專利名稱：維持和擴(kuò)增造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的方法和儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及維持和擴(kuò)增(expansion)造血干細(xì)胞的方法和儀器。更詳細(xì)的說，本發(fā)明涉及用于維持和/或擴(kuò)增造血干細(xì)胞和/或用于產(chǎn)生維持和/或擴(kuò)增造血干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的三維基質(zhì)細(xì)胞活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器。
哺乳動(dòng)物中的造血系統(tǒng)由細(xì)胞的異質(zhì)群體組成，其功能的范圍從具有有限增殖潛在性的成熟細(xì)胞至具有廣泛增殖、分化和自身更新能力的多能的干細(xì)胞(1-3)。造血干細(xì)胞(HSC)唯一需要移植后的造血重組并用作基因治療的主要目標(biāo)。盡管干細(xì)胞在維持造血系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，它們?cè)谠煅M織中極低的出現(xiàn)率、以及在來自體內(nèi)條件下，在延長時(shí)間階段維持或擴(kuò)增未分化干細(xì)胞的有限的能力，不僅保留這些細(xì)胞的基本臨床應(yīng)用的主要缺點(diǎn)，而且反映目前的不可用性，和對(duì)新的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑的需求。
人們已廣泛接受這樣的事實(shí)，即干細(xì)胞在體內(nèi)與骨髓內(nèi)的分散生態(tài)位(4-6)緊密相關(guān)，借助細(xì)胞-細(xì)胞接觸或近程相互作用，它提供共同介導(dǎo)它們的分化作用和自身更新的分子信號(hào)(7)。這些生態(tài)位是“造血誘導(dǎo)微環(huán)境”(HIM)的一部分，由骨髓基質(zhì)細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成(8)。通過提供細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)和有利于細(xì)胞-細(xì)胞接觸的基底膜成分，骨髓基質(zhì)細(xì)胞維持HIM的功能完整(9-11)。它們也提供用于可控制的造血細(xì)胞分化和增殖需要的多種可溶性或停留細(xì)胞因子(12-14)。
鑒于以上事實(shí)，開發(fā)用于延長維持人HSC的培養(yǎng)系統(tǒng)的努力主要集中在使用預(yù)先建立的原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層上就不感到奇怪了。這些包括長期培養(yǎng)的未照射(Dexter，15)或照射(16-19)的人原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及人或鼠基質(zhì)細(xì)胞系(16，19-24)，含有或不含有外源性加入的細(xì)胞因子。HSC輸出試驗(yàn)最初依賴于這樣的細(xì)胞產(chǎn)生骨髓后代(長期培養(yǎng)起始細(xì)胞；LTC-IC)的能力或依賴于在這樣的基質(zhì)細(xì)胞上延長(5-7周)培養(yǎng)后生成具有圓石塊(cobblestone)形態(tài)學(xué)(形成細(xì)胞的圓石塊；CAFC)集落的能力(16，17)。盡管廣泛使用LTC-IC和CAFC試驗(yàn)，然而，它們檢測(cè)高度原始的祖細(xì)胞而非真正種群恢復(fù)的造血干細(xì)胞(25，26)變得越來越明顯。
最近開發(fā)的人干細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)SCID種群恢復(fù)的細(xì)胞(SRC)，其對(duì)非肥胖性糖尿病(NOD)/SCID小鼠的骨髓提供居所(home)(27)，在那里它產(chǎn)生人的髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞胞樣的和CD34+祖細(xì)胞群體(28-30)。在表達(dá)CD34+38-表面抗原(31)的造血細(xì)胞部分廣泛發(fā)現(xiàn)SRC且在CB(1/3×105細(xì)胞)中它的出現(xiàn)次數(shù)與BM(1/9×105細(xì)胞)或流動(dòng)的PB(1/6×106細(xì)胞)相比是豐富的。最近研究顯示SRC殘留在CD34+/38-/CXCR4+細(xì)胞的亞種群中(33)。CXCR4，系因子基質(zhì)趨化細(xì)胞衍化因子1的表面受體(SDF-1，34)，對(duì)NOD/SCID骨髓中的人造血干細(xì)胞返回(homing)和移入顯然是必要的(33)。
旨在誘導(dǎo)延長的維持/擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上人HSC的研究主要建立在作為終點(diǎn)試驗(yàn)的CAFC、LTC-IC或CD34+38-表型上(16，19-24)。關(guān)于在基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物上維持/擴(kuò)增SRC很少的報(bào)道沒能說明明顯的長期支持。例如，發(fā)現(xiàn)同種異體人骨髓誘導(dǎo)短期(7天)SRC維持，隨后在活性上迅速、明顯下降(6倍)(26)。支持在基質(zhì)細(xì)胞層上的可移植人干細(xì)胞長期維持/擴(kuò)增的不可能性可歸因于與這些細(xì)胞的體外培養(yǎng)有關(guān)的幾個(gè)因素。在這些因素當(dāng)中，一種因素可包括基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層的用途，其并不反映在天然的、三維結(jié)構(gòu)的骨髓上的體內(nèi)生長條件。這樣的條件可減少基質(zhì)細(xì)胞提供最佳的、適宜的支持微環(huán)境的能力以及基質(zhì)細(xì)胞定位于特定的生態(tài)位和與基質(zhì)細(xì)胞及它們的產(chǎn)物物理相互作用的能力。的確，通過與它們?cè)谶@樣細(xì)胞的單細(xì)胞層的增殖相比較的那樣，在3D膠原基質(zhì)上接種的基質(zhì)細(xì)胞的人造血細(xì)胞系的優(yōu)先生長可提供造血祖細(xì)胞生物活性的三維(3D)結(jié)構(gòu)重要性的證據(jù)(35)。更重要的是，最近顯示與單獨(dú)或在骨髓基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層上培養(yǎng)的細(xì)胞相比較，3D鉭包衣的多孔生物材料增強(qiáng)獼猴L(fēng)TCIC或CD34+38-細(xì)胞的短期維持(36)。然而，未研究基質(zhì)細(xì)胞包衣的3D載體的作用。
最近研究已顯示鼠AFT024細(xì)胞系在支持2-3周的人CB SRC幸存活和維持(盡管未擴(kuò)大培養(yǎng))中優(yōu)于人基質(zhì)(37)。已發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系表達(dá)幾種新的編碼膜結(jié)合蛋白質(zhì)的HIM基因(21，38，39)，它在干細(xì)胞生理學(xué)中具有基本作用。在更密切模擬它們的3D骨髓微環(huán)境的條件下，這些和其它的基因經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞可能的表達(dá)(并因此使它們達(dá)到最佳的、生理功能活性)能夠得以測(cè)定。
廣泛研究已顯示基質(zhì)非接觸培養(yǎng)基(19，21，22，40，41)或基質(zhì)條件培養(yǎng)基(SCM)(21，42-44)單獨(dú)或與細(xì)胞因子一起能夠支持體內(nèi)維持或擴(kuò)增原生造血祖細(xì)胞。也已顯示SCM改善這樣的細(xì)胞的恢復(fù)和傳導(dǎo)效力(45，46)。當(dāng)這些發(fā)現(xiàn)再次強(qiáng)調(diào)可溶性基質(zhì)細(xì)胞因子的重要性時(shí)，在這樣的試驗(yàn)中LTC-IC、CAFC或CD34+38-的終點(diǎn)的用途不能反映SCM在維持/擴(kuò)增可移植性HSC的作用。此外，人們并不知道從基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞層培養(yǎng)基中得到的這樣的SCM是否確實(shí)包含參與人HSC生理學(xué)的所有與基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的基因產(chǎn)物。
最近針對(duì)來自體內(nèi)擴(kuò)增的可移植性造血干細(xì)胞的注意力已集中在建立細(xì)胞因子補(bǔ)充的懸浮培養(yǎng)液(47-53)上面。這些研究已幫助鑒定用于該目的主要相關(guān)細(xì)胞因子，例如，早期作用的細(xì)胞因子如干細(xì)胞因子(SCF)、FLT3配體和血小板生成素(TPO)。然而，已得到變化的結(jié)果，指明在培養(yǎng)2-4周期間(47，53)后短期喪失(48，49)、維持(50-52)、以及一些少有的SRC擴(kuò)增實(shí)例。在3D生長條件下，這些細(xì)胞因子和干細(xì)胞支持SRC的維持/擴(kuò)增的內(nèi)在活性的能力尚未定義。
因此，人們廣泛意識(shí)到需要具有可移植性造血干細(xì)胞來自體內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)和維持的方法和儀器，且它是高度有利的，這避免以上的局限性，與先有技術(shù)相比較具有優(yōu)越的結(jié)果。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和步驟(b)將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的另一個(gè)特征，該方法還包括分離未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明另一方面提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)在含有基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基上培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供制備用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的方法，方法包括以下步驟(a)在以片的形式存在的底物上于靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中建立基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)當(dāng)已獲得所需的基質(zhì)細(xì)胞密度時(shí)，從靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器上收集培養(yǎng)基，由此獲得用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一方面提供將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體(recipient)中的方法，方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，包括(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和(ii)將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中，其中在以片的形式存在的底物上，已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)將從步驟(a)生成的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體中。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的另一個(gè)特征，該方法還包括在步驟(b)前分離未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
