一種非依賴裂解基因e的菌蛻制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種菌蛻制備方法，特別涉及一種非依賴裂解基因 E的菌蛻制備方 法，本發(fā)明還涉及應(yīng)用該方法制備的菌蛻的應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌菌蛻（Bacterial ghost)是不包含核酸及細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)容物的細(xì)菌空殼， 目前菌蛻制備策略和技術(shù)絕大多數(shù)是基于噬菌體PhiX174的裂解基因 E表達(dá)裂解蛋白，從 而裂解革蘭氏陰性菌形成的。菌蛻極為完整地保留了和活菌一致的細(xì)菌胞膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)抗 原成分，從而能夠誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。菌蛻外膜的天然的高度保守結(jié)構(gòu) PAMP(pathogen_associated molecular patterns)，例如：脂多糖、肽聚糖、菌毛等，能被免 疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體識(shí)別，有效地被樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬，并有效地促進(jìn)樹突 狀細(xì)胞的成熟和活化。菌蛻的這些生物學(xué)特點(diǎn)使其可直接作為疫苗使用，還可作為遞呈異 源抗原的重組疫苗及作為蛋白、核酸甚至藥物的遞送載體。
[0003] 應(yīng)用裂解基因 E制備菌蛻，需要將裂解基因 E克隆至表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)裂解基因 E的可控表達(dá)。裂解基因 E的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)已經(jīng)成功地應(yīng)用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙 門氏菌、腸炎沙門氏菌、霍亂弧菌、肺炎克雷伯氏菌、幽門螺旋桿菌、胸膜肺炎放射桿菌、流 感嗜血桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、遲鈍愛德華菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌等。然而 仍有很多種病原菌存在著顯著的限制性遺傳屏障，裂解基因 E的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)無法導(dǎo)入這 些菌體或無法被識(shí)別并啟動(dòng)表達(dá)，因此難以成功制備菌蛻。另外，制備菌蛻時(shí)，將裂解基因 E 的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)導(dǎo)入細(xì)菌的同時(shí)也引入了抗生素抗性基因，易導(dǎo)致抗生素抗性基因的側(cè)向 傳播，并且裂解基因 E的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)導(dǎo)入菌體及誘導(dǎo)表達(dá)需要消耗一定的時(shí)間。因此，尋 找到一種不依賴于裂解基因 E的快速制備菌蛻的方法是眾多病原菌，尤其是存在限制性遺 傳屏障的病原菌，能夠成功制備菌蛻的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)目前應(yīng)用裂解基因 E制備菌蛻方面的不足，本發(fā)明提供了一種非依賴裂解基 因 E的菌蛻制備方法。該方法采用NaOH、Triton X-100、Na2EDTA和H2O2這4種化合物來制 備菌蛻，突破了依賴裂解基因 E制備菌蛻的局限性，能廣泛有效地應(yīng)用于眾多病原菌，尤其 是存在限制性遺傳屏障的病原菌菌蛻制備。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種非依賴裂解基因 E的菌蛻制備方法，其特征是，通過在 細(xì)菌懸液中加入NaOH、Triton X-100、Na2EDTA和H2O2四種化學(xué)物質(zhì)制備菌蛻，滿足了菌體 內(nèi)容物的完全釋放與菌體空殼的完整性的要求。
[0006] 進(jìn)一步的，上述方法具體為：
[0007] (1)應(yīng)用微量肉湯稀釋法測(cè)定上述四種化學(xué)物質(zhì)的最小抑菌濃度（MIC)和最小細(xì) 菌生長(zhǎng)濃度（MGC);
[0008] (2)應(yīng)用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得制備菌蛻所需要的上述四種化學(xué)物質(zhì)的 最佳濃度；
[0009] (3)將細(xì)菌培養(yǎng)物通過離心收集菌體，沖洗后用雙蒸水重懸菌體；按照上述最佳 濃度將NaOH、Triton X-KKKNa2EDTA和H2O2分別添加到細(xì)菌懸液中培養(yǎng)；培養(yǎng)完畢后，混合 物離心后沖洗菌體沉淀，然后將菌體沉淀重懸在滅菌雙蒸水中，冷凍后（_20°C)室溫振蕩 4-6min，離心后沖洗菌體沉淀，最后獲得的菌體沉淀即為菌蛻，取少量菌蛻進(jìn)行活菌檢測(cè)， 應(yīng)無活菌生長(zhǎng)。將菌蛻冷凍干燥后保存。
