專利名稱：：用糖化蛋白質(zhì)促進(jìn)口服耐受性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及促進(jìn)動(dòng)物口服耐受性的方法，其包括給該動(dòng)物施用糖化蛋白質(zhì)；用于促進(jìn)動(dòng)物口服耐受性的糖化蛋白質(zhì)；用于促進(jìn)動(dòng)物口服耐受性的包含糖化蛋白質(zhì)的食品；和制備所述食品的方法。
背景技術(shù)：
：對(duì)于所有嬰兒(infant)而言都推薦母乳。但是，在一些情況中，由于醫(yī)學(xué)原因母乳喂養(yǎng)不充足或不成功或不適當(dāng)，或者母親選擇不進(jìn)行母乳喂養(yǎng)。對(duì)于這些情況而言已經(jīng)研制了嬰兒配方食品(infantformula),大多數(shù)嬰兒配方食品是以牛奶為基礎(chǔ)的。但是，在嬰兒中常見(jiàn)牛奶變態(tài)反應(yīng)或奶超敏反應(yīng)(milkhypersensitivity)。這種現(xiàn)象通常到兩歲或三歲消失，但是其有時(shí)可能終身存在。其是嬰兒最常見(jiàn)的疾病，在足月嬰兒中的發(fā)生率為0.5至3%,在早產(chǎn)嬰兒中的發(fā)生率為3至5%。這種變態(tài)反應(yīng)可導(dǎo)致皮瘆、蕁麻滲、口周圍發(fā)紅、流弟(runnynose)、打噴噢、絞痛、腹瀉、嘔吐、過(guò)敏反應(yīng)，或者更常見(jiàn)地是消化困難。其還可能與一些嬰兒猝死的情況有關(guān)。應(yīng)當(dāng)將奶超敏反應(yīng)與乳糖不耐受區(qū)分開(kāi)，乳糖不耐受是由于乳糖酶先天不足而造成的對(duì)乳的不耐受。在大多數(shù)情況中，牛奶變態(tài)反應(yīng)是由對(duì)乳清部分中的a-乳清蛋白和卩-乳球蛋白反應(yīng)造成的。其也可由酪蛋白和/或白蛋白引起，酪蛋白和白蛋白是也存在于牛奶中的可能變應(yīng)原性乳蛋白質(zhì)。在出生后的前幾個(gè)月，免疫系統(tǒng)尚在形成，可能無(wú)法識(shí)別和耐受該類飲食蛋白。結(jié)果是嬰兒將飲食蛋白作為外來(lái)物質(zhì)處理并對(duì)其發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。如果兒童的免疫系統(tǒng)不能識(shí)別和耐受這些蛋白質(zhì)，則他們也可對(duì)其它飲食蛋白質(zhì)發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。有兩種類型的免疫響應(yīng)對(duì)于細(xì)菌和病毒的攻擊而言很重要的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫響應(yīng)(或Thl)和參與變態(tài)反應(yīng)的體液免疫響應(yīng)(或Th2)。在嬰兒出生前，其身體是無(wú)菌的，Thl路徑是靜止的。但是，在出生前Th2路徑是活性的，因?yàn)槠涫欠乐箣雰航⑵饘?duì)母親的免疫響應(yīng)所必需的。嬰兒出生后立即接觸到許多細(xì)菌(良性和有害的)，為了應(yīng)對(duì)這種攻擊，Thl路徑被激活。當(dāng)每種新的可能的外來(lái)物質(zhì)出現(xiàn)在腸中時(shí)，其通過(guò)M細(xì)胞被與腸有關(guān)的淋巴組織吸收并邂逅原初T細(xì)胞。如果Thl路徑正確運(yùn)轉(zhuǎn)，則機(jī)體將產(chǎn)生由特定抗體或特定致敏的T淋巴細(xì)胞組成的免疫響應(yīng)。這些變得專門針對(duì)無(wú)害飲食抗原的T細(xì)胞將來(lái)會(huì)以抑制機(jī)理發(fā)揮作用以防止經(jīng)由Th2路徑發(fā)生超敏反應(yīng)。這種機(jī)理纟皮稱為口服耐受性。但是，如果該免疫響應(yīng)產(chǎn)生的抗體是IgE抗體，則其將通過(guò)產(chǎn)生炎性反應(yīng)(其是變態(tài)反應(yīng))而對(duì)與該抗原的進(jìn)一步接觸產(chǎn)生響應(yīng)。這類變態(tài)反應(yīng)的機(jī)理可以如下解釋IgE抗體出現(xiàn)在包括循環(huán)嗜堿性粒細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞表面。當(dāng)該變應(yīng)原/IgE相互作用出現(xiàn)時(shí)，呈遞該IgE/變應(yīng)原偶合的細(xì)胞產(chǎn)生并釋;^文包括組胺在內(nèi)的化學(xué)介質(zhì)。這種現(xiàn)象導(dǎo)致了一些病理學(xué)作用，如局部或全身血管舒張。細(xì)菌的存在刺激Thl路徑。