專利名稱：細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求保護(hù)2001年1月19日遞交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/262885的利益，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
已經(jīng)鑒定了相對(duì)于健康細(xì)胞而言在腫瘤細(xì)胞中進(jìn)行過量表達(dá)的各種各樣的基因。人們期望這樣的基因的鑒定將為抗癌藥物的研制和癌癥診斷提供藥靶。
概述本發(fā)明基于人類細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者中相對(duì)于正常相鄰組織該蛋白在肝細(xì)胞中過量表達(dá)。將該蛋白命名為肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白或HURP。全長人HURPcDNA(GenBank入藏號(hào)AB076695)顯示如下人HURPcDNA序列AGCAAACCAATCGCAAGCCTCGTTGAGTGGAAGGGGT -181GGGATCTTCCCCGGAAGTTTTGGTTAAAGCCCCTCCAATCAGCGGCTCGGTGCGGCAAGTTTGAATTTCGTGGAGGCTCGGGTTGTGAGG -91GTTCCTGCTTCGGAGTCGGCGGTGGTCGTCCAGACCGAGTGTTCTTTACTTTTTGTTTGGTTGAGGTTTCACGCTAGAAGGTGGCTCAGG -1ATGTCTTCATCACATTTTGCCAGTCGACACAGGAAGGATATAAGTACTGAAATGATTAGAACTAAAATTGCTCATAGGAAATCACTGTCT 901M S S S H F A S R H R K D I S T E M I R T K I A H R K S L SCAGAAAGAAAATAGACATAAGGAATACGAACGAAATAGACACTTTGGTTTGAAAGATGTAAACATTCCAACCTTGGAAGGTAGAATTCTT 18031 Q K E N R H K E Y E R N R H F G L K D V N I P T L E G R I LGTTGAATTAGATGAGACATCTCAAGAGCTTGTTCCAGAAAAGACCAATGTTAAGCCAAGGGCAATGAAAACTATTCTAGGTGATCAACGA 27061 V E L D E T S Q E L V P E K T N V K P R A M K T I L G D Q RaAACAGATGCTCCAAAAATACAAAGAAGAAAAGCAACTTCAAAAATTGAAAGAGCAGAGAGAGAAAGCTAAACGAGGAATATTTAAAGTG 36091 K Q M L Q K Y K E E K Q L Q K L K E Q R E K A K R G I F K VGGTCGTTATAGACCTGATATGCCTTGTTTTCTTTTATCAAACCAGAATGCTGTGAAAGCTGAGCCAAAAAAGGCTATTCCATCTTCTGTA 450121 G R Y R P D M P C F L L S N Q N A V K A E P K K A I P S S VCGGATTACAAGGTCAAAGGCCAAAGACCAAATGGAGCAGACTAAGATTGATAACGAGAGTGATGTTCGAGCAATCCGACCTGGTCCAAGA 540151 R I T R S K A K D Q M E Q T K I D N E S D V R A I R P G P RCAAACTTCTGAAAAGAAAGTGTCAGACAAAGAGAAAAAAGTTGTGCAGCCTGTAATGCCCACGTCGTTGAGAATGACTCGATCAGCTACT 630181 Q T S E K K V S D K E K K V V Q P V M P T S L R M T R S A T
CAAGCAGCAAAGCAGGTTCCCAGAACAGTCTCATCTACCACAGCAAGAAAGCCAGTCACAAGAGCTGCTAATGAAAACGAACCAGAAGGA 720211 Q A A K Q V P R T V S S T T A R K P V T R A A N E N E P E GAAGGTGCCAAGTAAAGGAAGACCTGCCAAAAATGTACAAACAAAACCCGACAAGGGTATTTCTTGTAAAGTCGATAGTGAAGAAAATACT 810241 K V P S K G R P A K N V E T K P D K G I S C K V D S E E N TTTGAATTCACAAACTAATGCAACAAGTGGAATGAATCCAGATGGAGTCTTATCAAAAATGGAAAACTTACCTGAGATAAATACTGCAAAA 900271 L N S Q T N A T S G M N P D G V L S K M E N L P E I N T A KATAAAAGGGAAGAATTCCTTCGCACCTAAGGATTTTATGTTTCAGCCACTGGATGGTCTGAAGACCTATCAAGTAACACCTATGACTCCC 990301 I K G K N S F A P K D F N F Q P L D G L K T Y Q V T P M T PAGAAGTGCCAATGCTTTTTTGACACCCAGTTACACCTGGACTCCTTTAAAAACAGAAGTTGATGAGTCTCAAGCAACAAAAGAAATTTTG 1080331 R S A N A F L T P S Y T W T P L K T E V D E S Q A T K E I LGCACAAAAATGTAAAACTTACTCTACCAAGACAATACAGCAAGATTCAAATAAATTGCCATGTCCTTTGGGTCCTCTAACTGTTTGGCAT 1170361 A Q K C K T Y S T K T I Q Q D S N K L P C P L G P L T V W 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EGGAATGGAACTGAATTCTTCAATTACATCACAGGATGTTTTGATGAGTAGCCCTCAAAAAAATACAGCTTCACAAAATAGCATCTTAGAA 2360751 G M E L N S S I T S Q D V L M S S P E K N T A S Q N S I L EGAAGGGGAAACTAAAATTTCTCAGTCAGAACTATTTGATAATAAAAGTCTCACTACTGAATGCCACCTTCTTGATTCACCAGGTCTAAAC 2430781 E G E T K I S Q S E L F D N K S L T T E C H L L D S P G L NTGCAGTAATCCATTTACTCAGCTGGAGAGGAGACATCAAGAACATGCCAGACACATTTCTTTTGGTGGTAACCTGATTACTTTTTCACCT 2520811 C S N P F T Q L E R R H Q E H A R H I S F G G N L I T F S PCTACAACCAGGAGAATTTTGA2541841L Q P G E F (SEQ ID NO4)ATTTAAAAATAAATCCAAACATTTTCCTTCATATTATCAATGCTTATATATTCCTTAGACTATTGAAATTTTGGAGAAAATGTATTTGTG 2631TTCACTTCTATAGCATATAATGTTTTAATATTCTGTGTTCATCAAAGTGTATTTTAGATATACTCTTTCTCAAGGGAAGTGGGGATATTT 2721TGTACATTTTCAACACAGAATAAAAAATGTACTGTGCCTTG (SEQ ID NO6)2762已經(jīng)克隆了鼠HURP基因。全長鼠HURP cDNA(GenBank入藏號(hào)AB076696)如下鼠HURP cDNA序列AGTTTATAGTGTGTCGCTGCGTCGCCTAGC-271GGGTTTACCGCCTCCCTCCTCCCCCTCGCCCTCCCGCTCCCAACCCTTTGCCTTCCAAACAATTTAAATGTCGCACAGAACCAACCTATC-181GCAAGCCTCGTTCGAGGGGAAGGGGCGGGAGCTTCCGGAAGTGTTGGCAAAAGTCCCTCCAATCAGCGGCTGGCAGCGGGAAATTTCAGT-91TCCGTGAAGGGTCGGTCCGGGAGTTCCTTCTGGGGATCGGTGGAGTTTTCTGTGTTGGGAAATTGTTGTGGATCCAGAAACTGCTTCAGG-1ATGCTGGTGTCACGTTTTGCCAGTCGGTTTCGGAAAGACTCGAGCACTGAGATGGTTAGAACCAACTTGGCTCATAGAAAGTCTCTGTCT901M L V S R F A S R F R K D S S T E M V R T N L A H R K S L SCAGAAGGAGAACAGACACAGGGTGTATGAGCGAAACAGACACTTCGGTTTGAAGGACGTCAACATTCCACTGGAAGGGCGAGAGCTTGGT18031 Q K E N R H R V Y E R N R H F G L K D V N I P L E G R E L GAATATACACGAGACATCGCAAGACCTCTCTCCAGAGAAGGCCAGCTCCAAAACAAGGTCAGTAAAAATGGTCCTGAGTGACCAACGGAAG27061 N I H E T S Q D L S P E K A S S K T R S V K M V L S D Q R KCAGCTCCTCCAGAAGTATAAGGAAGAAAAACAACTTCAAAAACTGAAAGAACAGCGAGAGAAAGCCAAACGTGGAGTGTTCAAAGTGGGT36091 Q L L Q K Y K E E K Q L Q K L K E Q R E K A K R G V F K V GCTCTATAGACCCGCTGCGCCTGGCTTTCTTGTCACAGACCAGAGGGGTGCGAAAGCTGAGCCAGAAAAGGCTTTTCCACATACTGGACGG450121 L Y R P A A P G F L V T D Q R G A K A E P E K A F P H T G RATTACAAGATCAAAGACCAAAGAATATATGGAGCAGACTAAGATTGGTAGCAGGAATGTTCCTAAAGCAACCCAGAGTGACCAAAGACAA540151 I T R S K T K E Y M E Q T K I G S R N V P K A T Q S D Q R QACTTCTGAAAAACAACCATTAGACAGAGAGAGAAAAGTTATGCAGCCTGTGCTGTTCACGTCAGGGAAAGGGACTGAATCAGCGGCTACT630181 T S E K Q P L D R E R K V M Q P V L P T S G K G T E S A A TCAGAGAGCCAAGCTGATGGCCCGAACAGTGTCATCCACTACAAGAAAGCCAGTCACAAGAGCCACGAATGAGAAAGGATCACAAAGAATG720211 Q R A K L M A R T V S S T T R K P V T R A T N E K G S E R MAGACCAAGTGGAGGGAGACCTGCCAAAAAACCAGAAGGCAAGCCGGACAAGGTCATTCCTTCCAAAGTTGAGCGGGACCAAAAGCATTTG810241 R P S G G R P A K K P E G K P D K V I P S K V E R D E K H LGATTCGCAGACCAGGGAAACAAGTGAAATGGGTCTGCTCGGAGTCTTCCGAGAAGTGGAAAGCTTGCCTCCAACAGCCCCTGCCCAAGGG900271 D S Q T R E T S E M G L L G V F R E V E S L P A T A P A Q 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2607AACCCTGTCTCGAAAAACCAAAATAAATAAATAAATAAATAAACAAACAAACAAACAAA (SEQ ID NO5) 2666
