專利名稱：大豆乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，特別是來源于大豆的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用。
大豆作為一種重要的油料和糧食作物，改善其抗病性以及抗逆性具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。
本發(fā)明所提供的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子的名稱為GmEREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中序列2氨基酸殘基序列是由384個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。所述序列2中自碳端到氮端第117-174個氨基酸殘基是轉(zhuǎn)錄因子GmEREB的ERF功能保守域。
乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子GmEREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；
2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1599個堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)榈?06到第1257位堿基，其表達(dá)主要受乙烯、干旱、低溫以及高鹽的瞬時誘導(dǎo)。
利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的編碼轉(zhuǎn)錄因子GmEREB的基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得對干旱、低溫和高鹽脅迫耐受力得到增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記。攜帶有本發(fā)明GmEREB基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞，被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，特別是培育抗旱、抗寒和抗鹽的植物品種，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
圖2為Southern雜交分析結(jié)果。
圖3為不同脅迫條件下Northern雜交檢測的GmEREB基因表達(dá)特征。
取1μg總RNA通過4對特異簡并性引物(四條正向引物與一條反向引物組合)進(jìn)行各自獨(dú)立的一步逆轉(zhuǎn)錄鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)(PCR)。四條對應(yīng)于RAP2.2和RAP2.12的AP2/EREBP保守域N-端的5’-YRGIRQ-3’正向引物(Forward primers)是DF15’-TA(C/T)CGIGGIAT(A/C/T)CGICA(A/G)-3’DF25’-TA(C/T)CGIGGIAT(A/C/T)AG(A/G)CA(A/G)-3’
DF35’-TA(C/T)AG(A/G)GGIAT(A/C/T)CGICA(A/G)-3’DF45’-TA(C/T)AG(A/G)GGIAT(A/C/T)AG(A/G)CA(A/G)-3’一條對應(yīng)于AP2/EREBP保守域C-端的反向引物5’-AKVNFP-3’(Reverseprimers)是DR15’-IGG(A/G)AA(A/G)TTIAC(C/T)TTIGC-3’上述引物中，I(inosine)為次黃苷。PCR條件為4℃，3分；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，1.5分-30循環(huán)；72℃，10分；4℃保存。PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上用于測序。
再以陽性克隆為模板，利用一對特異性引物，DFR5’-CTGGCGGATTCCGCGATA-3’；DRF5’-GCCAAGGTGAATTTCCCT-3’通過逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因的5’端以及3’端。然后體外包裝In vitro-GmEREB基因序列，再設(shè)計(jì)一對特異性引物GmF5’-ATGTGTGGTGGTGCGATT-3’和GmR5’-GAAGACTCCT GCCATGGA-3’擴(kuò)增GmEREB-cDNA，PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T載體進(jìn)行測序，得到了一個與體外包裝序列完全一致的cDNA克隆，命名為GmEREB，為序列表中的序列1。該基因插入片段1599bp，含有1152bp的開放閱讀框架(106起始-1257終止)，編碼384個氨基酸組成的多肽(序列表中的序列2)，其5’端為115bp，3’端為282bp。該基因含有一個典型的植物轉(zhuǎn)錄因子EREBP家族中所特有的AP2/ER EBP結(jié)構(gòu)保守域，該結(jié)構(gòu)域能夠與乙烯應(yīng)答元件GCC合子核心的順式作用元件相互作用而啟動目的抗逆基因的表達(dá)。
實(shí)施例2、大豆GmEREB基因在大場桿菌中的體外表達(dá)鑒定根據(jù)序列1設(shè)計(jì)一對特異性引物GmERFF331 5’-AAAAGAATTCTTTGGGTTCTCTCGCTCC-3’348和GmERFR1044 5’-AAAACTCGAGCACCACATCCTGCGAGTT 1027，通過PCR擴(kuò)增得到一個712bp的包含AP2/EREBP結(jié)構(gòu)保守域的cDNA片段，并將其插入到蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-1(GST)相對應(yīng)的位點(diǎn)上，然后轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，經(jīng)IPTG在大腸桿菌中誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測表明該基因能夠在大腸桿菌中進(jìn)行體外翻譯表達(dá)，聚丙烯凝膠電泳譜帶如

