專利名稱：灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的在于對灰樹花菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，提高菌絲體的得率和多糖肽的產(chǎn)量。
灰樹花的主要活性成份是灰樹花多糖，多糖組份中以葡萄糖為主，以具有β-(1→6)側(cè)鏈的β-(1→3)葡聚糖為主要結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，灰樹花多糖主要通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，釋放細(xì)胞因子，激活機(jī)體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞，促進(jìn)免疫球蛋白、白細(xì)胞介素的生成，提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率等而發(fā)揮其抗腫瘤作用，在基因水平上有較強(qiáng)的抗化學(xué)誘變作用，可用于慢性乙型肝炎及惡性腫瘤放化療后乏力，白細(xì)胞減少，免疫功能降低的綜合治療。灰樹花多糖正還具有抗愛滋病毒、降血糖、降血壓等作用。
本發(fā)明提供了一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，該發(fā)酵工藝的流程為斜面菌種或茄瓶菌種→搖瓶種子→50-100L3種子罐(一級)→500-1000L3種子罐(二級)→5000-10噸發(fā)酵罐。
本發(fā)明的方法包括下列步驟(1)灰樹花的育種用組織分離法獲得灰樹花純菌株GF103，將其接種在PDA或麥芽汁固定斜面培養(yǎng)基上，于25～28℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆?。采用紫外誘變法對菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，紫外照射距離為20～30cm，照射時間為5～15秒。初篩誘變株在固體培養(yǎng)基上的菌絲體生長能力，復(fù)篩誘變株在液體培養(yǎng)基中菌絲體生長量和多糖肽產(chǎn)量，獲得優(yōu)質(zhì)菌株GF103-21。該菌株分類命名為灰樹花Grifolafrondosa，該菌株已于2002年7月16日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心的編號為CGMCC No.07732001325A。并于2002年7月16日檢測結(jié)果為存活。
固體培養(yǎng)用70～78％的甘蔗渣(或木屑、棉子殼)、1％的蔗糖或葡萄糖、20％～28％的麩皮或米糠、1％的石膏或碳酸鈣，加水拌勻，含水量60％，PH自然，瓶裝，在1.5kg/m2的壓力下滅菌1小時，冷卻后，在無菌操作下?lián)u瓶種子接種于固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度22～26℃，20～30天菌絲體布滿全瓶。原基萌發(fā)后，降低栽培溫度至1 8～24℃，保持適當(dāng)濕度、光照和通風(fēng)，20～25天后，子實體成熟；(2)菌株的發(fā)酵搖瓶種子的裝量75～150ml/250ml或150～250ml/500ml培養(yǎng)基，往復(fù)式搖床振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度24～28℃。培養(yǎng)時間2～3天。種子罐和發(fā)酵罐投料量50～70％，接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/vmin，發(fā)酵培養(yǎng)時間4～7天。隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)基由混濁逐漸變清。發(fā)酵液中還原糖、氨態(tài)氮、PH都逐漸降低，菌絲體生物量不斷增加，至第5～6天時多糖肽產(chǎn)量達(dá)最高時終止發(fā)酵。(3)灰樹花多糖肽的生產(chǎn)方法灰樹花發(fā)酵液用沙芯漏斗抽濾，分離發(fā)酵液和菌絲體，工廠可用板框機(jī)分離發(fā)酵液與菌絲體。將濕菌絲體加10～20倍水浸泡過夜，用90～100℃水浴回流提取2～5小時，過濾，將濾液濃縮后加2～5％倍的95％乙醇0～4℃沉淀8～10小時，干燥得灰樹花多糖肽。
本發(fā)明所述從腐木個經(jīng)組織分離法得到的GF103菌種，短柄，呈珊瑚狀分枝，末端生扇形至匙形菌蓋，重疊成叢，大的叢寬40～60cm。菌蓋直徑2～7cm，灰色至淺褐色。菌蓋表面有細(xì)毛，老后光滑，有反射性條紋，過緣薄，內(nèi)卷。菌肉白，菌管長1～4mm，管孔延生，孔面白色至淡黃色，管口多角形，平均每毫米1～3個。孢子無色，光滑，卵圓形至橢圓形。菌絲壁薄，分枝，有橫隔，無鎖狀聯(lián)合。物理誘變所得的菌株GF103-21在固體木屑麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其子實體形態(tài)與天然實體相同。
