專利名稱：一種利用超聲波促進雜交反應(yīng)的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進雜交反應(yīng)的方法及其裝置，特別涉及快速及高特異性核酸或核酸結(jié)合蛋白檢測的方法及裝置。此方法及裝置可應(yīng)用于臨床診斷、生命科學基礎(chǔ)研究、農(nóng)業(yè)及環(huán)境監(jiān)測等技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種利用超聲波促進雜交反應(yīng)的方法，該方法利用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生一定強度的超聲，將準備好的固液雜交反應(yīng)體系或液液雜交反應(yīng)體系置于超聲波傳播途徑中，通過放置在超聲波諧振元件與雜交反應(yīng)體系之間的耦合介質(zhì)，使超聲波傳導至雜交反應(yīng)體系中；利用超聲波的高頻振動及輻射壓力在雜交反應(yīng)體系的液體介質(zhì)中形成有效的攪動與流動，通過液體的流動帶動其中的反應(yīng)分子的運動；并在進行雜交反應(yīng)的過程中，可根據(jù)不同的雜交反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)超聲輻射功率或頻率，改變液體介質(zhì)擾動強度，從而實現(xiàn)促進雜交反應(yīng)的進行。
本發(fā)明還提供了一種實施上述方法的裝置，該裝置包括固液雜交反應(yīng)體系或含有兩種或多種不同組分的液相組成的液液雜交反應(yīng)體系以及裝有雜交反應(yīng)體系的容器，其特征在于在反應(yīng)體系的上方、底部或四周至少放置一個超聲波諧振元件，在超聲波諧振元件與雜交反應(yīng)體系之間填充可使聲波傳導的耦合介質(zhì)，所述超聲波諧振元件與諧振電路相連。
對于不同的雜交反應(yīng)體系(比如長短不同、堿基組成不同的核酸雜交反應(yīng)體系)，由于存在反應(yīng)動力學差異，可以通過調(diào)節(jié)超聲輻射功率，改變液體擾動強度，使之達到最佳的反應(yīng)效果。同理，利用靶標分子與不同探針分子雜交反應(yīng)時的反應(yīng)動力學差異，也可以在反應(yīng)過程中通過調(diào)節(jié)超聲輻射功率來提高雜交反應(yīng)的特異性。比如對于基因芯片上的核酸雜交反應(yīng)，由于對同一長度的核酸序列，有一定錯配情況時的靶標分子與探針分子的結(jié)合力要小于完全配對情況。如果超聲輻射強度增加的結(jié)果使得液體對雜交液中核酸分子的作用力大于有一定錯配情況時的靶標分子與探針分子的結(jié)合力，但又小于完全配對情況時靶標分子與探針分子的結(jié)合力，那么超聲輻射的結(jié)果可以保留完全配對而排斥錯配，從而提高基因芯片雜交的特異性。
本發(fā)明與傳統(tǒng)雜交技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及有益效果可以顯著提高雜交信號的強度(實施例顯示經(jīng)超聲作用輔助的雜交結(jié)果信號強度比常規(guī)技術(shù)雜交結(jié)果信號強度提高4到5倍)，使雜交反應(yīng)更快地達到完全反應(yīng)狀態(tài)，縮短反應(yīng)時間；可以使固體基質(zhì)表面不同位置的雜交反應(yīng)更趨一致，提高雜交信號的均勻性；可以降低假陽性信號強度，提高雜交反應(yīng)的特異性。另外，本發(fā)明提供的裝置結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，核心元件僅有超聲諧振元件和相應(yīng)諧振電路以及有效的耦合介質(zhì)，操作簡便，易于實現(xiàn)自動化。
圖2為本發(fā)明提出的實施例中將基因芯片放置在諧振元件上進行雜交反應(yīng)時的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為本發(fā)明提出的實施例中采用壓電陶瓷片作為超聲諧振元件的正面視圖。
圖4為本發(fā)明提出的實施例中采用壓電陶瓷片作為超聲諧振元件的背面視圖。
圖5為基因芯片采用常規(guī)技術(shù)雜交結(jié)果掃描熒光信號偽彩色圖。