編碼人HURP蛋白的核苷酸序列(即SEQ ID NO6的ATG起始密碼子到緊接終止密碼子之前的密碼子)命名為SEQ ID NO3，編碼鼠HURP蛋白的核苷酸序列(即SEQ ID NO5的ATG起始密碼子到緊接終止密碼子之前的密碼子)命名為SEQ ID NO1。
本發(fā)明的特征為包括至少65％(例如至少70，75，80，85，90，95，98或100％)等同于SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的純化多肽。一旦在細(xì)胞中表達(dá)，該多肽加速G2/M的進(jìn)行并且促進(jìn)細(xì)胞存活。
“純化多肽”是沒有其他生物學(xué)大分子的多肽，例如它至少有干重量的75％(例如至少80，85，95或99％)的純度。采用合適的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如采用柱層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳，或HPLC分析可以測(cè)量純度。
利用如Karlin和Altschul修飾的Karlin和Altschul的算法(美國科學(xué)院年報(bào)905873-5877，1993)可以測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列的“等同百分?jǐn)?shù)”(美國科學(xué)院年報(bào)872264-2268，1990)。這樣的方法引入到Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(分子生物學(xué)雜志215403-410，1990)。用NBLAST程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，評(píng)分為100，字節(jié)長＝12。用XBLAST程序進(jìn)行BLAST蛋白檢索，評(píng)分為50，字節(jié)長＝3。兩個(gè)序列之間存在缺口，如Altschul等人描述進(jìn)行缺口的BLAST(核酸研究253389-3402，1997)。當(dāng)利用BLAST和有缺口的BLAST程序時(shí)，利用各個(gè)程序的默認(rèn)參數(shù)(例如XBLAST和NBLAST)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
一旦在細(xì)胞中表達(dá)，本發(fā)明多肽促進(jìn)G2/M進(jìn)行，即過量表達(dá)HURP的細(xì)胞具有較高的DNA合成，或在無血清培養(yǎng)基中，當(dāng)從有絲分裂抑制狀態(tài)釋放時(shí)，過量表達(dá)HUPR的細(xì)胞需要較少的時(shí)間從M階段發(fā)展到G1階段。按照下面實(shí)施例5的描述，測(cè)定HURP過量表達(dá)對(duì)G2/M進(jìn)行的加速。本發(fā)明多肽的表達(dá)也促進(jìn)細(xì)胞存活，即在補(bǔ)充了0.5％，1％，或2％血清的培養(yǎng)基，過量表達(dá)HURP的細(xì)胞以穩(wěn)定的速率生長，直到達(dá)到穩(wěn)定水平，而沒有過量表達(dá)HURP的細(xì)胞在初期之后不久停止增生，緩慢的生長。按照下面實(shí)施例6的描述，測(cè)定過量表達(dá)HURP對(duì)細(xì)胞存活的促進(jìn)。
本發(fā)明的多肽可用于產(chǎn)生特異地結(jié)合到HURP蛋白的抗體(單克隆或多克隆)。依次這些抗體可用于檢測(cè)HURP在組織和細(xì)胞的隔室的存在和分布。例如，通過測(cè)定HURP蛋白在細(xì)胞中分布，可將這樣的抗體用于測(cè)定細(xì)胞是否沒有分裂或是在G2/M階段?；蛘?，通過測(cè)定HURP蛋白在組織中是否過量表達(dá)將它們用于診斷生癌的組織(例如，肝癌組織)。
本發(fā)明的特征也在于編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸，和核酸的補(bǔ)體。本發(fā)明內(nèi)核酸的例子是在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(即在65℃，0.5×SSC雜交，接著在45℃，0.1×SSC洗滌)與SEQ ID NO1或3，或SEQ ID NO1或3的補(bǔ)體雜交的分離的核酸。這樣的核酸有至少15(例如，至少30，50，100，200，500，或1000)核苷酸長度。通過測(cè)定HURP mRNA是否在組織或細(xì)胞中過量表達(dá)可將本發(fā)明的核酸用于診斷癌(例如，肝癌)。在基于PCR的檢測(cè)方法中將該核酸用作為引物，或在核酸印跡法中用作為標(biāo)記的探針(例如，Northern印跡)。
“分離的核酸”是其結(jié)構(gòu)不完全相同于任何天然存在的核酸的或橫跨三個(gè)以上的獨(dú)立的基因的天然存在的基因組核酸的片段的核酸。因此術(shù)語包括例如(a)具有部分天然存在的基因組DNA分子的序列的DNA，其中序列的側(cè)面不是兩個(gè)編碼序列，該兩個(gè)編碼序列以生物體的基因組的部分分子為側(cè)面，其中該分子在該生物體天然存在；(b)以獲得的分子與天然存在的載體或基因組DNA不完全相同的方式，摻入到載體或摻入到原核生物或真核細(xì)胞的基因組DNA的核酸；(c)例如cDNA，基因組片段，由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段或限制性片段的單獨(dú)的分子；和(d)是雜合基因的一部分的重組核苷酸序列，即編碼融合蛋白的基因。特定地從該定義排除的是存在于不同的(i)DNA分子，(ii)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或(iii)細(xì)胞克隆的混合物中的核酸，例如在DNA文庫例如cDNA或基因組DNA文庫中存在的核酸。
另外，本發(fā)明的特征是(1)在細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄物，即在上面描述的高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1或3雜交的轉(zhuǎn)錄物I的方法，或(2)在細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄物，即與轉(zhuǎn)錄物I互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄物II的方法。當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)轉(zhuǎn)錄物I可作為與內(nèi)源的HURP mRNA結(jié)合的反義RNA以阻止其翻譯為功能蛋白。因此將該方法用于基因治療以治療癌(例如，肝癌)。轉(zhuǎn)錄物II編碼HURP蛋白，和當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，轉(zhuǎn)錄物II翻譯為HURP蛋白。因此，該方法可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽或用于治療具有與不足的HURP基因表達(dá)關(guān)聯(lián)的疾病的患者。
本發(fā)明進(jìn)一步的特征在于經(jīng)過將來自患者的測(cè)試樣品中HURP基因表達(dá)的水平與來自正常人的對(duì)照樣品的HURP基因表達(dá)的水平進(jìn)行比較而測(cè)定患者是否具有細(xì)胞增殖紊亂的診斷的方法。在測(cè)試樣品中較高的HURP基因表達(dá)水平顯示患者具有與HURP基因過量表達(dá)關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖紊亂，例如肝癌。在測(cè)試樣品中低的HURP基因表達(dá)水平顯示患者具有與HURP基因的不足的表達(dá)關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖紊亂。
本發(fā)明的特征還在于鑒定適用于治療細(xì)胞增殖紊亂的候選化合物的方法。例如，通過用各個(gè)化合物處理表達(dá)HURP基因的細(xì)胞，和檢測(cè)和比較測(cè)試化合物存在和缺乏時(shí)HURP基因表達(dá)水平可以篩選化合物文庫。抑制HURP基因表達(dá)的化合物是治療與HURP基因過量表達(dá)關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖，例如肝癌的候選物。加強(qiáng)HURP基因表達(dá)的化合物是用于治療與HURP基因的不足的表達(dá)關(guān)聯(lián)的細(xì)胞增殖的候選物。
本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方案列于下文的描述。根據(jù)說明書和權(quán)利要求書本發(fā)明的其他特征，目的和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。
詳細(xì)描述本發(fā)明涉及新的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白或HURP)和編碼該蛋白的核酸。如下文實(shí)施例1-2的描述已經(jīng)克隆人和小鼠HURPcDNAs。