本發(fā)明另一方面提供把未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體中的方法，方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，包括(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和(ii)在包含基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供生物反應(yīng)器活塞，活塞包括具有一個(gè)出口和一個(gè)入口的容器，且其中含有以片的形式存在的底物，底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，底物支持至少每立方厘米底物5×106個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供包含以上生物反應(yīng)器活塞的活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器。
按照以下描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中另外的特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動(dòng)的體循環(huán)血和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個(gè)體。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個(gè)體。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米底物5×106個(gè)細(xì)胞的密度。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米底物107個(gè)細(xì)胞的密度。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，當(dāng)接種后生物反應(yīng)器中的流動(dòng)切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中的步驟。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，纖維形成總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維組成，纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述基質(zhì)由具有2微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成。按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的另外特征，纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)材料選自聚酯類、聚烯烴、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
按照所描述的優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
通過提供更有效擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞的方法，本發(fā)明成功克服目前已知構(gòu)型的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的方法和生物反應(yīng)器的實(shí)施可包括人工、自動(dòng)或它們的聯(lián)合進(jìn)行或完成選擇的任務(wù)或步驟。此外，按照本發(fā)明的方法和生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)際儀器操作和設(shè)備，通過在任何固件的任何操作系統(tǒng)的硬件或軟件或它們的聯(lián)合，能夠?qū)嵤追N選擇的步驟。例如，作為硬件，本發(fā)明選擇的步驟能夠作為芯片或電路實(shí)施。作為軟件，作為經(jīng)使用任何適宜的操作系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)執(zhí)行大量軟件指令，能夠?qū)嵤┍景l(fā)明選擇的步驟。在任何情況下，如由數(shù)據(jù)處理器進(jìn)行的那樣，例如用于執(zhí)行大多數(shù)指令的計(jì)算平臺(tái)，能夠描述本發(fā)明的方法和生物反應(yīng)器選擇的步驟。繪圖的簡短描述在此僅借助實(shí)施例，并參照附圖來描述本發(fā)明。目前特別參照詳細(xì)的圖，強(qiáng)調(diào)所顯示的細(xì)節(jié)借助實(shí)施例來說明并僅用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案舉例說明的討論的目的，并在提供的情況下提出確信為最有用的且最易于理解本發(fā)明的原理和概念方面的描述的情況下提出。在這個(gè)方面，未作嘗試來更詳細(xì)顯示基本理解本發(fā)明必需的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，采用作圖描述，如何具體實(shí)踐本發(fā)明的幾種形式，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見。
圖中


圖1為舉例說明的活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器20的圖解描述，其當(dāng)減少本發(fā)明實(shí)踐時(shí)被使用；1-培養(yǎng)基庫；2-氣體混合物容器；3-氣體濾膜；4-注射點(diǎn)；5-活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器20的活塞或容器；6-流動(dòng)監(jiān)視器；6a-流動(dòng)閥門；7-條件培養(yǎng)基收集/分離容器；8-用于培養(yǎng)基交換的容器；9-蠕動(dòng)泵；10-采樣點(diǎn)；11-用于培養(yǎng)基交換的容器；12-O2監(jiān)視器；14-轉(zhuǎn)向裝置；PH-PH探頭。
圖2證實(shí)CAFC經(jīng)14F1.1細(xì)胞維持。在有限稀釋下，將臍帶血CD34+細(xì)胞接種到照射14F1.1或原代人骨髓基質(zhì)上。5周后，測(cè)定圓石的形成。結(jié)果表示2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖3證實(shí)LTC-IC經(jīng)14F1.1細(xì)胞維持。在有限稀釋下，將臍帶血CD34+細(xì)胞接種到照射14F1.1或原始人骨髓基質(zhì)上。7周后，測(cè)定髓細(xì)胞樣的集落的形成。伴隨每周培養(yǎng)基替換，加入FLT-3配體(300ng/ml)、TPO(300ng/ml)和SCF(100ng/ml)。結(jié)果表示2個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖4證實(shí)CD34+38-細(xì)胞在14F1.1和原始人骨髓基質(zhì)上的擴(kuò)增。在70 CD34+38-細(xì)胞/孔下，將CD34+細(xì)胞接種到14F1.1或原始人骨髓基質(zhì)上。每周加入細(xì)胞因子。7-21天后，胰蛋白酶消化培養(yǎng)基。經(jīng)FACS分析測(cè)定CD34+38-。結(jié)果表示2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖5a-b顯示用14F1.1基質(zhì)細(xì)胞系接種載體10天(圖5a)或40天(圖5b)后的掃描電子顯微攝影(SEM)。放大倍數(shù)×150。
圖6a-b證實(shí)3D對(duì)比2D的14F1.1條件培養(yǎng)基在CD34+38-擴(kuò)增上的作用。在來自14F1.1和原始人骨髓基質(zhì)的條件培養(yǎng)基的多種濃度存在下，于懸浮液培養(yǎng)基上接種CD34+細(xì)胞。經(jīng)FACS分析測(cè)定CD34+38-細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果表示2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
圖7證實(shí)CD34+38-細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞包衣載體上的維持。將基質(zhì)細(xì)胞包衣的載體從3D系統(tǒng)移至硅酮包衣的96孔盤上，隨后加入1.5×104CD34+細(xì)胞。對(duì)照組只包含載體和與載體等量的單層(2D)生長的14F1.1細(xì)胞。在設(shè)定的時(shí)間下收獲細(xì)胞并經(jīng)FACS分析。結(jié)果表示2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。
參照?qǐng)D和所附的描述可更好理解本發(fā)明的原理和操作。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本發(fā)明不局限于它在以下描述中或在圖中闡明概述的對(duì)結(jié)構(gòu)和組件布置細(xì)節(jié)上的應(yīng)用。本發(fā)明能夠以多種方式實(shí)踐或進(jìn)行其它的實(shí)施方案。也應(yīng)理解在此使用的用語和術(shù)語用于描述目的而不應(yīng)看作是限制。
