專利名稱：用于增加造血細胞的方法
背景技術(shù)：
造血是血細胞由骨髓中的多能干細胞發(fā)育和分化的過程。該過程包括通過靶細胞上的膜結(jié)合受體發(fā)揮作用的多肽生長因子(細胞因子)間的復(fù)雜的相互作用。對一特定的通常是系特異性和/或階段特異性細胞因子的反應(yīng)，細胞因子的作用導(dǎo)致細胞的增殖和分化。由干細胞向一單一細胞類型如血小板的發(fā)育可能需要許多以適宜的順序發(fā)揮作用的細胞因子的協(xié)調(diào)作用。
多年來推測血小板的產(chǎn)生可能由特定的體液因子調(diào)節(jié)。早期的實驗已經(jīng)表明血小板減少的動物的血漿和尿液含有一種促進巨核細胞集落形成和增大骨髓巨核細胞的活性。在文獻中這種活性被稱為血小板生成素(最近由McDonald，《實驗血液學(xué)》(Exp.Hematol.)16201-205，1988和McDonald，《美國兒科血液學(xué)和腫瘤學(xué)雜志》(Am.J.Ped.Hematol.Oncol.)148-21，1992綜述)。該活性的低濃度以及缺乏適宜的生物檢測方法長期妨礙著蛋白質(zhì)的純化和鑒定。目前已經(jīng)利用培養(yǎng)的基因工程細胞制備出血小板生成素。見de Sauvage等，《自然》(Nature)369533-538，1994；Lok等，《自然》369565-568，1994；Kaushansky等，《自然》369568-571，1994；和Bartley等，《細胞》(Cell)771117-1124，1994。
已表明血小板生成素在正常的(Lok等，同上)和血小板減少的(Sprugel等，《血液》(Blood)84(10增刊1)242a，1994)動物體內(nèi)增加血小板的數(shù)量并且刺激紅細胞的產(chǎn)生(Kaushansky等，《臨床研究雜志》(J.Clin.Invest.)待發(fā)表)。在體外TPO促進定向成為巨核細胞的CD34+細胞的存活和增殖(Papayannopoulou等，《血液》84(10增刊1)324a，1994)。
雖然目前TPO的克隆和鑒定允許研究其在刺激血小板生成中的臨床應(yīng)用，但血小板減少和貧血仍是重要的臨床問題，如與癌癥患者的化療和放療相關(guān)聯(lián)。在接受骨髓移植和外周血干細胞移植，包括自體移植的患者中仍特別需要刺激血小板產(chǎn)生的方法。且還需要刺激紅細胞產(chǎn)生。本發(fā)明提供滿足這些需要的治療方法并提供其它相關(guān)的的優(yōu)點。
發(fā)明的總結(jié)本發(fā)明提供用于在一需要增加造血細胞的受體患者體內(nèi)增加造血細胞的方法。這些方法包括步驟(a)給予供體一定數(shù)量的足以刺激供體體內(nèi)髓系細胞增殖的血小板生成素(TPO)；(b)從供體收集細胞，其中細胞為骨髓細胞或外周血干細胞；并(c)將骨髓細胞或外周血干細胞輸注給受體患者。供體和受體可以是不同個體或同一個體。在本發(fā)明的一個實施方案中，受體患者已進行過化療或放療處理。在另一實施方案中，給予骨髓細胞或外周血干細胞后或同時，給予受體患者一定量的足以促進血小板恢復(fù)或紅細胞恢復(fù)的TPO。
在另一方面，本發(fā)明提供制備用于移植的細胞的方法，包括給予供體一定數(shù)量的足以刺激供體體內(nèi)髓系細胞增殖的TPO，和從供體收集細胞，其中細胞為骨髓細胞或外周血干細胞。
在第三方面，本發(fā)明提供一種在一接受化療或放療的患者體內(nèi)刺激血小板恢復(fù)或紅細胞恢復(fù)的方法，包括(a)給予患者一定數(shù)量的足以刺激患者體內(nèi)髓系細胞增殖的TPO；(b)在化療或放療前從患者體內(nèi)收集骨髓細胞或外周血干細胞；并(c)在化療或放療后給患者回輸所收集的細胞。在一個實施方案中本方法進一步包括在回輸所收集的細胞后或同時給予患者一定量的足以促進血小板恢復(fù)或紅細胞恢復(fù)的TPO。
參考下面詳細的描述和所附的圖，本發(fā)明的這些和其它方面將更為明顯。
圖的簡要描述