相對(duì)正常的肝細(xì)胞，HURP是在肝癌細(xì)胞中過量表達(dá)。在正常的人組織，HURP mRNA僅僅在增生的正常組織亞群，例如在胸腺，結(jié)腸和睪丸中，但是不在肝臟中，以高的水平表達(dá)。如通過HURP mRNA在(1)在同步HeLa細(xì)胞，和(2)在部分的肝切除術(shù)之后再生鼠肝的G2/M時(shí)期中表達(dá)升高所闡明，在細(xì)胞周期中，HURP mRNA的內(nèi)源水平緊緊地受調(diào)節(jié)。除了差異表達(dá)，HURP蛋白的細(xì)胞分布依賴于細(xì)胞周期的時(shí)期而不同。免疫熒光法研究顯示，在細(xì)胞周期的分裂間期HURP定位于胞液，在有絲分裂時(shí)移動(dòng)到紡錘體極點(diǎn)。此外，在293T細(xì)胞中HURP的過量表達(dá)導(dǎo)致G2/M加快進(jìn)行和在低血清培養(yǎng)基中加強(qiáng)細(xì)胞生長。
上面的結(jié)果顯示(1)在細(xì)胞周期中HURP調(diào)節(jié)G2/M轉(zhuǎn)變(2)當(dāng)正常細(xì)胞受阻塞時(shí)，HURP的過量表達(dá)通過使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，并減少對(duì)細(xì)胞外的生長因子的依賴而導(dǎo)致惡性腫瘤，和(3)HURP表達(dá)或活性的抑制使癌細(xì)胞恢復(fù)到更正常表現(xiàn)型。因此HURP是新的癌基因和因此是新的癌藥物靶。HURP的用途本文描述的核酸分子，蛋白，蛋白同系物和抗體可用于一種或多種下面方法a)篩選分析；b)預(yù)測(cè)藥物(例如診斷分析，預(yù)后的分析，監(jiān)視臨床的試驗(yàn)，和遺傳藥理學(xué))；和c)治療方法(例如治療學(xué)的和預(yù)防性的)。
本發(fā)明的分離核酸分子可用于例如表達(dá)HURP蛋白(例如在基因治療應(yīng)用中借助于重組表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá))，以探測(cè)HURP mRNA(例如，在生物學(xué)的樣品)或在HURP基因中遺傳的改變，和調(diào)節(jié)HURP活性。HURP蛋白可用于治療特征為HURP底物的不足的或過多的產(chǎn)生或HURP抑制劑的產(chǎn)生的紊亂。此外，HURP蛋白可用于篩選天然存在的HURP底物，篩選調(diào)控HURP活性的藥物或化合物，以及治療特征為HURP蛋白不足的或過多的產(chǎn)生或HURP蛋白類型的產(chǎn)生的混亂，該HUPR蛋白類型與HURP野生型蛋白相比具有減少的、異常的或多余的活性(例如，在肝癌)。而且，本發(fā)明的抗-HURP抗體可用于檢測(cè)和分離HURP蛋白，調(diào)節(jié)HURP蛋白的生物可利用率，和調(diào)控HURP活性。
提供評(píng)價(jià)與本發(fā)明HURP多肽相互作用(例如結(jié)合)的能力的化合物的方法。該方法包括將本發(fā)明的HURP多肽與化合物接觸；和評(píng)價(jià)該化合物與本發(fā)明的HURP多肽相互作用，例如結(jié)合或形成復(fù)合物的能力。該方法可以在體外，例如在無細(xì)胞系統(tǒng)，或在體內(nèi)，例如在二個(gè)雜合的交互作用的隨機(jī)存取程序分析中進(jìn)行。該方法可用于鑒定與本發(fā)明HURP多肽相互作用的天然存在的分子。還可用于尋找本發(fā)明的HURP多肽的天然的或合成的抑制劑。(a)篩選測(cè)試本發(fā)明提供了用于鑒定調(diào)控劑，即與HURP蛋白結(jié)合的候選物或測(cè)試化合物或試劑(例如蛋白，肽，模擬肽，類胨，小分子，或其他藥物)的方法(本文也稱作為“篩選分析”)，這些調(diào)控劑對(duì)例如HURP表達(dá)或HURP活性具有刺激或抑制的作用，或?qū)鏗URP底物的表達(dá)或活性具有刺激或抑制的作用。如此鑒定的化合物可用于在治療的方案中調(diào)控靶基因產(chǎn)物的活性(例如HURP基因)以詳細(xì)說明靶基因產(chǎn)物的生物學(xué)的功能，或鑒定破裂正常的靶基因相互作用的化合物。
在一個(gè)具體方案中，本發(fā)明提供了用于篩選作為HURP蛋白或多肽或其生物學(xué)活性的部分的底物的候選物或測(cè)試化合物的分析。在另一個(gè)具體方案中，本發(fā)明提供了用于篩選與HURP蛋白或多肽或其生物學(xué)活性的部分結(jié)合或調(diào)控其活性的候選物或測(cè)試化合物的分析方法。
利用本領(lǐng)域已知的組合文庫方法，有很多的途徑獲得本發(fā)明的測(cè)試化合物，這些方法包括生物學(xué)的文庫；類胨文庫(具有肽功能的大分子文庫，但是有對(duì)酶的降解有抗性，但是沒有保留生物活性的新的非肽主鏈；參見，例如，Zuckermann，R.N.等人(1994)醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志372678-85)；在空間地可尋址的平行固相或溶液相文庫；需要反褶積的合成的文庫方法，“一個(gè)珠一個(gè)化合物”文庫方法，和使用親和層析法選擇的合成的文庫方法可以獲得本發(fā)明的測(cè)試化合物。將生物學(xué)文庫和類胨文庫途徑限制到肽文庫，而其他的四個(gè)途徑可應(yīng)用到肽，非肽寡聚物，或化合物的小分子文庫(Lam，K.S.(1997)抗癌藥物研究12145)。
在本領(lǐng)域可以找到用于分子文庫合成的方法實(shí)例，例如在DeWitt等人(1993)美國科學(xué)院年報(bào)906909；Erb等人(1994)美國科學(xué)院年報(bào)9111422；Zuckermann等人(1994).醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志372678；cho等人(1993)科學(xué)2611303；Carrell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.EngL 332059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和在Gallop等人(1994)醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志371233。
化合物文庫可以以溶液存在(例如，Houghten(1992)，Biotechniques 134124-21)，在珠子(Lam(1991)自然35482-84)，在芯片(Fodor(1993)自然364555-556)，細(xì)菌(Ladner，USP 5,223,409)，孢子(Ladner USP’409)，質(zhì)粒(Cull等人(1992)美國科學(xué)院年報(bào)891865-1869)，或在噬菌體(Scott和Smith(1990)科學(xué)249386-390；Devlin(1990)科學(xué)249404-406；Cwirla等人(1990)美國科學(xué)院年報(bào)876378-6382；Felici(1991)分子生物學(xué)雜志222301-310；Ladner見上文)。
在一個(gè)具體方案中，試驗(yàn)是基于細(xì)胞的分析，其中表達(dá)HURP蛋白或其生物學(xué)活性的部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)控HURP活性的能力。通過監(jiān)視例如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的細(xì)胞的定位，完成對(duì)調(diào)控HURP活性的測(cè)試化合物的能力的測(cè)定。細(xì)胞例如可以是哺乳動(dòng)物(例如人)來源。
還可以評(píng)價(jià)測(cè)試化合物調(diào)控HURP結(jié)合到化合物，例如HURP底物，或結(jié)合到HURP的能力?？梢酝ㄟ^將該化合物，例如底物，與放射性同位素或酶標(biāo)記物結(jié)合來完成，以便通過檢測(cè)復(fù)合物中標(biāo)記的化合物(例如底物)來測(cè)定化合物(例如底物)與HURP的結(jié)合?；蛘邔URP與放射性同位素或酶的標(biāo)記物偶合以監(jiān)視復(fù)合物中測(cè)試化合物調(diào)控HURP與HURP底物的結(jié)合的能力。例如將化合物(例如，HURP底物)直接地或間接地用125I，35S，14C，或3H標(biāo)記，并通過直接計(jì)數(shù)放射散發(fā)或通過閃爍計(jì)數(shù)探測(cè)放射性同位素?；蛘?，用辣根過氧化物酶，堿性的磷酸酶，或螢蟲素酶酶標(biāo)記該化合物，并通過測(cè)定適當(dāng)?shù)牡孜镛D(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物而檢測(cè)酶的標(biāo)記物。
可以評(píng)價(jià)化合物(例如，HURP底物)與有或沒有標(biāo)記的相互作用劑存在時(shí)與HURP相互作用的能力。例如微生理功能測(cè)定可用于檢測(cè)在化合物或HURP沒有標(biāo)記時(shí)化合物與HURP的相互作用(McConnell，H.M.等人(1992)科學(xué)2571906-1912)。例如本文使用過的，″微生理功能測(cè)定″(例如，細(xì)胞傳感器)是利用光可尋址的傳感器(LAPS)測(cè)量細(xì)胞使環(huán)境變酸的速率的分析儀器。酸化速率的變化可用作為化合物和HURP之間相互作用的指標(biāo)。
在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了無細(xì)胞的測(cè)試，其中對(duì)HURP蛋白或其生物學(xué)活性的一部分與試驗(yàn)的化合物接觸，對(duì)測(cè)試化合物與HURP蛋白或者其生物學(xué)活性部分結(jié)合的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。用于本發(fā)明的測(cè)試的HURP蛋白的優(yōu)選的生物學(xué)活性部分包括參與與非-HURP分子，例如具有高表面可能性評(píng)分的片段的相互作用的片段。
分離的蛋白(例如HURP蛋白，或者其生物學(xué)活性部分)的可溶的和/或膜結(jié)合的形式可應(yīng)用到本發(fā)明的無細(xì)胞分析評(píng)價(jià)中。當(dāng)?shù)鞍椎哪そY(jié)合形式被使用時(shí)，利用增溶劑也許合乎需要。這樣的增溶劑的例子包括類似n-辛基糖苷，n-十二基糖苷，n-十二基麥芽糖甙，辛酰-N-甲基葡糖酰胺，癸酰-N-甲基葡糖酰胺，Triton RX-100，Triton RX-114，ThesitR，Isotridecypoly(乙烯乙二醇醚)n，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基amminio]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)，3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基amminio)-2-氫氧基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS ○)，或者N-十二烷基N，N-二甲基-3-氨溶-1-丙烷磺酸鹽的非離子去污劑。