目前策略集中在可移植的人造血干細(xì)胞(HSC)的來自體內(nèi)的長期維持或擴(kuò)增，但到目前為止僅獲得有限的成功。在此描述接近模擬骨髓微環(huán)境且能夠支持骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長和延長維持的新的三維(3D)活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器系統(tǒng)。后者接種到以玻璃柱包裝的由聚酯的非編織纖維基質(zhì)組成的多孔載體上，因而在相對(duì)小的體積中繁殖大量的細(xì)胞數(shù)。在以下實(shí)施例部分提供的實(shí)施例部分中，用鼠14F1.1基質(zhì)細(xì)胞系或用原始人骨髓基質(zhì)細(xì)胞接種生物反應(yīng)器。至接種后第40天，載體包含增加100倍的細(xì)胞密度。在多種水平下柱的密度是相同的，說明氧和營養(yǎng)物被均勻轉(zhuǎn)移至細(xì)胞。在生物反應(yīng)器(3D SCM)內(nèi)，在支持長期維持人臍帶血(CB)的CD34+38-細(xì)胞中，經(jīng)基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基優(yōu)于基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層(2D)SCM。3D SCM也能夠支持CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的擴(kuò)增，這表示SCID/NOD的種群恢復(fù)的細(xì)胞(SRC)。在細(xì)胞因子(FLT3配體和TPO)存在下，3D SCM增強(qiáng)干細(xì)胞自身更新且抑制分化，而2D SCM+細(xì)胞因子誘導(dǎo)相反的作用。三維基質(zhì)干細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)也呈現(xiàn)出比單細(xì)胞層基質(zhì)細(xì)胞上協(xié)同培養(yǎng)更優(yōu)良的CD34+38-細(xì)胞的維持。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)借助優(yōu)良的基質(zhì)干細(xì)胞接觸且或許借助基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生已知和/或新的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑，3D活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器提供用于來自體內(nèi)的維持/擴(kuò)增人HSC的適宜的系統(tǒng)。
人HSC為移植和基因療法的基本目標(biāo)。HSC高的減少出現(xiàn)次數(shù)、以及目前的生長因子能夠在缺乏晚期分化下誘導(dǎo)干細(xì)胞自身更新的無效性，仍對(duì)實(shí)施這樣的策略以及對(duì)HSC“庫”的大規(guī)模設(shè)置構(gòu)成主要的障礙。
目前策略集中在長期維持/擴(kuò)增未分化的人HSC上，迄今為止僅獲得有限的成功。當(dāng)最近用細(xì)胞因子補(bǔ)充的懸浮液培養(yǎng)基的研究已顯示一些SRC表達(dá)時(shí)，通過大量增加初期的造血祖細(xì)胞(53，62)也實(shí)現(xiàn)該方法，表明干細(xì)胞分化發(fā)生的基本程度。例如，一個(gè)理想系統(tǒng)就是其中SRC擴(kuò)增，而LTC-IC在數(shù)量上保留減少的系統(tǒng)。
用于造血細(xì)胞擴(kuò)增的當(dāng)前系統(tǒng)使用單獨(dú)的(參見U.S.專利5,646,043號(hào))或接種在基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層(參見U.S.專利5,605,822號(hào))上的造血細(xì)胞的灌流懸浮液培養(yǎng)基。前者系統(tǒng)證實(shí)定型(committed)祖細(xì)胞大量的產(chǎn)生，后者經(jīng)歷單細(xì)胞層基質(zhì)-干細(xì)胞相互作用的非生理性質(zhì)。用于干細(xì)胞擴(kuò)增的另外的系統(tǒng)描述基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(參見U.S.專利4,536,151號(hào)和5,437,994號(hào))的用途。然而，從基質(zhì)細(xì)胞單細(xì)胞層培養(yǎng)基得到后者，其在此清楚顯示與3D SCM相比較干細(xì)胞激活能力的低下和不同(參見實(shí)施例部分的表3)。盡管最近已描述(參見U.S.專利5,906,940號(hào))靜止相生物反應(yīng)器使用基質(zhì)細(xì)胞包衣的玻璃珠，玻璃珠不提供生理的、3D結(jié)構(gòu)且與減少本發(fā)明實(shí)踐使用的載體相比較，使每ml10倍降低數(shù)量的基質(zhì)細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)。通過在此呈現(xiàn)的結(jié)果，3D衍生的SCM或3D基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物支持維持CD34+38-細(xì)胞的優(yōu)越能力(參見圖6和7)，清楚證實(shí)3D對(duì)單細(xì)胞層基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的有利條件。3D SCM的優(yōu)越作用可歸因于已知細(xì)胞因子或新的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑的增加的水平。
旨在評(píng)價(jià)3D SCM和多種細(xì)胞因子(SCF，F(xiàn)LT3配體，TPO)在CD34+38-CXCR4+(或SRC)擴(kuò)增/維持(表3)上的聯(lián)合作用的實(shí)驗(yàn)清楚顯示在FLT3配體和TPO而沒有SCF存在下的3D SCM的有利作用。這些結(jié)果能夠歸因于3D SCM對(duì)干細(xì)胞分化的相對(duì)抑制作用。這些結(jié)果強(qiáng)烈指明在3D條件下，與新的基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的因子被產(chǎn)生，其或許它們本身沒有多少活性，可與這樣的細(xì)胞因子共同起作用。使用LTC-IC和定型祖細(xì)胞(GM-CFU)的產(chǎn)量讀出試驗(yàn)除CD34+產(chǎn)量以外，可測(cè)試干細(xì)胞的分化。
在此描述的生物反應(yīng)器是獨(dú)特的，即它將3D基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物與持續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)合并。最近已描述(U.S.專利5,541,107號(hào))沒有持續(xù)培養(yǎng)基流動(dòng)的3D基質(zhì)-造血細(xì)胞系統(tǒng)，在此描述的結(jié)果(參見例如圖7)清楚證實(shí)在缺乏持續(xù)流動(dòng)的情況下，相對(duì)單細(xì)胞層的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的有利條件減少。
在此描述的3D活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器能夠支持基質(zhì)細(xì)胞系以及原始骨髓基質(zhì)細(xì)胞的長期生長。基質(zhì)細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的用途不僅對(duì)建立優(yōu)良的基質(zhì)-干細(xì)胞接觸(借助獨(dú)特的“生態(tài)位”和細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-ECM相互作用)是必需的，而且對(duì)已知的和新的可溶性和膜結(jié)合細(xì)胞因子產(chǎn)生基質(zhì)細(xì)胞也是必需的?；|(zhì)細(xì)胞通過使用基因工程化細(xì)胞因子產(chǎn)生的變體，能夠有利于用適宜的細(xì)胞因子補(bǔ)充這樣的生物反應(yīng)器。
生物反應(yīng)器基質(zhì)細(xì)胞也能夠設(shè)計(jì)用作逆病毒包裝的細(xì)胞系，使基因材料有效傳導(dǎo)至在生物反應(yīng)器本身內(nèi)的干細(xì)胞中。各種基質(zhì)細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的用途也能選擇最適宜的底物用于驅(qū)除Ph陽性干細(xì)胞，已知后者對(duì)基質(zhì)細(xì)胞粘附的能力較低(63)。原始基質(zhì)細(xì)胞具有有利條件，它們能建立“自體的”基質(zhì)-干細(xì)胞生物反應(yīng)器，在它上面自體的或甚至臍帶血干細(xì)胞能夠被擴(kuò)增且其在移植前不需要除去基質(zhì)細(xì)胞。
當(dāng)在生物反應(yīng)器中的最初的接種試驗(yàn)指明在載體中的相對(duì)低收率的CD34+38-細(xì)胞，接種后培養(yǎng)基流動(dòng)速率以及最初接種至生物反應(yīng)器中的CD34+細(xì)胞數(shù)量可以容易地最優(yōu)化。在CD34+38-C×CR4+接種后的早期時(shí)間點(diǎn)(1-4天)分析對(duì)這樣的優(yōu)化是必要的。
與先有技術(shù)方法存在明顯差別，本發(fā)明的生物反應(yīng)器使用基本增加用于粘合基質(zhì)細(xì)胞的可以利用的附著表面的生長基質(zhì)，以便模擬骨髓的機(jī)械基本結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)高度0.5mm的生長基質(zhì)，基于生長基質(zhì)計(jì)算，因子增加至少5至30倍。每單位層的因子這樣增加大約5至30倍，且如果使用經(jīng)墊片(spacer)等堆積或分離的大量這樣的層，每一個(gè)這樣的結(jié)構(gòu)應(yīng)用5至30倍的因子。當(dāng)基質(zhì)以片形式、優(yōu)選非編織纖維片或開孔泡沫聚合物片使用時(shí)，優(yōu)選片的厚度為大約50至1000μm或更高，提供用于細(xì)胞入口、營養(yǎng)物入口和用于除去來自片的廢物的足夠的孔隙率。按照優(yōu)選方案，孔具有10μm至100μm的有效直徑。從多種厚度的纖維能夠制備這樣的片，優(yōu)選纖維厚度或纖維直徑范圍在大約0.5μm至20μm之間，更優(yōu)選纖維直徑在10μm至15μm范圍內(nèi)。
可通過或甚至更好地結(jié)合于提供用于二維穩(wěn)定性和物理強(qiáng)度的多孔載片或篩子，可支持本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。
也可將這樣的基質(zhì)片切割、沖壓或破碎以提供具有相同級(jí)的厚度(大約50-1000μm)的、大約0.2mm2至大約10mm2級(jí)的投射面積的顆粒。
在U.S.專利5,168,085號(hào)且尤其是5,266,476號(hào)中，描述用于減少本發(fā)明實(shí)踐的生長基質(zhì)的制備、用途和/或有利條件有關(guān)的其它細(xì)節(jié)，兩者通過引用結(jié)合到本文中。