圖6為基因芯片采用本發(fā)明所進行的雜交結(jié)果掃描熒光信號偽彩色圖。
圖7為本發(fā)明提出的實施例雜交結(jié)果掃描與常規(guī)雜交結(jié)果掃描的熒光信號強度值對比分析圖。


圖1為本發(fā)明的一個具體實施例，該實施例利用超聲波促進基因芯片的雜交反應(yīng)。
(1)將一直徑為2.5厘米、頻率為1.7MHz的圓形壓電陶瓷片2貼附于一尺寸為8.5cm×5cm×2cm的塑料盒1中，壓電陶瓷片2通過塑料盒1側(cè)壁所鉆小孔引出導線3與超聲波諧振電路5相接。超聲波諧振電路5的輸出功率為10W。然后將導線引出孔用環(huán)氧樹脂膠密封。壓電陶瓷片2邊緣套有環(huán)形橡皮密封圈4，其作用是為了形成凹槽盛裝耦合介質(zhì)，以使壓電陶瓷片2與置于其上的基因芯片6之間保持良好接觸，保證超聲在不同介質(zhì)之間界面處有較高的透射率。7指示基因芯片上固定有核酸探針點陣的區(qū)域。
(2)將混合好的雜交液放到加熱器上，98℃下加熱4分鐘使雙鏈結(jié)構(gòu)解鏈，在4℃下冷卻8分鐘使單鏈結(jié)構(gòu)得到保持，52℃下預雜交15分鐘，4℃下冷卻5分鐘以上，然后取出立即放入冰盒。
(3)在壓電陶瓷片2上面環(huán)形橡皮密封圈4形成的圓形凹槽內(nèi)充滿水或甘油，以利于超聲波的傳導，然后將進行雜交反應(yīng)的基因芯片6(以載玻片為載體)置于其上(固定有探針的一面背對壓電陶瓷片，并使芯片6上的雜交點陣區(qū)域7正好位于壓電陶瓷片2的正上方)。
(4)用移液槍在芯片6的每個方陣上滴加8μl雜交液，并迅速將裝有待雜交基因芯片的塑料盒1上蓋并以封口膜密封，以防止水份的揮發(fā)喪失。然后將塑料盒置于已調(diào)節(jié)恒溫為30℃的雜交爐中，同時打開超聲波發(fā)生器電源。此超聲波發(fā)生器周期性地開通和關(guān)閉，每一循環(huán)的開通和關(guān)閉時間分別為2秒和10秒。在不同的雜交反應(yīng)中，超聲波發(fā)生器可以采用連續(xù)發(fā)生的方式或間斷發(fā)生方式。
(5)雜交反應(yīng)進行2小時后，取出雜交盒，快速取出芯片，放到裝有清洗液(0.2％SDS)的盒內(nèi)，然后置于搖床上振蕩清洗15分鐘(室溫)，以去離子水沖洗干凈，離心2分鐘(1500轉(zhuǎn)/分鐘)甩干。
利用Scanarray 4000掃描儀掃描雜交芯片，檢測雜交結(jié)果。儀器為一基于激光誘導熒光檢測的光學檢測儀，利用該儀器可獲得本實例中基因芯片上每個點的熒光強度信號，進而獲得對應(yīng)的雜交樣品濃度信息。掃描儀的參數(shù)激光光源功率設(shè)為儀器最大值的80％，檢測器光電倍增管(PMT)的靈敏度設(shè)為儀器最大值的65％，掃描精度設(shè)為5微米。
圖3和圖4為實施例中的超聲波諧振元件所采用的壓電陶瓷片的電極排布圖。圖3為壓電陶瓷片正面視圖，圖4為壓電陶瓷片背面視圖8指示超聲壓電陶瓷片表面所鍍金屬電極，9指示超聲壓電陶瓷片背面裸露的壓電材料。
圖5和圖6為雜交熒光信號偽彩色圖。此二圖比較了常規(guī)雜交結(jié)果掃描圖與超聲輔助雜交結(jié)果掃描圖，顯示了超聲作用對基因芯片雜交反應(yīng)的促進效果。
本實例中涉及的雜交體系如下在芯片(醛基修飾的玻片)上先固定一系列捕獲子(capturer)探針，它們?yōu)槟┒税被揎椀墓押塑账?，靶分子為比探針長一些的核苷酸，其中一段與探針互補，它的另一段與反應(yīng)體系中加入的帶有熒光標記的報告分子互補。雜交液中分別含有靶分子與報告分子，為提高芯片上的捕獲子探針與靶分子的雜交效率，先在52℃下使靶分子與報告分子預雜交，然后再與芯片上的探針雜交。由此靶分子的量可以通過報告分子所帶的熒光標記分子的熒光強度值間接測得。
從圖中可以看出，在施加超聲的情況下，雜交熒光信號可以得到明顯增強。
生物材料(1)固定到芯片表面的捕獲子(capturer)探針固定到點陣行1上的探針為5’-NH2-T12-TCACAGACTGACCGAGG；固定到點陣行2上的探針為5’-NH2-T12-TCACAGACTGACCGAGT；固定到點陣行3上的探針為5’-NH2-T12-TCACAGACTGACCGAGA；(2)與靶分子雜交的報告分子(reporter)5’-GAACC TGGGG ACCCT GCGCG GCTAC TACTA CTAGTG-3’(3)靶分子HLA A區(qū)2601型熒光不對稱PCR產(chǎn)物，長度為1kb。
