一種編碼甘薯ERF轉(zhuǎn)錄因子的IbERF4基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種編碼甘薯ERF轉(zhuǎn)錄因子的IbERF4基因、 該基因編碼的蛋白質(zhì)以及含有該基因的重組載體及基因的抗逆應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在植物中許多基因都受逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，根據(jù)作用方式的不同，主要分為兩大 類：調(diào)芐基因和功能基因。調(diào)芐基因主要是在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因 子；功能基因主要編碼一些調(diào)節(jié)滲透勢(shì)、清除自由基和活性氧的酶等。一般認(rèn)為，植物對(duì)干 旱和高鹽等逆境的抗性受多基因控制，因此，利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入單個(gè)功能基因雖然能 增加植物的某種單一抗性，但并不能從整體上綜合提高植物的抗逆性。轉(zhuǎn)錄因子作為功能 基因表達(dá)的調(diào)節(jié)開關(guān)，可以對(duì)不同的基因進(jìn)行精確的調(diào)節(jié)，在植物逆境信號(hào)傳遞過程中發(fā) 揮著關(guān)鍵的作用，所以通過增強(qiáng)某個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的作用，可促使多個(gè)與抗逆有關(guān)的功能基因 表達(dá)，這是使植物抗逆性狀獲得綜合改良的一條非常有效的途徑。
[0003] 植物AP2/ERF是一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，含有由60~70個(gè)氨基酸組成的 AP2/ERF結(jié)構(gòu)域而得名，存在于所有的植物中。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子參與多種生物學(xué)過程，包 括植物生長(zhǎng)、花發(fā)育、果實(shí)發(fā)育、種子發(fā)育、損傷、病菌防御、高鹽、干旱等環(huán)境脅迫響應(yīng)等。 AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子參與水楊酸、茉莉酸、乙烯、脫落酸等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而且是逆境信 號(hào)交叉途徑中的連接因子。根據(jù)含AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子含5個(gè)亞組，包 括AP2(APETALA 2)、RAV(related to ABI3/VP1)、DREB(dehydration-responsive element binding protein)、ERF和其他。AP2家族含 2個(gè)AP2/EREBP (ethylene-responsive element binding protein)結(jié)構(gòu)域，ERF和DREB家族僅含I個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，而RAV家族除一 個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域外還含1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域。ERF家族是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子大家族的一個(gè)主 要亞家族，在調(diào)節(jié)植物生物和非生物逆境反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在擬南芥和水稻基因組中 分別含有122和139個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，根據(jù)基因序列系統(tǒng)樹和蛋白保守結(jié)構(gòu)域等 特征，擬南芥和水稻ERF基因分別組成12和15個(gè)不同的組。
[0004] 甘薯不僅是重要的糧食作物，而且還是重要的經(jīng)濟(jì)作物和能源作物。甘薯廣泛種 植在世界上的100多個(gè)國(guó)家，我國(guó)是世界上的最大生產(chǎn)國(guó)，甘薯生產(chǎn)約占世界甘薯的80%。 與其他糧食作物相比，甘薯相對(duì)較為耐旱，但品種間差異較大，世界上相當(dāng)比例的甘薯種植 在干旱的環(huán)境下，而世界干旱、半干旱地區(qū)已占陸地面積的三分之一以上，干旱對(duì)植物的 影響在諸多自然逆境因素中居首位。我國(guó)現(xiàn)有邊際性土地資源（非耕地）約20億畝，主要 是干旱、鹽堿灘涂地。在我國(guó)農(nóng)業(yè)用水緊缺、耕地面積緊張的形勢(shì)下，在這些地區(qū)開發(fā)種植 耐旱甘薯，既能合理的利用土地資源，又能部分緩解糧食和能源緊缺問題。通過定向改良甘 薯的抗逆境能力，提高甘薯在邊際性土地區(qū)的生長(zhǎng)適應(yīng)性，對(duì)確保我國(guó)的糧食安全具有重 要的戰(zhàn)略意義。因此在甘薯中克隆新的ERF類轉(zhuǎn)錄因子基因，研宄其基本的生物學(xué)特性和 功能，可為整個(gè)植物抗逆基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及脅迫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，并為改良作物 抗逆性提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種編碼甘薯ERF轉(zhuǎn)錄因子的IbERF4基因。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種該基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有該基因的表達(dá)載體。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供該基因的用途。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0011] 一種編碼甘薯ERF轉(zhuǎn)錄因子的IbERF4基因，它是SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。 所述的核苷酸序列由684個(gè)堿基組成。所述IbERF4基因具有負(fù)責(zé)調(diào)控植物耐逆與促進(jìn)植 物衰老的功能。
[0012] 上述基因編碼的蛋白質(zhì)，它是SEQ ID No. 2所不的氣基酸序列。所述的序列由227 個(gè)氨基酸殘基組成。
[0013] 一種含有上述基因的表達(dá)載體pCAMBIA1305-LcERF，它含有SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列。
[0014] 一種含有表達(dá)載體農(nóng)桿菌宿主細(xì)胞EHA105:pCAMBIA1305-2X35s-IbERF4的構(gòu) 建。