如果新生兒或者非常小的幼兒(baby)不能遇見(jiàn)足夠的細(xì)菌(如在發(fā)達(dá)國(guó)家因?yàn)樾l(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)高而可能發(fā)生這種情況)，則Thl路徑不能良好運(yùn)行。在該類情況中，免疫系統(tǒng)的唯一響應(yīng)將是Th2響應(yīng)，對(duì)所討論的抗原的變態(tài)反應(yīng)將發(fā)生。這僅僅是不能形成口服耐受性的一個(gè)原因；可能還有其它原因。毫無(wú)疑問(wèn)，認(rèn)為存在遺傳素質(zhì)。因此，口服耐受性現(xiàn)象是通過(guò)其經(jīng)口服路徑施用抗原可預(yù)防隨后的對(duì)以免疫原形式給予的相同抗原的全身免疫響應(yīng)的能力。據(jù)信，類似的機(jī)理可預(yù)防對(duì)腸內(nèi)正常細(xì)菌群落的超敏反應(yīng)響應(yīng)，這些腸內(nèi)正常細(xì)菌群落也是生命所必需的，是無(wú)害抗原的來(lái)源。如果嬰兒不能充分形成口服耐受性的機(jī)理，或者如果對(duì)某些抗原耐受的生理狀態(tài)瓦解，則這可能導(dǎo)致發(fā)生超敏反應(yīng)。通常，當(dāng)易受影響的嬰兒第一次接觸牛奶時(shí)會(huì)出現(xiàn)奶超敏反應(yīng)。從々大食角度來(lái)看，有兩種方法可以處理既成變態(tài)反應(yīng)一必須完全避免含有該變應(yīng)原的食品或者必需對(duì)食品進(jìn)行處理以降低其變應(yīng)原性，例如通過(guò)水解來(lái)進(jìn)行這樣的處理。針對(duì)這后一目的，制造了嬰兒配方食品和含有廣泛水解的蛋白質(zhì)(由不超過(guò)5種氨基酸組成的肽)的谷類食品。但是，需要有助于降低發(fā)生變態(tài)反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)和促進(jìn)對(duì)完整蛋白形成耐受性的產(chǎn)品，特別是對(duì)認(rèn)為有這類風(fēng)險(xiǎn)的兒童而言更是如此(例如，如果他們具有至少一個(gè)患有變態(tài)反應(yīng)的家族成員)。例如，已經(jīng)建議給嬰兒喂食部分水解的蛋白質(zhì)以誘導(dǎo)口服耐受性。在WO03/09卯37中描述了另一種誘導(dǎo)和維持口服耐受性的方法，即使用含有益生菌(probioticbacteria)的食品。益生菌的實(shí)例包括各種乳酸桿菌(丄acto^"7/0和雙岐桿菌C^y^6fl"er,'ff)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)施用益生菌可幫助在嬰兒中誘導(dǎo)口服耐受性。本發(fā)明的目的是提供另一種促進(jìn)口服耐受性的方法。嬰兒配方食品常常含有乳清蛋白，從營(yíng)養(yǎng)觀點(diǎn)來(lái)看，其特別令人感興趣，含有所有必需氨基酸，可以被迅速和容易地消化。當(dāng)在還原糖存在下對(duì)乳清蛋白進(jìn)行加熱時(shí)，該蛋白質(zhì)的游離氨基將與糖反應(yīng)，導(dǎo)致該蛋白質(zhì)糖化。如果使該類反應(yīng)不受抑制地進(jìn)行，則結(jié)果可能是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大大降低，還可能觀察到一些褐變?？赡馨l(fā)生的復(fù)雜系列反應(yīng)被統(tǒng)稱為麥拉德(Maillard)反應(yīng)。實(shí)際上，甚至認(rèn)為含有所需化學(xué)基團(tuán)的食品在室溫下也可發(fā)生麥拉德型反應(yīng)，但是非常緩慢。盡管麥拉德反應(yīng)一般被認(rèn)為是不希望的并且因此在相關(guān)食品加工過(guò)程中采取措施來(lái)控制該反應(yīng)，但是最近人們已經(jīng)意識(shí)到在小心控制的情況下，乳清蛋白的糖化可提供以許多方式控制蛋白質(zhì)性質(zhì)的機(jī)會(huì)。由糖基和蛋白質(zhì)的a-或s-氨基的非酶促相互作用產(chǎn)生的第一不可逆產(chǎn)物被稱為Amadori化合物。當(dāng)進(jìn)行酸水解時(shí)，所有Amadori化合物均產(chǎn)生糠氨酸(furosine),因此設(shè)計(jì)了一種監(jiān)測(cè)奶蛋白質(zhì)糖化進(jìn)程的方法，該方法基于糠氨酸產(chǎn)生的測(cè)量。用這種工具和隨后開(kāi)發(fā)的質(zhì)譜技術(shù)，理論上可對(duì)麥拉德反應(yīng)的進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。糖化可以在溶液中或在固體狀態(tài)下進(jìn)行。WO00/18249描述了一種含乳清蛋白的粉狀物質(zhì)的固體狀態(tài)糖化方法，其包括將該粉末的水活度調(diào)至0.3至0.8，使糖化在30至75'C的溫度下進(jìn)行1小時(shí)至80天。