糖化血紅蛋白的測定方法、測定試劑和測定試劑盒的制作方法
【專利說明】
[0001 ] 本申請是申請?zhí)枮?01280029249.4(國際申請?zhí)枮镻CT/JP2012/065237)、中國國 家階段進入日為2013年12月13日(國際申請日為2012年6月14日)、發(fā)明名稱為"糖化血紅蛋 白的測定方法、測定試劑和測定試劑盒"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及糖化血紅蛋白的測定方法、測定試劑和測定試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0003] 糖化血紅蛋白是在血紅蛋白上結(jié)合葡萄糖而成的糖化物。血紅蛋白具有由α鏈、β 鏈構(gòu)成的四聚體結(jié)構(gòu),將β鏈的Ν末端糖化后的血紅蛋白稱為血紅蛋白A1 c (以下也記作 HbAlc),血糖值越高越增加,因此,作為糖尿病標志物而在臨床檢查中進行測定。
[0004] 作為糖化血紅蛋白的測定方法,已知HPLC法等色譜法、電泳法、膠乳免疫凝集法等 利用抗體的免疫測定法、使用作用于糖化蛋白的酶和作用于糖化肽和/或糖化氨基酸的酶 的酶測定法等。
[0005] 作為糖化血紅蛋白的酶測定法,已知如下方法(吸光度法)等:首先,利用變性劑使 含有血紅蛋白的試樣中的血紅蛋白變性,使蛋白質(zhì)分解酶作用于變性后的血紅蛋白,接著 使糖化肽氧化酶作用于生成的糖化肽,使生成的過氧化氫在過氧化物酶等過氧化活性物質(zhì) 存在下與氧化顯色型色原體反應(yīng)而生成色素,由生成的色素的吸光度測定糖化血紅蛋白。
[0006] 但是,利用該吸光度法的糖化血紅蛋白的測定中,大量存在于試樣中的血紅蛋白 的影響成為問題。作為針對該問題的解決方法,已知例如:使用陽離子型表面活性劑和/或 兩性表面活性劑的方法(專利文獻I)、使用砜化合物和/或硝基化合物的方法(專利文獻2、 專利文獻3)、使用四唑·_化合物的方法(專利文獻4)、使用聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽類等特定 的陰離子系表面活性劑的方法(專利文獻5)等。
[0007] 但是,這些方法中,也未必能夠避免血紅蛋白的影響,因而需要不受血紅蛋白影響 的、準確地測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的方法。
[0008] 另外,基于氧化還原反應(yīng)的底物和酶的測定方法中,已知為了避免還原劑、特別是 抗壞血酸的妨礙而使用碘酸鹽的方法(專利文獻6)。但是,還不知道為了避免血紅蛋白的影 響而使用碘酸鹽等鹵素氧化物的方法。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻1:日本特開平3-010696號公報
[0012] 專利文獻2:W02003/107011小冊子 [0013] 專利文獻3:日本特開2007-147630號公報
[0014] 專利文獻4:日本特開2000-210100號公報
[0015] 專利文獻5:W02005/049858小冊子 [0016] 專利文獻6:日本特開昭56-151358號公報
【發(fā)明內(nèi)容】
[0017]發(fā)明所要解決的問題
[0018] 本發(fā)明的目的在于提供用于不受血紅蛋白的影響、準確且高靈敏度地測定含有血 紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的方法和試劑。
[0019] 用于解決問題的方法
[0020] 本發(fā)明人進行了深入的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了如下見解:在表面活性劑存在下使蛋白 質(zhì)分解酶作用于含有血紅蛋白的試樣、然后使用果糖基肽氧化酶進行作用的反應(yīng)中,在鹵 素氧化物存在下進行該反應(yīng),并對生成的過氧化氫進行測定,由此,能夠不受血紅蛋白的影 響、準確且高靈敏度地測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白,從而完成了本發(fā)明。 即,本發(fā)明涉及以下[1]~[18]項。
[0021] [1]-種含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的測定方法,其特征在于,在表面 活性劑存在下使蛋白質(zhì)分解酶作用于含有血紅蛋白的試樣、然后使用果糖基肽氧化酶進行 作用的反應(yīng)中,在鹵素氧化物存在下進行該反應(yīng),并對生成的過氧化氫進行測定。
[0022] [2]如[1]所述的方法,其中,鹵素氧化物為選自由碘酸或其鹽、溴酸或其鹽和高碘 酸或其鹽組成的組中的鹵素氧化物。
[0023] [3]如[1]或[2]所述的方法,其中,表面活性劑為陽離子型表面活性劑。
[0024] [4]如[3]所述的方法其中,陽離子型表面活性劑為選自由下述通式(I)表示的吡 啶犠鹽、下述通式(II)表示的轔鹽和下述通式(III)表示的季銨鹽組成的組中的陽離子型 表面活性劑,
[0026]式(I)中,R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基,Ra表示氫原子、取 代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基,η表示1~5的整數(shù),表示一價的陰離子,
[0028]式(II)中,R2~R5相同或不同,表示取代或未取代的烷基,Y-表示一價的陰離子,
[0030]式(III)中,R6~R9相同或不同,表示取代或未取代的烷基,Ζ-表示一價的陰離子。
[0031] [5]如[1]~[4]中任一項所述的方法,其中,過氧化氫的測定使用過氧化氫測定試 劑進行。
[0032] [6]如[5]所述的方法,其中,過氧化氫測定試劑為含有過氧化物酶和無色型色原 體的試劑。