試劑(1)雜交液組成3.6μl靶(target)DNA1.0μl報告分子(reporter)(40ng/ul)2.7μl 20×SSC0.8μl 1％SDS(2)洗滌液組成2×SSC0.1％SDS圖7為本發(fā)明提出的實施例雜交結(jié)果掃描與常規(guī)雜交結(jié)果掃描的熒光信號強度值對比分析圖。從圖7可以看出，在其他條件相同的情況下，施加超聲會使雜交反應(yīng)的熒光信號強度增加4-5倍，從而增加檢測的靈敏度。說明超聲對雜交反應(yīng)是有確定的促進作用的。本實驗已重復4-5次，均得到相同的實驗結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種利用超聲波促進雜交反應(yīng)的方法，其特征在于該方法利用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生一定強度的超聲，將準備好的固液雜交反應(yīng)體系或液液雜交反應(yīng)體系置于超聲波傳播途徑中，通過填充在超聲波諧振元件與雜交反應(yīng)體系之間的耦合介質(zhì)，使超聲波傳導至雜交反應(yīng)體系中；利用超聲波的高頻振動及輻射壓力在雜交反應(yīng)體系的液體介質(zhì)中形成有效的攪動與流動，通過液體的流動帶動其中的反應(yīng)分子的運動；并在進行雜交反應(yīng)的過程中，根據(jù)不同的雜交反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)超聲輻射功率或頻率，改變液體介質(zhì)擾動強度，從而實現(xiàn)促進雜交反應(yīng)的進行。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波促進雜交反應(yīng)的方法，其特征在于所述超聲波發(fā)生器的功率可在0.1W到200W之間變化。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種利用超聲波促進雜交反應(yīng)的方法，其特征在于超聲波發(fā)生器所產(chǎn)生的超聲波頻率可在20kHz到100MHz之間變化。
4.按照權(quán)利要求1所述一種利用超聲波促進雜交反應(yīng)的方法，其特征在于所述的超聲波發(fā)生器產(chǎn)生超聲波的方式為連續(xù)進行或間斷進行。
5.實施如權(quán)利要求1所述方法的裝置，該裝置包括固液雜交反應(yīng)體系或由兩種或多種不同組分的液相組成的液液雜交反應(yīng)體系以及裝有雜交反應(yīng)體系的容器，其特征在于在反應(yīng)體系的上方、底部或四周至少放置一個超聲波諧振元件，在超聲波諧振元件與雜交反應(yīng)體系之間填充可使聲波傳導的耦合介質(zhì)，所述超聲波諧振元件與諧振電路相連。
全文摘要
一種利用超聲波促進雜交反應(yīng)的方法及裝置，該方法及裝置利用超聲波發(fā)生器產(chǎn)生一定強度的超聲，將準備好的雜交反應(yīng)體系置于超聲波傳播途徑中，利用超聲波的高頻振動及輻射壓力在雜交反應(yīng)體系的液體介質(zhì)中形成有效的攪動與流動，通過液體的流動帶動其中反應(yīng)分子的運動，從而促進雜交反應(yīng)的進行。本發(fā)明可顯著提高雜交信號的強度，更快地達到完全反應(yīng)狀態(tài)，縮短反應(yīng)時間；并使固體基質(zhì)表面不同位置的雜交反應(yīng)更趨一致，提高雜交信號的均勻性及雜交反應(yīng)的特異性。其裝置結(jié)構(gòu)簡單，成本低廉，核心元件僅有超聲諧振元件和相應(yīng)諧振電路，操作簡便，易于實現(xiàn)自動化。本發(fā)明可應(yīng)用于Southern、Northern及基因芯片等各種雜交反應(yīng)體系。
文檔編號C12Q1/68GK1402967SQ02128859
公開日2003年3月19日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月16日
發(fā)明者李剛, 邢婉麗, 王棟, 高華方, 郭旻, 程京 申請人:清華大學, 北京博奧生物芯片有限責任公司