圖1說明移植來自TPO或載體處理的供體小鼠的骨髓細胞對受體動物的血小板記數(shù)的效果。在一個實驗中，對TPO處理的骨髓的受體也用TPO(20kU/天腹腔注射)處理。數(shù)據(jù)表示為在兩個實驗中的10-20只小鼠的均值。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
圖2說明移植來自TPO或載體處理的供體小鼠的骨髓細胞對受體動物的紅細胞記數(shù)的效果。數(shù)據(jù)表示為在兩個實驗中的20只小鼠的均值。*，p＜0.05；**，p＜0.005。
圖3說明在接受來自TPO或載體處理的供體的骨髓移植物的小鼠中經(jīng)過或不經(jīng)過移植后TPO處理血小板的恢復(fù)。
發(fā)明的詳細描述術(shù)語“干細胞”此中被用于表示多能干細胞和髓樣祖細胞。
術(shù)語“移植”此中被用于表示從一個供體移走細胞隨后將細胞給予一受體的過程。該術(shù)語包括同種異基因移植，其中供體和受體是同一物種的不同個體；和自體移植，其中供體和受體為同一個體。
術(shù)語“增加造血細胞”此中被用于表示在造血細胞被摧毀后，如由于疾病或治療的干涉導(dǎo)致的摧毀，造血細胞水平的恢復(fù)或增進的復(fù)原。
術(shù)語“血小板生成素”包括以特異性結(jié)合同種的MPL受體并在體內(nèi)刺激血小板產(chǎn)生的能力為特點的蛋白質(zhì)。在正常的測試動物中，TPO能夠在開始每日給藥后的10天內(nèi)將血小板水平提高100％或更高。在序列號1中顯示一個代表性的TPO cDNA序列，而在序列號2中顯示相應(yīng)的氨基酸序列。分析和實驗證據(jù)表明成熟蛋白在殘基Ser-22處起始。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到所闡明的序列與人TPO基因的一個單等位基因一致，并且預(yù)期等位基因變異存在。等位基因變體包括含有沉默突變的那些和突變導(dǎo)致氨基酸序列改變的那些。顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠制備其它變體，如通過利用另一密碼子在便于核苷酸序列操作的位點改造，通過密碼子的置換在氨基酸序列中產(chǎn)生保守的改變，等。本發(fā)明考慮利用等位基因的和改造的變體TPO。另外，已知長度上大約150個氨基酸或更多的氨基端TPO多肽是有活性的(de Sauvage等，ibid；Bartley等，同上；普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?8/346,999)，并且TPO的這種截短形式的利用在本發(fā)明的范圍之中。在科學(xué)文獻中已經(jīng)公布了源自非人物種的血小板生成素(Lok等，同上；de Sauvage等，同上；Bartley等，同上)。
本發(fā)明提供用于增加患者，特別是如在癌癥的治療中經(jīng)過放療和/或化療的患者體內(nèi)造血細胞的方法。這些療法殺傷骨髓和外周血中正在分裂的祖細胞，這限制治療且通常需要輸血來恢復(fù)血小板和其它血細胞的循環(huán)水平。尤為重要的是那些在放療后接受骨髓和/或外周血干細胞移植的和患有先天性代謝缺陷需要骨髓移植的患者。這些適應(yīng)癥是與乳腺癌、白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤的治療相關(guān)的骨髓移植以及如重癥聯(lián)合免疫缺陷、地中海貧血和鐮狀細胞貧血的先天性缺陷。在腫瘤細胞存在于外周血中的風(fēng)險不存在的條件下可以優(yōu)選外周血干細胞移植。
進行骨髓和外周血干細胞移植的方法在本領(lǐng)域中是已知的。綜述見Synder等，“輸血醫(yī)學(xué)”(Transfusion Medicine)Benz和McArthur編輯，《血液學(xué)》(Hematology)1994，美國血液學(xué)會，96-106，1994。按照公認的臨床步驟通過白細胞分離收集外周血干細胞。根據(jù)細胞表面標志物(例如CD34)篩選造血祖細胞，這容許富集預(yù)期的細胞并清除污染的腫瘤細胞。將收集的細胞在一種合適的冷凍保護劑中(例如二甲基亞砜、羥乙基淀粉)凍存直至需要。在麻醉下通過骨穿刺從供體收集骨髓細胞。為了降小體積，通常對收集的骨髓進行處理使血漿和細胞成分分開。在異基因骨髓移植中，移走血漿也可以消除紅細胞不相容性。對細胞組分可以利用密度梯度技術(shù)或自動化分離方法富集單核細胞并利用各種細胞毒藥物清除T細胞。按照已經(jīng)建立的方法包括控制速率的冷凍和冷凍保存劑的使用來冷凍保存收集的骨髓細胞。在使用前將干細胞立即在一溫水浴融化使與融化相關(guān)的損失降至最小。在異基因骨髓移植情況下，供體和受體是組織相配的以使移植物抗宿主病的風(fēng)險降至最低。