本發(fā)明所述灰樹花菌株GF103-21的培養(yǎng)性狀是①接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，溫度24～28℃，生長旺盛，菌絲體純白色、絨狀，接種十天菌落直徑達(dá)15-20mm。②接種在木屑培養(yǎng)基上，其培養(yǎng)特征如上所述。③在搖瓶振蕩培養(yǎng)時，用往復(fù)式搖床，振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床，振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分，形成菌株，當(dāng)菌大量形成時，發(fā)酵液由混濁變清，粘度逐漸增加，散發(fā)濃郁果香味。④在發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～6天時，菌絲體生長和多糖肽產(chǎn)量達(dá)到最高，可終止發(fā)酵。
灰樹花多糖肽的毒性試驗和藥效試驗上述工藝過程使用的培養(yǎng)基成分和各種溶劑均無毒性，發(fā)酵生產(chǎn)的灰樹花菌絲體和灰樹花多糖肽，經(jīng)國家規(guī)定的急性毒性試驗和慢性毒性試驗證明，本發(fā)明的產(chǎn)中品均無毒性。長期使用本產(chǎn)品不僅不會產(chǎn)生任何毒副作用，反而能增加機(jī)體的免疫功能。
從上述發(fā)明方法所獲得的灰樹花菌絲體和多糖肽能明顯促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，能抵抗由環(huán)磷酰胺引起的白血球下降和食欲減退；能提高荷瘤機(jī)體的免疫球蛋白、補(bǔ)體和血清溶血素的含量；能抑制腫瘤細(xì)胞的生長。可用于臨床抗腫瘤，減輕腫瘤病人化療和放療所引起的副作用，如惡心嘔吐、食欲不振、白細(xì)胞降低等癥狀，提高生存質(zhì)量。并可作為亞健康人士提高機(jī)體免疫功能的保健品。
采用物理誘變法對灰樹花菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，用成本低廉的黃豆粉等作為培養(yǎng)基原料，發(fā)酵培養(yǎng)灰樹花菌絲體，提高菌絲體的得率和多糖肽的產(chǎn)量。本方法發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品菌絲體和多糖肽安全無毒。從灰樹花菌絲體中提取的多糖肽具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長，對化療和放療的腫瘤病人的惡心嘔吐、食欲不振、白細(xì)胞降低等癥狀有明顯改善作用，是一種新型的生物免疫調(diào)節(jié)劑。
PDA配方如下馬鈴薯200g葡萄糖20g
瓊脂20g水 1000ml鈴薯去皮，切塊，加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過濾，取汁。
將斜面菌種接種在裝有100ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，振蕩培養(yǎng)。采用往復(fù)式搖床(振蕩速度80～150次/分)或旋轉(zhuǎn)式搖床(振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分)，振蕩培養(yǎng)度24～28℃。培養(yǎng)第二天出現(xiàn)小菌球，鏡檢菌絲生長繁茂、多分枝、具橫隔、五色、透明、具鎖狀聯(lián)合，發(fā)酵至第5～7天發(fā)酵液粘稠，此時菌絲體生長量最大，多糖肽產(chǎn)量最高，可終止發(fā)酵。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下淀粉 3％黃豆粉0.5％麩皮 0.3％酵母粉0.2％磷酸二氫鉀0.2％硫酸鎂0.05％發(fā)酵液經(jīng)離心后，得灰樹花菌絲體，加水10倍后，用細(xì)胞搗碎機(jī)打碎細(xì)胞，然后加90℃熱水回流提取3～5小時，將提取液再經(jīng)真空薄膜濃縮，取1份濃縮加3份95％乙醇，在0～4℃條件下醇析8小時。經(jīng)真空干燥或冷凍干燥后即可獲得褐色粉末狀的灰樹花多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用葡萄糖凝膠(Sdphadex-G75)進(jìn)行層析分離，用紫外吸收法和酚硫酸測定層析液的多糖和多肽，樣品在收集試管中出現(xiàn)多糖和多肽，證明是灰樹花多糖肽。
實施例2灰樹花子實體經(jīng)組織分離，獲得純種，將純種進(jìn)行斜面低溫保藏或液氮保存，接種在綜合PDA斜面培養(yǎng)基上，24～26℃培養(yǎng)7～10天。
綜合PDA配方如下馬鈴薯 200g蔗糖 20gKH2PO43gMgSO47H2O 1.5g瓊脂 20g水 1000ml馬鈴薯去皮，切塊，加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過濾，取汁。麩皮加水煮沸20～30分鐘后，4層紗布過濾，取汁。
將斜面菌種接種在裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，振蕩培養(yǎng)。采用復(fù)式搖床(振蕩速度80～150次/分)或旋轉(zhuǎn)式搖床(振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分)，振蕩培養(yǎng)溫度24～28℃。二天后以壓差法移種入 50～100L種子罐內(nèi)，罐裝量70％(v/v)，接種量10％(v/v)，通氣培養(yǎng)2天后移入500～1000L發(fā)酵罐。發(fā)酵罐裝量70％(v/v)，接種量10％(v/v)，罐溫24～30℃，通氣量1∶1(v/v)機(jī)械攪拌速度100～200rpm。發(fā)酵至第5～7天發(fā)酵液粘稠，此時菌絲體生長量最大，多糖肽產(chǎn)量最高，可終止發(fā)酵。
