一種珠子參轉(zhuǎn)錄因子基因PjbHLH1的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，尤其是一種珠子參皂苷生物合成轉(zhuǎn)錄因子基因pjbHLH:mm%。
【背景技術(shù)】
[0002]珠子參Parmx japonicus C.A.Mey.var.major (Burk.) C.Y.Wu et Κ.M.Feng為五加科Araliaceae人參屬植物，因根莖節(jié)間纖細(xì)，節(jié)膨大成球形念珠狀而得名，其根莖入藥。珠子參作為藥材，始載于《滇南本草》，為歷版《中國藥典》收載品種。藥用珠子參主產(chǎn)于云南，屬名貴常用中藥材，是彝族、納西族、白族、藏族、傈僳族等少數(shù)民族的傳統(tǒng)用藥。目前，野生珠子參主要分布于滇西北、滇東北地區(qū)，常見于海拔達(dá)2500-4000m的亞高山針葉林及闊葉林下。珠子參性味苦、甘、微寒，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有補肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛，止血之功效，臨床上應(yīng)用于氣陰兩虛，煩熱口渴，虛癆咳嗽，跌打損傷，關(guān)節(jié)疼痛，咳血，吐血，外傷出血等。
[0003]珠子參阜苷{(diào)Panax japonicus saponins, PJS)為珠子參的主要活性成分，包括達(dá)瑪烷型、齊墩果烷型三萜皂苷。目前，已從珠子參根莖及葉中分離出了 30多種皂苷成分，主要包括竹節(jié)參皂苷IVa、竹節(jié)參皂苷IV、竹節(jié)參皂苷V、人參皂苷Ro、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rbl等。人參屬的代表物種“人參”ginseng)主要含達(dá)瑪烷型皂苷，齊墩果烷型皂苷僅發(fā)現(xiàn)含量極微的人參皂苷Ro ;另一種人參屬著名藥材“三七” {Panaxnotoginseng)，只含達(dá)瑪烷型皂苷，不含齊墩果烷型皂苷。珠子參所含皂苷組分與同屬“人參”、“三七”相比，在成分種類以及各組分含量上均存在明顯差異，因其含有大量齊墩果烷型皂苷，導(dǎo)致臨床上的特殊用途。
[0004]珠子參為多年生草本植物，需生長6年以上方能入藥。目前，珠子參藥材多為野生品，無序采挖導(dǎo)致珠子參資源日漸枯竭，生境受到破壞。近些年，以珠子參為組分的藥品市場迅速擴(kuò)大，導(dǎo)致珠子參藥材需求增長，供需矛盾突出。鑒于人工栽培時間長，化學(xué)合成機理和路線不夠清晰等弊端，利用生物工程技術(shù)和基因調(diào)控的方法來生產(chǎn)珠子參皂苷逐漸成為研究熱點。
[0005]轉(zhuǎn)錄因子對基因的轉(zhuǎn)錄激活是植物次生代謝過程重要的調(diào)控環(huán)節(jié)。利用轉(zhuǎn)錄因子作為改造植物代謝途徑的工具，以其獨有的“多點調(diào)控”優(yōu)勢，彌補了代謝工程操作中單個關(guān)鍵酶基因作用不足和多個關(guān)鍵酶基因可能產(chǎn)生組成性致死表達(dá)的情況，成為一種新的策略。次生代謝途徑中多個功能相關(guān)的酶基因常被同一轉(zhuǎn)錄因子正調(diào)控或負(fù)調(diào)控，對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因修飾顯然比多基因操作更容易改良目標(biāo)次生代謝途徑。
[0006]含堿性/螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(basic/helix-loop-helix，bHLH)的轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于生物中，是真核生物中一類含有眾多成員的重要轉(zhuǎn)錄因子。越來越多的研究表明該類轉(zhuǎn)錄因子對真核生物的次生代謝過程具有重要調(diào)控作用。例如青蒿UriMkiaapiacea ) AabHLHl轉(zhuǎn)錄因子可以提高青蒿素生物合成相關(guān)的紫穗槐4，11- 二稀合酶(ADS)和細(xì)胞色素P450單加氧酶(CYP71AV1)基因的表達(dá)量，正調(diào)控青蒿素的合成；紅豆杉(Taxuschinensis)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子TcJAMYC可與紫杉醇生物合成相關(guān)基因啟動子的E_box結(jié)合，激活這些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，提高紫杉醇的合成量。