其聲稱所得粉末具有增強(qiáng)的功能性，如增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、乳化活性、抗氧化劑活性和腸毒素結(jié)合容量。該粉末可用作添加劑以增強(qiáng)食品的功能性和營(yíng)養(yǎng)含量。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及促進(jìn)哺乳動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的口服耐受性的方法，其包括給該哺乳動(dòng)物施用所述蛋白質(zhì)的糖化形式。該糖化蛋白質(zhì)被腸內(nèi)施用，例如通過(guò)摻入食品中來(lái)進(jìn)行腸內(nèi)施用。該類產(chǎn)品制造和施用簡(jiǎn)單并且具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另一方面，本發(fā)明涉及用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物對(duì)未糖化蛋白質(zhì)的口服耐受性的糖化蛋白質(zhì)。第三方面，本發(fā)明涉及用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物對(duì)未糖化蛋白質(zhì)的口服耐受性的包含糖化蛋白質(zhì)的食品。糖化蛋白質(zhì)優(yōu)選是糖化乳清蛋白。包含糖化乳清蛋白的食品的一個(gè)實(shí)例是幼兒或嬰兒配方食品。或者，該食品可以是包含糖化蛋白質(zhì)的千燥的、潮濕的或液態(tài)的寵物食品。糖化乳清蛋白優(yōu)選包含糖化P-乳球蛋白，糖化優(yōu)選是乳糖化，即還原糖是乳糖。由于這些組分存在于許多食品成分例如乳清蛋白分離物(isolate)、乳清蛋白濃縮物或脫脂奶粉中，調(diào)整這些產(chǎn)品的制備方法以包括乳糖化步驟是簡(jiǎn)單的。這些含乳清蛋白的產(chǎn)品均被廣泛用作食品成分，其因它們的蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)以及它們的良好營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)而有價(jià)值。另一方面，本發(fā)明涉及制備上述食品的方法，其包括使產(chǎn)品中含有的蛋白質(zhì)進(jìn)行糖化過(guò)程。糖化可以在溶液中或在固體狀態(tài)下進(jìn)行。另一方面，本發(fā)明涉及含有糖化蛋白質(zhì)、優(yōu)選糖化乳清蛋白的嬰兒配方食品。附1表示用具有不同乳糖化程度的不同類型的乳清蛋白或P-乳球蛋白喂養(yǎng)的九組小鼠的抗-P-乳球蛋白IgE低響應(yīng)性；圖2表示與圖l相同的九組小鼠的抗-p-乳球蛋白IgGl低響應(yīng)性；圖3表示用具有不同乳糖化程度的不同類型的乳清蛋白或p-乳球蛋白喂養(yǎng)的五組小鼠的抗-p-乳球蛋白IgE低響應(yīng)性；圖4表示與圖3相同的五組小鼠的抗-p-乳球蛋白IgGl低響應(yīng)性。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)如乳清蛋白p-乳球蛋白(其是可對(duì)其發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的抗原)可以被糖化并施用于哺乳動(dòng)物以促進(jìn)對(duì)所述抗原的口服耐受性?？梢允褂玫钠渌鞍踪|(zhì)包括乳清蛋白a-乳清蛋白、酪蛋白和白蛋白。促進(jìn)口服耐受性意指同時(shí)或單獨(dú)地誘導(dǎo)和維持口服耐受性。由于在大多數(shù)情況中牛奶是嬰兒遇到的第一種食品，因此最常見(jiàn)的食品變態(tài)反應(yīng)或超敏反應(yīng)是牛奶變態(tài)反應(yīng)或牛奶超敏反應(yīng)。所以本文的討論主要集中于這種變態(tài)反應(yīng)。但是，本專利申請(qǐng)的范圍并不僅限于這種變態(tài)反應(yīng)，而是也涉及促進(jìn)對(duì)其它飲食蛋白質(zhì)如堅(jiān)果(例如花生)、小麥和卵蛋白的口服耐受性，它們也常與兒童的變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。例如，才艮據(jù)本發(fā)明，可以將糖化的小麥蛋白施用于哺乳動(dòng)物以促進(jìn)其對(duì)小麥蛋白的口服耐受性，可以將糖化的卵蛋白施用于哺乳動(dòng)物以促進(jìn)其對(duì)卵蛋白的口服耐受性，可以將糖化的堅(jiān)果蛋白施用于哺乳動(dòng)物以促進(jìn)其對(duì)堅(jiān)果蛋白的口服耐受性。