種子培養(yǎng)基配方如下玉米粉3％淀粉 2％磷酸二氫鉀0.1％硫酸鎂0.05％發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下淀粉 3％黃豆粉0.5％麩皮 0.3％酵母粉0.2％磷酸二氫鉀0.2％硫酸鎂0.05％發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后，得灰樹花菌絲體，加水10倍后，用細(xì)胞搗碎機(jī)打碎細(xì)胞，然后加95℃熱水回流提取4小時，將提取液真空薄膜濃縮，加水3倍體積的95％乙醇，低溫醇析。醇析物用無水丙酮和無水乙醚分別洗滌3次，于50℃下烘干，獲得褐色粉末狀的灰樹花多糖肽。取多糖肽加水(1∶100重量比)溶解后，用兩塊硅膠薄析進(jìn)行TLC層析，分別用茚三酮和茴香醛顯色，兩塊板顯示的Rf值一致，證明所提取的樣品為灰樹花多糖肽。
權(quán)利要求
1.一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)灰樹花的育種用組織分離法獲得灰樹花純菌株GF103，將其接種在PDA或麥芽汁固定斜面培養(yǎng)基上，于25～28℃恒溫培養(yǎng)7～10天后，置于4℃左右的冰箱中保存?zhèn)溆?，采用紫外誘變法對菌絲細(xì)胞進(jìn)行誘變，紫外照射距離為20～30cm，照射時間為5～15秒，初篩誘變株在固體培養(yǎng)基上的菌絲體生長能力，復(fù)篩誘變株在液體培養(yǎng)基中菌絲體生長量和多糖肽產(chǎn)量，獲得優(yōu)質(zhì)菌株GF103-21；固體培養(yǎng)用70～78％的甘蔗渣 或木屑、棉子殼，1％的蔗糖或葡萄糖，20％～28％的麩皮或米糠，1％的石膏或碳酸鈣，加水拌勻，含水量60％，PH自然，瓶裝，在1.5kg/m2的壓力下滅菌1小時，冷卻后，在無菌操作下?lián)u瓶種子接種于固體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)溫度22～26℃，20～30天菌絲體布滿全瓶，原基萌發(fā)后，降低栽培溫度至18～24℃，保持適當(dāng)濕度、光照和通風(fēng)，20～25天后，子實體成熟；(2)菌株的發(fā)酵搖瓶種子的裝量75～150ml/250ml或150～250ml/500ml培養(yǎng)基，往復(fù)式搖床振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度24～28℃，培養(yǎng)時間2～3天，種子罐和發(fā)酵罐投料量50～70％，接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/vmin，發(fā)酵培養(yǎng)時間4～7天，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)基由混濁逐漸變清，發(fā)酵液中還原糖、氨態(tài)氮、PH都逐漸降低，菌絲體生物量不斷增加，至第5～6天時多糖肽產(chǎn)量達(dá)最高時終止發(fā)酵；(3)灰樹花多糖肽的生產(chǎn)方法灰樹花發(fā)酵液用沙芯漏斗抽濾，分離發(fā)酵液和菌絲體，工廠可用板框機(jī)分離發(fā)酵液與菌絲體，將濕菌絲體加10～20倍水浸泡過夜，用90～100℃水浴回流提取2～5小時，過濾，將濾液濃縮后加2～5％倍的95％乙醇0～4℃沉淀8～10小時，干燥得灰樹花多糖肽；本發(fā)明所述從腐木個經(jīng)組織分離法得到的GF103菌種，短柄，呈珊瑚狀分枝，末端生扇形至匙形菌蓋，重疊成叢，大的叢寬40～60cm，菌蓋直徑2～7cm，灰色至淺褐色，菌蓋表面有細(xì)毛，老后光滑，有反射性條紋，過緣薄，內(nèi)卷，菌肉白，菌管長1～4mm，管孔延生，孔面白色至淡黃色，管口多角形，平均每毫米1～3個，孢子無色，光滑，卵圓形至橢圓形，菌絲壁薄，分枝，有橫隔，無鎖狀聯(lián)合，物理誘變所得的菌株GF103-21在固體木屑麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其子實體形態(tài)與天然實體相同；本發(fā)明所述灰樹花菌株GF103-21的培養(yǎng)性狀是①接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，溫度24～28℃，生長旺盛，菌絲體純白色、絨狀，接種十天菌落直徑達(dá)15-20mm，②接種在木屑培養(yǎng)基上，其培養(yǎng)特征如上所述，③在搖瓶振蕩培養(yǎng)時，用往復(fù)式搖床，振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床，振蕩速度100～200轉(zhuǎn)/分，形成菌株，當(dāng)菌大量形成時，發(fā)酵液由混濁變清，粘度逐漸增加，散發(fā)濃郁果香味，④在發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5～6天時，菌絲體生長和多糖肽產(chǎn)量達(dá)到最高，可終止發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種姬松茸的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的優(yōu)質(zhì)菌株AB103-51的分類命名為灰數(shù)花Grifola