[0007]隨著對植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)的深入解析和調(diào)控機制的闡明，特別是調(diào)節(jié)特定次生代謝物合成的轉(zhuǎn)錄因子的分離和鑒定，基于轉(zhuǎn)錄因子的基因工程將為開發(fā)利用植物次生代謝物提供更加有效的手段。本發(fā)明以體外培養(yǎng)的珠子參愈傷組織為研究對象，克隆PjbHLHl轉(zhuǎn)錄因子基因，并對該轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析和功能鑒定，明確PjbHLHl轉(zhuǎn)錄因子在珠子參皂苷生物合成過程中的地位和作用，為獲得高效、穩(wěn)定的珠子參皂苷合成調(diào)控技術(shù)和同源或異源高效表達(dá)系統(tǒng)的建立提供理論參考和依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種珠子參轉(zhuǎn)錄因子基因Pjbrnmmk，即珠子參轉(zhuǎn)錄因子基因在提高珠子參皂苷生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量和增加珠子參愈傷組織中皂苷含量中的應(yīng)用；本發(fā)明從珠子參中克隆獲得可調(diào)控珠子參皂苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子基因以及明確該轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明基于同源克隆的原理，從珠子參中克隆得到bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因的cDNA并對其編碼蛋白進(jìn)行功能鑒定。發(fā)明人將這個基因命名為PjbHLHl,基因登錄號為KP890785，其中所述cDNA如SEQ ID NO: I所示。對該基因進(jìn)行序列分析，表明份cDNA大小為966 bp，正好為開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼含有321個氨基酸的蛋白質(zhì)，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。利用植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胫樽訁⒂鷤M織中，可提高珠子參皂苷合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，使珠子參皂苷的產(chǎn)量增加。
[0010]上述轉(zhuǎn)錄因子基因可應(yīng)用于正調(diào)控珠子參皂苷的生物合成，具體操作如下:
(1)基因的獲得:提取珠子參總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；通過RT-PCR擴(kuò)增出/!/??份的全長編碼區(qū)，然后將其連接到pGEM-T easy載體上，經(jīng)測序驗證獲得具有目的基因的克隆；
(2)植物表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化:用限制性內(nèi)切酶ZAaI和Pstl酶切vGm-?-PjbHLHljmtL,通過膠回收獲得目的基因片段。用同樣的內(nèi)切酶消化植物表達(dá)載體PCAMBIA2300S，膠回收獲得載體大片段。將目的基因片段與pCAMBIA2300S載體片段連接，構(gòu)建植物超表達(dá)載體pCAMBIA2300S-/^M￡份。通過液氮凍融法將pCAMBIA2300S_/^M￡份質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將PjbHLHl導(dǎo)M好參愈、傷組織中使其過量表達(dá)。通過抗生素篩選和qRT-PCR篩選陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；
(3 )轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系皂苷含量檢測:提取珠子參轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的皂苷，分析轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系間皂苷含量的差異。
[0011]本發(fā)明為提高珠子參中皂苷的含量提供了一種新方法，利用生物工程技術(shù)和基因調(diào)控的方法可更高效率合成珠子參皂苷，克服了人工栽培周期長、化學(xué)合成機理和路線不夠清晰等缺點。將轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胫樽訁⒓?xì)胞中表達(dá)，使珠子參皂苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量提高，增加了珠子參皂苷的產(chǎn)量，為大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)珠子參皂苷提供了理論參考和科學(xué)依據(jù)。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明中珠子參總RNA電泳圖譜；
圖2為本發(fā)明中/5JbHLHl RT-PCR檢測結(jié)果，其中M為DL2000 DNA Marker，I為/5JbHLHl的RT-PCR產(chǎn)物；
圖3為本發(fā)明中PjbHLHl的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；
圖4為本發(fā)明中qRT-PCR結(jié)果分析圖，表示珠子參皂苷合成途徑中受PjbHLHl調(diào)控的基因在野生型和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的表達(dá)水平，其中C為野生型細(xì)胞系，1-3為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；