糖化蛋白質(zhì)優(yōu)選是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖化過(guò)程、優(yōu)選固體狀態(tài)糖化過(guò)程來(lái)制備的。根據(jù)Morgan(JAgricFoodChem(1999)47(11):4543-8),固體狀態(tài)過(guò)程導(dǎo)致較小的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化。此外，固體狀態(tài)過(guò)程易于監(jiān)測(cè)和控制，從而使得可以避免不希望的作用，如蛋白質(zhì)聚集和高級(jí)麥拉德反應(yīng)。糖化過(guò)程熱處理達(dá)至多約72小時(shí)。整個(gè)過(guò)程十分簡(jiǎn)單、十分適用于現(xiàn)有的工業(yè)設(shè)備并且耗能低。整個(gè)過(guò)程可包括調(diào)節(jié)和平衡粉末的水活度、對(duì)潮濕了的粉末進(jìn)行加熱處理；并且任選地包括冷卻和/或干燥粉末。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方面，在食品中摻入糖化蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"食品，，旨在包括任何可消耗的物質(zhì)。因此，其可以是用于被人消耗的產(chǎn)品，特別是嬰兒配方食品、幼兒配方食品、嬰幼兒后繼配方食品(follow-upformula)等。根據(jù)1991年5月14日的歐洲委員會(huì)法令(theEuropeanCommissionDirective)91/32I/EEC關(guān)于嬰兒配方食品和后繼配方食品的第1.2條，年齡在12個(gè)月以下的兒童是"嬰兒"。"嬰兒配方食品"是用于出生后前6個(gè)月期間嬰兒的全部營(yíng)養(yǎng)的食品。但是，糖化蛋白質(zhì)也可包含在不專用于嬰兒或幼兒營(yíng)養(yǎng)、但也可被這類群體消耗的食品中，該類食品例如奶、酸奶、凝乳、干酪、發(fā)酵乳、以奶為基礎(chǔ)的發(fā)酵產(chǎn)品、冰洪淋、以發(fā)酵谷類為基礎(chǔ)的產(chǎn)品或以奶為基礎(chǔ)的產(chǎn)品等。術(shù)語(yǔ)"食品"還包括被其它哺乳動(dòng)物消耗的產(chǎn)品，所述哺乳動(dòng)物例如寵物如狗、貓、兔、豚鼠、小鼠、大鼠或其它家養(yǎng)哺乳動(dòng)物如家畜，例如牛、馬、豬、綿羊、山羊、水牛、駱駝等。這方面，寵物優(yōu)選是伴侶動(dòng)物(companionanimal)。因此，上述糖化蛋白質(zhì)也可4皮摻入寵物食品中以促進(jìn)口服耐受性。適宜的寵物食品包括大塊產(chǎn)品(chmikproducts)、炸肉餅(croquettes)、咀嚼產(chǎn)品、潮濕的產(chǎn)品，如罐裝食品和液體配方食品，如小貓或小狗喝的奶。寵物食品是適于被寵物消耗的食品，優(yōu)選是適于寵物全部營(yíng)養(yǎng)的食品。根據(jù)定義，隨著糖化度提高，糖化蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)逐漸降低。對(duì)于乳清蛋白而言，這可以通過(guò)測(cè)量被阻斷的賴氨酸的。/。來(lái)進(jìn)行評(píng)估。這些蛋白質(zhì)的有限糖化不會(huì)導(dǎo)致對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的顯著有害作用，但是當(dāng)配制產(chǎn)品時(shí)必須考慮特定產(chǎn)品中所用的糖化蛋白質(zhì)的糖化程度和比例。例如，嬰兒配方食品應(yīng)優(yōu)選含有不大于約15%被阻斷的賴氨酸。如果在配方食品中使用糖化蛋白質(zhì)，則可以通過(guò)將所有蛋白質(zhì)糖化至該最大所需程度或者通過(guò)氨酸的總指標(biāo)來(lái)實(shí)現(xiàn)該指標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了制備該類食品的方法，其包括對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖化過(guò)程，優(yōu)選固體狀態(tài)糖化過(guò)程。本發(fā)明還提供了含有糖化蛋白質(zhì)如糖化乳清蛋白的嬰兒配方食品。該嬰兒配方食品可以是其中的蛋白質(zhì)被糖化或者被選擇的糖化蛋白質(zhì)替代的標(biāo)準(zhǔn)組合物。如上面所討論的那樣，含有糖化乳清蛋白的嬰兒配方食品應(yīng)優(yōu)選含有不大于約15。/"皮阻斷的賴氨酸，可以通過(guò)將配方食品中的所有蛋白質(zhì)糖化至該最大所需程度或者通過(guò)使用更高糖化的蛋白質(zhì)和未進(jìn)行處理的蛋白質(zhì)的混合物以遵守被阻斷的賴氨酸的總指標(biāo)來(lái)實(shí)現(xiàn)該指標(biāo)。