專利名稱：細胞膜被修飾的細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被生理活性物質(zhì)或探針修飾的細胞。更詳細地說，本發(fā)明涉及生理活性物質(zhì)或探針與兩親性化合物的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合的細胞。
在特表2000-507849號報道了使之與相對于細胞表面存在的官能基的生物體適合性聚合物反應(yīng)，通過共價鍵進行表面修飾的方法。另外，在The FASEB Journal，10，574？586，1996中報道了使用GPI-錨連蛋白(GPI-anchored protein)的細胞表面的修飾方法。另外，在Polymer Preprints，Japan，47，10，2499-2500，1998和蛋白質(zhì)·核酸·酶，45，11，1859-1864，2000中，公開了包含使用聚丙烯酰胺作為水溶性高分子，使該高分子末端的反應(yīng)性基團與膜蛋白或糖鏈反應(yīng)工序的細胞表面的修飾方法，通過配位體與細胞膜上的受體結(jié)合修飾細胞表面的方法，和使用疏水性錨修飾細胞表面的方法。
這樣，雖然已知幾種通過使細胞膜蛋白和糖鏈與高分子末端的反應(yīng)性基團結(jié)合進行細胞表面的修飾的方法，但是，直接在細胞膜上進行這樣的化學(xué)修飾，使細胞表面物質(zhì)的性質(zhì)變化，恐怕會給細胞帶來障礙。另外，使用GPI-錨連蛋白的方法，由于GPI-錨連蛋白本身的獲得是困難的，存在適用范圍有限的問題。另外，使用疏水性錨的方法是只用聚丙烯酰胺鏈對表面修飾，達到細胞凝聚的抑制、修飾后的穩(wěn)定性很差，而且也未證實在細胞膜表面可固定化聚丙烯酰胺鏈。另外，用這些方法都不可能在細胞表面結(jié)合生理活性物質(zhì)。
另外，在The Journal of Immunology，2433-2443，2000中，公開了使用含有烴基的螯合物，將該螯合物在細胞膜上錨定后，在該螯合物上離子鍵合生理活性物質(zhì)的方法。但是，使用該方法，由于生理活性物質(zhì)與細胞膜的結(jié)合是離子鍵合，結(jié)合容易受到鹽濃度或pH的影響，是不穩(wěn)定的，也存在在細胞上的應(yīng)用范圍受到限制的問題。另外，由于該螯合物不含親水性基團，親油性強，向細胞的添加是困難的，因此采用通過脂質(zhì)體化細胞融合使之攝取到細胞中的方法等，但通過該方法細胞修飾不是簡便的。
如上所述，不對細胞造成傷害，通過共價鍵使生理活性物質(zhì)結(jié)合到該細胞膜上的改質(zhì)細胞膜的方法不是已知的。
本發(fā)明者們?yōu)榻鉀Q上述課題進行了積極地研究，發(fā)現(xiàn)使用使生理活性物質(zhì)或探針等修飾對象物質(zhì)與兩親性化合物反應(yīng)得到的反應(yīng)生成物，可非共價鍵地修飾細胞膜，以及通過使用具有脂肪族烴基的特定兩親性化合物，可不對細胞產(chǎn)生傷害，極其有效地進行修飾。本發(fā)明是基于這些知識完成的。
即，本發(fā)明是提供，具有下述特征的兩親性化合物(1)在1個末端中含有1個以上脂肪族烴基，(2)在分子中具有1個以上含有親水性基團的部分，和(3)在與(1)不同的末端中具有1個以上可與修飾對象物質(zhì)共價結(jié)合的反應(yīng)性官能基和修飾對象物質(zhì)的反應(yīng)生成物通過非共價鍵結(jié)合在細胞膜上的細胞。按照本發(fā)明的優(yōu)選方案，提供修飾對象物質(zhì)是生理活性物質(zhì)或探針的上述細胞；和細胞是動物細胞的上述細胞。
按照本發(fā)明更優(yōu)選的方案，提供脂肪族烴基是含有1個以上碳原子數(shù)11～18的脂肪族烴基的化合物殘基的上述細胞；脂肪族烴基是含有1個以上油基或碳原子數(shù)17的不飽和脂肪族烴基的化合物殘基的上述細胞；和親水性基團是含有聚氧化烯基的化合物殘基的上述細胞。