造血細胞的增加是干細胞移植入受體患者特別是髓系細胞包括CD34+干細胞和來自CD34+干細胞的細胞所造成的。尤為重要的是巨核細胞系和紅系細胞，它們分別可以重建受體的血小板和紅細胞群。
在本發(fā)明中，供體在捐獻骨髓或外周血細胞前用足以刺激髓系細胞增殖的數(shù)量的TPO處理供體。這個數(shù)量通常是在0.5lg/kg/天到40lg/kg/天范圍之間，優(yōu)選1lg/kg/天到20lg/kg/天。對供體的處理將在骨髓或外周血干細胞收獲前的3天到2周內(nèi)進行一天到幾天，優(yōu)選大約2-5天。優(yōu)選在細胞收獲前5到10天內(nèi)處理供體。供體體內(nèi)CD34+干細胞和髓系其它細胞的增加可以通過移植物受體的血小板和/或紅細胞水平的加速恢復(fù)來證實。
在本發(fā)明的一個實施方案中，對受體在移植后用TPO處理以進一步促進血小板的恢復(fù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用TPO進行移植后處理可提高經(jīng)致死劑量照射并給予取自TPO處理供體骨髓的測試動物的存活?！耙欢康淖阋源龠M血小板恢復(fù)的血小板生成素”是與未處理患者相比在正常血小板水平恢復(fù)的時間上產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著的降低或在血小板記數(shù)上產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加的量。移植后處理中所用的TPO的劑量通常是在0.5lg/kg/天到40lg/kg/天范圍之間，給藥大約3到20天。大體上，接受骨髓移植的患者比那些接受外周血干細胞移植的患者需要更長時間的移植后處理。
在本發(fā)明中使用的TPO可利用基因工程的培養(yǎng)細胞按照本領(lǐng)域中普遍已知的方法制備?，F(xiàn)總結(jié)這些方法，將編碼TPO的一種DNA分子與提供其維持和在宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的其它DNA序列相連。將所得的表達載體插入宿主細胞，并將所獲得的被“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”的細胞在一合適的營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。幼倉鼠腎(BHK)細胞是一種優(yōu)選的宿主。雖然可以從細胞裂解液中回收TPO并在體外處理來產(chǎn)生活性蛋白，但優(yōu)選改造細胞以分泌TPO到培養(yǎng)基中。大體上，見de Sauvage等，ibid；Lok等，ibid；Kaushansky等，《自然》369568-571，1994；Wendling等，《自然》369571-574，1997；Bartley等，ibid；和未決的普通轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?8/366,859和08/347,029，這些以一個整體并入本文作為參考。
可以通過聯(lián)合應(yīng)用層析和其它技術(shù)包括染料-配體親和基質(zhì)上的直接俘獲和離子交換層析從細胞條件培養(yǎng)液中純化TPO?？梢酝ㄟ^羥磷灰石吸附除去污染的蛋白質(zhì)。
