一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料及其制備方法和應(yīng)用，其解決了現(xiàn)有電活性材料電學(xué)特性無法匹配天然骨愈合過程等技術(shù)問題，本發(fā)明中促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料是以鈦酸鍶為基底，釕酸鍶為中間層，表面沉積鐵酸鉍的薄膜。本發(fā)明同時(shí)提供了其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明可用于促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化技術(shù)領(lǐng)域。
【專利說明】
一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由于干細(xì)胞具有高度自我更新能力及多向分化潛能，是再生醫(yī)學(xué)的重要種子細(xì)胞。模擬干細(xì)胞的體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境，調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)，實(shí)現(xiàn)其體外定向分化已成為目前再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。已有大量研究證實(shí)生長因子、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、彈性模量等可以單獨(dú)或者協(xié)同影響干細(xì)胞分化。而近年來，生物材料的表面電荷逐漸成為影響干細(xì)胞行為的另一重要因素。
[0003]在骨骼活組織的完整部位與損傷部位之間存在的電位差，即為損傷電位。如將電位計(jì)的其中一個(gè)電極移至損傷部位，另一電極處于完整部位表面，則可觀察到電位計(jì)的指針發(fā)生偏轉(zhuǎn)，損傷部位為負(fù)，完整部位為正。此種電位差，能夠促進(jìn)成骨，加速骨折愈合。因此，骨組織的損傷電位特性由于其在骨重建以及修復(fù)過程中的關(guān)鍵作用，將為促進(jìn)成骨分化、加速骨骼愈合提供了一種新的思路。
[0004]生物材料介導(dǎo)的電刺激誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化近年來受到廣泛關(guān)注。其中具有長期儲(chǔ)存表面電荷的壓電材料如鈦酸鋇(BaTi03)、鈮酸鋰(LN)等在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有大量研究報(bào)道，結(jié)果顯示其具有良好的電活性和生物相容性，能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)成骨分化。
[0005]然而，這些電活性材料的極化強(qiáng)度低，不能長期保持極化，無法匹配成骨修復(fù)的過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有電活性材料電學(xué)特性無法匹配天然骨愈合過程等技術(shù)問題，基于損傷電位對(duì)于骨修復(fù)與重建的重要性，利用高極化強(qiáng)度的鐵酸鉍(BFO)構(gòu)建損傷電位模型，建立模擬損傷電位促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]為此，本發(fā)明提供一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料，其是以鈦酸鍶為基底，釕酸鍶為中間層，表面沉積鐵酸鉍的薄膜。
[0008]優(yōu)選的，表面的鐵酸鉍薄膜厚度為5?10nm，中間層釕酸鍶厚度為5?10nm，基底鈦酸鍶厚度為0.5mm，表面電勢(shì)為-30mV?-70mV。
[0009]優(yōu)選的，鐵酸鉍薄膜厚度為20?30nm，中間層釕酸鍶厚度為20?30nm，，表面電勢(shì)為-65?_70mVo
[0010]本發(fā)明同時(shí)提供一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料的制備方法，其采用脈沖激光沉積法。
[0011]優(yōu)選的，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料的制備過程中生長溫度為300-800°C，生長中間層釕酸鍶的激光頻率為1-5HZ;激光能量為60-90mj ;氧分壓為10-20pa;生長時(shí)間為5-30min;生長表面鐵酸鉍的激光頻率為5HZ;激光能量為70_90mj ;氧分壓為15_20pa;生長時(shí)間為5_60min。
[0012]本發(fā)明還提供一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其包括如下步驟:(I)制備模擬損傷電位的電活性鐵酸鉍薄膜材料模型；(2)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)擴(kuò)增培養(yǎng):采用無成骨誘導(dǎo)因子的間充值干細(xì)胞培養(yǎng)基，間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)，胰酶消化并傳代；(3)材料模型上接種間充質(zhì)干細(xì)胞:取間充質(zhì)干細(xì)胞接種于具有極化表面電荷的鐵酸鉍薄膜表面，仍采用無成骨誘導(dǎo)因子的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);(4)間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附與成骨分化檢測(cè)。
[0013]優(yōu)選的，步驟(2)中，骨髓來源或脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后于T75的培養(yǎng)瓶中貼壁生長，每3天用0.25%的胰酶消化并傳代。