如由技術(shù)人員易于意識(shí)到的那樣，本發(fā)明提供擴(kuò)增的未分化的造血干細(xì)胞群，它們能夠用于多種應(yīng)用，例如(但不局限于)(i)在受體基質(zhì)上擴(kuò)增人干細(xì)胞(自體或臍帶血來源的)，移植前不需要分離基質(zhì)干細(xì)胞；(ii)借助基質(zhì)-干細(xì)胞相互作用，在自體沉淀中排除Ph+CML干細(xì)胞；(iii)在生物反應(yīng)器中將基因轉(zhuǎn)移到自身更新干細(xì)胞中或隨后從生物反應(yīng)器中收獲；(iv)在懸浮培養(yǎng)基中或在干細(xì)胞生物反應(yīng)器中，產(chǎn)生3D基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SCM)，用于體內(nèi)維持/擴(kuò)增未分化的造血干細(xì)胞；(v)在缺乏分化下分離誘導(dǎo)干細(xì)胞自身更新的新的蛋白質(zhì)以及具有另外的生物功能的蛋白質(zhì)；(vi)分離3D基質(zhì)細(xì)胞RNA，用于克隆與新的基質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的干細(xì)胞調(diào)節(jié)劑和其它的功能性基質(zhì)細(xì)胞基因產(chǎn)物。
本發(fā)明的一個(gè)方面是提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法。通過實(shí)施以下方法步驟，進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的方法。首先，獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中，在與參考文獻(xiàn)編號(hào)一致的
圖1中描述它們的一個(gè)實(shí)例，其中在以片形式存在的底物上預(yù)先建立基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此，如在以上另外描述的那樣和在以下實(shí)施例部分中舉例說明的那樣，擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“未分化的造血干細(xì)胞”指的是未定型的(uncommitted)造血細(xì)胞。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“祖細(xì)胞”指的是定型的、然而未成熟的造血細(xì)胞。
未分化的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞兩者為CD34+細(xì)胞。因此，術(shù)語“獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞”和它的等價(jià)術(shù)語“未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞被獲得”兩者均指獲得分離的未分化的造血干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，或包含未分化的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的CD34+細(xì)胞群。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“擴(kuò)增的”和“擴(kuò)增”指的是基本未分化的細(xì)胞生長，即伴隨這樣增加未分化的細(xì)胞群增加。
如在以下說明書和在權(quán)利要求部分中使用的那樣，術(shù)語“維持的”和“維持”指的是基本未分化的細(xì)胞更新，即伴隨這樣的靜止期的未見分化的基本靜止的細(xì)胞群。
如在此使用的術(shù)語“分化”指的是發(fā)育期間來自相對(duì)歸一化到特殊種類的變化。各種細(xì)胞系的細(xì)胞分化為已得到充分證明的過程，在此不需進(jìn)一步描述。
如在此使用的術(shù)語“來自體內(nèi)”指的是從生命有機(jī)體除去的細(xì)胞且在有機(jī)體外面繁殖(例如，在試管中)。
擴(kuò)增后，例如，通過各種親和力分離/標(biāo)記技術(shù)，例如(但不局限于)熒光活化細(xì)胞分選和借助親和底物的親和分離，能夠分離現(xiàn)在擴(kuò)增的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。能夠用于實(shí)施這樣分離方法的親和分子包括例如其結(jié)合于CD34+細(xì)胞的抗-CD34抗體。
本發(fā)明另一方面提供擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的另一種方法。通過實(shí)施以下方法步驟，可進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明這個(gè)方面的方法。首先，獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，在包含作為單一成分或作為添加劑的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已建立基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，因此，如在以上另外描述的那樣和在以下實(shí)施例部分中舉例說明的那樣，擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供制備用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的方法。通過實(shí)施以下方法步驟，進(jìn)行本發(fā)明這個(gè)方面的方法。首先，在以片的形式存在的底物上(底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì))在靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中建立基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，當(dāng)已獲得所需的基質(zhì)細(xì)胞密度時(shí)，比如說，例如每立方厘米基質(zhì)大約5×106或107個(gè)細(xì)胞以上，如在以上另外描述的那樣和在以下實(shí)施例部分中舉例說明的那樣，從靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中收集培養(yǎng)基，獲得用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一方面提供將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植進(jìn)入到受體中的方法。通過實(shí)施以下方法步驟，進(jìn)行本發(fā)明這個(gè)方面的方法。首先，經(jīng)任何以上描述的方法擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。其次，將從第一步驟中生成的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植到受體中。
如在
圖1中所示，本發(fā)明的另一方面提供包含容器5的生物反應(yīng)器活塞，一般以具有一個(gè)出口和一個(gè)入口的柱的形式存在，且其中含有以片的形式存在的底物，底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，底物支持每立方厘米底物至少基質(zhì)細(xì)胞系或原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的5×106個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，優(yōu)選為至少個(gè)107個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供包含以上生物反應(yīng)器活塞的活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器。
在這方面，應(yīng)該意識(shí)到底物在理論上可支持最多每立方厘米5×107個(gè)細(xì)胞。一旦足夠的細(xì)胞聚集到底物上，能夠采用諸如照射的方法以停止另外的細(xì)胞生長，以便控制通過底物支持的準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)。
能夠從組織中純化或分離用作實(shí)施本發(fā)明方法的此類細(xì)胞來源的未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如(但不局限于)臍帶血、細(xì)胞因子移動(dòng)的體循環(huán)血(例如經(jīng)白細(xì)胞提取法(leukapheresis)收集)和骨髓，已知所有它們均包含未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。這樣的分離方法為本領(lǐng)域熟知的，最經(jīng)常使用的是熒光活化細(xì)胞分選，其中首先用熒光團(tuán)親和標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞且然后收集。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一的個(gè)體。因此，在把它們移植到受體中的情況下，不需要分離細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個(gè)體。例如，未分化的造血于細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的未來受體用于提供基質(zhì)細(xì)胞，而未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞來自供給這樣的細(xì)胞至受體的根據(jù)HLA適容性選擇的供體。因此，移植前不再需要分離細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。然而，按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，當(dāng)這樣接種后，生物反應(yīng)器中的流動(dòng)切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中的步驟，以致于使細(xì)胞能夠固定到基質(zhì)細(xì)胞覆蓋的基質(zhì)上。
以下描述提供用于實(shí)施本發(fā)明關(guān)于優(yōu)選底物的深入了解。
因此，按照一個(gè)實(shí)施方案，底物纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。按照另一個(gè)實(shí)施方案，制備底物的基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維組成，纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。按照另一個(gè)實(shí)施方案，基質(zhì)由具有2微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成。按照另外的實(shí)施方案，纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。按照另外的實(shí)施方案，制備底物的基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。按照另一個(gè)實(shí)施方案，基質(zhì)具有50-1000μm的高度，這是就使用它們的堆積而論的。按照另一個(gè)實(shí)施方案，制備底物的基質(zhì)材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。按照另一個(gè)實(shí)施方案，基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。按照另一個(gè)實(shí)施方案，基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