圖1所示，圖中，M是Marker；1、3是經(jīng)誘導(dǎo)的菌株；2是未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株。從圖中可以看出，經(jīng)誘導(dǎo)的菌株有蛋白條帶出現(xiàn)，未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株沒有蛋白條帶出現(xiàn)。
實(shí)施例3、GmEREB基因在大豆中的拷貝數(shù)量分析利用經(jīng)同位素磷-32標(biāo)記的GmEREB cDNA編碼區(qū)為探針與經(jīng)三種不同限制性內(nèi)切酶(SalI，EcoRV和XhoI)消化的大豆植物基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析，并經(jīng)高嚴(yán)謹(jǐn)度洗膜(高嚴(yán)謹(jǐn)度的條件是0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)，結(jié)果如圖2所示，每一種消化的DNA均有多條雜交帶出現(xiàn)，表明GmEREB基因是一個多拷貝基因。
實(shí)施例4、大豆GmEREB基因在逆境脅迫條件下的表達(dá)特征。
生長2個星期的大豆幼苗分別置于4℃水、250mM NaCl水溶液以及2mM乙烯溶液中在室溫下進(jìn)行光照培養(yǎng)，干旱處理是將生長2個星期的大豆幼苗經(jīng)水洗凈后置于足以吸干水分的濾紙上在室溫下脫水。對上述所有處理分別在1小時、5小時、12小時以及24小時取樣，提取總RNA與GmEREB cDNA探針雜交。結(jié)果如圖3所示，其中A是干旱處理的結(jié)果，B是4℃低溫處理的結(jié)果，C是250mM NaCl處理的結(jié)果，D是2mM乙烯處理的結(jié)果，從圖中可以看出，基因GmEREB的轉(zhuǎn)錄主要受乙烯與干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)，并不同程度受低溫以及鹽的誘導(dǎo)。
序列表<160>2<210>1<211>1599<212>DNA<213>大豆屬大豆(Glycine max(L.)Merr.)<400>1tgattgagcc aaagctttgt attttctgcg ataattttcc attgggtgga agaaagtctc 60aacctttatt cgaaagagca aggatctgag ttgagttgag tgatcatgtg tggtggtgcg 120attatctccg acttcatacc ggcaggtccc gccagcgggg cgcggcgcgt gaccgccgac 180atcctgtggc cgagtttgag gaagcgcttc tcgaagccgc tgctggacga tgatttcgag 240gctgggttca gagaattcaa ggatgattcg gaaatcgagg atgttgatga cgaggacgat 300gaagacgagg aggagttgaa gaagaagccc tttgggttct ctcgctccag caacaaggct 360gcttctaagc ctctctctcg tggagcaaca actgtgaaat ctgtggaatc aaaggggcaa 420gctgagaagt gtgccaagag aaagaggaag aaccagtatc gcggaatccg ccagcgtcca 480tggggaaagt gggctgctga gattcgcgac ccaagaaagg gggttcgtgt ttggcttgga 540actttcagca ctgctgaaga agctgcaaga gcttacgatg ctgaagcaag gaggatccgt 600ggcaagaaag ccaaggtgaa tttccctgat gagccttcag gcgctgcttc ctcaaaacgt 660ctcaaggcga atccagaggc tcagccaatg aagaaaaatc tgaactctgt gaagccgaaa 720ataaaccaga tgttcaattt tggtgacaat cttgagggct actacagccc tatagatcag 780gtggaacaga aaccactggt taaccagtat gttaaccgtg ccccgtttgc tggaaatgga 840gttcaagtct cacctgttac tccatctgct gatgttactg cttacttcag ctctgagcat 900tcgagcaact cgtttgatta ttctgacctt ggatggggtg aacaagtccc caagaccccc 960gagatctcat ccttgctttc tgctgctcct ttggagggtg ctgctgatca ggttcagaag 1020accaacaact cgcaggatgt ggtggctgca caagatgatt ctgcaaaaac cctttccgaa 1080gagcttgcag acattgaatc ccagctcaag ttctttgaga ccccttcttt tcttgatgaa 1140gcctgggctg atgctacatt ggcgtctttg ctcggcggag acgcaactca tgacgccgcc 1200ggaaacccta tgaacctttg gagcttcgac gacctgcctt ccatggcagg agtcttctga 1260acacccttta tctccccttt tatgtaaata aagctacaag aattgtgatc gtgatgttgg 1320tgatggagtc cacagccaag aaacctgctt aaagcttatg tggagtttat tttatcttgt 1380agctaatgca gtagtatagg actatatata ggtttttatt atagggtatc cttttgtgaa 1440ctcaaagacc tcgttttcag gggattttct gtttgatgtc cttaaggatt atcaattatg 1560ttatatatgg tcttggataa aaataaaaaa aaaaaaaaa1599<210>2<211>384<212>PRT<213>大豆屬大豆(Glycine max(L.)Merr.)