[0014]優(yōu)選的，步驟(3)中，取3-6代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于鐵酸鉍表面，采用無成骨誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基，置于溫度37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0015]本發(fā)明利用高極化強(qiáng)度的鐵酸鉍(BFO)作為模擬損傷電位促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的研究模型，將有助于提升電活性植入材料在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用潛能，具有以下技術(shù)效果:
[0016](I)本發(fā)明通過脈沖激光沉積法，通過調(diào)控激光頻率、激光能量、生長時(shí)間及氧分壓等參數(shù)，得到模擬損傷電位的BFO外延薄膜材料模型，且具有較高的極化強(qiáng)度。
[0017](2)本發(fā)明通過模擬損傷電位促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，解決了電活性材料電學(xué)特性無法匹配天然骨愈合過程等技術(shù)問題，提供了一種不依靠誘導(dǎo)因子調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞分化的方法。
[0018](3)本發(fā)明所制得的模擬損傷電位的電活性材料BFO外延薄膜與MSCs具有良好的親和性，可促進(jìn)MSCs的黏附增殖，促進(jìn)其成骨分化。
[0019](4)本發(fā)明在不加入任何誘導(dǎo)因子的條件下可實(shí)現(xiàn)直接誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的目的，安全性好，可控性強(qiáng)。
[0020]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中模擬損傷電位的BFO外延薄膜的原子力顯微鏡照片；
[0022]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中模擬損傷電位的BFO外延薄膜的表面電勢(shì)示意圖；
[0023]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中模擬損傷電位的BFO外延薄膜的體外間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)3小時(shí)的免疫熒光照片；
[0024]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中模擬損傷電位的BFO外延薄膜促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)的免疫熒光染色激光共聚焦照片；
[0025]圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中模擬損傷電位的BFO外延薄膜促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的Runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)的免疫熒光染色激光共聚焦照片。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明提供了一種模擬損傷電位促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法，下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0027]下列實(shí)施例中所用的MSCs細(xì)胞，購自于賽業(yè)生物科技有限公司。
[0028]實(shí)施例1
[0029](I)制備模擬損傷電位的電活性鐵酸鉍(BFO)薄膜材料模型。以鈦酸鍶(STO)為基底，采用脈沖激光沉積法(PLD)制備模擬損傷電位的BFO外延薄膜。生長溫度為700 °C，生長中間層釕酸鍶的激光頻率為2HZ;激光能量為70mj ;氧分壓為13pa;生長時(shí)間為20min。生長BFO的激光頻率為5HZ;激光能量為75m j ;氧分壓為18pa;生長時(shí)間為30min。
[0030](2)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng):采用無成骨誘導(dǎo)因子的間充值干細(xì)胞培養(yǎng)基(間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%的胎牛血清+100 IU/mL青霉素-鏈霉素，均購買于賽業(yè)生物科技有限公司，下同)JSCs細(xì)胞復(fù)蘇后于T75的培養(yǎng)瓶中貼壁生長，每3天用0.25%的胰酶消化并傳代。
[0031](3)誘導(dǎo)MSCs向成骨分化:取3-6代MSCs接種于BFO外延薄膜表面，采用無成骨誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基，置于溫度37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0032](4)培養(yǎng)3h后MSCs黏附觀察，包括細(xì)胞鋪展面積以及黏著斑表達(dá)差異。
[0033](5)培養(yǎng)Id后MSCs成骨分化檢測(cè)，包括BMP2、RUNX2的免疫熒光染色。
[0034]通過以上步驟所得的BFO薄膜厚度為20?30nm，均勻性好，晶粒排布緊密且表面平整。中間層釕酸鍶厚度為20?30nm，ST0基底厚度為0.5臟。表面電勢(shì)為-65?-7011^。有良好的生物相容性，有利于促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。
[0035]實(shí)施例2
[0036](I)制備模擬損傷電位的電活性材料鐵酸鉍(BFO)薄膜。以STO為基底，采用脈沖激光沉積法(PLD)模擬損傷電位的BFO外延薄膜。生長溫度為300°C，生長中間層SRO的激光頻率為5HZ;激光能量為80mj ;氧分壓為15pa;生長時(shí)間為24min。生長BFO時(shí)激光頻率均為5HZ;激光能量為80m j ;氧分壓為15pa;生長時(shí)間為90min。
[0037](2)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng):采用無成骨誘導(dǎo)因子的間充值干細(xì)胞培養(yǎng)基，MSCs細(xì)胞復(fù)蘇后于T75的培養(yǎng)瓶中貼壁生長，每3d用0.25%的胰酶消化并傳代。