為了藥物的利用，將TPO按照傳統(tǒng)的方法制備以用于非腸道特別是靜脈內(nèi)或皮下給藥。靜脈內(nèi)給藥可以是通過大丸注射或在一到幾個小時這樣一個典型的期間輸注。大體上，藥物的配方可包括一種造血蛋白聯(lián)合一種藥學(xué)上可用的載體，如鹽水、緩沖鹽、5％葡萄糖水溶液或類似的物質(zhì)。配方還可包括一種或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑(例如磷酸鹽緩沖液)、白蛋白或一種防止蛋白質(zhì)在藥瓶表面丟失的非離子去污劑等。另外，TPO可與其它細胞因子、尤其是早期作用細胞因子如干細胞因子、IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF聯(lián)合。在利用這種聯(lián)合療法時，可將細胞因子組合在一個單一配方中或以各自的配方給藥。配制的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的并被公布在如《Remington藥物科學(xué)》，Grnnaro編，Mack出版公司，Easton PA，1990中，它被并入本文作為參考。
通過下面的非限定性的實施例對本發(fā)明做進一步闡明。
實施例實施例1利用轉(zhuǎn)染的幼倉鼠腎細胞(BHK 570細胞，ATCC CRL 10314)制備小鼠血小板生成素。無血清培養(yǎng)基含有145kU/ml的TPO活性，其中將10個單位定義為在利用轉(zhuǎn)染有編碼MPL受體的表達載體(Vigon等《(美國國家科學(xué)院學(xué)報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)895640-5644，1992)的BaF3細胞進行的細胞分裂(3H-胸苷摻入)測試中產(chǎn)生半量最大刺激的TPO的量。BaF3是一種源于小鼠骨髓的白細胞介素-3依賴前淋巴樣細胞系(Palacios和Steinmetz，《細胞》41727-734，1985；Mathey-Prevot等，《(分子細胞生物學(xué)》(Mol.Cell.Biol.)64133-4135，1986)。在3H-胸苷存在的情況下將細胞暴露于測試樣品。通過與一個人TPO的標準曲線相比較對摻入細胞DNA的3H-胸苷進行定量。在集落形成測試中TPO在大約100-400U/ml的范圍內(nèi)是有效的。小鼠中在20-40kU/天的范圍內(nèi)可以見到體內(nèi)活性。對于體內(nèi)實驗，在無內(nèi)毒素的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)中TPO稀釋至預(yù)期的濃度并通過腹膜內(nèi)或皮下注射給藥。
雌性Balb-C小鼠(年齡范圍8-12周)是獲自Broekman B.V.(Someren，荷蘭)，并用商品化的嚙齒類食物喂養(yǎng)和隨意提供酸化的水。將移植的受體飼養(yǎng)在無病原體環(huán)境中并喂以含有濃度為1mg/ml的環(huán)丙沙星、70lg/ml的多粘菌素B和2g/100ml的蔗糖的水。
將受體小鼠置于一聚間位乙酸甲酯盒中并利用菲利浦SL75-5/6mV直線加速器(菲利浦醫(yī)療系統(tǒng)，Best，荷蘭)進行致死量(8.5Gy)照射。以4Gy/min的劑量率在后-前和前-后位置上將輻射分為兩部分。用105取自穩(wěn)定狀態(tài)的供體小鼠的骨髓細胞移植小鼠。在采集骨髓的4小時內(nèi)進行移植。在移植后1-5、3-8或3-12天腹膜內(nèi)給予(i.p.)20kU/天劑量的TPO治療5只受體小鼠的實驗組。以相同數(shù)量的骨髓細胞移植對照組動物，并在移植后以相似的時間間隔給予鹽水。與鹽水處理的對照受體相比，給予TPO不能導(dǎo)致加速的血小板重建。在1-14天皮下(S.C.)給予30kU/天的劑量在加速血小板恢復(fù)上也是無效的。在血細胞或紅細胞的重建上也未見到效果。
在第二個系列的實驗中，用TPO以每只小鼠20kU/天i.p.的劑量連續(xù)5天處理供體小鼠。在第5天處死小鼠并收獲血液、骨髓和脾。在一個Sysmex800計數(shù)儀(TOA Medical Electronics Company，Kobe，日本)上對白細胞、紅細胞和血小板計數(shù)。TPO處理誘導(dǎo)血小板數(shù)量增加2.5倍，但對白細胞或紅細胞的數(shù)量卻無影響。