在以下實(shí)施例的檢驗(yàn)上，本發(fā)明另外的目的、優(yōu)點(diǎn)和新的特征對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，不打算對(duì)其限制。因此，發(fā)現(xiàn)如在以上概述的和如在以下權(quán)利要求部分中要求的本發(fā)明另外的各種實(shí)施方案和方面中的每一個(gè)得到以下實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)支持。
一般在此使用的術(shù)語和在本發(fā)明中使用的實(shí)驗(yàn)室方法包括分子、生物化學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。在文獻(xiàn)中詳盡解釋這樣的技術(shù)。參見例如，“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，Sambrook等，(1989)；“分子生物學(xué)中的通用流程”(Current Protocols in Molecular Biology)，第I-III卷，Ausubel，R.M.編輯(1994)；Ausubel等“分子生物學(xué)中的通用流程”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“分子克隆實(shí)用指南”John Wiley & Sons，紐約(1988)；Watson等，“重組DNA”，Scientific American Books，紐約；Birren等(編輯)“基因組分析實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)系列”，第1-4卷，Cold Spring Harbor實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(1998)；在U.S.專利4,666,828號(hào)，4,683,202號(hào)，4,801,531號(hào)，5,192,659號(hào)和5,272,057號(hào)中闡述的方法學(xué)；“細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，第I-III卷，Cellis，J.E.編輯(1994)；“免疫學(xué)中的通用流程”，第I-III卷，Coligan J.E.編輯(1994)；Stites等(編輯)“基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編輯)“細(xì)胞免疫學(xué)中的精選方法”，W.HFreeman公司，紐約(1980)；在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛描述可獲得的免疫試驗(yàn)，參見例如，U.S.專利3,791,932號(hào)、3,839,153號(hào)、3,850,752號(hào)、3,850,578號(hào)、3,853,987號(hào)、3,867,517號(hào)、3,879,262、3,901,654號(hào)、3,935,074號(hào)、3,984,533號(hào)、3,996,345號(hào)、4,034,074號(hào)、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；“寡核苷酸合成”，Gait，M.J.編輯(1984)；“核酸雜化作用”，Hames，B.D.和Higgins S.J.編輯(1985)；“轉(zhuǎn)錄和翻譯”，Hames，B.D.和Higgins S.J.編輯(1984)；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”，F(xiàn)reshney，R.I.編輯(1986)；“固定化細(xì)胞和酶”(ImmobilizedCells and Enzymes)，IRL出版社，(1986)；“分子克隆實(shí)用指南”，Perbal，B.，(1984)和“酶學(xué)中的方法”，第1-317卷，Academic出版社；“PCR流程方法和應(yīng)用指南”，Academic出版社，圣迭戈，CA(1990)；等，“蛋白質(zhì)純化和鑒定策略-實(shí)驗(yàn)室方法手冊(cè)”，CSHL出版社(1996)；所有文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中，好象在此充分概述的那樣。其它的一般參考文獻(xiàn)也隨該文件一起提供。相信其中的方法是本領(lǐng)域熟知的并為便利讀者而提供。包含在那里的所有信息通過引用結(jié)合到本文中。材料和實(shí)驗(yàn)方法生物反應(yīng)器根據(jù)本發(fā)明技術(shù)使用的生物反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)上與在
圖1中描述的設(shè)計(jì)一致。設(shè)計(jì)玻璃器皿并在Technino(以色列)制備，經(jīng)硅膠管(silicone tubing)(Degania，以色列)連接。在不含有Ca+2和Mg+2的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；Beit Ha’Emek工業(yè)，以色列)中，將載體旋轉(zhuǎn)過夜，隨后除去PBS和釋放的碎片。每柱用10ml填充載體填充。用PBS-Ca-Mg填充生物反應(yīng)器，密封所有出口且將系統(tǒng)高壓滅菌(120℃，30分鐘)。借助容器[8]除去PBS并在包含有300ml的含有10％熱滅活的小牛血清(FCS；Beit Ha’Emek工業(yè)，以色列)和Pen-Strep-Nystatin混合物(100U/ml100μg/ml1.25μn/ml；Beit Ha’Emek)的Dulbecco氏高葡萄糖培養(yǎng)基(DMEM；GIBCO BRL)的37℃的孵育器中，將生物反應(yīng)器循環(huán)48小時(shí)。用含有以上物質(zhì)+2ML-谷氨酰胺(BeitHa’Emek)的新鮮DMEM替代循環(huán)培養(yǎng)基。
基質(zhì)細(xì)胞于充分潤濕的空氣5％CO2的孵育器中，在37℃下，在用10％FSC補(bǔ)充的DMEM中維持基質(zhì)細(xì)胞系。在組織培養(yǎng)燒瓶(Corning)中，細(xì)胞生長并在達(dá)到匯合后經(jīng)胰蛋白酶作用裂解。從經(jīng)受開放心臟手術(shù)的血液學(xué)健康供體抽取的胸骨骨髓建立原代人骨髓基質(zhì)細(xì)胞。簡言之，在Hank氏平衡鹽溶液(HBSS；GIBCO BRL)中，將骨髓抽吸液稀釋3倍且經(jīng)歷菲可帕克(Robbins Scientific公司，Sunnyvale，CA)密度梯度離心。收集骨髓單核細(xì)胞(＜1.077gm/cm3)，以HBSS洗滌3次且重懸浮于長期培養(yǎng)基(LTC)中，培養(yǎng)基由用12.5％FCS、12.5％馬血清(Beit Ha’Emek)、10-4M β-巰基乙醇(Merck)和10-6mol/L琥珀酸氫化可的松鈉(Sigma)補(bǔ)充的DMEM組成。在37℃(5％CO2)下，將細(xì)胞在25ml組織培養(yǎng)燒瓶(Corning)中孵育3天且然后在33℃(同上)下孵育，每周重新加入培養(yǎng)基。來自各自供體的基質(zhì)細(xì)胞用于每一個(gè)生物反應(yīng)器。為3D和單細(xì)胞層研究，每10天經(jīng)胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶和EDTA在Puck氏鹽水A中；Beit Ha’Emek)分裂原代基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，以使足夠的基質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增。對(duì)LTC-IC和CAFC(參見如下)，使用137Cs源照射(1500cGy)基質(zhì)細(xì)胞，在33℃下于LTC培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)物。
基質(zhì)細(xì)胞的接種基質(zhì)細(xì)胞系或5周原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞的匯合培養(yǎng)物經(jīng)胰蛋白酶消化且以HBSS將細(xì)胞洗滌3次，重懸浮于生物反應(yīng)器培養(yǎng)基(參見以上)中，計(jì)數(shù)并在10ml體積中借助注射點(diǎn)以106細(xì)胞/ml接種([4]，
圖1)到在生物反應(yīng)器的玻璃柱中的10ml載體上。接種后立即停止循環(huán)16小時(shí)以使細(xì)胞固定于載體上。通過除去載體且經(jīng)MTT方法對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)(56)，監(jiān)測(cè)基質(zhì)細(xì)胞生長。當(dāng)基質(zhì)細(xì)胞匯合時(shí)，用LTC培養(yǎng)基替代培養(yǎng)基，用于繼續(xù)研究(制備SCM，干細(xì)胞接種)。
基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SCM)的制備在等價(jià)細(xì)胞密度下，用新鮮LTC培養(yǎng)基重新載荷單細(xì)胞層和生物反應(yīng)器的基質(zhì)細(xì)胞。孵育細(xì)胞過夜后，收集SCM。為此目的，將3D培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基流動(dòng)停止16小時(shí)并在重新開始循環(huán)前直接從柱上移去。為分析CD34+細(xì)胞對(duì)SRC的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的作用，在把CD34+細(xì)胞接種到3D系統(tǒng)中后在各個(gè)間隔(2-7天)停止循環(huán)且如上描述的那樣從柱收集培養(yǎng)基。將SCM離心(1000xg，10分鐘)，過濾且貯存在-20℃下。在生物反應(yīng)器中，基質(zhì)細(xì)胞也可在不含有血漿的培養(yǎng)基中生長，為收集SCM，排除不確定的變化。
CD34+細(xì)胞的分離在菲可帕克上，將在傳遞期間于滅菌條件下采集的臍帶血樣分級(jí)培養(yǎng)(fractionated)并收集上浮的(buoyant)(＜1.077gr/cm3)單核細(xì)胞。將來自各CB樣品的細(xì)胞混合，用抗CD34抗體孵育并經(jīng)midi MACS(Miltenyl Biotech)分離。
CD34+細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)基在0.5ml減去或加上單獨(dú)或聯(lián)合的300ng/ml每一個(gè)FLT3配體、SCF或TPO的0-100％SCM中，于24孔盤(TPP，瑞典)上孵育CB CD34+細(xì)胞(5×105/孔)。對(duì)照組包含加上或減去細(xì)胞因子的LTC培養(yǎng)基。在37℃下，于5％CO2的空氣中，孵育細(xì)胞。每周交換培養(yǎng)基。接種前及在各個(gè)時(shí)間(1-3周)，收獲細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)計(jì)數(shù)用于CD34+/38-/CXCR4+試驗(yàn)。輸出量試驗(yàn)也可包括SRC、CAFC和LTC-IC。