無細(xì)胞的分析評(píng)價(jià)涉及在一定的條件和在完全能夠允許2個(gè)組成部分相互作用和結(jié)合時(shí)制備靶基因蛋白和測(cè)試化合物的反應(yīng)混合物從而形成可以被去除和/或檢測(cè)的復(fù)合物。
另外，例如使用熒光管能量轉(zhuǎn)移(FET)還可以檢測(cè)兩個(gè)分子之間的相互作用(參見，例如，Lakowicz等人，美國專利號(hào)5,631,169；Stavrianopoulos，等人美國專利號(hào)4868103)。選擇在第一“供體”分子的熒光團(tuán)標(biāo)記，以便其發(fā)出的熒光的活力將按順序能發(fā)熒光的能量被第二“受體”分子的熒光標(biāo)記吸收，從而由于吸收的能量它能夠發(fā)熒光。或者，’供體’蛋白分子可簡單利用色氨酸殘基的天然的熒光能量。選擇發(fā)出不同波長光的標(biāo)記物，以便’受體’分子標(biāo)記物可以從“供體”區(qū)分。由于兩個(gè)標(biāo)記物之間的能量轉(zhuǎn)移的效率與分子之間間隔的距離相關(guān)，可以評(píng)價(jià)分子之間的空間關(guān)系。在兩個(gè)分子之間出現(xiàn)結(jié)合的情形下，該測(cè)試中“受體”分子發(fā)出的熒光應(yīng)該是最大。采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)熒光測(cè)量手段可以方便地測(cè)量結(jié)合的發(fā)生(例如，利用熒光測(cè)量計(jì))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，利用實(shí)際的時(shí)間生物分子的相互作用分析(BIA)測(cè)定HURP蛋白與靶分子結(jié)合的能力(參見，例如，Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)化學(xué)分析632338-2345和Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.BioL 5699-705)。沒有對(duì)任何相互作用劑(例如，BIAcore)進(jìn)行任何標(biāo)記，″表面胞質(zhì)團(tuán)諧振″或″BIA″檢測(cè)在實(shí)際的時(shí)間的生物特異性相互作用。在結(jié)合表面群體的改變(指明結(jié)合的發(fā)生)致使表面附近光的折射指數(shù)的改變(表面胞質(zhì)團(tuán)諧振(SPR)的光學(xué)現(xiàn)象)致使出現(xiàn)可用作為生物學(xué)分子之間的實(shí)際時(shí)間反應(yīng)的指標(biāo)的可檢測(cè)信號(hào)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案，靶基因產(chǎn)物或測(cè)試的底物被錨定到固相。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)可以測(cè)定固相上的靶基因產(chǎn)物/測(cè)試化合物的復(fù)合物。優(yōu)選的說，可以直接或間接用本文討論的可檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)錨定到固相表面的靶基因產(chǎn)物和測(cè)試化合物(沒有被錨定)進(jìn)行標(biāo)記。
使HURP，抗HURP的抗體或其靶分子固定以有助于將一個(gè)或兩個(gè)蛋白的復(fù)合的與未復(fù)合的形式分離，或者該分析評(píng)價(jià)適應(yīng)自動(dòng)操作也許合乎需要。在候選化合物存在和缺乏時(shí)，在適用于含有反應(yīng)劑的任何容器中可以完成測(cè)試化合物與HURP蛋白的結(jié)合，或HURP蛋白與靶分子的相互作用。這樣的容器的例子包括微滴板，測(cè)試管，和微離心管。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，提供了增加允許一個(gè)或多個(gè)蛋白結(jié)合到基質(zhì)的區(qū)域的融合蛋白。例如可以將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/HURP融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/融合蛋白吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma化學(xué)St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生出的微滴板，然后將它與測(cè)試化合物結(jié)合或與測(cè)試化合物和非吸附的靶蛋白或HURP蛋白之一結(jié)合，和將其混合物在有助于復(fù)合物形成的條件下保溫(例如，在生理?xiàng)l件下的鹽和pH的)。在保溫之后，將珠或微滴板洗滌以除掉任何未束縛的組成部分，固定到珠上的基質(zhì)。例如按照上面所述直接或間接測(cè)定復(fù)合物。或者從基質(zhì)解離復(fù)合物，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定HURP結(jié)合或活性水平。
將HURP蛋白或靶分子固定到基質(zhì)的其他技術(shù)包括使用生物素和鏈生抗生物素蛋白的耦合。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從生物素-NHS(N-氫氧基-琥珀酰亞胺)制備生物素化的HURP蛋白或靶分子(例如，生物素化試劑盒，Pierce化學(xué)品公司，Rockford，IL)，并且固定到鏈生抗生物素蛋白-包被的96孔平板的孔中(Pierce化學(xué)品公司)。
為了實(shí)施分析評(píng)價(jià)，非固定的組成部分加到包被的含有錨定的成分的表面。在反應(yīng)完成之后，除掉未反應(yīng)的成分(例如洗滌)以便形成的復(fù)合物保留在固體表面?？梢栽S多方式完成錨釘著固體表面的復(fù)合物的檢測(cè)。先前將非固定的成分預(yù)標(biāo)記，檢測(cè)固定在表面的標(biāo)記物顯示形成了復(fù)合物。而預(yù)先末將非固定的成分預(yù)標(biāo)記，可將間接標(biāo)記物用于檢測(cè)錨定到表面的復(fù)合物；例如利用特異于固定的成分的標(biāo)記的抗體(依次可利用標(biāo)記的抗Ig抗體直接或間接標(biāo)記抗體)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，利用與HURP蛋白或靶分子反應(yīng)的抗體進(jìn)行測(cè)試，但是不干擾HURP蛋白結(jié)合到其靶分子。這樣的抗體可以附著到平板的孔，和通過抗體耦合將未結(jié)合的靶或HURP蛋白誘捕于孔。除了上面描述的用于OST固定的復(fù)合物的那些，檢測(cè)這樣的復(fù)合物的方法包括利用與HURP蛋白或其靶分子反應(yīng)的抗體，以及酶聯(lián)測(cè)試方法免疫檢測(cè)該復(fù)合物，所述測(cè)試依賴于對(duì)與HURP蛋白或靶分子相關(guān)的酶活性的檢測(cè)?；蛘咴谝合噙M(jìn)行無細(xì)胞的測(cè)試。在這樣的測(cè)試中，采用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)成分分離，包括但不限于分級(jí)離心(參見，例如，Rivas，G.，和Minton，A.P.，(1993)生物化學(xué)科學(xué)趨勢(shì)18284-7)；層析(凝膠過濾層析，離子交換層析)；電泳(參見，例如，Ausubel，F(xiàn).等人，當(dāng)前的分子的生物學(xué)草案1999，3.Wiley紐約)；和免疫沉淀(參見，例如，Ausubel，F(xiàn).等人，(1999)當(dāng)前的分子生物學(xué).Wiley紐約)。這樣的樹脂和層析技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的(參見，例如Heegaard，N.H.，(1998)JMolRecognit 11141-8；Hage，D.S.，和Tweed，S.A.(1997)JChromatogr B Biomed Sci Appl.699499-525)。此外，也可以方便地利用熒光能量傳遞，如本文所述，以檢測(cè)沒有進(jìn)一步從溶液純化復(fù)合物時(shí)的結(jié)合。
在優(yōu)選的實(shí)施方案，測(cè)試分析包括將HURP蛋白或其生物學(xué)活性的部分與已知的化合物接觸，該化合物結(jié)合HURP以形成測(cè)試混合物，將測(cè)試混合物與測(cè)試化合物接觸，和測(cè)定測(cè)試化合物與HURP蛋白交互作用的能力，測(cè)定測(cè)試化合物與HURP蛋白交互作用的能力包括測(cè)定測(cè)試化合物優(yōu)先與HURP或其生物學(xué)活性的部分結(jié)合的能力，或與已知化合物相比調(diào)節(jié)靶分子的活性。
本發(fā)明的靶基因產(chǎn)物體內(nèi)可以與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或胞外大分子，例如蛋白交互作用。為了討論的目的，這樣細(xì)胞和胞外大分子本文稱作為“結(jié)合配體”。破壞這樣的交互作用的化合物可用于調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)物的活性。這樣的化合物包括，但是不限于分子如抗體，肽，和小分子。用于實(shí)施例的優(yōu)選的靶基因/產(chǎn)物是本文鑒定的HURP基因。在可選的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供了通過調(diào)節(jié)HURP靶分子下游的效應(yīng)基因的活性用于測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)HURP蛋白的活性的能力的方法。例如，可以測(cè)定效應(yīng)物分子對(duì)適當(dāng)?shù)陌械幕钚裕驕y(cè)定效應(yīng)物結(jié)合到適當(dāng)?shù)陌?，如前所述?br> 為了鑒定化合物是否干擾靶分子產(chǎn)物和其細(xì)胞或胞外結(jié)合配體之間的交互作用，在允許二個(gè)產(chǎn)物形成復(fù)合物的條件和足夠時(shí)間時(shí)，制備含有靶基因產(chǎn)物和結(jié)合配體反應(yīng)混合物。為了測(cè)試抑制劑，在存在和沒有測(cè)試化合物時(shí)提供反應(yīng)混合物。在反應(yīng)混合物中最初可以包括測(cè)試化合物，或在后來時(shí)間加入靶基因和它的細(xì)胞的或細(xì)胞外的結(jié)合配體。將對(duì)照反應(yīng)混合物在沒有測(cè)試化合物或有無效對(duì)照劑時(shí)孵育。然后探測(cè)靶基因產(chǎn)物和細(xì)胞的或細(xì)胞外的結(jié)合配體之間任何復(fù)合物的形成。對(duì)照反應(yīng)中，復(fù)合物的形成，但是包含測(cè)試化合物的反應(yīng)混合物不形成，顯示該化合物干擾了靶基因產(chǎn)物和相互作用的結(jié)合配體的交互作用。另外，含有測(cè)試化合物和正常的靶基因產(chǎn)物的反應(yīng)混合物內(nèi)復(fù)合物的形成也可以與含有測(cè)試化合物和突變型靶基因產(chǎn)物的反應(yīng)混合物內(nèi)復(fù)合物的形成相比較。在鑒定分裂突變體但是不是正常的靶基因產(chǎn)物的交互作用的化合物的情況下這種對(duì)比是重要的。