按照本發(fā)明特別優(yōu)選的方案，兩親性化合物是，下述通式(1) (式中，Z表示具有2～10個羥基的化合物殘基；AO表示碳原子數(shù)2～4的氧亞烷基；R1表示氫原子或碳原子數(shù)1～3的烴基；R2表示含有碳原子數(shù)7～22的脂肪族烴基的化合物殘基；X表示含有1個以上選自琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基、和巰基的反應(yīng)性官能基的基團；a表示0或1；n1、n2、和n3表示碳原子數(shù)2～4的氧亞烷基的平均加成摩爾數(shù)，且n1、n2、n3、k1、k2、和k3是滿足下列條件的數(shù)0≤n1、n2≤500、2≤n3≤500，且2≤n1+n2+n3≤5000≤k1≤8、1≤k2≤4、1≤k3≤4、且2≤k1+k2+k3≤10)所表示的化合物的上述細胞。
按照上述本發(fā)明更優(yōu)選的方案，提供R2是含有1個以上碳原子數(shù)11～18的直鏈脂肪族烴基的化合物殘基的上述細胞；R2是含有1個以上油基或碳原子數(shù)17的不飽和脂肪族烴基的化合物殘基的上述細胞；和R2是下述通式(2) (R3和R4分別獨立地表示碳原子數(shù)7～21的烴基；R5表示碳原子數(shù)2～4的烴基，b是0或1)所示的基團的上述細胞。
另一方面，本發(fā)明提供了為使與生理活性物質(zhì)或探針的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合使用的上述兩親性化合物；和用于細胞膜修飾的上述兩親性化合物的用途。另外，本發(fā)明提供了細胞膜的修飾方法，含有下述工序(1)使生理活性物質(zhì)或探針與上述兩親性化合物反應(yīng)的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合的工序。
圖2是用與聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物結(jié)合的熒光素標識的鏈霉抗生物素進行膜修飾的小鼠成纖維細胞株NIH3T3(例2)的切片的顯微照片。
圖3是表示用流式細胞儀觀察的通過聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-EGFP綴合物膜修飾的浮游細胞(例6)的結(jié)果的圖。
圖4是用與聚氧化乙烯油基醚(n＝180，平均分子量8400)-生物素綴合物結(jié)合的熒光素標識的鏈霉抗生物素膜修飾的小鼠成纖維細胞株NIH3T3(例9)的顯微照片。
圖5是用熒光標識(熒光素)-聚氧化乙烯修飾的二油?；字Ｒ掖及纺ば揎椀男∈蟪衫w維細胞株NIH3T3(例11)的顯微照片。
圖6是嘗試通過聚氧化乙烯(n＝114，平均分子量5000)-生物素進行膜修飾的小鼠成纖維細胞株NIH3T3(例16比較例)的顯微照片。
對于適合與細胞結(jié)合的修飾對象物質(zhì)的種類沒有特別的限制，可使用任何具有至少一個可與兩親性化合物共價結(jié)合的官能基的物質(zhì)。作為可共價結(jié)合的官能基，可列舉例如，氨基、羥基、巰基、羧基等。作為修飾對象化合物，優(yōu)選可使用生理活性物質(zhì)或探針。本發(fā)明的細胞中可結(jié)合兩種以上的修飾對象物質(zhì)，例如，也可組合生理活性物質(zhì)和探針后與細胞結(jié)合。
對于生理活性物質(zhì)的種類沒有特別的限制，例如，除了作為酶抑制劑或受體·拮抗劑或激動劑等藥物有效成分的化合物以外，可使用氨基酸、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、糖蛋白、單糖類、多糖類、和維生素類等，低分子物質(zhì)到高分子物質(zhì)的各種物質(zhì)。優(yōu)選作為生理活性物質(zhì)可列舉多肽如明膠、抗體、粘附分子、受體、增殖因子等細胞因子。在本說明書中使用的“生物活性物質(zhì)”的用語是應(yīng)是包含可引起至少一種生理反應(yīng)的物質(zhì)，或在生物體內(nèi)可利用的生物體關(guān)聯(lián)物質(zhì)等的最廣義的解釋，不是任何意義中限定的解釋。