基質(zhì)-干細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)在含有等密度的匯合基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞層或生物反應(yīng)器上，在同等數(shù)目(大約5×105)下接種分離的、混合的CB CD34+細(xì)胞。當(dāng)加入到生物反應(yīng)器上時(shí)，停止培養(yǎng)基流動(dòng)16小時(shí)以使與基質(zhì)細(xì)胞接觸且在每分鐘0.1-1.0ml的速度下重新開始。在缺乏培養(yǎng)基交換下，除去CD34+細(xì)胞接種的基質(zhì)細(xì)胞載體以進(jìn)行對(duì)照研究。在含有或不含有細(xì)胞因子的LTC培養(yǎng)基中，維持協(xié)同培養(yǎng)。在多個(gè)時(shí)間(最多可達(dá)4周)，從單細(xì)胞層上清液或從循環(huán)培養(yǎng)基中，借助容器([8]，
圖1)收集非粘附細(xì)胞。借助順序胰蛋白酶作用并接觸基于EDTA的解離緩沖液(GIBCO BRL)，隨后溫和吸取細(xì)胞，收集粘附細(xì)胞。為避免在生成的懸浮液中存在基質(zhì)細(xì)胞，將細(xì)胞重懸浮于HBSS+10％FCS中并在37℃下于塑料組織培養(yǎng)皿(Corning)上經(jīng)歷60分鐘的粘附過程。將循環(huán)的且分離載體的造血細(xì)胞洗滌，經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)計(jì)數(shù)并分開用于CD34+/38-/CXCR4+試驗(yàn)。輸出量試驗(yàn)也可包括SRC、CAFC和LTC-IC。
流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)在4℃下，用飽和濃度的單克隆抗-CD34+PerCP(Beckton-Dickinson)、抗-CXCR4-熒光異氰酸酯(FITC，R&D系統(tǒng))和-藻紅蛋白(PE，Beckton-Dickinson)抗體孵育細(xì)胞30分鐘。在含有5％熱滅活的FCS的冰冷卻的PBS中，洗滌細(xì)胞2次并重懸浮以用于在FACS掃描(Beckton-Dickinson)上的三色流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)定。
LTC-IC和CAFC試驗(yàn)如先前描述的那樣(16，17)，新鮮分離的CD34+細(xì)胞，即從基質(zhì)-干細(xì)胞協(xié)同培養(yǎng)或從懸浮培養(yǎng)基分離的細(xì)胞，用于LTC-IC和CAFC測(cè)定。將匯合的原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，照射(1500cGy)且以0.1ml鋪在96孔板(Corning)上(1.5×104/孔)。建立24平行測(cè)定孔/組。用0.1ml含有連續(xù)稀釋的CD34+細(xì)胞(500-5細(xì)胞/孔)的LTC培養(yǎng)基或用從各試驗(yàn)中收獲的系列稀釋的細(xì)胞，覆蓋基質(zhì)細(xì)胞。在33℃下，直接將培養(yǎng)基孵育5周，伴隨每周交換半數(shù)的培養(yǎng)基。如先前描述的那樣(57)，在1000rpm下，將這些板離心10分鐘，移去培養(yǎng)基上清液，用甲基纖維素培養(yǎng)基和用于骨髓祖細(xì)胞試驗(yàn)的細(xì)胞因子覆蓋剩余的細(xì)胞。14天后對(duì)計(jì)數(shù)細(xì)胞且按照給出37％陰性培養(yǎng)物(16)的受試細(xì)胞濃度的倒數(shù)測(cè)定LTC-IC出現(xiàn)的次數(shù)。除缺乏甲基纖維素和細(xì)胞因子以外，基本上如以上描述的那樣進(jìn)行CAFC試驗(yàn)。在接種系列稀釋的受試細(xì)胞懸浮液后6周，測(cè)定具有在基質(zhì)層下的至少5個(gè)細(xì)胞(圓石區(qū))中的至少一個(gè)暗相(phase-dark)造血克隆的孔百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果減少本發(fā)明實(shí)踐所使用的生物反應(yīng)器系統(tǒng)在
圖1中描述。它包含四個(gè)平行的活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器單位[5]。每個(gè)生物反應(yīng)器單位包含1克由聚酯的非編織纖維基質(zhì)制成的多孔載體(直徑4mm)(58)。這些載體使得在相對(duì)小的體積中繁殖大量的細(xì)胞數(shù)目。載體的結(jié)構(gòu)和填充物對(duì)氧和營養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移以及在局部濃度和釋放的基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)物(例如，ECM蛋白質(zhì)，細(xì)胞因子，59)有很大的影響。生物反應(yīng)器在37℃的孵育器中維持。
監(jiān)測(cè)每個(gè)生物反應(yīng)器中的流動(dòng)[6]且通過閥門調(diào)節(jié)[6a]。每個(gè)生物反應(yīng)器包含一個(gè)進(jìn)樣和注射點(diǎn)[4]，使順序接種基質(zhì)和造血細(xì)胞。在pH7.0下，從貯庫[1]中[13]供應(yīng)培養(yǎng)基。在不同的比例下依生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度而定，以維持5-40％溶解氧在從柱的出口，經(jīng)含有空氣/CO2/O2[2]的過濾[3]氣體混合物供應(yīng)貯庫。如由監(jiān)控器測(cè)定的那樣[12]，O2的比例適宜于溶解氧在生物反應(yīng)器出口的水平。借助硅酮試管，將氣體混合物供應(yīng)于貯庫。使培養(yǎng)基通過分開的容器[7]，該容器能收集循環(huán)的、未粘附的細(xì)胞。在0.1-3ml/分鐘的速率下，借助蠕動(dòng)泵[9]獲得培養(yǎng)基循環(huán)。生物反應(yīng)器單位配備另外的進(jìn)樣點(diǎn)[10]和兩個(gè)用于以10-50ml/天的速率連續(xù)交換培養(yǎng)基的容器[8，11]。使用四個(gè)平行的生物反應(yīng)器單位以便于定期拆除，例如細(xì)胞除去、掃描電子顯微鏡、組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、RNA提取等。
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，建立包含其先前顯示支持定型的人髓樣祖細(xì)胞(24)生長的鼠14F1.1基質(zhì)細(xì)胞系(24、60、61)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該細(xì)胞系也同樣能夠支持人CB CAFC(圖2)、LTC-IC(圖3)和CD34+38-細(xì)胞(圖4)以及原代人骨髓基質(zhì)細(xì)胞。在這些圖中呈現(xiàn)的結(jié)果也顯示，將FLT3配體+TPO加入到這些培養(yǎng)基中對(duì)LTC-IC無作用，而這些細(xì)胞因子顯著增強(qiáng)CAFC和CD34+38-細(xì)胞產(chǎn)量。反之，SCF誘導(dǎo)LTC-IC和CAFC兩者下降。當(dāng)以1.5×106個(gè)細(xì)胞/10ml培養(yǎng)物體積接種到生物反應(yīng)器中時(shí)，14F1.1細(xì)胞生長且鋪展在載體(圖5)上。接種后第40天，載體包含100倍增加的細(xì)胞密度，即大約1.5×106個(gè)細(xì)胞/載體，1.5×107個(gè)細(xì)胞/ml(表1)。表114F1.1和原代人骨髓基質(zhì)在載體上生長的動(dòng)力學(xué)
MTT分析包括5個(gè)載體/測(cè)定。2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值在柱的各種水平載體上的細(xì)胞密度是相同的，指明氧和營養(yǎng)物均勻轉(zhuǎn)移到細(xì)胞上。對(duì)這些細(xì)胞優(yōu)化培養(yǎng)條件培養(yǎng)基(Dulbecco氏高葡萄糖培養(yǎng)基+10％小牛血清)、流動(dòng)速率(1ml/min)、培養(yǎng)基交換次數(shù)(每周一次)、最初接種密度(如上)。未發(fā)現(xiàn)膠原或聚L-賴氨酸載體包衣對(duì)14F1.1細(xì)胞的生長速率和最終密度上的有益作用。用原代人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(表1)初步結(jié)果表明14F1.1細(xì)胞和原代基質(zhì)細(xì)胞在分別接種后在第10天和第14天具有相似的密度。
為測(cè)定基質(zhì)細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的功能活性，測(cè)定從生物反應(yīng)器柱(3D SCM)中獲得的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SCM)對(duì)用人CB CD34+細(xì)胞接種的懸浮培養(yǎng)液中的CD34+38-細(xì)胞擴(kuò)增的作用。該活性可與從包含相同濃度的基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞層培養(yǎng)物(2D SCM)獲得的SCM相比較。如在圖6中顯示的那樣，發(fā)現(xiàn)來自14F1.1細(xì)胞的SCM比來自原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞的SCM相等地或更能夠支持人CB CD34+38-細(xì)胞的維持。在較低的濃度下，始終觀察到14F1.1細(xì)胞SCM比原代骨髓SCM強(qiáng)的最大作用。此外，在支持人CBCD34+38-細(xì)胞的擴(kuò)增中，發(fā)現(xiàn)3D SCM優(yōu)于兩種細(xì)胞類型的2D SCM。在培養(yǎng)期間(14天對(duì)21天)，2D和3D SCM之間的活性差異更加明顯。如與只含有培養(yǎng)基的對(duì)照培養(yǎng)液相比較，將14F1.1 3D SCM加入到人CB CD34+細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)液中也導(dǎo)致CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的維持(表2)。表23D 4F1.1 SCM對(duì)CD34+38-/CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)量的作用
將人CB CD34+細(xì)胞(8×104/點(diǎn))接種在含有LTC培養(yǎng)基或50％3D 14F1.1 SCM的懸浮培養(yǎng)液中。7天后收獲培養(yǎng)物且經(jīng)FACS分析細(xì)胞。CD34+38-和CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)量分別為2800和112。