這些試驗(yàn)可以以異種的或同種的形式進(jìn)行。異種的試驗(yàn)涉及將靶基因產(chǎn)物和其結(jié)合配體錨定到固相，并且在反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨定到固相的復(fù)合物。在同種的試驗(yàn)，整個(gè)反應(yīng)在液相進(jìn)行。對(duì)任何一種途徑，可以變化加反應(yīng)物的次序以獲得待測(cè)試化合物的不同的信息。例如，通過在測(cè)試物質(zhì)存在下進(jìn)行反應(yīng)確定通過競爭干擾靶基因產(chǎn)物和結(jié)合配體之間的交互作用的測(cè)試化合物?；蛘咴趶?fù)合物已經(jīng)形成之后通過將測(cè)試化合物加到反應(yīng)混合物可以測(cè)試破壞預(yù)先形成的復(fù)合物的測(cè)試化合物，例如具有較高的從復(fù)合物替換組分之一的結(jié)合物質(zhì)的化合物。各種的形式簡單地描述如下。
在異種的試驗(yàn)系統(tǒng)中，將靶基因產(chǎn)物和相互作用的細(xì)胞的或細(xì)胞外的結(jié)合配體錨定到固體表面(例如，微滴板)，而直接地或間接地對(duì)非錨定的樣本進(jìn)行標(biāo)記。通過非共價(jià)的或共價(jià)的接合可以固定錨定的樣本?；蛘弑诲^定的特異于該樣本的固定的抗體可用于將該樣本錨定到固體表面。
為了進(jìn)行試驗(yàn)，將固定的樣本的配體暴露于用或沒有用測(cè)試化合物包被的表面。在反應(yīng)完成之后，去除未反應(yīng)的成分(例如，通過洗滌)，形成的復(fù)合物將保持固定在固體表面。非固定的樣本進(jìn)行預(yù)標(biāo)記，對(duì)固定到表面的標(biāo)記物檢測(cè)顯示形成了復(fù)合物。若對(duì)未固定的樣本不進(jìn)行預(yù)標(biāo)記，例如使用標(biāo)記的特異于最初的非固定的樣本的抗體的間接標(biāo)記物用于探測(cè)固定到表面的復(fù)合物。依次用例如標(biāo)記的抗-Ig抗體直接或間接對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記。依據(jù)加入的反應(yīng)組分的次序，可以探測(cè)抑制復(fù)合物形成或破壞預(yù)先形成的復(fù)合物的測(cè)試化合物。
或者，在測(cè)試化合物存在或缺乏時(shí)，在液相中進(jìn)行反應(yīng)，例如使用特異于結(jié)合成分之一的固定化抗體在溶液中錨定形成的復(fù)合物，和特異于其他的配體的標(biāo)記的抗體以探測(cè)錨定的復(fù)合物，將反應(yīng)產(chǎn)物與未反應(yīng)的組分分開，探測(cè)復(fù)合物。又，依據(jù)加入到液相的反應(yīng)物的次序，可以鑒定抑制復(fù)合物形成或破壞預(yù)先形成的復(fù)合物的測(cè)試化合物。
在可選的實(shí)施方案中，可以使用同種的試驗(yàn)。例如，制備靶基因產(chǎn)物和相互影響的細(xì)胞的或胞外的結(jié)合配體產(chǎn)物的預(yù)先形成的復(fù)合物以便對(duì)靶基因產(chǎn)物或其結(jié)合配體進(jìn)行標(biāo)記，但是由于復(fù)合物形成熄滅了標(biāo)記物產(chǎn)生的信號(hào)(參見，例如，美國專利號(hào)4,109,496利用該途徑進(jìn)行免疫測(cè)定)。和預(yù)先形成復(fù)合物的一個(gè)樣本競爭和替換的測(cè)試物質(zhì)的加入致使上面的背景產(chǎn)生信號(hào)。以這種方式可以鑒定破壞靶基因產(chǎn)物結(jié)合配體的測(cè)試物質(zhì)。
在另一個(gè)方面，可以以二個(gè)雜合分析方法或三個(gè)雜合分析方法將HURP蛋白用作為″餌蛋白″以鑒定其它蛋白，(參見，例如美國專利號(hào)5,283,317；Zervos等人(1993)細(xì)胞72223-232；Madura等人(1993)生物化學(xué)雜志26812046-12054；Bartel等人(1993)生物技術(shù)14920-924；Iwabuchi等人(1993)致癌基因81693-1696；和BrentWO94/l 0300)這些蛋白結(jié)合到或與HURP相互作用(″HURP-結(jié)合蛋白″或″HURP-bp″)和參與HURP活性。這樣的HURP-bps可以是HURP蛋白或HURP靶的活化劑或信號(hào)的抑制劑，如作為HURP-介導(dǎo)的信號(hào)形成途徑的下游元件。
二個(gè)雜合系統(tǒng)基于大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄因子的模塊化本性，這些因子由可分離的DNA-結(jié)合和活化區(qū)域組成。簡短地說，試驗(yàn)利用二個(gè)不同的DNA構(gòu)建體。在一個(gè)構(gòu)建體中，將編碼HURP蛋白的基因融合到編碼已知的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合區(qū)域的基因(例如，GAL-4)。在另一個(gè)構(gòu)建體中，將編碼未鑒定的蛋白的來自于DNA序列文庫的DNA序列(″捕食″或“樣品”)融合到編碼已知的轉(zhuǎn)錄因子的活化區(qū)域的基因。(或者將HURP蛋白融合到活化劑區(qū)域)。如果“餌”和″捕食″蛋白在體內(nèi)能夠相互作用形成HURP依賴性復(fù)合物，將轉(zhuǎn)錄因子的DNA-結(jié)合和活化區(qū)域促使緊密地接近。這種接近允許報(bào)道基因(例如，lacZ)的轉(zhuǎn)錄，可操作連接到對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)位點(diǎn)?？梢詸z濺報(bào)道基因的表達(dá)并且可以分離含有功能轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞集落并且用于獲得編碼與HURP蛋白相互作用的蛋白的克隆基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案，鑒定了HURP表達(dá)的調(diào)節(jié)子。例如將細(xì)胞或無細(xì)胞混合物與候選化合物接觸并且相對(duì)于無侯選化合物存在下的HURP mRNA或蛋白的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)HURP mRNA或蛋白的表達(dá)。當(dāng)HURP-mRNA或蛋白的表達(dá)在候選化合物存在下比沒有存在侯選化合物時(shí)更大時(shí)，則該候選化合物被鑒定為HURP mRNA或蛋白表達(dá)的刺激劑?；蛘撸?dāng)在候選化合物存在下比沒有存在侯選化合物時(shí)HURP mRNA或蛋白的表達(dá)更小(統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著小)時(shí)，則將該候選化合物確定為HURPmRNA或蛋白表達(dá)的抑制劑。采用上文描述的用于檢測(cè)HURP mRNA或蛋白的方法可以測(cè)定HURP mRNA或蛋白的表達(dá)水平。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了兩個(gè)或多個(gè)本文描述的測(cè)試方法的組合。例如，利用基于細(xì)胞的或無細(xì)胞的測(cè)試可以鑒定調(diào)節(jié)劑以及確定調(diào)節(jié)HURP蛋白在體內(nèi)例如在類似肝細(xì)胞癌的動(dòng)物模型的動(dòng)物中的活動(dòng)的能力。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及采用上面描述的篩選測(cè)試方法鑒定新的因子。因此，進(jìn)一步在合適的動(dòng)物模型中使用本文鑒定的因子(例如，HURP調(diào)節(jié)劑，反義HURP的核酸分子，特異于HURP-的抗體或結(jié)合HURP-的配體)以測(cè)定這樣的因子的功效，毒性，副作用或作用的機(jī)制，或治療的機(jī)制也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，由上面描述的篩選測(cè)試鑒定的新的因子用于治療例如肝臟癌。(b)HURP分子用作為替代標(biāo)記物本發(fā)明的HURP分子也可用于作為紊亂或疾病狀態(tài)的標(biāo)記物，作為疾病狀態(tài)的前體的標(biāo)記物，作為疾病狀態(tài)的預(yù)處理的標(biāo)記物，作為藥物活性的標(biāo)記物或作為患者的藥物遺傳概況的標(biāo)記物。利用本文描述的方法，可以對(duì)本發(fā)明的HURP分子的存在、缺乏和/或定量進(jìn)行檢測(cè)，并且可能在體內(nèi)與一個(gè)或多個(gè)生物學(xué)狀態(tài)有關(guān)。例如，本發(fā)明的HURP分子可用作為一個(gè)或多個(gè)紊亂或疾病狀態(tài)或?qū)е录膊〉臓顟B(tài)的替代標(biāo)記物。如本文所述，“替代標(biāo)記物”是與疾病或紊亂的存在或缺乏相關(guān)或與疾病或狀態(tài)(例如與肝腫瘤的存在或缺乏)的進(jìn)行相關(guān)的目的生化標(biāo)記物。這樣的標(biāo)記物的存在或定量不依賴于疾病。因此，這些標(biāo)記物可用于指明是否治療的特定的過程在減輕疾病或紊亂時(shí)有效。當(dāng)疾病狀態(tài)或紊亂存在或程度難于采用標(biāo)準(zhǔn)的方法評(píng)價(jià)時(shí)(例如早期腫瘤)，替代標(biāo)記物特別有用，或當(dāng)達(dá)到潛在的危險(xiǎn)性臨床目標(biāo)點(diǎn)之前期望對(duì)疾病的進(jìn)展進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)(例如利用膽固醇水平作為替代標(biāo)記物可以對(duì)心血管疾病進(jìn)行評(píng)價(jià)，利用HIV RNA水平作為替代標(biāo)記物進(jìn)行HIV感染的分析，最好是在冠狀動(dòng)脈愛梗塞或完全發(fā)展的AIDS的不需要的臨床缺陷加劇時(shí))，替代標(biāo)記物也是特別有用。在本領(lǐng)域內(nèi)替代標(biāo)記物的使用的例子包括Koomen等人描述的(2000)質(zhì)譜雜志35258-264；和James(1994)AIDS治療的新檔案209。