作為探針，可使用為檢出氨基酸、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、酶底物、金屬離子等的探針，可使用熒光探針、發(fā)光探針、磁性探針、放射性探針、和金膠體等微粒子探針等。理所當然的，可利用的探針并不限于以上述物質(zhì)為對象的探針和具備上述檢出手段的探針。
該兩親性化合物是具有下述特征的化合物(1)在1個末端中含有1個以上脂肪族烴基，(2)在分子中具有1個以上含有親水性基團的部分，和(3)在與(1)不同的末端中具有1個以上可與修飾對象物質(zhì)共價結(jié)合的反應(yīng)性官能基。
作為親水性基團，可使用合成和天然的水溶性化合物，優(yōu)選水溶性高分子化合物的殘基。作為提供親水性基團的水溶性化合物，可列舉例如，聚亞烷基二醇、多糖、聚乳酸、聚乙烯基醇、聚丙烯酸和聚丙烯酰胺等，優(yōu)選聚亞烷基二醇、多糖、聚乳酸、聚乙烯基醇，更優(yōu)選聚亞烷基二醇。
作為脂肪族烴基，可以是合成或天然的脂肪族烴由來的基團，優(yōu)選碳原子數(shù)6～24的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基(在本說明書中所說的“不飽和”的情況是對于分子或官能基中存在的雙鍵或三鍵的數(shù)沒有特別的限制，可組合含有雙鍵和三鍵)，更優(yōu)選含有碳原子數(shù)11～18的飽和或不飽和的脂肪族烴基的基團，更優(yōu)選含有油基或碳原子數(shù)17的不飽和脂肪族烴基的基團。該烴基可以是單獨一種，也可以是兩種以上的組合。組合兩種以上時，對其組合方式?jīng)]有限制。
兩親性化合物中的反應(yīng)性官能基，優(yōu)選在親水部分末端配置。作為反應(yīng)性官能基，可使用任何與生理活性物質(zhì)的氨基、羧基、巰基、和羥基等官能基可反應(yīng)的反應(yīng)性官能基?？闪信e例如，琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基或巰基等。
作為兩親性化合物，可使用式(1)所示的化合物。作為Z表示的具有2～10個羥基的化合物殘基，具體可列舉，乙二醇、丙二醇、甘油、二甘油、季戊四醇、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、和八甘油等化合物殘基。作為Z優(yōu)選可使用具有2～8個羥基的化合物的殘基。
AO是碳原子數(shù)2～4，優(yōu)選碳原子數(shù)2或3的氧亞烷基，可列舉例如，氧亞乙基、氧亞丙基、氧三亞甲基、氧亞丁基、氧四亞甲基等。其中，特別優(yōu)選氧亞乙基。分子內(nèi)雖然只存在n個氧亞烷基，但該氧亞烷基可以是單獨一種，或也可以是2種以上的組合。在2種以上組合的情況下，對其組合方式?jīng)]有特別的限制。另外，氧亞烷基可以是嵌段狀也可以是無規(guī)的。條件是，由于相對于全體氧亞烷基的氧亞乙基的比率低的話，水溶性降低，因此優(yōu)選相對于全體氧亞烷基的氧亞乙基的比率在50～100摩爾％。
式(1)中n1+n2+n3表示氧亞烷基的平均加成摩爾數(shù)，該總和例如在2～500范圍內(nèi)，優(yōu)選8～300，更優(yōu)選12～200。加成摩爾數(shù)，例如，可由與R1或R2的疏水性基團的親水性和疏水性平衡決定。在k2是2以上，或R2是磷脂化合物殘基時，顯示疏水性的脂肪族烴基存在2鏈以上，氧亞烷基的平均加成摩爾數(shù)n1+n2+n3優(yōu)選20～500，更優(yōu)選30～200。
前述式(1)所示的k1+k2+k3的值是對應(yīng)于Z的分支數(shù)，為2～10，優(yōu)選是2～4的整數(shù)。在k1+k2+k3的值比2小時，由于得不到一個末端是脂肪族烴基的疏水性基團，另一個末端是具有反應(yīng)性官能基的化合物，因此對于細胞表面的修飾是不利的。另外，在k1+k2+k3的值比10大時，由于分子的立體結(jié)構(gòu)變得過大，由于立體障礙不能進行穩(wěn)定的表面修飾。