對TPO處理的供體小鼠也測定了祖細胞的水平。在無菌條件下通過用含有500lg/ml青霉素、250lg/ml鏈霉素和2％胎牛血清(FBS)(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)的RPMI 1640沖洗股骨收獲細胞。通過研磨器官和用含有2％FBS的RPMI 1640沖洗一次來制備脾的單細胞懸液。為了計數(shù)集落形成單位，按照發(fā)表的步驟(Fibbe等，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)148417，1992)培養(yǎng)CFU-GM。簡言之，在小鼠GM-CSF(1.25ng/ml)存在的條件下，將骨髓細胞培養(yǎng)于含有104細胞/孔的微量滴定板中的半固體培養(yǎng)基中。將外周血單核細胞和脾細胞分別培養(yǎng)于含有5×105細胞/ml和106細胞/ml的3.5cm平板中。在37℃含有5％CO2的充分濕化的環(huán)境中培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)6天后，利用倒置顯微鏡對集落(定義為＞20個細胞的集團)計數(shù)。在1.25ng/ml重組小鼠GM-CSF、2U/ml重組人EPO、25ng/ml重組IL-3、5％轉(zhuǎn)鐵蛋白、5％牛血清白蛋白、5％10-3β巰基乙醇和7.5％Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)聯(lián)合存在的條件下以相同的方式在3.5cm平板中進行CFU-mix檢測。在充分濕化含有5％CO2的環(huán)境中于37℃培養(yǎng)6到7天后，利用一倒置顯微鏡對集落形成細胞計數(shù)。與鹽水處理的對照相比，TPO處理導(dǎo)致骨髓或脾中集落形成單位(CFU)和BFU-E數(shù)量的增加(表)。
表供體處理股骨TPO 鹽水有核細胞(×106) 18.4±4.719.9±4.3CFU(×103)55.3±12.5*38.6±5.2BFU-E(×103) 24.0±4.916.4±2.3脾有核細胞(×106) 71.8±35.0 78.4±42.5CFU(×103)27.3±16.9 16.3±11.4BFU-E(×103) 10.2±2.31.9±0.7結(jié)果以每個器官(股骨或脾)的絕對細胞數(shù)(均值±S.D.，n＝7)表達。
CFU代表在CFU-mix測試中培養(yǎng)的集落總數(shù)。*p＜0.05。
用取自以20kU/天i.p.的劑量連續(xù)處理5天的供體或鹽水處理對照供體的105骨髓細胞移植致死性照射的受體動物。移植后每3天通過尾靜脈放血從每個受體取血樣。在TPO處理或未處理的骨髓細胞的受體之間于可見的出血傾向上未觀察到差別。
利用學(xué)生T檢驗分析細胞計數(shù)。在MANOVA分析中，考慮它們的時間過程對組進行比較。在數(shù)據(jù)的log值上進行分析。將＜0.05的值認為統(tǒng)計學(xué)上顯著。利用MANOVA檢驗對曲線進行比較。結(jié)果表明與用取自鹽水處理對照供體的同等數(shù)量骨髓細胞移植的對照動物相比，在TPO處理骨髓的受體中血小板的重建被顯著地改變(圖1)。另外，在接受TPO處理骨髓的動物中，血小板最低點高于接受對照骨髓的動物(在移植后12天88×109對30×109，20個小鼠的均值)。如在圖1中所示，用20kU/天TPC(腹內(nèi)注射)在1-5天進行移植后處理在接受取自TPO處理供體骨髓的小鼠中未導(dǎo)致血小板重建的進一步加速。