[0033] [7]-種糖化血紅蛋白測定試劑,用于測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋 白,其特征在于,含有蛋白質(zhì)分解酶、果糖基肽氧化酶、鹵素氧化物和表面活性劑。
[0034] [8]如[7]所述的試劑,其中,鹵素氧化物為選自由碘酸或其鹽、溴酸或其鹽和高碘 酸或其鹽組成的組中的鹵素氧化物。
[0035] [9]如[7]或[8]所述的試劑,其中,表面活性劑為陽離子型表面活性劑。
[0036] [10]如[9]所述的試劑,其中,陽離子型表面活性劑為選自由下述通式(I)表示的 吡啶德鹽、下述通式(II)表示的轔鹽和下述通式(III)表示的季銨鹽組成的組中的陽離子 型表面活性劑,
[0038]式(I)中,R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基,Ra表示氫原子、取 代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基,η表示1~5的整數(shù),表示一價的陰離子,
[0040]式(II)中,R2~R5相同或不同,表示取代或未取代的烷基,Y-表示一價的陰離子,
[0042]式(III)中,R6~R9相同或不同,表示取代或未取代的烷基,表示一價的陰離子。
[0043] [11]如[7]~[10]中任一項所述的試劑,其中,還含有過氧化氫測定試劑。
[0044] [12]如[11]所述的試劑,其中,過氧化氫測定試劑為含有過氧化物酶和無色型色 原體的試劑。
[0045] [13]-種糖化血紅蛋白測定試劑盒,用于測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅 蛋白,其特征在于,包含含有蛋白質(zhì)分解酶、鹵素氧化物和表面活性劑的第一試劑以及含有 果糖基肽氧化酶的第二試劑。
[0046] [14]-種糖化血紅蛋白測定試劑盒,用于測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅 蛋白,其特征在于,包含含有蛋白質(zhì)分解酶和表面活性劑的第一試劑以及含有果糖基肽氧 化酶和鹵素氧化物的第二試劑。
[0047] [15]如[13]或[14]所述的試劑盒,其中,鹵素氧化物為選自由碘酸或其鹽、溴酸或 其鹽和高碘酸或其鹽組成的組中的鹵素氧化物。
[0048] [16]如[13]~[15]中任一項所述的試劑盒,其中,表面活性劑為陽離子型表面活 性劑。
[0049] [17]如[16]所述的試劑盒,其中,陽離子型表面活性劑為選自由下述通式(I)表示 的吡啶鋪鹽、下述通式(II)表示的轔鹽和下述通式(III)表示的季銨鹽組成的組中的陽離 子型表面活性劑,
[0051]式(I)中,R1表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基,Ra表示氫原子、取 代或未取代的烷基或者取代或未取代的烯基,η表示1~5的整數(shù),表示一價的陰離子,
[0053]式(II)中,R2~R5相同或不同,表示取代或未取代的烷基,Y-表示一價的陰離子,
[0055]式(III)中,R6~R9相同或不同,表示取代或未取代的烷基,表示一價的陰離子。 [0056] [18]如[13]~[17]中任一項所述的試劑盒,其中,在第一試劑和第二試劑中或者 在第二試劑和第一試劑中還分別含有過氧化物酶和無色型色原體。
[0057]發(fā)明效果
[0058]根據(jù)本發(fā)明,提供用于不受血紅蛋白的影響、準確且高靈敏度地測定含有血紅蛋 白的試樣中的糖化血紅蛋白的方法、試劑和試劑盒。
【附圖說明】
[0059] 圖1是表示使用實施例1~3和比較例1的試劑盒的樣本中的HbAlc的測定中血紅蛋 白濃度與反應(yīng)吸光度的關(guān)系的圖。?表示使用比較例1的試劑盒的測定,?表示使用實施例 1的試劑盒的測定,▲表示使用實施例2的試劑盒的測定,□表示使用實施例3的試劑盒的測 定,縱軸表示反應(yīng)吸光度(X l(T4Abs),橫軸表示血紅蛋白濃度(mg/mL)。
[0060] 圖2是表示使用實施例4和比較例2的試劑盒的樣本中的HbAlc的測定中血紅蛋白 濃度與反應(yīng)吸光度的關(guān)系的圖。?表示使用比較例2的試劑盒的測定,□表示使用實施例4 的試劑盒的測定,縱軸表示反應(yīng)吸光度(Xl〇_4Abs),橫軸表示血紅蛋白濃度(mg/mL)。
[0061] 圖3是表示使用實施例5和比較例3的試劑盒的樣本中的HbAlc的測定中血紅蛋白 濃度與反應(yīng)吸光度的關(guān)系的圖。?表示使用比較例3的試劑盒的測定,□表示使用實施例5 的試劑盒的測定,縱軸表示反應(yīng)吸光度(Xl〇_ 4Abs),橫軸表示血紅蛋白濃度(mg/mL)。
[0062] 圖4是表示使用實施例6和比較例4的試劑盒的樣本中的HbA 1 c的測定中血紅蛋白 濃度與反應(yīng)吸光度的關(guān)系的圖。?表示使用比較例4的試劑盒的測定,?表示使用實施例6 的試劑盒的測定,縱軸表示反應(yīng)吸光度(Xl〇_ 4Abs),橫軸表示血紅蛋白濃度(mg/mL)。
【具體實施方式】
[0063] (1)含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的測定方法
[0064] 本發(fā)明的含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的測定方法為如下方法:在表面 活性劑存在下使蛋白質(zhì)分解酶作用于含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白、然后使用果 糖基肽氧化酶進行作用的反應(yīng)中,在鹵素氧化物存在下進行該反應(yīng),并對生成的過氧化氫 進行測定。鹵素氧化物可以存在于使用果糖