在前述式(1)中，k1是聚氧化烯分支末端的殘基為氫原子或碳原子數(shù)1～3的烴基(具體為甲基、乙基、正丙基、或異丙基)的殘基的合計數(shù)，是0～8范圍內(nèi)的整數(shù)。在前述式(1)中，k2是在聚氧化烯末端殘基中含有碳原子數(shù)8～22的脂肪族烴基的化合物殘基的結(jié)合數(shù)，是1～4的整數(shù)。K2是0時，由于不存在疏水性基團，不能完成細胞的修飾，在5以上時，由于體積大不能在細胞膜上錨定。
在前述式(1)中a是0或1，a是0情況是指R2所示的含有脂肪族烴基的化合物殘基在聚氧化烯殘基的末端醚鍵合，a是1的情況是指R2所示的含有脂肪族烴基的化合物殘基在聚氧化烯殘基的末端通過羰基酯鍵合。
在前述式(1)中，k3是X所示的含有反應(yīng)性基團的基團與末端殘基結(jié)合的聚氧化烯殘基的數(shù)，為1～4的整數(shù)，優(yōu)選1～3。K3是2以上的情況，X中含有的反應(yīng)性基團可以是單獨一種，也可以是2種以上的組合。在2種以上的情況下，可使同種或不同種的生理活性物質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)入細胞膜。
在前述式(1)中，R1是氫原子、甲基、乙基、或直鏈或支鏈丙基。K2是1以上時，含有R2的脂肪族烴基的化合物殘基作為式(1)化合物的疏水性基團作用。
在前述式(1)中，R2是含有碳原子數(shù)7～22的脂肪族烴基的化合物殘基。優(yōu)選碳原子數(shù)7～22的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪族烴基，或具有1個以上碳原子數(shù)7～22的飽和或不飽和的直鏈或支鏈的脂肪族烴基的含有磷酸基的化合物殘基。作為R2的具體例，a是0時，可列舉辛基、癸基、月桂基、肉豆蔻基、肉豆蔻腦基、棕櫚基、棕櫚油基、硬脂基、異硬脂基、油基、亞油基、二十烷基、二十烯基、二十二烷基、芥基(エルカイル基)等飽和或不飽和直鏈或支鏈的烴基。優(yōu)選碳原子數(shù)10～20的飽和或不飽和的脂肪族烴基或具有碳原子數(shù)10～20的飽和或不飽和脂肪族烴基的磷脂殘基，更優(yōu)選碳原子數(shù)11～18的飽和或不飽和直鏈脂肪族烴基或具有碳原子數(shù)11～18的飽和或不飽和直鏈烴基的磷脂殘基，最優(yōu)選碳原子數(shù)18的飽和或不飽和直鏈脂肪族烴基或具有碳原子數(shù)17的飽和或不飽和的直鏈脂肪族烴基的磷脂殘基。作為磷脂，可列舉磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰絲氨酸等。另外，a是1時，作為R2CO的具體例可列舉，例如，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻腦酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、異硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、二十二烷酸、芥酸等飽和或不飽和直鏈或支鏈脂肪酸由來的酰基，優(yōu)選油酸由來的酰基。
在前述式(1)中，X是含有琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基、或巰基等反應(yīng)性官能基的基團。對于在聚氧化烯殘基末端的X的結(jié)合方式?jīng)]有特別的限制，可使用JMS-REV.MACROMOL.CHEM.PHYS.，C25(3)，325-372(1985)等報告的一般的結(jié)合方式，但是為了簡便導(dǎo)入上述反應(yīng)基團，優(yōu)選通過2價烴基、酯或酰胺鍵進行導(dǎo)入。作為在該目的中使用的烴基，可列舉例如，亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基和亞己基等，或亞苯基等環(huán)狀化合物基團，酯鍵可以是單羧酸或二羧酸由來的酯鍵，作為二羧酸可列舉琥珀酸、戊二酸和馬來酸等，作為酰胺鍵可列舉乙酰胺和丙酰胺由來的酰胺鍵。