表3證實(shí)包含在2D與包含在3D SCM中的CD34+的懸浮培養(yǎng)液細(xì)胞因子的作用的比較。結(jié)果清楚證實(shí)在支持維持CD34+38-且更重要的是在維持CD34+38-CXCR4+(SRC)亞群兩者中3D SCM優(yōu)于2DSCM。表3細(xì)胞因子對(duì)擴(kuò)增3 D14F1.1 SCM中的CD34+38-/CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的作用
人CB CD34+細(xì)胞(2.6×105/點(diǎn))50％2D對(duì)3D 14F1.1 SCM，在FLT3配體(300ng/ml)TPO(300ng/ml)或SCF(50ng/ml)缺乏或存在下的比較。7天后收獲培養(yǎng)物且經(jīng)FACS分析細(xì)胞。CD34+38-和CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)量分別為7900和360。
這可涉及到2D SCM對(duì)細(xì)胞分化的更強(qiáng)作用，如由CD34+細(xì)胞的產(chǎn)率檢測(cè)的那樣。在2D SCM存在下TPO+FLT3配體減少CD34+38-/CD34+38-CXCR4+的產(chǎn)率，但增強(qiáng)它們?cè)谟?D SCM補(bǔ)充的培養(yǎng)物中的產(chǎn)率。如經(jīng)CD34+表面標(biāo)記測(cè)定的那樣，這再次歸因于3D系統(tǒng)中更小程度的分化。在2D和3D SCM兩種培養(yǎng)基中，SCF誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的明顯增加和在CD34+38-/CD34+38-CXCR4+細(xì)胞的產(chǎn)率上明顯的減少。
為測(cè)定在我們的生物反應(yīng)器中基質(zhì)-干細(xì)胞的相互作用，首先評(píng)價(jià)CD34+38-細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞(14F1.1)包衣的載體上的維持/擴(kuò)增。從生物反應(yīng)器中移出后者并進(jìn)入到硅酮包衣的96孔盤上，隨后加入CD34+細(xì)胞。對(duì)照品僅含有載體和載體-相等數(shù)量的單層14F1.1細(xì)胞。如在圖7中顯示的那樣，通過只存在載體的情況下，增強(qiáng)CD34+38-細(xì)胞的生存，證實(shí)3D結(jié)構(gòu)對(duì)原生祖細(xì)胞的生存和維持的有益作用(36)。在促進(jìn)7-天的CD34+38-細(xì)胞的生存/維持中，基質(zhì)-細(xì)胞包衣的載體優(yōu)于單獨(dú)的載體或優(yōu)于單細(xì)胞層的14F1.1細(xì)胞。在14F1.1單細(xì)胞層和14F1.1包衣的載體培養(yǎng)基中，延長的培養(yǎng)基(第14天)導(dǎo)致CD34+38-的數(shù)目增加。
在隨后的實(shí)驗(yàn)中，將6×106混合的CB CD34+(3×105CD34+38-)細(xì)胞接種到含有未照射的4柱、14F1.1包衣的載體在350ml循環(huán)培養(yǎng)基中的生物反應(yīng)器中。流動(dòng)停止培養(yǎng)基16小時(shí)，之后在正常速率(1ml/min)下繼續(xù)進(jìn)行。協(xié)同培養(yǎng)4天后，經(jīng)對(duì)收獲的活細(xì)胞的FACS分析測(cè)定，循環(huán)培養(yǎng)基含有10％初步接種的CD34+38-細(xì)胞。培養(yǎng)18天后，循環(huán)培養(yǎng)基包含0.4％CD34+38-細(xì)胞，而載體粘附的細(xì)胞包含3％最初接種的CD34+38-群體。
盡管結(jié)合它們的具體實(shí)施方案已描述本發(fā)明，事實(shí)上許多選擇、修飾和變化、對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。因此，打算包括所有這樣的選擇、修飾和變化，其均在所附的權(quán)利要求書的精神和廣義范圍內(nèi)。在此引用的所有出版物通過引用全文結(jié)合到本文中。在本申請(qǐng)書中任何參考文獻(xiàn)的引用或認(rèn)證別將不構(gòu)成為一種認(rèn)可，即不應(yīng)認(rèn)為這樣的參考文獻(xiàn)如同本發(fā)明的先有技術(shù)一樣是可以利用的。
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權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中，其中三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物已被預(yù)先建立在以片的形式存在的底物上，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動(dòng)的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個(gè)體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個(gè)體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個(gè)細(xì)胞的密度。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個(gè)細(xì)胞的密度。
10.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)所述接種后所述生物反應(yīng)器中的流動(dòng)切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行所述將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到所述靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中的步驟。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
15.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
16.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
17.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
18.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
19.權(quán)利要求1的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
20.權(quán)利要求1的方法，該方法還包括分離所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
21.一種擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)在包含基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動(dòng)的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個(gè)體。
25.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個(gè)體。
26.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個(gè)細(xì)胞的密度。
29.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個(gè)細(xì)胞的密度。
30.權(quán)利要求21的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
31.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
32.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
33.權(quán)利要求21的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
34.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
35.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
36.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
37.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
38.權(quán)利要求21的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
39.一種制備用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的方法，該方法包括以下步驟(a)在以片的形式存在的底物上于靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中建立基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)當(dāng)已獲得所需的基質(zhì)細(xì)胞密度時(shí)，從所述靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器上收集培養(yǎng)基，由此獲得用于擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個(gè)細(xì)胞的密度。
41.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個(gè)細(xì)胞的密度。
42.權(quán)利要求39的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
43.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
44.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
45.權(quán)利要求39的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
46.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
47.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
48.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
49.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
50.權(quán)利要求39的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