frondosa，保藏編號為CGMCC No.07722001325A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的優(yōu)質(zhì)菌株GB103-21的發(fā)酵工藝，其種子培養(yǎng)基的特征是100ml的培養(yǎng)基天然黃豆粉0.5～1g、葡萄糖或蔗糖0.5～1g、硫酸鎂0.05～0.1g、磷酸二氫鉀0.1～0.2g組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的優(yōu)質(zhì)菌株GB103-21的發(fā)酵工藝，其發(fā)酵培養(yǎng)基的特征是100ml的培養(yǎng)基的配比是淀粉1.5～2.5g、天然黃豆粉0.5～1g、麩皮0.2～0.8g、葡萄糖或蔗糖0.5～1g、酵母粉0.1～0.3、硫酸鎂0.05～0.1g、磷酸二氫鉀0.1～0.2g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是發(fā)酵罐培養(yǎng)可添加泡敵或豆油適量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是培養(yǎng)基中可添加玉米漿，添加量為0.1～1％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是搖瓶種的發(fā)酵條件250ml搖瓶裝量75～150ml培養(yǎng)基，500ml搖瓶裝量150～250ml培養(yǎng)基，采用往復(fù)式搖床，振蕩速度80～150次/分，或旋轉(zhuǎn)式搖床，振蕩速度度100～200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度24～28℃，培養(yǎng)時間2～3天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是發(fā)酵條件接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發(fā)酵溫度為24～28℃，罐壓0.3～0.5kg/cm2，發(fā)酵培養(yǎng)時間2～3天。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的發(fā)酵工藝的特征是發(fā)酵條件為接種量8～10％，攪拌速度100～200rpm，通氣量1∶0.5～1∶1v/v min，發(fā)酵溫度為24～28℃，罐壓0.3～0.5kg/cm2，發(fā)酵培養(yǎng)時間4～7天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中一種灰樹花G菌株GF103-21的固體培養(yǎng)用稻草或木屑、棉子殼，蔗糖或葡萄糖，麩皮或米糠，石膏或碳酸鈣所組成的培養(yǎng)基。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的培養(yǎng)工藝的特征是培養(yǎng)基的百分含量是稻草甘蔗渣或木屑、棉子殼70～80，蔗糖或葡萄糖1，麩皮或米糠20～28，石膏或碳酸鈣1。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中所述的灰樹花培養(yǎng)物過濾得GF103-21的菌絲體，菌絲細(xì)胞破碎后，溫菌絲體加10-20倍水，在90～100℃熱水中回流提取2～5小時，得菌絲體提取液，濃縮后加2～5倍的95％乙醇，在0～4℃沉淀8～10小時，層析物干燥得灰褐色的灰樹花多糖肽。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種灰樹花的發(fā)酵工藝及其多糖肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法是將從腐木上組織分離的灰樹花GF103菌株純化后，采用物理法對其菌絲體進(jìn)行誘變，經(jīng)初篩和復(fù)篩后，獲得液體發(fā)酵菌絲體生物量多、多糖肽產(chǎn)量高的優(yōu)質(zhì)菌株GF103－21。用天然黃豆粉、麩皮、葡萄糖或蔗糖、酵母粉、玉米漿、硫酸鎂、磷酸二氫鉀等作為培養(yǎng)基，從斜面菌種，到搖瓶種子，一級種子、二級種子，到發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵工藝流程，獲得含菌絲體及多糖肽較高的灰樹花發(fā)酵液。從GF103－21的菌絲體中，用熱水提取，乙醇沉淀等方法，獲得一種具有生物免疫調(diào)節(jié)劑作用的灰樹花多糖肽。
文檔編號C12N1/14GK1398979SQ0213651
公開日2003年2月26日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者錢秀萍, 藍(lán)德剛, 王強(qiáng) 申請人:維京仲華(上海)生物醫(yī)藥科技有限公司