除加速的血小板重建外，TPO處理骨髓細胞的受體也表現(xiàn)出加速的紅細胞重建(圖2)。在這些動物中紅細胞計數(shù)的最低點也比在移植有相等數(shù)量未處理骨髓細胞的對照中高。進行實驗來進一步證實這種效應(yīng)是由于TPO對紅系造血的直接活性而與血小板計數(shù)和出血傾向的差別無關(guān)。這個實驗中受體動物直到移植后12天未發(fā)生出血，此時處死受體小鼠并評價骨髓和血液來源的祖細胞的數(shù)量。雖然這些差別沒有統(tǒng)計學(xué)的顯著性，TPO處理骨髓細胞的受體比移植有相等數(shù)量未處理骨髓細胞的對照具有更高的BFU-E集落數(shù)/股骨(770±386對422±320，均值±SD，n＝5)。用TPO以所測試的劑量進行移植后處理未導(dǎo)致紅細胞重建的進一步加速。實施例2進行第二個實驗用來在經(jīng)致死性照射并接受取自TPO處理的或未處理的供體骨髓的小鼠中比較血小板計數(shù)，并確定對受體動物進行移植后TPO處理的效果。
B6D2 F1小鼠獲自Taconic(Germantown，NY)并在無特定病原體的條件下喂養(yǎng)。將小鼠每籠養(yǎng)5只并隨意喂以酸化的水和食物。40只雌性小鼠用作受體，5只雄性小鼠用作供體。
利用轉(zhuǎn)染的BHK 570細胞制備重組TPO。主要的分子樣品是一條70kD的帶。制備物具有5641 U/lg的特異性活性。在pH6.0含有0.05％多乙氧基醚80和0.13M NaCl的29mM磷酸鉀緩沖液中配制該蛋白，并以每份20kU凍存。在使用前將TPO和載體溶液直接融化，并每日一次皮下注射給小鼠。
對兩只供體小鼠均用每天20kU TPO處理4天，然后在第5天通過頸椎脫臼處死。無菌取出股骨，并用含有2％胎牛血清的Ham’s F12(FredHutchinson腫瘤研究中心，西雅圖，WA)通過插入一個連至注射器的25g針頭沖洗出骨髓。將細胞懸液通過一個18g針頭、一個20g針頭和一個22g針頭沖洗兩次制備單細胞懸液。在血細胞計數(shù)儀上對有核細胞計數(shù)。
在第2天，將受體小鼠暴露于發(fā)自137Cs源(Gammacell 40 Irradiator，Automic Energy of Canada Radiochemical Company，Kanata，加拿大)的1200 cGy全身照射。照射后2到4小時進行骨髓移植。20只小鼠接受取自TPO處理的供體的骨髓(1×105細胞)和20只小鼠接受取載體處理的供體的1×105細胞。在第1天(移植后2天)開始用TPO(20kU/天)處理受體并持續(xù)14天。
將小鼠在乙醚麻醉下由眶后竇放血。將50ll血樣收集于肝素化的微量移液管(VWR Scientific，西雅圖，WA)中，滴入帶有EDTA(BectonDickson，San Jose，CA)的微量試管中。也將血滴在玻璃片上，并制備涂片。在一個Cell Dyn3500血液分析儀(Abbott，Santa Clara，CA)上分析血液。確定血細胞比容、RBC計數(shù)、WBC計數(shù)和血小板計數(shù)。
在接受取自對照供體骨髓的小鼠中，血小板計數(shù)在第8天降至低水平(低至正常的6％)并在TPO處理的和對照的動物中于12天開始恢復(fù)(圖3)。在血小板恢復(fù)上兩組間無差別。然而，在載體處理的對照中，10只動物只有3只存活，而在TPO處理的組中，9只動物有7只存活。死亡與出血有關(guān)。在TPO處理組中，因為一些血小板計數(shù)很低的動物能夠存活故標準差較大。
接受TPO處理供體骨髓的小鼠在第8天具有低于正常的6％的血小板數(shù)。大體上用TPO處理14天的動物在血小板計數(shù)上恢復(fù)更快。9只TPO處理動物中存活了8只，而9只載體處理小鼠中只有4只存活。與對照相比，RBC在接受TPO預(yù)處理的骨髓并用TPO處理的小鼠中恢復(fù)更快。TPO處理在白細胞恢復(fù)中沒有影響。
由前所述，雖然此中為了說明已經(jīng)描述了本發(fā)明的特定實施方案，但應(yīng)認識到仍可進行各種不偏離本發(fā)明的精神和范圍的修改。相應(yīng)地，除了如由所附的權(quán)利要求限定的外，本發(fā)明是沒有限定的。
序列表(1)一般信息(i)申請人ZymoGenetics，Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattleWAUSA98102(ii)發(fā)明題目用于增加造血細胞的方法(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)收信人ZymoGenetics，Inc.