前述式(2)是含有1個以上碳原子數(shù)7～21的飽和或不飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基的含磷酸基的化合物殘基，即含有磷脂酰乙醇胺的殘基。在前述式(2)中，R3和R4分別獨立地是碳原子數(shù)7～21的飽和或不飽和的直鏈或支鏈烴基，優(yōu)選碳原子數(shù)11～17的飽和或不飽和直鏈烴基，更優(yōu)選碳原子數(shù)17的不飽和脂族烴基。R3和R4通?？墒褂肦3CO和R4CO形式的脂肪酸由來的?；?。作為R3CO和R4CO的具體例可列舉，例如，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻腦酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、異硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、二十二烷酸、芥酸等飽和或不飽和直鏈或支鏈脂肪酸由來的?；鼉?yōu)選油酸由來的?；?br> R3和R4可相同或不同。R3和R4的碳原子數(shù)分別超過21時，由于疏水性變強柔軟性小，可能與細胞膜的結(jié)合變得困難，另外，碳原子數(shù)比7小時，與細胞膜結(jié)合后，由于疏水性弱，可能從細胞膜脫落。R2是式(2)所示的含磷脂化合物的殘基時，由于有2個酰基，細胞膜修飾后的穩(wěn)定性比一根鏈高，以與細胞膜錨定的狀態(tài)很難發(fā)生分子的脫落。
在前述式(2)中，R5是碳原子數(shù)2～4的2價烴基，可以是直鏈、支鏈、環(huán)狀、或它們的組合的任一種，可以是飽和或不飽和的。具體可列舉-CH2CH2-、-(CH2)3-、或(CH2)4-基等。
B表示0或1。
在本發(fā)明細胞中，在兩親性化合物具有1個以上不對稱碳原子時，作為兩親性化合物，可使用任意的光學(xué)活性體或非對映異構(gòu)體等純形式的立體異構(gòu)體、立體異構(gòu)體的任意混合物、外消旋體等任意物質(zhì)。另外，含有烯烴類雙鍵時，可以使用純粹形式的E體或Z體，或它們的混合物中的任一種。
本發(fā)明提供的細胞膜的修飾方法，特征在于包含下述工序(1)使生理活性物質(zhì)或探針與上述兩親性化合物反應(yīng)的工序；和(2)將上述工序(1)得到的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合的工序。
在前述工序(1)反應(yīng)工序中使用的溶劑的種類，只要是與反應(yīng)無關(guān)的溶劑都可以，對此沒有特別的限制，可使用磷酸緩沖液、硼酸緩沖液、Tris緩沖液、醋酸緩沖液、碳酸緩沖液、グッド緩沖液等緩沖液或其等滲液，或有機溶劑或上述水性介質(zhì)和有機溶劑的混合物等，這可以是單獨溶劑體系，也可以是混合溶劑體系。優(yōu)選使用不使生理活性物質(zhì)等的修飾對象物質(zhì)變性失活的與反應(yīng)無關(guān)的乙腈、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺等有機溶劑。反應(yīng)溫度只要是不使生理活性物質(zhì)等的修飾對象物質(zhì)變性失活的溫度都可以，對此沒有特別的限制，例如，0～100℃，優(yōu)選0～40℃。反應(yīng)時間通常為1分鐘～48小時左右，優(yōu)選0.5～3小時。反應(yīng)后，可使用透析、超濾、凝膠過濾等常用的蛋白質(zhì)純化法等純化反應(yīng)生成物，但也可以不進行反應(yīng)生成物的純化用于工序(2)中。