本發(fā)明的HURP分子也可用作為藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物。如本文描述，“藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物”是特異性地與藥物作用有關(guān)的目的生化標(biāo)記物。藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物的存在或定量與施用該藥物治療的疾病狀態(tài)或紊亂無關(guān)；因此標(biāo)記物的存在或定量表明藥物在患者內(nèi)的存在或活性。例如，藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物可以指明生物組織中藥物的濃度，因?yàn)樵摌?biāo)記物在該組織中的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄或不表達(dá)或不轉(zhuǎn)錄與該藥物水平相關(guān)。以該方式，采用藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物可以監(jiān)測(cè)藥物的分布或攝取。類似地，藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物的存在或定量與藥物的代謝產(chǎn)物的存在或定量相關(guān)，這樣標(biāo)記物的存在或定量是體內(nèi)藥物的相對(duì)破碎速率的指標(biāo)。藥物動(dòng)力學(xué)的標(biāo)記物特別可用于增加藥效檢測(cè)的敏感度，尤其以低的劑量給藥時(shí)。甚至小量的藥也完全能夠激活多輪標(biāo)記物(例如HURP標(biāo)記物)的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，擴(kuò)增的標(biāo)記物可以是比藥物本身更容易檢測(cè)到的量。而且由于標(biāo)記物本身獨(dú)特性，利用本文描述的方法，可以更容易地檢測(cè)標(biāo)記物，抗-HURP抗體可用于基于免疫的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)作為HURP蛋白標(biāo)記物，或HURP-特異性放射性標(biāo)記的探針可用于檢測(cè)HURP mRNA標(biāo)記物。此外，由于藥物治療超過了可能的直接觀測(cè)結(jié)果的范圍，藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物的使用可以提供基于機(jī)理的危險(xiǎn)預(yù)言。本領(lǐng)域使用的藥物動(dòng)力學(xué)標(biāo)記物的例子是在Matsuda等人，美國專利6,033,862；Hattis等人(1991)Env.Health Perspect.90229-238；Schentag(1999)Am.J Health-Syst.Pharm.56增刊 3S21-S24；和Nicolau(1999)Am，J Health-Syst.Pharm.56增刊 3S16-S20。
本發(fā)明的HURP分子可以作為藥物遺傳標(biāo)記物。如本文使用，″藥物遺傳標(biāo)記物″是與特異性臨床藥物應(yīng)答相關(guān)或患者敏感的實(shí)用生化標(biāo)記物(參見，例如McLeod等人(1999)歐洲癌癥雜志351650-1652)。藥物遺傳的標(biāo)記物的存在或定量與給藥之前患者對(duì)特定的一種藥物或一類藥物的預(yù)測(cè)的應(yīng)答相關(guān)。通過在患者中，對(duì)一個(gè)或多個(gè)藥物遺傳的標(biāo)記物的存在或定量的評(píng)價(jià)，可以選擇最適用于該患者、或預(yù)測(cè)具有更大程度的成功的藥物治療。例如，基于患者對(duì)特異性腫瘤標(biāo)記物的RNA，或蛋白的存在或定量(例如，HURP蛋白或RNA)，可以選擇最適合治療似乎存在患者的特異性腫瘤的治療的藥物或過程。類似地，HURP DNA中存在或缺乏特異性序列突變可以與HURP藥物應(yīng)答相關(guān)。因此藥物遺傳標(biāo)記物的使用允許對(duì)每個(gè)沒有進(jìn)行治療的患者使用最合適的治療。
(C)藥物遺傳學(xué)如由本文描述的篩選方法鑒定的本發(fā)明的HURP分子，以及因子或?qū)URP活性(例如，HURP基因表達(dá))具有刺激或抑制作用的調(diào)節(jié)劑可用于對(duì)個(gè)體給藥以治療(預(yù)防或治療)與畸變的或多余的HURP活力相關(guān)的HURP相關(guān)的紊亂(例如，肝癌)。與這樣的治療相結(jié)合，也考慮藥物遺傳學(xué)(即，研究個(gè)人遺傳型和對(duì)外來化合物或藥物的應(yīng)答之間的關(guān)系)。關(guān)于疾病的新陳代謝的不同，通過改變藥物學(xué)活性藥物的劑量和血液濃度之間的關(guān)系而導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性或治療的失敗。因此，醫(yī)師或臨床醫(yī)生可以認(rèn)為在決定是否以HURP分子或HURP調(diào)節(jié)劑給藥，以及制作用HURP分子和HURP調(diào)節(jié)劑治療的劑量和治療方式時(shí)可以應(yīng)用在相關(guān)藥物遺傳學(xué)研究獲得的知識(shí)。
由于改變了受影響的人中藥物沉淀和異常功能，藥物遺傳學(xué)處理對(duì)藥物應(yīng)答的臨床顯著遺傳的變異。參見，例如，Biehelbaum，M.等人(1996)藥物生理學(xué)的臨床試驗(yàn)23983-985和Linder，M.W等人(1997)臨床化學(xué)43254-266。通常，可以分為兩種類型的藥物遺傳的狀況。作為改變藥物作用于身體的途徑(改變藥物的作用)的單個(gè)因子傳遞的遺傳條件，或作為改變身體作用于藥物的途徑(改變藥物代謝)的單個(gè)因子傳遞的遺傳條件。由于罕有的遺傳缺陷或天然存在的多態(tài)性可以出現(xiàn)這些藥物遺傳學(xué)的狀況。例如，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的缺陷(G6PD)是共同的固有的酶病，其中在攝取氧化藥物(抗-瘧疾的，磺胺藥物，止痛劑，nitroflirans)和吃蠶豆之后主要的臨床復(fù)雜情況是溶血。
鑒定預(yù)測(cè)藥物應(yīng)答的藥物遺傳學(xué)途徑，已知為″基因組-廣泛的相關(guān)″主要地依賴于人基因組的高圖形分辨率結(jié)構(gòu)圖，由已經(jīng)已知的基因相關(guān)標(biāo)記物組成(例如，″二-等位的’基因標(biāo)記物圖，由人基因組的60,000-100,000多態(tài)性或可變的位點(diǎn)組成，各個(gè)具有兩個(gè)變異)。這樣的高圖形分辨率遺傳結(jié)構(gòu)圖可以與參加階段II/III藥物試驗(yàn)以鑒定與特定的藥物應(yīng)答或副作用相關(guān)標(biāo)記物的各個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著量的患者基因組的圖相對(duì)比?；蛘?，可以從人基因組中千萬已知的單個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNP)的結(jié)合可以產(chǎn)生這樣高的圖形分辨率遺傳結(jié)構(gòu)圖。如本文所述，″SNP″是發(fā)生在DNA整個(gè)長度中的單核苷酸堿基的共同的改變。例如DNA的每1000個(gè)堿基可以出現(xiàn)SNP一次。SNP參與疾病的過程，但是大量的SNP大多與疾病不相關(guān)?；谶@樣的SNP的出現(xiàn)給出遺傳圖，依據(jù)個(gè)體基因組的特定的SNP模式可以將個(gè)體分組為遺傳目錄。以這樣的方式，考慮這樣的遺傳類似的個(gè)體共同的特性，將治療模式制作為遺傳類似的個(gè)體的組。
或者，將稱作為″侯選基因途徑″的方法用于鑒定預(yù)知藥物應(yīng)答的基因。根據(jù)該方法，如果編碼藥物靶的基因是已知(例如，本發(fā)明的HURP蛋白)，在群體中相當(dāng)易于鑒定基因的所有共同的變異，可以測(cè)定一個(gè)基因相對(duì)另一個(gè)基因的變異是否與特定的藥物應(yīng)答相關(guān)。
或者，稱作為″基因表達(dá)譜圖″的方法可用于鑒定預(yù)知藥物應(yīng)答的基因。例如，給藥(例如，本發(fā)明的HURP分子或HURP調(diào)節(jié)劑)的動(dòng)物的基因表達(dá)可指示是否涉及毒性的基因途徑已經(jīng)開啟。
從上面一個(gè)以上的藥物遺傳學(xué)途徑產(chǎn)生的信息可用于決定合適的劑量和治療方式以預(yù)防或治療個(gè)體。當(dāng)用于決定劑量或藥物選擇時(shí)，這些知識(shí)可以避免毒副作用或治療失敗，因此當(dāng)用HURP分子或HURP調(diào)節(jié)劑，例如由本文描述的列舉的篩選測(cè)試之一鑒定的調(diào)節(jié)劑治療患者時(shí)加強(qiáng)了治療或預(yù)防效率。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了鑒定新的因子或其結(jié)合物的方法，該方法基于鑒定調(diào)節(jié)由一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的基因編碼的一個(gè)或多個(gè)基因產(chǎn)物的活性的因子，而這些產(chǎn)物與細(xì)胞對(duì)治療劑的抗性相關(guān)。特定地說，由本發(fā)明的HURP基因編碼的蛋白的活性可用作為鑒定克服基因抗性的因子的基礎(chǔ)。通過阻止一個(gè)或多個(gè)抗性蛋白的活性，靶細(xì)胞例如人細(xì)胞將變得對(duì)該因子的處理敏感，該因子是未修飾靶細(xì)胞抵抗的因子。