糖化蛋白質(zhì)應(yīng)優(yōu)選作為未被糖化的蛋白質(zhì)的替代物被消耗直至建立了對(duì)該蛋白質(zhì)的耐受性。例如，在建立對(duì)卵蛋白的耐受性之前，應(yīng)僅消耗糖化的卵蛋白，在建立了對(duì)卵蛋白的耐受性時(shí)可以在不擔(dān)心變態(tài)反應(yīng)的情況下消耗普通的卵。類似地，應(yīng)當(dāng)給幼兒喂食含有糖化蛋白質(zhì)的嬰兒配方食品，直至完全斷奶和兒童達(dá)到吃正常食物的年齡，例如3至5歲。實(shí)施例用下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明范圍內(nèi)的產(chǎn)品和制備所述產(chǎn)品的方法進(jìn)行說(shuō)明。絕不應(yīng)將它們視為對(duì)本發(fā)明的限制?？梢詫?duì)本發(fā)明進(jìn)行變化和修改。即，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到這些實(shí)施例中許多可能的變型，其覆蓋了廣泛的組合物、成分、加工方法和混合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可針對(duì)各種應(yīng)用調(diào)整本發(fā)明的化合物的天然存在水平。實(shí)施例1:乳清蛋白在液體條件下的糖化P-乳球蛋白(BLG)得自戴維斯克(Davisco)公司(美國(guó))。用RP-HPLC測(cè)定其純度(90%)。乳糖得自富可(Fluka)公司。將4%BLG(大約2.2mM)和7%乳糖單水合物(大約200mM)溶解在20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)中。在0.22mm醋酸纖維素濾器(密理博(Millipore)公司)上過(guò)濾后，將蛋白質(zhì)和乳糖的混合物放置在蓋好蓋的燒瓶中并在水浴中于60'C加熱0、24或72小時(shí)以達(dá)到不誘導(dǎo)對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著有害作用的低水平乳糖化。在理論上，這些條件使得每個(gè)p-乳球蛋白單體在共計(jì)14個(gè)可能的賴氨酸殘基上結(jié)合2-3個(gè)乳糖分子(Morgan等人，1999，J.Agri.FoodChem.47，83-91)。所有實(shí)驗(yàn)均通過(guò)將300ml燒瓶的頂部空間降低至l-2ml而在缺氧和無(wú)菌條件下進(jìn)行。加熱后，不對(duì)不同級(jí)分進(jìn)行透析，而是將其立即冷凍干燥以防止膠凝。將對(duì)照的天然P-乳球蛋白(對(duì)照BLG)在室溫下水合6小時(shí)，在冰浴中冷卻，然后加入乳糖以達(dá)到與糖化BLG相同的7%濃度。作為另一個(gè)對(duì)照，將相同的純化的BLG溶液在沒(méi)有乳糖的情況下溫育，冷卻，然后加入乳糖粉末并使其溶解以達(dá)到7%濃度。其后立即將該溶液冷凍干燥。另外，還對(duì)兩個(gè)乳清蛋白分離物(WPI)進(jìn)行了試驗(yàn)-戴維斯克WPIBIPRO，其在乳糖基P-乳球蛋白中基本上被耗竭(用質(zhì)鐠法控制)，和-得自阿拉食品(ArlaFoods)公司的Lacprodan80，其含有高水平的乳糖基p-乳球蛋白形式(用質(zhì)譜法表征)。用糠氨酸測(cè)定法來(lái)測(cè)定被阻斷的賴氨酸。將蛋白質(zhì)的等分試樣(約20mg蛋白質(zhì))用60ml6M鹽酸于110。C在回流裝置中水解24小時(shí)。用水定量至100ml體積后，將10ml等分試樣蒸發(fā)至干，進(jìn)一步混懸在3ml0.02MHC1中。然后通過(guò)將10^進(jìn)樣到配有檸檬酸鈉緩沖液和用于蛋白質(zhì)水解物分析的柱的HitachiL-8500氨基酸分析儀中來(lái)進(jìn)行分析。在用茚三酮試劑進(jìn)行柱后衍生化后，通過(guò)于外標(biāo)進(jìn)行比較在相同的色傳圖中對(duì)賴氨酸和糠氨酸進(jìn)行定量。由酸水解物中的賴氨酸和糠氨酸含量來(lái)計(jì)算被阻斷的賴氨酸的百分比，假^L在水解期間約40%s-脫氧果糖基賴氨酸(被阻斷的賴氨酸)被重新轉(zhuǎn)化成賴氨酸，部分被轉(zhuǎn)化成吡噴氨酸(pyridosine),約32%被轉(zhuǎn)化成糠氨酸(Finot等人，(1981)Prog.FoodNutr.Sci.5，345-355)。所有結(jié)果均是由兩個(gè)獨(dú)立測(cè)量獲得的平均值。結(jié)果如下面的表l所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在實(shí)施例2中被喂食蛋白質(zhì)的小鼠組。