[0038](3)誘導(dǎo)MSCs向成骨分化:取3-6代MSCs接種于不同極化方向的BFO表面，采用無成骨誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基，置于溫度37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0039](4)培養(yǎng)3h后MSCs黏附觀察，包括細(xì)胞鋪展面積以及黏著斑表達(dá)差異。
[0040](5)培養(yǎng)Id后MSCs成骨分化檢測(cè)，包括BMP2、RUNX2的免疫熒光染色。
[0041 ]通過以上步驟所得的BFO薄膜厚度為70-80nm，均勻性較差，晶粒排布較雜亂且表面存在大顆粒。中間層厚度為70-80nm，STO基底厚度為0.5mm，表面電勢(shì)為-30?-45mV，誘導(dǎo)MSCs成骨分化指標(biāo)BMP2、RUNX2表達(dá)水平低。
[0042]實(shí)施例3
[0043 ] (I)制備模擬損傷電位的電活性材料鐵酸鉍(BFO)薄膜。以STO為基底，采用脈沖激光沉積法(PLD)模擬損傷電位的BFO外延薄膜。生長溫度為500°C，生長中間層SRO的激光頻率為5HZ;激光能量為95mj ;氧分壓為20pa;生長時(shí)間為2min。生長BFO時(shí)激光頻率均為5HZ;激光能量為105mj ;氧分壓為20pa;生長時(shí)間為lOmin。
[0044](2)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng):采用無成骨誘導(dǎo)因子的間充值干細(xì)胞培養(yǎng)基，MSCs細(xì)胞復(fù)蘇后于T75的培養(yǎng)瓶中貼壁生長，每3d用0.25%的胰酶消化并傳代。
[0045](3)誘導(dǎo)MSCs向成骨分化:取3-6代MSCs接種于不同極化方向的BFO表面，采用無成骨誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基，置于溫度37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0046](4)培養(yǎng)3h后MSCs黏附觀察，包括細(xì)胞鋪展面積以及黏著斑表達(dá)差異。
[0047](5)培養(yǎng)Id后MSCs成骨分化檢測(cè)，包括BMP2、RUNX2的免疫熒光染色。
[0048]通過以上步驟所得的模擬損傷電位BFO薄膜厚度為5-10nm，均勻性較差，致密性較低。中間層的LSMO或SRO厚度為5-10nm，STO基底厚度為0.5mm，表面電勢(shì)為-45?_60mV，誘導(dǎo)MSCs成骨分化指標(biāo)BMP2、RUNX2表達(dá)水平較低。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料，其特征是所述材料是以鈦酸鍶為基底，釕酸鍶為中間層，表面沉積鐵酸鉍的薄膜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料，其特征在于表面的鐵酸鉍薄膜厚度為5?10nm，中間層釕酸鍶厚度為5?10nm，基底鈦酸鍶厚度為0.5_，表面電勢(shì)為-30mV ?-70mV。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料，其特征在于所述鐵酸鉍薄膜厚度為20?30nm，中間層iI了酸鎖厚度為20?30nm，，表面電勢(shì)為-65?_70mVo4.如權(quán)利要求1所述的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料的制備方法，其特征是采用脈沖激光沉積法。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料的制備方法，其特征在于所述制備過程中生長溫度為300-800°C，生長中間層釕酸鍶的激光頻率為1-5HZ;激光能量為60-90mj ;氧分壓為10-20pa;生長時(shí)間為5-30min;生長表面鐵酸鉍的激光頻率為5HZ;激光能量為70-90m j ；氧分壓為15-20pa ；生長時(shí)間為5_60min。6.如權(quán)利要求1所述的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特征是包括如下步驟: (1)制備模擬損傷電位的電活性鐵酸鉍薄膜材料模型； (2)間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng):采用無成骨誘導(dǎo)因子的間充值干細(xì)胞培養(yǎng)基，間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)，胰酶消化并傳代； (3)材料模型上接種間充質(zhì)干細(xì)胞:取間充質(zhì)干細(xì)胞接種于具有極化表面電荷的鐵酸鉍薄膜表面，仍采用無成骨誘導(dǎo)因子的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)； (4)間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附與成骨分化檢測(cè)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中，骨髓來源或脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后于T75的培養(yǎng)瓶中貼壁生長，每3天用0.25%的胰酶消化并傳代。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的材料在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(3)中，取3-6代間充質(zhì)干細(xì)胞接種于鐵酸鉍表面，采用無成骨誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基，置于溫度37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK106047802SQ201610423493
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】鄧旭亮, 劉云, 衛(wèi)彥, 張學(xué)慧, 張金星
【申請(qǐng)人】北京大學(xué)口腔醫(yī)院