檢測(cè)因子(例如，藥物)對(duì)HURP蛋白的表達(dá)和活性的影響可用于臨床試驗(yàn)。例如，通過本文描述的篩選測(cè)試測(cè)定的的作用可提高HURP基因表達(dá)，蛋白水平、HURP活性的因子，可用于監(jiān)測(cè)在顯示降低的HURP基因表達(dá)，蛋白水平或HURP活性的患者的臨床試驗(yàn)。或者，由降低HURP基因表達(dá)，蛋白水平或HURP活性的患者的篩選試驗(yàn)中測(cè)定的因子的作用可以用于在臨床試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)升高的HURP基因表達(dá)，蛋白水平或活性。在這樣的臨床試驗(yàn)中，在例如HURP相關(guān)紊亂中暗示的HURP基因，和優(yōu)選的是其他基因的表達(dá)或活性可用作為特定細(xì)胞的表現(xiàn)型的″讀取″或標(biāo)記物。
沒有進(jìn)一步的說明，相信本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于上面公開的內(nèi)容和下面的例子，利用本發(fā)明到最全面的程度。下面的例子僅僅用于說明本領(lǐng)域的技術(shù)人員怎樣分離和使用本發(fā)明的多肽和核酸，并且不以任何方式限制。本文記載的所有出版物引入本文作為參考。
序列表<110>國立陽明大學(xué)<120>細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白<130>PI021536<150>60/262,885<151>2001-01-19<160>6<170>FastSEQ for windows Version 4.0<210>1<211>2424<212>DNA<213>Mus musculus<400>1atgctggtgt cacgttttgc cagtcggttt cggaaagact cgagcactga gatggttaga 60accaacttgg ctcatagaaa gtctctgtct cagaaggaga acagacacag ggtgtatgag 120cgaaacagac acttcggttt gaaggacgtc aacattccac tggaagggcg agagcttggt 180aatatacacg agacatcgca agacctctct ccagagaagg ccagctccaa aacaaggtca 240gtaaaaatgg tcctgagtga ccaacggaag cagctcctcc agaagtataa ggaagaaaaa 300caacttcaaa aactgaaaga acagcgagag aaagccaaac gtggagtgtt caaagtgggt 360ctctatagac ccgctgcgcc tggctttctt gtcacagacc agaggggtgc gaaagctgag 420ccagaaaagg cttttccaca tactggacgg attacaagat caaagaccaa agaatatatg 480gagcagacta agattggtag caggaatgtt cctaaagcaa cccagagtga ccaaagacaa 540acttctgaaa aacaaccatt agacagagag agaaaagtta tgcagcctgt gctgttcacg 600tcagggaaag ggactgaatc agcggctact cagagagcca agctgatggc ccgaacagtg 660tcatccacta caagaaagcc agtcacaaga gccacgaatg agaaaggatc 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530 535 540gat gac gac gga cga gcg gca gct agg agt cgc ctt gct gcc ata aag 1980Asp Asp Asp Gly Arg Ala Ala Ala Arg Ser Arg Leu Ala Ala Ile Lys545 550 555560aat gca atg aaa ggc agg cca cag cag gaa gtg cag gcc cac gca gca 2028Asn Ala Met Lys Gly Arg Pro Gln Gln Glu Val Gln Ala His Ala Ala565 570 575gct ccg gag acc aca aag gaa gtt gac aaa ata gtg ttt gac gct ggg 2076Ala Pro Glu Thr Thr Lys Glu Val Asp Lys Ile Val Phe Asp Ala Gly580 585 590ttt ttc aga atc gag agc cca gtg aag tca ttc tca gtc ctg tct tct 2124Phe Phe Arg Ile Glu Ser Pro Val Lys Ser Phe Ser Val Leu Ser Ser595 600 605gaa cgt cgt tct caa aga ttt gga aca cct ctg tct gcc agc aaa gtt 2172Glu Arg Arg Ser Gln Arg Phe Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Lys Val610 615 620gtg cct gag ggc agg gct gca ggg gac ctt ctg aga cag aag atg cca 2220Val Pro Glu Gly Arg Ala Ala Gly Asp Leu Leu Arg Gln Lys Met Pro625 630 635 640ctg aag aag ccg gac cct cag agc agc aag agt gag cat gtt gat cgg 2268Leu Lys Lys Pro Asp Pro Gln Ser Ser Lys Ser Glu His Val Asp Arg645 650 655acg ttt tca gat ggt ctt gaa agc agg tgc cac gta gaa gac acc ccc 2316Thr Phe Ser Asp Gly Leu Glu Ser Arg Cys His Val Glu Asp Thr Pro660 665 670tgt cct gga gag caa gat tca agt gac ata gag cat gat gta aat aaa 2364Cys Pro Gly Glu Gln Asp Ser Ser Asp Ile Glu His Asp Val Asn Lys675 680 685ata aat gtc aag atg gat tgt ttc tct gtt gaa acg aat ttg cct ctt 2412Ile Asn Val Lys Met Asp Cys Phe Ser Val Glu Thr Asn Leu Pro Leu690 695 700cct gct ggt gat gct aat acc aat caa aaa gaa gca atc tca gcc gtg 2460Pro Ala Gly Asp Ala Asn Thr Asn Gln Lys Glu Ala Ile Ser Ala Val705 710 715 720gaa gga gcg agc act gca gtc acc tcc cag gat ttg ctg atg agc aac 2508Glu Gly Ala Ser Thr Ala Val Thr Ser Gln Asp Leu Leu Met Ser Asn725 730 735cct gag aca aat acc tcc tca cag agc aac acc tca caa gaa gaa gct 2556Pro Glu Thr Asn Thr Ser Ser Gln Ser Asn Thr Ser Gln Glu Glu Ala740 745 750gag gcg tcg cag tca gta ctg tta cat aaa agt ctc act tct gaa tgc 2604Glu Ala Ser Gln Ser Val Leu Leu His Lys Ser Leu Thr Ser Glu Cys755 760 765cac ctt ctt gaa cca cca ggc ctc agc tgc acc agc ccc tgc act cgg 2652His Leu Leu Glu Pro Pro Gly Leu Ser Cys Thr Ser Pro Cys Thr Arg770 775 780gag gag acc aga cag cca gat cgc agc aga cag ttc tcc ttt gga ggt 2700Glu Glu Thr Arg Gln Pro Asp Arg Ser Arg Gln Phe Ser Phe Gly Gly785 790 795 800gac ctc att ctc ttc tca cca cta tgaccctgaa gggaacacca ggagggcttt 2754Asp Leu Ile Leu Phe Ser Pro Leu805aaatttaaca tgacttttaa tattaattta aataaacatt cagtgctcgc ctttaatccc2814agcactccgg gaggtagagg caggcggatt tctgagttcg aggccagcct ggtctacaga2874gtgagttcca ggacagccag gactatacag agaaaccctg tctcgaaaaa ccaaaataaa2934taaataaata aataaacaaa caaacaaaca aa 2966<210>6<211>2979<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(218)...