圖5為本發(fā)明中珠子參皂苷的含量測定結(jié)果，其中C為野生型細(xì)胞系，1-3為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
【具體實施方式】
[0013]下面通過附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實施例中方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，使用的試劑如無特殊說明均為常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。
[0014]實施例1基因的克隆以及生物信息學(xué)分析
因珠子參中含有較多的次生代謝物質(zhì)，需采用兩步法進(jìn)行總RNA的提取。先采用改良的異硫氰酸胍法取進(jìn)行粗提，接著使用DNA酶進(jìn)行消化并利用氯仿抽提得到較純的珠子參總RNA(圖1)。采用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV (promega)以珠子參總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系和操作過程為:取5 yg Total RNA，依次加入50 ng oligo(dT) 15、2 μ L dNTP(2.5 mM each)、DEPC水至反應(yīng)體積為13.5 μ L ;混勻后，70°C加熱變性5 min后迅速在冰上冷卻 5 min，然后依次加入 4 μ L 5 X First-stand buffer、0.5 μ L RNasin (200U)、Iμ L M-MLV (200 U)，混勻并瞬時離心，42 °C溫浴1.5 h，取出后70 °C加熱10 min，終止反應(yīng)。cDNA第一鏈合成后置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0015]以合成的第一鏈cDNA為模板，根據(jù)三七中與調(diào)控三七皂苷生物合成相關(guān)的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因cDNA序列設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增目的基因PjbHLHl,所用引物序列分別為 5’ -TCTAGAATGGAGGATCCTTATTCCAATATCC-3’ 以及 5’ -CTGCAGTCACATTAACTGTTTGAGAGCTGCG-3’。采用 Advantage? 2 PCR Enzyme (Clontech)擴(kuò)增出目的基因。PCR 反應(yīng)條件:94cC 5 min ；94 °C 30 S，54.5 °C 30 S，72 °C I min, 32 cycles ；72 °C 10 min。反應(yīng)體系(50 yL)為 4 yL 第一鏈 cDNA、5 μ L 10XBuffer、l μ L 50 X dNTP Mix、0.5 μ L正向引物(10 μΜ)、0.5 yL 反向引物(10 μΜ)、1 μ L Advantage? 2 PCR Enzyme、38 μ LPCR-Grade Water。PCR結(jié)束后，取5 μ L用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性以及大小(圖2)，其余PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。將目的片段膠回收產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，反應(yīng)體系和操作過程為:取3.6 μ L膠回收產(chǎn)物，依次加入0.7 μ L pGEM-T easy vector (50 ng/ μ L)、5 μ L 2 X Rapid Ligat1n Buffer，和 0.7 μ L T4 DNA Ligase 混勻置于 8 °C過夜反應(yīng)。采用熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transl-Tl中。用含有氨節(jié)青霉素(ampicillin，Amp)的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。挑選若干個白色菌落，搖菌后用擴(kuò)增PjbHLHimf異引物鑒定出多克隆位點插入PjbHLHim克隆，將鑒定的克隆進(jìn)行測序。
[0016]最終獲得的/!7??///cDNA 大小為 966 bp，通過 NCBI ORF finder (http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析發(fā)現(xiàn)其正好為開放閱讀框(見序列表)。PjbHLHl編碼蛋白的分子量約為36.3 KD,等電點為8.36，不穩(wěn)定系數(shù)為39.92，預(yù)測尸JMMI編碼的蛋白質(zhì)穩(wěn)定。生物信息學(xué)預(yù)測PjbHLHl不包含跨膜區(qū)，不含信號肽，具有一個bHLH轉(zhuǎn)錄因子特征保守結(jié)構(gòu)域。通過在線工具iPSORT預(yù)測PjbHLHl可能定位于細(xì)胞核。借助SWISS-MODEL工具，PjbHLHl以Myc原癌基因蛋白為模