(B)街1201 Eastlake Avenue East(C)城市西雅圖(D)州WA(E)國家美國(F)郵政編碼98102(V)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申請資料
(A)申請?zhí)?B)申請日期(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Parker，Gary E(B)注冊號31-648(C)參考/案卷號95-10(ix)通訊信息(A)電話206-442-6600分機6673(B)傳真206-442-6678(2)序列號1的資料(i)序列特征(A)長度1062個堿基對(B)類型核酸(C)線型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置1..1059(xi)序列描述序列號1ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACTGCA48Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu ThrAla1 5 10 15AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGAGTC96Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu ArgVal20 25 30CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTGAGC 144Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg LeuSer35 40 45CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCTGCT 192Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu ProAla50 55 60GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACCAAG 240Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu ThrLys65 70 7580GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTGATG 288Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly ValMet85 90 95GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTGGGG 336Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu LeuGly100 105 110CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGCCTC 384Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln SerLeu115 120 125CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAGGAT 432Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His LysAsp130 135 140CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAGGTG 480Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly LysVal145 150 155160CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGGGCC 528Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg ArgAla165 170 175CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACACTG 576Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu ThrLeu180 185 190AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTCACT 624Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn PheThr195 200 205GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAGGGA 672Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln GlnGly210 215 220TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCCCTG 720Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg SerLeu225 230 235240GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AATGGA 768Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu AsnGly245 250 255ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCCCCG 816Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly AlaPro260 265 270GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AACCTC 864Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro AsnLeu275 280 285CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAGTAT 912Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly GlnTyr290 295 300ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAGCTC 960Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val GlnLeu305 310 315320CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACCAGC 1008His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro ThrSer325 330 335CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAGGAA 1056Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser GlnGlu340 345 350GGG TAA1062Gly(2)序列號2的資料(i)序列特征(A)長度353個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述序列號2Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu ThrAla1 5 10 15Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu ArgVal20 25 30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg LeuSer35 40 45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu ProAla50 55 60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu ThrLys65 70 7580Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly ValMet85 90 95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu LeuGly100 105 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln SerLeu115 120 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His LysAsp130 135 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly LysVal145 150 155160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg ArgAla165 170 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu ThrLeu180 185 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn PheThr195 200 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln GlnGly210 215 220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg SerLeu225 230 235240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu AsnGly245 250 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly AlaPro260 265 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro AsnLeu275 280 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly GlnTyr290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val GlnLeu305 310 315320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro ThrSer325 330 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser GlnGlu340 345 350Gly
權(quán)利要求
1.一種用于在一需要增加造血細胞的受體患者中增加造血細胞的方法，包括給予供體一定數(shù)量的足以刺激供體體內(nèi)髓系細胞增殖的血小板生成素(TPO)；從供體收集細胞，其中細胞為骨髓細胞或外周血干細胞；將骨髓細胞或外周血干細胞給予受體患者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中受體患者已受過化療或放療處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中供體和受體患者是同一個體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中在收集和第二次輸注步驟之間用化療或放療處理受體患者。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細胞是骨髓細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細胞是外周血干細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進一步包括在輸注骨髓細胞或外周血干細胞后或同時，給予受體患者一定數(shù)量的足以促進血小板恢復(fù)或紅細胞恢復(fù)的血小板生成素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中TPO是人TPO。
9.一種制備用于移植的細胞的方法，包括給予供體一定數(shù)量的足以刺激供體體內(nèi)髓系細胞增殖的血小板生成素(TPO)；從供體收集細胞，其中細胞為骨髓細胞或外周血干細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中TPO是人TPO。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中細胞是骨髓細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中細胞是外周血干細胞。
13.一種在接受化療或放療的患者中刺激血小板或紅細胞恢復(fù)的方法，包括給予患者一定數(shù)量的足以刺激患者體內(nèi)髓系細胞增殖的TPO；在化療或放療前從患者收集骨髓細胞或外周血干細胞；并在化療或放療后給患者回輸所收集的細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，進一步包括在回輸所收集的細胞后或同時給予患者一定數(shù)量的足以促進血小板恢復(fù)或紅細胞恢復(fù)的血小板生成素。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中TPO是人TPO。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中細胞是骨髓細胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中細胞是外周血干細胞。
全文摘要
本發(fā)明公布用于在接受骨髓或外周血干細胞移植的患者中增加造血細胞包括血小板和紅細胞的方法。本方法包括給予供者一定數(shù)量的足以刺激髓系細胞增殖的血小板生成素,從供者收集細胞并將收集的細胞給予一受體患者,可以用額外的血小板生成素處理受體患者。本方法在異基因和自體移植過程中是有用的。
文檔編號A61K38/00GK1190348SQ96194536
公開日1998年8月12日 申請日期1996年5月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者W·E·菲比, A·格羅斯曼 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司