在工序(2)中，可將工序(1)得到的反應(yīng)生成物加入培養(yǎng)細胞中，但也可以將在細胞培養(yǎng)液或等滲液中使用的上述工序(1)得到的反應(yīng)生成物稀釋為臨界膠束形成濃度(以下簡稱為CMC)的0.1～1000倍，優(yōu)選其CMC的1～500倍，更優(yōu)選其CMC的10～100倍后添加。工程(1)得到的反應(yīng)生成物向細胞的結(jié)合通常在0～40℃進行，進行1秒～120分鐘，優(yōu)選在25～37℃進行10秒～20分鐘。在該工序中，也可添加工序(1)得到的反應(yīng)生成物以外的添加劑。在細胞膜上使上述反應(yīng)生成物結(jié)合后，可向細胞中添加等滲液洗凈。作為使用的等滲液只要是對細胞沒有傷害的溶劑都可以，對此沒有特別的限制，可使用磷酸緩沖液生理鹽水、細胞培養(yǎng)液等等滲液。
聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物的制備將4.4mg(1nmol)的活性化聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)溶于二甲基亞砜0.1ml中，形成活性化聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)溶液，將1nmol的EZ-linkTM生物素-PEO-胺(PIERCE社制；Cat#21346)溶于0.1ml的二甲基亞砜形成生物素-PEO-胺溶液，向其中加入聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)溶液形成反應(yīng)液。將反應(yīng)液在室溫(約25℃)攪拌后，放置1小時。向反應(yīng)液中加入1M的Tris緩沖液(pH8.0)0.02ml和組織培養(yǎng)用磷酸緩沖生理食鹽水(用Dulbecco PBS(-)組織培養(yǎng)用“Nissui”粉末(日水制藥(株)；Cat#05913)配制的)0.78ml，得到聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物溶液。實施例2聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物向小鼠成纖維細胞株NIH3T3的錨定小鼠成纖維細胞株NIH3T3的培養(yǎng)使用玻璃底微孔培養(yǎng)皿(35mm培養(yǎng)皿，未涂層的，No.0蓋玻片)容器使用添加了10％胎牛血清的Dulbecco改良伊格爾培養(yǎng)基將小鼠成纖維細胞NIH3T3在37℃，5％二氧化碳濃度的條件下培養(yǎng)。達到約80％輔滿為止培養(yǎng)20小時到45小時。將實施例1得到的聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物原液用Dulbecco改良伊格爾培養(yǎng)基稀釋至1/100倍，配制聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物液。用過濾滅菌處理過的磷酸緩沖液生理食鹽水(同上)2ml將附著了NIH3T3細胞的玻璃底微孔培養(yǎng)皿容器沖洗后，向玻璃表面附著的NIH3T3加入0.1ml的聚氧化乙烯油基醚-生物素綴合物液，在37℃反應(yīng)5分鐘。反應(yīng)后，用磷酸緩沖液生理鹽水2ml將細胞洗滌2次，向細胞中添加6.7nM鏈霉抗生物素熒光綴合物(分子探針Cat#S-869)(以下，稱為熒光標識的鏈霉抗生物素)磷酸緩沖液生理鹽水溶液0.1ml后，在37℃保溫20分鐘。
用磷酸緩沖生理鹽水2ml將細胞洗滌3次后，向細胞中添加磷酸緩沖生理鹽水1ml，得到被與聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物結(jié)合的熒光標識的鏈霉抗生物素膜修飾的細胞。細胞的膜修飾，通過將細胞在共焦點激光掃描顯微鏡(Leica社制)觀察確認細胞膜的修飾。結(jié)果在表1和