51.一種將未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植至受體的方法，該方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(ii)將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中，其中在以片的形式存在的底物上，已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(b)將從步驟(a)生成的所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植到受體中。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動(dòng)的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
54.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個(gè)體。
55.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個(gè)體。
56.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
57.權(quán)利要求51的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
58.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個(gè)細(xì)胞的密度。
59.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個(gè)細(xì)胞的密度。
60.權(quán)利要求51的方法，其中當(dāng)所述接種后所述生物反應(yīng)器中的流動(dòng)切斷至少10小時(shí)時(shí)，進(jìn)行所述將所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到所述靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中的步驟。
61.權(quán)利要求51的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
62.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
63.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
64.權(quán)利要求51的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
65.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
66.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
67.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
68.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
69.權(quán)利要求51的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
70.權(quán)利要求51的方法，該方法還包括在步驟(b)前分離所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的步驟。
71.一種把未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞移植到受體的方法，該方法包括以下步驟(a)通過以下步驟擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞(i)獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞；和(ii)在包含基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，所述基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基衍生于靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器，其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
72.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞為從選自臍帶血、流動(dòng)的體循環(huán)血液和骨髓的組織中分離的細(xì)胞。
73.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞分享共同的HLA抗原。
74.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自單一個(gè)體。
75.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的個(gè)體。
76.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自相同的物種。
77.權(quán)利要求71的方法，其中所述未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞和所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞來自不同的物種。
78.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物5×106個(gè)細(xì)胞的密度。
79.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的基質(zhì)細(xì)胞生長到至少每立方厘米所述底物107個(gè)細(xì)胞的密度。
80.權(quán)利要求71的方法，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
81.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維制成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
82.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1。
83.權(quán)利要求71的方法，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
84.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
85.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
86.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
87.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
88.權(quán)利要求71的方法，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
89.一種生物反應(yīng)器活塞，其包括具有一個(gè)出口和一個(gè)入口的容器且其中包含以片的形式存在的底物，所述底物包含形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì)，所述底物支持至少每立方厘米所述底物5×106個(gè)基質(zhì)細(xì)胞。
90.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述纖維形成為總體積百分比40至95％的孔體積和10微米至100微米的孔徑大小。
91.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述基質(zhì)由選自平面、非圓形和中空纖維和它們的混合物的纖維組成，所述纖維直徑或?qū)挾葹?.5微米至50微米。
92.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述基質(zhì)由具有2微米至20微米寬度的纖維形成的帶狀結(jié)構(gòu)組成，且其中纖維的寬度與厚度的比例為至少2∶1
93.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中所述基質(zhì)具有為總體積百分比60至95％的孔體積。
94.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)具有50-1000μm的高度。
95.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)的材料選自聚酯類、聚乙烯、聚氟氯乙烯類、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜類、乙酸纖維素、玻璃纖維和惰性金屬纖維。
96.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)以選自方形、環(huán)形、盤形和十字形的形狀存在。
97.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)以盤的形式存在。
98.權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器，其中基質(zhì)用聚-D-賴氨酸包衣。
99.一種活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器，其包含權(quán)利要求89的生物反應(yīng)器活塞。
全文摘要
通過獲得未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞;和把未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞接種到靜止相活塞流動(dòng)生物反應(yīng)器中,或者在從這樣的反應(yīng)器得到的條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞,擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞的方法,其中在以片的形式存在的底物上已預(yù)先建立三維基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物,底物包括形成生理學(xué)上可接受的三維纖維網(wǎng)狀物的非編織纖維基質(zhì),由此擴(kuò)增/維持未分化的造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1346403SQ00806007
公開日2002年4月24日 申請(qǐng)日期2000年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月4日
發(fā)明者S·梅查夫, S·梅雷特斯基 申請(qǐng)人:技術(shù)研究及發(fā)展基金有限公司