蛋白(APC-藍(lán))、細(xì)胞角蛋白19(FITC-綠)和HDV(PE-紅)染色來識別被肝炎D病毒的肝祖細(xì)胞。用Hoechst對細(xì)胞核復(fù)染。
胎兒肝細(xì)胞和來自感染HDV病毒病人的血清一起溫育。1小時后，將所述樣品放在間質(zhì)上并離開2周。固定培養(yǎng)物并用肝和抗HDV標(biāo)記物對其染色。這些培養(yǎng)方法支持了感染肝炎病毒細(xì)胞的生長。
實(shí)施例6人類肝移植細(xì)胞群體的體外擴(kuò)增將已經(jīng)富集為具有HLA低5E12+表型的肝祖細(xì)胞的人類肝移植細(xì)胞平皿培養(yǎng)或在提供細(xì)胞黏附、粘連和繁殖的細(xì)胞外矩陣(ECM)中培養(yǎng)。所述細(xì)胞在聯(lián)合矩陣構(gòu)成層粘蛋白的合適基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時存在肝移植細(xì)胞(LEC)培養(yǎng)基。圖11顯示了細(xì)胞的形態(tài)。
肝移植細(xì)胞(LEC)培養(yǎng)基DMEM/F12(50∶50)和L-谷氨酰胺；10％胎牛血清；地塞米松(10-7M)；煙酰胺(10mM)；β-巰基乙醇(0.05mM)；青霉素/鏈霉素(1X)；重組人類肝細(xì)胞生長因子(40ng/ml)；重組人類表皮生長因子(20ng/ml)。
在體外擴(kuò)增的整個過程中，擴(kuò)增細(xì)胞的促克隆形成潛力在間質(zhì)共培養(yǎng)試驗中評定，如上面對于未培養(yǎng)肝細(xì)胞所描述的。所述分泌的肝蛋白質(zhì)，白蛋白、α-1抗胰蛋白酶或α-胎蛋白通過來自ECM加LEC培養(yǎng)基上或間質(zhì)共培養(yǎng)基中繁殖細(xì)胞的培養(yǎng)上清液的ELISA分析來監(jiān)測。
通過在ECM加LEC培養(yǎng)基上培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞的移植潛力可通過在多種合適動物模型中移植來評定，包括NOD-SCID小鼠或NOD-SCID/FAH小鼠。另外一種方法是誘導(dǎo)擴(kuò)增細(xì)胞的分化，作為一種提高改善肝移植或長時間肝細(xì)胞功能的方法。通過在ECM加LEC培養(yǎng)基上培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞可暴露于另外的生長因子、細(xì)胞活素或分化試劑來提高成熟肝細(xì)胞分化狀態(tài)。這種處理對于擴(kuò)增和分化細(xì)胞移植潛力的影響可以通過在上述動物模型中移植來評價。
實(shí)施例7人類肝移植細(xì)胞群體的移植人類肝細(xì)胞的移植和肝細(xì)胞分化潛力通過移植入NOD-SCID小鼠而評定。簡單的，將人類肝細(xì)胞重新懸浮在注射緩沖液中(50％Matrigel BD Biosciences#356234，50％DMEM)并在冰上培養(yǎng)直至注射。將注射緩沖液中總共20ml的細(xì)胞注射入新生0-48小時的NOD-SCID小鼠肝臟中。來自被注射小鼠的血清在移植5-6周后通過ELISA分析人類肝-特異性蛋白質(zhì)的存在(白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶，或α-胎蛋白)。圖6中，接受總肝細(xì)胞、分選總肝細(xì)胞或分選R2 5E12+HLA低細(xì)胞移植6周后的NOD-SCID小鼠血清中發(fā)現(xiàn)循環(huán)人類α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和白蛋白(ALB)。移植了10,000個分選R2 5E12+HLA低細(xì)胞的小鼠中AAT或ALB水平要比移植了75,000個未分選總肝細(xì)胞或10,000或40,000個分選總肝細(xì)胞小鼠中的高或相等。移植了分選R2 5E12+HLA低細(xì)胞的小鼠持續(xù)5個月重復(fù)發(fā)現(xiàn)人類AAT或ALB，表明了持久的移植和持續(xù)的肝分化。圖7顯示了在接受移植6周后的代表性NOD-SCID小鼠肝臟中的移植人類胎兒肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了人類ALB或CK19蛋白質(zhì)。在處死動物時由ELISA分析發(fā)現(xiàn)的人類AAT和ALB的血清水平在底部組中顯示。
權(quán)利要求
1.一種從肝組織分離的哺乳動物肝移植細(xì)胞的組合物，其特征在于，所述組合物中至少80％的細(xì)胞特征為R2，且選自5E12；Ep-Cam；CD49f；和E-鈣粘著蛋白以及HLA低的標(biāo)記呈陽性；所述組合物包含能夠生長為成熟肝細(xì)胞的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是CD117和CD14陰性的。
3.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾而包含外源DNA載體。
5.一種富集哺乳動物肝移植細(xì)胞組合物的方法，其中，所述組合物中至少80％的細(xì)胞特征為R2，且選自5E12；Ep-Cam；CD49f；和E-鈣粘著蛋白以及HLA低的標(biāo)記呈陽性，其特征在于，所述方法包括將特異性識別5E12、Ep-Cam、CD49f和E-鈣粘著蛋白的試劑和特異性識別I型HLA抗原的試劑及肝細(xì)胞樣品結(jié)合；選擇R2群體；選擇那些選自5E12；Ep-Cam；CD49f和E-鈣粘著蛋白的標(biāo)記呈陽性的細(xì)胞，選擇那些低陰性表達(dá)I型HLA抗原的細(xì)胞；以提供有肝移植活性的細(xì)胞富集群體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法還包括選擇陰性表達(dá)CD117和CD14的細(xì)胞的步驟。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。