圖1中顯示。其結(jié)果，在視野(1000倍)中觀察到所有細胞的細胞膜上都有來自熒光素的熒光?？纱_認聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物在5分鐘與所有的細胞膜錨定。另外，生物素與鏈霉抗生物素的結(jié)合也沒有被阻礙。
細胞的立體觀察與實施例2相同，將用聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物處理的NIH3T3用熒光標識的鏈霉抗生物素染色，用共焦點激光掃描顯微鏡撿出高度方向(Z軸方向)2.3μm間隔的0.86μm寬的光學(xué)切片觀察。其結(jié)果如圖2所示。在所有細胞中，可觀察到只對細胞膜特異性的來自熒光素的熒光，通過立體的細胞觀察可確認液相中露出的細胞膜的所有部分與聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素綴合物結(jié)合。
與實施例4相同，將CHO細胞與聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-EGFP綴合物保溫，用共焦點激光掃描顯微鏡觀察。其結(jié)果如表1所示。其結(jié)果，在所有用聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-EGFP綴合物液處理的CHO細胞的細胞膜上可觀察到來自EGFP的熒光，可確認也可錨定在小鼠細胞以外的細胞上。
用流式細胞儀(コ一ルタ一社、EPICS-C)觀察分別處理的細胞懸浮液。其結(jié)果如表2和圖3所示。其結(jié)果，與只用EGFP處理的浮游細胞相比，用聚氧化乙烯油基醚-EGFP綴合物處理時，可觀察到熒光強度強的細胞數(shù)增加了。由此可知，通過用聚氧化乙烯油基醚-EGFP綴合物處理，在所有的浮游細胞膜上付與了EGFP，確認了在浮游細胞中可錨定聚氧化乙烯油基醚-EGFP。
實施例7到9的結(jié)果如表1所示。而且，實施例9的結(jié)果如圖4所示。觀察到在所有用聚氧化乙烯油基醚-生物素綴合物液處理的NIH3T3細胞的細胞膜上都有來自熒光素的熒光，確認了即使聚氧化乙烯的氧化乙烯加成摩爾數(shù)從15到180變化，任一個都可在細胞膜上錨定。
其結(jié)果，在所有用生物素-NH2溶液處理的細胞中完全觀察不到來自熒光素的熒光。由此可確認，生物素本身不與細胞結(jié)合。
表1 表中，++表示在視野(1000倍)中在所有細胞的細胞膜可觀察到很強的熒光活性；+表示在視野(1000倍)中在所有細胞的細胞膜可觀察到熒光活性；-表示在視野(1000倍)中在所有細胞的細胞膜上幾乎觀察不到熒光活性。
表2

評價細胞的熒光強度的相對值產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的細胞具有如下特征，由于用生理活性物質(zhì)或探針等修飾對象物質(zhì)穩(wěn)定地修飾了細胞膜，在細胞膜修飾中不對細胞產(chǎn)生傷害，通過細胞膜修飾可穩(wěn)定且長期地表達所期望的特性。另外，本發(fā)明提供的細胞膜的修飾方法，特征在于可有效且穩(wěn)定地提供具有上述特征的細胞。
權(quán)利要求
1.具有下述特征的兩親性化合物(1)在1個末端中含有1個以上脂肪族烴基，(2)在分子中具有1個以上含有親水性基團的部分，和(3)在與(1)不同的末端中具有1個以上可與修飾對象物質(zhì)共價結(jié)合的反應(yīng)性官能基和修飾對象物質(zhì)的反應(yīng)生成物通過非共價鍵結(jié)合在細胞膜上的細胞。
2.權(quán)利要求1記載的細胞，其中修飾對象物質(zhì)是生理活性物質(zhì)或探針。
3.權(quán)利要求1記載的細胞，其中細胞是動物細胞。
4.權(quán)利要求1記載的細胞，其中脂肪族烴基是含有1個以上碳原子數(shù)11～18的脂肪族烴基的化合物殘基。