[0010] 進(jìn)一步的，所述菌蛻為大腸桿菌0138菌蛻，所述NaOH、Triton X-100、Na2EDTA和 H2O2的濃度可以采用以下技術(shù)方案：
[0011] (l)NaOH、Na2EDTA和H2O2的濃度為最小細(xì)菌生長(zhǎng)濃度（MGC)，Triton X-100的濃 度為最小抑菌濃度（MIC);
[0012] (2)NaOH和H2O2的濃度為最小細(xì)菌生長(zhǎng)濃度（MGC) ,Triton X-100和Na2EDTA的濃 度為最小抑菌濃度（MIC);
[0013] (3) NaOH、Na2EDTA和Triton X-100的濃度為最小細(xì)菌生長(zhǎng)濃度（MGC)，H2O2的濃 度為最小抑菌濃度（MIC);
[0014] (4) NaOH和Na2EDTA的濃度為最小細(xì)菌生長(zhǎng)濃度（MGC)，Triton X-100和H2O2的濃 度為最小抑菌濃度（MIC)。
[0015] 進(jìn)一步的，所述H2O2采用濃度為30%的H2O 2。
[0016] 進(jìn)一步的，Na0H、Na2EDTA、30% !1202和 Triton X-100 的 MIC 為 I. 0mg/ml、0. 93mg/ ml、5. 0 μ 1/ml 和 6· 25 μ 1/ml。Na0H、Na2EDTA、30% !1202和 Triton X-100 的 MGC 為 0· 15mg/ ml、0. 19mg/ml、0. 80 μ1/ml 和 0· 78 μ1/ml。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選的大腸桿菌0138菌蛻的制備方法為：將大腸桿菌0138培養(yǎng)物通過離 心（5000rpm，10min)收集菌體，用PBS緩沖液（0.01M，ρΗ7·4)沖洗后用雙蒸水重懸菌體， 調(diào)整細(xì)菌濃度為（〇. 8-1. 2) X 106CFU/ml ;按照上述濃度將NaOH、Triton X-100、Na2EDTA和 H2O2分別添加到細(xì)菌懸液中培養(yǎng)50-70分鐘，混合物離心后PBS緩沖液沖洗菌體沉淀，然后 將菌體沉淀重懸在滅菌雙蒸水中，冷凍后（_20°C)室溫振蕩4-6min，離心后PBS緩沖液沖 洗菌體沉淀。最后獲得的菌體沉淀即為菌蛻，取少量菌蛻進(jìn)行活菌檢測(cè)，應(yīng)無活菌生長(zhǎng)。將 菌蛻冷凍干燥后保存。
[0018] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明制備的菌蛻，除了裂解孔隙外，菌蛻的細(xì)胞形態(tài)和表 面結(jié)構(gòu)未見明顯改變，菌蛻的質(zhì)量達(dá)到100%。本發(fā)明進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明制備的 菌蛻能靶向進(jìn)入特定細(xì)胞（如Hela細(xì)胞），對(duì)細(xì)胞沒有毒性，可作為藥物的新型遞送載體。 本發(fā)明制備的菌蛻還能通過腹腔注射免疫或口服灌胃免疫BALB/c小鼠，對(duì)同源攻毒具有 很好的保護(hù)效率，可作為新型疫苗。
[0019] 本發(fā)明的機(jī)理是：成功制備的細(xì)菌菌蛻要滿足兩個(gè)條件：菌體內(nèi)容物的完全釋放 與菌體空殼的完整性。本發(fā)明采用Na0H、Triton X-KKKNa2EDTA和H2O2這4種化合物來制 備菌蛻；其中NaOH能干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，Triton X-100能破壞細(xì)胞膜的磷脂雙分子層 使胞內(nèi)物質(zhì)釋放，Na2EDTA可以螯合連接相鄰脂多糖的Ca 2+、Mg2+從而破壞脂多糖，H 202用作 氧化劑來降解DNA。采用上述四種物質(zhì)成功制備了細(xì)菌菌蛻，滿足了菌體內(nèi)容物的完全釋放 與菌體空殼的完整性的要求。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)快速制備菌蛻，突破了依賴裂解基因 E制備菌蛻的局限性，能廣泛有效地應(yīng)用于眾多病原菌，尤其是存在限制性遺傳屏障的病原 菌菌蛻制備。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，制備的菌蛻除了裂解孔隙外，細(xì)胞形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)未 見明顯改變。菌蛻能靶向進(jìn)入特定細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞沒有毒性，且具有良好的免疫原性，可作為 藥物的新型遞送載體或新型疫苗。
【附圖說明】
[0021] 圖1為大腸桿菌0138菌蛻的掃描電鏡照片；
[0022] 圖2為菌蛻孵育的Hela細(xì)胞（a)和正常的Hela細(xì)胞（b)的透射電鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步闡釋本發(fā)明，本發(fā)明提供的一種非依賴裂解基因 E 的菌蛻制備方法的優(yōu)勢(shì)將隨著描述而更為清晰。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均 為常規(guī)方法。本發(fā)明以可引起仔豬水腫病的大腸桿菌（Escherichia coli) 0138為例說明。
[0024] 實(shí)施例1、化學(xué)物質(zhì)