<400>2Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Asp Phe Ile Pro Ala Gly Pro5 10 15Ala Ser Gly Ala Arg Arg Val Thr Ala Asp Ile Leu Trp Pro Ser20 25 30Leu Arg Lys Arg Phe Ser Lys Pro Leu Leu Asp Asp Asp Phe Glu35 40 45Ala Gly Phe Arg Glu Phe Lys Asp Asp Ser Glu Ile Glu Asp Val50 55 60Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Pro65 70 75Phe Gly Phe Ser Arg Ser Ser Asn Lys Ala Ala Ser Lys Pro Leu80 85 90Ser Arg Gly Ala Thr Thr Val Lys Ser Val Glu Ser Lys Gly Gln95 100 105Ala Glu Lys Cys Ala Lys Arg Lys Arg Lys Ash Gln Tyr Arg Gly110 115 120Ile Arg Gln Arg Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp125 130 135Pro Arg Lys Gly Val Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Ser Thr Ala140 145 150Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Arg Ile Arg155 160 165Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro Asp Glu Pro Ser Gly Ala170 175 180Ala Ser Ser Lys Arg Leu Lys Ala Ash Pro Glu Ala Gln Pro Met185 190 195Lys Lys Asn Leu Asn Ser Val Lys Pro Lys Ile Asn Gln Met Phe200 205 210Asn Phe Gly Asp Asn Leu Glu Gly Tyr Tyr Ser Pro Ile Asp Gln215 220 225Val Glu Gln Lys Pro Leu Val Asn Gln Tyr Val Asn Arg Ala Pro230 235 240Phe Ala Gly Asn Gly Val Gln Val Ser Pro Val Thr Pro Ser Ala245 250 255Asp Val Thr Ala Tyr Phe Ser Ser Glu His Ser Ser Asn Ser Phe260 265 270Asp Tyr Ser Asp Leu Gly Trp Gly Glu Gln Val Pro Lys Thr Pro275 280 285Glu Ile Ser Ser Leu Leu Ser Ala Ala Pro Leu Glu Gly Ala Ala290 295 300Asp Gln Val Gln Lys Thr Asn Asn Ser Gln Asp Val Val Ala Ala305 310 315Gln Asp Asp Ser Ala Lys Thr Leu Ser Glu Glu Leu Ala Asp Ile320 325 330Glu Ser Gln Leu Lys Phe Phe Glu Thr Pro Ser Phe Leu Asp Glu335 340 345Ala Trp Ala Asp Ala Thr Leu Ala Ser Leu Leu Gly Gly Asp Ala350 355 360Thr His Asp Ala Ala Gly Asn Pro Met Asn Leu Trp Ser Phe Asp365 370 375Asp Leu Pro Ser Met Ala Gly Val Phe380 38權(quán)利要求
1.乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子GmEREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于它是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于所述序列2中自氮端到碳端第117-174個氨基酸殘基保守結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄因子GmEREB的ERF功能保守域。
4.乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子GmEREB的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子GmEREB的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第106到第1257位堿基。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的表達(dá)載體。
8.含有權(quán)利要求4所述基因的細(xì)胞系。
9.權(quán)利要求4所述基因在培育抗逆境植物品種中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述逆境為旱害、寒害和鹽害。
全文摘要
本發(fā)明公開了大豆乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因與應(yīng)用，目的是提供具有較強(qiáng)抗逆效果的來源于大豆的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因。本發(fā)明所提供的乙烯應(yīng)答結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子的名稱為GmEREB，是具有序列表中序列2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。GmEREB的編碼基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤鼓嬷参锲贩N，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK1475496SQ02128818
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月14日
發(fā)明者侯玉霞, 程憲國, 劉強(qiáng) 申請人:清華大學(xué)