8.一種為宿主動物提供功能性肝細(xì)胞和/或膽囊細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括將包含完全純凈的哺乳動物肝移植細(xì)胞組合物的細(xì)胞群體導(dǎo)入所述宿主動物，其中，所述組合物中至少80％的細(xì)胞特征為R2，且選自5E12；Ep-Cam；CD49f；和E-鈣粘著蛋白以及HLA低的標(biāo)記呈陽性。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞陰性表達(dá)CD117和CD14。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人類細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述功能性肝細(xì)胞分泌白蛋白或α-1-抗胰蛋白酶。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述功能性肝細(xì)胞分泌α-1-抗胰蛋白酶。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述功能性肝細(xì)胞分泌白蛋白。
14.如權(quán)利要求1所述的肝移植細(xì)胞組合物，其特征在于，所述細(xì)胞經(jīng)遺傳修飾而包含外源DNA載體。
15.一種體外細(xì)胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述培養(yǎng)物包含哺乳動物肝移植細(xì)胞，所述細(xì)胞特征為R2，且選自5E12；Ep-Cam；CD49f；和E-鈣粘著蛋白以及HLA低的標(biāo)記呈陽性，所述培養(yǎng)物帶有或不帶有飼養(yǎng)細(xì)胞層。
16.如權(quán)利要求15所述的體外培養(yǎng)物，其特征在于，所述哺乳動物肝移植細(xì)胞是人類細(xì)胞。
17.一種嵌合型免疫缺陷小鼠，F(xiàn)AH-/-小鼠或FAH-/-免疫缺陷小鼠，其特征在于，所述小鼠包括從完全純凈的哺乳動物肝移植細(xì)胞組合物產(chǎn)生的功能再生肝細(xì)胞和/或膽囊細(xì)胞，其中，所述組合物中至少80％的細(xì)胞特征為R2，且選自5E12；Ep-Cam；CD49f；和E-鈣粘著蛋白以及HLA低的標(biāo)記呈陽性。
18.如權(quán)利要求17所述的嵌合小鼠，其特征在于，所述哺乳動物的肝移植細(xì)胞是人類細(xì)胞。
19.一種篩選在哺乳動物肝移植細(xì)胞中特異性表達(dá)的遺傳序列的方法，其特征在于，所述方法包括從權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群體、權(quán)利要求15所述的體外細(xì)胞培養(yǎng)物或權(quán)利要求17所述的嵌合小鼠中分離出RNA，從所述RNA制造探針，篩選與所述探針雜交的核酸群體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述肝移植細(xì)胞和第二種不同細(xì)胞群體間比較所得雜交結(jié)果。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述核酸群體以陣列表現(xiàn)。
22.一種篩選影響哺乳動物肝移植細(xì)胞生存能力、生長、代謝功能或分化的方法，其特征在于，所述方法包括接觸如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群體，如權(quán)利要求15所述的體外細(xì)胞培養(yǎng)物或如權(quán)利要求17所述的嵌合小鼠，并測定所述試劑對所述肝移植細(xì)胞生存能力、生長、代謝功能或分化的影響。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是懷疑對人肝細(xì)胞有毒性的藥物。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是人類肝炎病毒。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是人類肝炎病毒疫苗。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述試劑是抗病毒試劑。
全文摘要
提供了充分濃縮的哺乳動物肝移植細(xì)胞群體。提供了分離和培養(yǎng)這種肝移植細(xì)胞的方法。從許多的來源獲得祖細(xì)胞，包括胎兒和成人組織。所述細(xì)胞在實(shí)驗評價移植中有用，并可作為譜系和細(xì)胞特異性產(chǎn)物的來源，包括對于確認(rèn)這些細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因有用的mRNA種型，以及作為發(fā)現(xiàn)可影響它們的因子或分子的目標(biāo)。
文檔編號C12N5/10GK1665920SQ02816528
公開日2005年9月7日 申請日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者E·拉加西, T·奧斯丁 申請人:干細(xì)胞股份有限公司