*這一非常高的值是由凍干過(guò)程中的問(wèn)題造成的。實(shí)施例2:誘導(dǎo)小鼠的口服耐受性為了對(duì)誘導(dǎo)口服耐受性進(jìn)行測(cè)試，使用Pecquet等人(1999，Immunology96:278-285)所述的標(biāo)準(zhǔn)小鼠方案。給小鼠喂食不同類型的如實(shí)施例1中所述的乳糖化或未乳糖化的乳清蛋白或BLG。5天后，通過(guò)皮下注射在Al(OH)3溶液中稀釋的BLG(100mgP-乳球蛋白/小鼠)來(lái)對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)。3周后，將小鼠處死，收集血樣以通過(guò)測(cè)量不同組中BLG-特異性IgE和IgGl的滴度來(lái)評(píng)價(jià)口服耐受性資導(dǎo)。按照以下組對(duì)小鼠進(jìn)行處理A組水B組與乳糖一起凍干的對(duì)照BLG(不溫育)C組BLG+乳糖T0D組對(duì)照BLG，溫育24小時(shí)，然后與乳糖一起凍干E組BLG+乳糖，溫育24小時(shí)，然后凍干F組對(duì)照BLG，溫育72小時(shí)，然后與乳糖一起凍干G組BLG+乳糖，溫育72小時(shí)，然后凍干H組低乳糖化WPI(乳清蛋白分離物)(Bipro)I組高乳糖化WPI(Lacprodan)圖1中所給出的結(jié)果表明，與用天然BLG(B組)和低乳糖化乳清蛋白(H組)喂養(yǎng)的組相比，用乳糖化BLG(E組)和高乳糖化乳清蛋白(I組)喂養(yǎng)的小鼠進(jìn)一步改善了特異性抗-BLGIgE低響應(yīng)性，B組和H組均是陽(yáng)性對(duì)照。應(yīng)當(dāng)注意，盡管被喂食的蛋白質(zhì)具有最高的乳糖化率，但是B組(42。/。被阻斷的賴氨酸)并未產(chǎn)生最佳響應(yīng)。對(duì)此的一種解釋可能是乳糖化反應(yīng)未受控制。此外，其還可能是由于過(guò)度乳糖化掩蓋了蛋白質(zhì)中關(guān)鍵表位這一事實(shí)造成的。同樣，盡管G組和I組所喂食的蛋白質(zhì)中被阻斷的賴氨酸的水平相同，但是G組的結(jié)果不如I組的結(jié)果好。這可能是因?yàn)榻o予G組的BLG的乳糖化是在液體狀態(tài)下進(jìn)行的，因此未^U艮好地控制。難以控制的液態(tài)乳糖化可導(dǎo)致出現(xiàn)一些不希望的現(xiàn)象，包括蛋白質(zhì)聚集和高級(jí)麥拉德反應(yīng)。另一方面，給予I組的乳清蛋白的乳糖化是以干燥狀態(tài)進(jìn)行的，被更好地控制(僅發(fā)生早期的麥拉德反應(yīng))。用抗-BLG特異性IgGl(在Thl細(xì)胞調(diào)節(jié)下產(chǎn)生的另一種同種型)觀察到了類似的結(jié)果，表明了由于口服耐受性的誘導(dǎo)，這些細(xì)胞無(wú)變應(yīng)性。如圖2所示，E組和I組呈現(xiàn)出最低的抗-BLGIgGl滴度，表明分別與喂食具有較低乳糖化的相同蛋白質(zhì)的組即B組和H組相比，在這兩個(gè)組中，蛋白質(zhì)的乳糖化改善了低響應(yīng)性。實(shí)施例3:在干燥狀態(tài)下的糖化Prolacta75乳清蛋白濃縮物(WPC)購(gòu)自萊克塔利斯工業(yè)(LactalisIndustrie)公司(Retiers，法國(guó))。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，其含有76.4%蛋白質(zhì)、15.3%乳糖、3.2%灰分、0.42%鉤和5%水。通過(guò)固體狀態(tài)糖化將WPC乳糖化。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)將該粉末放在具有飽和K2C03的封閉室中將其水活度(Aw)調(diào)至約0.44。在該步驟期間，監(jiān)測(cè)吸水和Aw。當(dāng)達(dá)到所需Aw時(shí)，將粉末密封在不透明袋中。然后，將粉末在15。C下至少保持48小時(shí)以使水在基質(zhì)中平衡。通過(guò)將該粉末在自制的管狀加熱器中于60。C在密封的不銹鋼管(內(nèi)徑為16mm，30g粉末)中溫育3小時(shí)和8小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)糖化。在糖化期結(jié)束時(shí)檢查水活度，觀察到?jīng)]有發(fā)生變化。然后將該粉末在15t:下密封儲(chǔ)存。用質(zhì)鐠法(MALDI)檢測(cè)乳糖化形式的蛋白質(zhì)和定量Prolacta75(未糖化的和糖化的)中每個(gè)蛋白質(zhì)單體連接的乳糖的平均數(shù)。通過(guò)如上所述的游離氨基測(cè)定來(lái)評(píng)估糖化程度。用鄰-苯二曱醛法(OPA)測(cè)定游離氨基。