5.權(quán)利要求4記載的細胞，其中脂肪族烴基是含有1個以上油基或碳原子數(shù)17的不飽和脂肪族烴基的化合物殘基。
6.權(quán)利要求1記載的細胞，其中親水性基團是含有聚氧化烯基的化合物殘基。
7.權(quán)利要求5記載的細胞，其中親水性基團是含有聚氧化烯基的化合物殘基。
8.權(quán)利要求6記載的細胞，其中兩親性化合物是，下述通式(1)所示的化合物 式中，Z表示具有2～10個羥基的化合物殘基；AO表示碳原子數(shù)2～4的氧亞烷基；R1表示氫原子或碳原子數(shù)1～3的烴基；R2表示含有碳原子數(shù)7～22的脂肪族烴基的化合物殘基；X表示含有1個以上選自琥珀酰亞胺基、馬來酰亞胺基、氨基、羧基、醛基、縮水甘油基、和巰基的反應(yīng)性官能基的基團；a表示0或1；n1、n2、和n3表示碳原子數(shù)2～4的氧亞烷基的平均加成摩爾數(shù)，且n1、n2、n3、k1、k2、和k3是滿足下列條件的數(shù)0≤n1、n2≤500、2≤n3≤500，且2≤n1+n2+n3≤5000≤k1≤8、1≤k2≤4、1≤k3≤4、且2≤k1+k2+k3≤10。
9.權(quán)利要求8記載的細胞，其中R2是含有1個以上碳原子數(shù)11～18的直鏈脂肪族烴基的化合物殘基。
10.權(quán)利要求8記載的細胞，其中R2是含有1個以上油基或碳原子數(shù)17的不飽和脂肪族烴基的化合物殘基。
11.權(quán)利要求8記載的細胞，其中R2是下述通式(2)所示基團 R3和R4分別獨立地表示碳原子數(shù)7～21的烴基；R5表示碳原子數(shù)2～4的烴基，b是0或1。
12.權(quán)利要求1記載的兩親性化合物，用于使與生理活性物質(zhì)或探針的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合。
13.權(quán)利要求8記載的兩親性化合物，用于使與生理活性物質(zhì)或探針的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合。
14.權(quán)利要求11記載的兩親性化合物，用于使與生理活性物質(zhì)或探針的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合。
15.細胞膜的修飾方法，含有下述工序(1)使生理活性物質(zhì)或探針與權(quán)利要求1記載的兩親性化合物反應(yīng)的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合的工序。
16.細胞膜的修飾方法，含有下述工序(1)使生理活性物質(zhì)或探針與權(quán)利要求8記載的兩親性化合物反應(yīng)的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合的工序。
17.細胞膜的修飾方法，含有下述工序(1)使生理活性物質(zhì)或探針與權(quán)利要求11記載的兩親性化合物反應(yīng)的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反應(yīng)生成物通過非共價鍵與細胞膜結(jié)合的工序。
全文摘要
具有下述特征的兩親性化合物(1)在1個末端中含有1個以上脂肪族烴基，(2)在分子中具有1個以上含有親水性基團的部分，和(3)在與(1)不同的末端中具有1個以上可與修飾對象物質(zhì)共價結(jié)合的反應(yīng)性官能基和修飾對象的反應(yīng)生成物通過非共價鍵結(jié)合在細胞膜上的細胞。
文檔編號C12N5/00GK1405300SQ02128658
公開日2003年3月26日 申請日期2002年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月9日
發(fā)明者長棟輝行, 伊藤智佳, 安河內(nèi)徹, 大橋俊輔, 久保和弘 申請人:日本油脂株式會社, 長棟輝行