(2755)<400>6agcaaaccaa tcgcaagcct cgttgagtgg aaggggtggg atcttccccg gaagttttgg60ttaaagcccc tccaatcagc ggctcggtgc ggcaagtttg aatttcgtgg aggctcgggt120tgtgagggtt cctgcttcgg agtcggcggt ggtcgtccag accgagtgtt ctttactttt180tgtttggttg aggtttcacg ctagaaggtg gctcagg atg tct tca tca cat ttt 235Met Ser Ser Ser His Phe15gcc agt cga cac agg aag gat ata agt act gaa atg att aga act aaa 283Ala Ser Arg His Arg Lys Asp Ile Ser Thr Glu Met Ile Arg Thr Lys10 15 20att gct cat agg aaa tca ctg tct cag aaa gaa aat aga cat aag gaa 331Ile Ala His Arg Lys Ser Leu Ser Gln Lys Glu Asn Arg His Lys Glu25 30 35tac gaa cga aat aga cac ttt ggt ttg aaa gat gta aac att cca acc 379Tyr Glu Arg Asn Arg His Phe Gly Leu Lys Asp Val Asn Ile Pro Thr40 45 50ttg gaa ggt aga att ctt gtt gaa tta gat gag aca tct caa gag ctt 427Leu Glu Gly Arg Ile Leu Val Glu Leu Asp Glu Thr Ser Gln Glu Leu55 60 65 70gtt cca gaa aag acc aat gtt aag cca agg gca atg aaa act att cta 475Val Pro Glu Lys Thr Asn Val Lys Pro Arg Ala Met Lys Thr Ile Leu75 80 85ggt gat caa cga aaa cag atg ctc caa aaa tac aaa gaa gaa aag caa 523Gly Asp Gln Arg Lys Gln Met Leu Gln Lys Tyr Lys Glu Glu Lys Gln90 95 100ctt caa aaa ttg aaa gag cag aga gag aaa gct aaa cga gga ata ttt 571Leu Gln Lys Leu Lys Glu Gln Arg Glu Lys Ala Lys Arg Gly Ile Phe105 110 115aaa gtg ggt cgt tat aga cct gat atg cct tgt ttt ctt tta tca aac 619Lys Val Gly Arg Tyr Arg Pro Asp Met Pro Cys Phe Leu Leu Ser Asn
120 125 130cag aat gct gtg aaa gct gag cca aaa aag gct att cca tct tct gta 667Gln Asn Ala Val Lys Ala Glu Pro Lys Lys Ala Ile Pro Ser Ser Val135 140 145 150cgg att aca agg tca aag gcc aaa gac caa atg gag cag act aag att 715Arg Ile Thr Arg Ser Lys Ala Lys Asp Gln Met Glu Gln Thr Lys Ile155 160 165gat aac gag agt gat gtt cga gca atc cga cct ggt cca aga caa act 763Asp Asn Glu Ser Asp Val Arg Ala Ile Arg Pro Gly Pro Arg Gln Thr170 175 180tct gaa aag aaa gtg tca gac aaa gag aaa aaa gtt gtg cag cct gta 811Ser Glu Lys Lys Val Ser Asp Lys Glu Lys Lys Val Val Gln Pro Val185 190 195atg ccc acg tcg ttg aga atg act cga tca gct act caa gca gca aag 859Met Pro Thr Ser Leu Arg Met Thr Arg Ser Ala Thr Gln Ala Ala Lys200 205 210cag gtt ccc aga aca gtc tca tct acc aca gca aga aag cca gtc aca 907Gln Val Pro Arg Thr Val Ser Ser Thr Thr Ala Arg Lys Pro Val Thr215 220 225 230aga gct gct aat gaa aac gaa cca gaa gga aag gtg cca agt aaa gga 955Arg Ala Ala Asn Glu Asn Glu Pro Glu Gly Lys Val Pro Ser Lys Gly235 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權(quán)利要求
1.純多肽，包含至少65％完全相同于SEQ D NO2或4的氨基酸序列，其中一旦在細(xì)胞過量表達(dá)，該多肽加速G2/M前進(jìn)和促進(jìn)細(xì)胞存活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中其氨基酸序列至少70％相同于SEQ ID NO4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其中氨基酸序列至少80％相同于SEQID NO4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其中氨基酸序列至少90％相同于SEQ IDNO4。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽，其中氨基酸序列是SEQ ID NO4。
6.編碼權(quán)利要求1的多肽或其互補(bǔ)序列的分離的核酸。
7.編碼權(quán)利要求2的多肽或其互補(bǔ)序列的分離的核酸。
8.編碼權(quán)利要求3的多肽或其互補(bǔ)序列的分離的核酸。
9.編碼權(quán)利要求4的多肽或其互補(bǔ)序列的分離的核酸。
10.編碼權(quán)利要求5的多肽或其互補(bǔ)序列的分離的核酸。
11.與權(quán)利要求1的多肽選擇性結(jié)合的抗體。
12.與權(quán)利要求2的多肽選擇性結(jié)合的抗體。
13.與權(quán)利要求3的多肽選擇性結(jié)合的抗體。
14.與權(quán)利要求4的多肽選擇性結(jié)合的抗體。
15.與權(quán)利要求5的多肽選擇性結(jié)合的抗體。
16.在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1或3，或其互補(bǔ)序列雜交的分離的核酸。
17.在細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄物的方法，該方法包括將一個(gè)含有編碼轉(zhuǎn)錄物的核酸的載體導(dǎo)入到細(xì)胞；和在細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄物；其中在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下該轉(zhuǎn)錄物與SEQ ID NO1或3，或其互補(bǔ)序列雜交。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中該轉(zhuǎn)錄物編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
19.測(cè)定患者是否具有細(xì)胞增殖紊亂的方法，該方法包括提供了來自于具有細(xì)胞增殖紊亂的患者的測(cè)試樣品，和在測(cè)試樣品中檢測(cè)肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)，其中在測(cè)試樣品中肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)的水平不同于來自于正常人的對(duì)照樣品的肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)的水平，說明患者具有細(xì)胞增殖紊亂。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在測(cè)試樣品中肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)的水平高于對(duì)照樣品的肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)的水平。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中細(xì)胞增殖紊亂是癌癥。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中癌癥是肝細(xì)胞癌或子宮頸癌。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在測(cè)試樣品中肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)的水平低于對(duì)照樣品的肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)的水平。
24.鑒定可用于治療細(xì)胞增殖紊亂的侯選化合物的方法，該方法包括在測(cè)試化合物存在下檢測(cè)肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)，其中在測(cè)試化合物存在下肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平不同于沒有測(cè)試化合物存在下肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平，說明測(cè)試化合物是可用于治療細(xì)胞增殖紊亂的候選物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中在測(cè)試化合物存在下肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平低于沒有測(cè)試化合物存在下肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中細(xì)胞增殖紊亂是癌癥。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中癌癥是肝細(xì)胞癌或子宮頸癌。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中在測(cè)試化合物存在下肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平高于沒有測(cè)試化合物存在下肝細(xì)胞瘤上調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和編碼它們的核酸。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1412198SQ02107529
公開日2003年4月23日 申請(qǐng)日期2002年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者楊鉅文, 鄒安平, 戚謹(jǐn)文, 范明基, 周成功 申請(qǐng)人:陽明大學(xué), 臺(tái)北榮民總醫(yī)院, 財(cái)團(tuán)法人衛(wèi)生研究院, 國光生物科技股份有限公司