OPA測(cè)定通過(guò)以下操作進(jìn)行將200ml蛋白質(zhì)溶液(1.5g/1，在50mmo1/1磷酸鈉緩沖液pH7.8中)、2ml還原溶液(480mg分散在200ml0.1mol/1硼酸鈉緩沖液pH9.3中的N-乙?；?L-半胱氨酸)和50ml20%(w/w)SDS溶液混合。在混合并于50。C溫育10分鐘后，加入50mlOPA試劑(通過(guò)將170mgOPA分散在5ml甲醇中制得)。將該混合物于50。C再溫育30分鐘，然后在室溫下冷卻30分鐘，然后在340nm下用Uvikon810分光光度計(jì)(福樂(lè)派克(Flowspek)公司，巴塞爾(Basel),瑞士)讀取吸光度。在最終混合物中在10至200mmol/l的濃度范圍中用L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品獲得校準(zhǔn)曲線。為了獲得反應(yīng)信號(hào)，扣除兩個(gè)空白?？瞻譴(蛋白質(zhì)信號(hào))是用曱醇代替OPA試劑獲得的?？瞻?是用磷酸鈉緩沖液代替蛋白質(zhì)溶液獲得的。所用的產(chǎn)品和試劑分別為硼酸、N-乙?；?L-半胱氨酸、得自福路卡化學(xué)公司(FlukaChemieGmbH)(Buchs，瑞士)的OPA、磷酸二氫鈉單水合物、甲醇、得自默克(Merck)公司(Darmstadt,德國(guó))的氫氧化鈉和得自星瑪(Sigma)公司的L-亮氨酸(圣路易斯(St-Louis)，MO，美國(guó))。用分子排阻色譜法檢查Prolacta75(未糖化的和糖化的)中是否存在聚集的蛋白質(zhì)。用足量的洗脫緩沖液稀釋蛋白質(zhì)樣品，得到等于lg/l的蛋白質(zhì)濃度(以起始蛋白質(zhì)濃度為基礎(chǔ))。柱為TSK2000SW(Tosohaas公司)，用0.1M磷酸鹽pH6.8+NaCl0.15M以0.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫。在214或280nm下記錄光學(xué)密度。用含有天然a-乳清蛋白和P-乳球蛋白的MW標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)該柱進(jìn)行校準(zhǔn)?；瘜W(xué)表征的結(jié)果如下面表2中所示。表2樣<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>每個(gè)蛋白質(zhì)單體結(jié)合的平均乳糖數(shù)(MALDI-MS)BLGABLGBa國(guó)LA未糖化的Prolacta75糖化3小時(shí)的Prolacta75糖化8小時(shí)的Prolacta758.6%6.2%5.5%5%19.7%31.0%0.83.45.40.83.60.3，63.4發(fā)現(xiàn)在用于表征蛋白質(zhì)乳糖化的各種方法之間有良好的關(guān)聯(lián)性。蛋白質(zhì)乳糖化(干燥狀態(tài)糖化)所用的條件不會(huì)導(dǎo)致形成蛋白質(zhì)聚集物(如分子排阻色傳法所示)。實(shí)施例4:誘導(dǎo)小鼠的口服耐受性為了測(cè)量乳糖化的作用，用上述小鼠模型進(jìn)行口服耐受性的誘導(dǎo)。給小鼠喂食未糖化的和實(shí)施例3中制得的糖化的Prolacta蛋白質(zhì)的不同制備物。然后，以全身水平用p-乳球蛋白(BLG)對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)，3周后，通過(guò)評(píng)估小鼠血清中BLG特異性IgE和IgGl水平來(lái)測(cè)量對(duì)BLG的口服耐受性的誘導(dǎo)。按照以下組對(duì)小鼠進(jìn)行處理A組LacprodanB組未糖化的Prolacta75C組糖化Prolacta75(被阻斷的賴氨酸19%)D組糖化Prolacta75(被阻斷的賴氨酸31%)E組對(duì)照(水)結(jié)果如圖3中所示。以與實(shí)施例2中給出的結(jié)果相同的方式，可發(fā)現(xiàn)用乳糖化的Prolacta進(jìn)行耐受誘導(dǎo)的小鼠(C組和D組)比喂食未乳糖化的Prolacta或喂食Lacprodan的小鼠組表現(xiàn)出更好的BLG特異性IgE低響應(yīng)性。圖4中所示的抗-BLGIgGl滴度顯示出相同類型的致耐受性響應(yīng)，C組和D組滴度最低?？傊?，該數(shù)據(jù)表明與未乳糖化的蛋白質(zhì)相比，乳清蛋白的乳糖化改善了特異性致耐受性低響應(yīng)性(IgE和IgGl)。