[0015] 上述基因在轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用，尤其是在制備轉(zhuǎn)基因擬南芥中的 應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 發(fā)明從甘薯中分離出編碼ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的完整cDNA，連接到植物表達(dá)載體 上，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化植物，獲得的轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了抗逆性分析，結(jié) 果表明IbERF4基因能夠響應(yīng)逆境信號(hào)，負(fù)調(diào)控植物的耐旱鹽等能力，并且促進(jìn)植株的衰 老。此基因可以應(yīng)用于植物遺傳改良。
【附圖說明】
[0017] 圖I. IbERF4氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果
[0018] 圖2. IbERF4基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)
[0019] 圖3. IbERF4基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)
[0020] 圖4.甘薯不同葉齡中IbERF4的表達(dá)
[0021] 圖 5. pCAMBIA1305-2 X 35s-IbERF4 載體示意圖
[0022] 圖6.轉(zhuǎn)化空載體的擬南芥株系和轉(zhuǎn)IbERF4基因植株抗旱比較
[0023] 圖7.轉(zhuǎn)化空載體的擬南芥株系和轉(zhuǎn)IbERF4基因植株耐鹽比較
[0024] 圖8.轉(zhuǎn)化空載體的擬南芥株系和轉(zhuǎn)IbERF4基因植株老化比較
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但下述實(shí)施例中所涉及的具體實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法或按照制 造廠商說明書建議的條件實(shí)施。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 甘薯中ERF轉(zhuǎn)錄因子IbERF4基因序列獲得，具體如下：
[0028] 利用OMEGA RNA試劑盒，從IOOmg的新鮮的甘薯葉片中提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試 劑盒（Bioteke)合成 cDNA。
[0029] 具體反應(yīng)體系如下：
[0030] Total RNA 0.2-2ug Oligo dT(50 uM) Iul dNTP mixture(10mM each) Iul Sxfirst strand buffer 4ul M-MLV Reverse Transcriptase (200U/ul) Iul Rnase Inhibitor (40U/ul) Iul Rnase Free dH20 up to 20uI
[0031] 在PCR儀上按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：l、50°C，45min ;2、70°C，10min ;之后冰上 冷卻。
[0032] 將提取的總RNA送華大基因 （Bei jing Genomic Institute, BGI)，通過高通 量測(cè)序獲得甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并通過De novo拼接獲得甘薯Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)，其中 Unigene23081與NR數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)該基因可能參與逆境響應(yīng)。將Unigene23081通過 OFR FINDER(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/gorf/)在線軟件預(yù)測(cè)基因完成的 0RF，并利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整ORF引物：
[0033] IbERF4(F):5' CCTCTTTCGATTTCCACCTTAT 3'
[0034] IbERF4(R):5, CAATTCGCTCTGTCGGCTGTA 3，
[0035] 利用TAKARA公司Primerstar GXL DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，具體步驟如下：
[0036] 5x PrimeSTAR GXL Buffer IOuI dNTP Mixture (2.5 mM each) 4ul lbERF4 (F) 10~15pmol 2ul lbERF4 (R) 10~15 pmol 2ul Template 2ul PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Iul 滅菌蒸饋水 upto50ul
[0037] 反應(yīng)條件如下：94°C，4min ;98°C，IOSec ;55°C，15Sec ;68°C，I. 5min ;72°C，IOmin ; 30個(gè)循環(huán)。使用OMEGA DNA純化試劑盒將PCR產(chǎn)物純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pEASY-Blunt 載體連接（本過程使用TransGEN的pEASY-Blunt Vector Cloning Kit試劑盒），反應(yīng)體系 如下：IbERF4 基因的 cDNA 片段 4ul，pEASY-Blunt 載體 lyL。反應(yīng)條件：20-30°C，30min。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E-Coli·DH5α感受態(tài)，涂布在含有40ul25mg/ml的X-Gal、16ul50mg/ml的 IPTG、100mg/mL Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。挑選白色菌落，使用菌落 PCR法確認(rèn)pEASY-Blunt載體中插入片段的長(zhǎng)度大小，與預(yù)期一致。送南京金斯瑞生物科技 公司測(cè)序獲得基因序列SEQ ID NO. 1。
[0038] 實(shí)施例2
[0039] IbERF4蛋白序列同源分析，具體如下：
[0040] 測(cè)序獲得cDNA全長(zhǎng)907bp，ORF為684bp，編碼227個(gè)氨基酸SEQ ID NO. 2,將翻 譯獲得蛋白序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)（http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，獲得了與IbERF4蛋白序列相似的植物種屬同源基因。在多重比較分析的基礎(chǔ)上，建 立了各同源植物種屬基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，詳見圖1。包括煙草（Nicotiana tabacum)，土豆 (Solanum tuberosum)，蕃前（Solanum Iycopersicum)，辣椒（Capsicum annuum)，黃花螺方定 理藻（Genlisea aurea)，咖啡（Coffea arabica)，橡