實(shí)施例5:含有糖化乳清蛋白的嬰兒配方食品下面給出了該嬰兒配方食品的組成-<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>200680046708.4說(shuō)明書第14/14頁(yè)維生素B2(mg)0.151.0煙酸(mg)16.7維生素B6(mg)0.0750.50葉酸(Hg)960泛酸(mg)0.453維生素B12Oig)0.32生物素(Hg)2.215膽堿(mg)1067Fe(mg)1.2815100Cu(mg)0.060.4Zn(mg)0.755蛋白質(zhì)源是用上面實(shí)施例3中所述的方法糖化至被阻斷的賴氨酸含量為11%的Prolacta75乳清蛋白濃縮物。該嬰兒配方食品是通過(guò)將蛋白質(zhì)源、碳水化合物源和脂肪源混合物在一起來(lái)制備的。如果需要，可以在該混合物中包含乳化劑。然后，混入已經(jīng)進(jìn)行了反滲透處理的水，以形成液體混合物。通過(guò)將其迅速加熱至約80'C至約IIO'C的溫度達(dá)約5秒至約5分鐘來(lái)對(duì)該液體混合物進(jìn)行熱處理以降低細(xì)菌負(fù)載量。然后，將該液體混合物快速冷卻至60'C至85。C。然后將該液體混合物分兩步勻化，首先在約7MPa至約40MPa下勻化，然后在第二步中在約2MPa至約14MPa下勻化。將勻化的混合物進(jìn)一步冷卻并加入熱敏感的微生物類和礦物質(zhì)。這時(shí)，使該勻化的混合物的pH和固體含量符合標(biāo)準(zhǔn)。然后，將勻化的混合物轉(zhuǎn)移到噴霧干燥器中，將其轉(zhuǎn)化成水含量低于約5%重量的粉末。權(quán)利要求1.促進(jìn)哺乳動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的口服耐受性的方法，其包括給該哺乳動(dòng)物腸內(nèi)施用所述蛋白質(zhì)的糖化形式。2.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述糖化蛋白質(zhì)被口服施用。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述糖化蛋白質(zhì)是食品的組分。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述食品是幼兒或嬰兒配方食品。5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述食品是寵物食品。6.權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是乳清蛋白。7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述糖化乳清蛋白是乳糖化乳清蛋白。8.權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述乳清蛋白包含P-乳球蛋白。9.用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物對(duì)未糖化蛋白質(zhì)的口服耐受性的糖化蛋白質(zhì)。10.權(quán)利要求9所述的糖化蛋白質(zhì)，其是乳清蛋白。11.權(quán)利要求10所述的糖化乳清蛋白，其是乳糖化乳清蛋白。12.權(quán)利要求10或11所述的糖化乳清蛋白，其中所述乳清蛋白包含P-乳球蛋白。13.用于促進(jìn)哺乳動(dòng)物對(duì)未糖化蛋白質(zhì)的口服耐受性的包含糖化蛋白質(zhì)的食品。14.權(quán)利要求13所述的食品，其中所述糖化蛋白質(zhì)是乳清蛋白。15.權(quán)利要求14所述的食品，其中所^t化乳清蛋白是乳糖化的。16.權(quán)利要求14或15所述的食品，其中所述乳清蛋白包含P-乳球蛋白。17.權(quán)利要求13至16中任意一項(xiàng)所述的食品，其中該食品是幼兒或嬰兒配方食品。18.權(quán)利要求13所述的食品，其中該食品是寵物食品。19.制備權(quán)利要求13至18中任意一項(xiàng)所述的食品的方法，其包括使產(chǎn)品中含有的蛋白質(zhì)進(jìn)行固體狀態(tài)糖化過(guò)程。20.含有糖化蛋白質(zhì)的嬰兒配方食品。21.含有糖化乳清蛋白的嬰兒配方食品。全文摘要本發(fā)明涉及促進(jìn)動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的口服耐受性的方法，其包括給該動(dòng)物施用所述蛋白質(zhì)的糖化形式；用于促進(jìn)動(dòng)物口服耐受性的糖化蛋白質(zhì)；用于促進(jìn)動(dòng)物口服耐受性的包含糖化蛋白質(zhì)的食品；和制備所述食品的方法。文檔編號(hào)A61P37/00GK101325880SQ200680046708公開(kāi)日2008年12月17日申請(qǐng)日期2006年11月14日優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日發(fā)明者F·摩根,L·J·R·博韋托,S·佩凱申請(qǐng)人:雀巢技術(shù)公司