專利名稱：具有堿性α－淀粉酶活性的多肽以及編碼該多肽的核酸的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有α-淀粉酶活性的分離的多肽以及編碼該多肽的分離的核酸序列。并且，本發(fā)明涉及本發(fā)明的α-淀粉酶的變體。本發(fā)明還涉及含有所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用所述多肽的方法。并且，本發(fā)明還涉及用于洗衣、洗碗和/或堅硬表面清潔的組合物。
相關(guān)技術(shù)的描述許多年來α-淀粉酶被用于各種不同的目的，其中最重要的是淀粉的液化、紡織品的退漿、造紙和紙漿業(yè)中淀粉的修飾，以及用于釀酒和焙烤面包。α-淀粉酶的另一個變得愈來愈重要的用途是在堿性PH下采用洗滌劑進(jìn)行洗滌的過程中去除淀粉污染。
商業(yè)α-淀粉酶產(chǎn)品的實例是TermamylTM、DuramylTM、NatalaseTM、BANTM、和FungamylTM，全部從Novo Nordisk A/S，丹麥購得。從其它商業(yè)渠道獲得的這些產(chǎn)品以及相似產(chǎn)品具有一個酸性至中性的PH最適值，通常在pH 5至pH 7.5的范圍內(nèi)，在堿性pH下的洗滌劑溶液中，它們沒有顯示出最佳活性。
WO 95/26397公開了來源于一株芽孢桿菌屬菌株的α-淀粉酶。WO96/23873描述了洗滌條件下性能得到改善的芽孢桿菌淀粉酶的變體。
US 5147796描述了一種具有α-淀粉酶活性的堿性支鏈淀粉酶。文件中的圖2b顯示了pH8-8.5下的最佳淀粉酶活性。
M.Takagi等，發(fā)酵生物工程雜志(J.Ferment.Bioeng.)，81卷，第6期，557-559(1996)描述了一種源自于芽孢桿菌屬的嗜堿性α-淀粉酶-支鏈淀粉酶。該酶在pH 9時具有最佳淀粉酶活性，但是在較高的pH下活性迅速下降，在pH 10時的活性比在pH 7時的活性低。
WO 97/00324(KAO)公開了編碼一種源自于保藏號為FERM BP-3048的芽孢桿菌屬菌株KSM-AP1378且適用于洗滌劑的堿性液化α-淀粉酶的基因。
Tsukamoto等，(1988)，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.BiopHys.Res Commun.)151，25-33頁公開了一種源自于芽孢桿菌#707的堿性α-淀粉酶。
本發(fā)明的一個目的是提供性能改變的，特別是在堿性溶液中，尤其是在pH約為9-11的堿性洗滌劑溶液中性能改善的新型α-淀粉酶。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有α-淀粉酶活性和選自于下組的一種或多種特性或性能的分離的多肽(a)一種含有與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸至少具有96％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)一種由核酸序列編碼的多肽，在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下該核酸序列與(i)SEQID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；(c)(a)或(b)的等位變體；(d)(a)、(b)或(c)的具有α-淀粉酶活性的片段；(e)一種具有采用Phadebas方法(37℃)測定的在pH 8至9范圍內(nèi)的最適pH值的多肽；(f)一種具有采用Phadebas方法(pH 9.0)測定的在55至65℃范圍內(nèi)的最適溫度的多肽；(g)一種具有7-8之間的pI的多肽，所述pI是通過等電聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH 3.5-9.3)測定的；和(i)一種在pH 9-11范圍內(nèi)洗滌和/或洗碗性能得到改進(jìn)的多肽。
應(yīng)該理解本發(fā)明的α-淀粉酶可以具有一個或多個上述特征。
并且，本發(fā)明涉及本發(fā)明的α-淀粉酶的變體。本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的分離的核酸序列并涉及含有所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用所述多肽的方法。
附圖的主要描述


圖1表示幾種芽孢桿菌α-淀粉酶的對比排列。
圖2表示AA560α-淀粉酶與SP722和SP690α-淀粉酶的pH變化圖譜的比較。pH變化圖譜是在37℃下測定的?；钚砸訟bs650/mg酶的絕對值表示。
圖3表示AA560α-淀粉酶與SP722和SP690α-淀粉酶的溫度變化圖譜的比較。溫度變化圖譜表示為Abs650/mg酶。
圖4表示AP型洗滌劑97中的AA560α-淀粉酶分別與SP722和SP690和Termamyl的洗滌性能的比較。
圖5表示Omo Multi Acao中的AA560α-淀粉酶分別與SP722和SP690和Termamyl的洗滌性能的比較。
圖6表示濃縮Omo(Omo Concentrated)中的AA560α-淀粉酶分別與SP722和SP690和Termamyl的洗滌性能的比較。
圖7表示Ariel Futur液體中的AA560α-淀粉酶分別與SP722和SP690和Termamyl的洗滌性能的比較。
發(fā)明詳述微生物的來源本發(fā)明的堿性α-淀粉酶可以得自于芽孢桿菌屬的菌株。優(yōu)選的菌株是芽孢桿菌DSM12649(AA560α-淀粉酶)或芽孢桿菌DSM12648(AA349α-淀粉酶)。根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，發(fā)明人于1999年1月25日將這些菌株保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig DE。
分別含有克隆在質(zhì)粒pLiH1274和pTVB299中的α-淀粉酶基因并分別命名為NN049467和NN049470的兩株大腸桿菌菌株同理也于1999年4月7日被保藏在德意志微生物和培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig DE，保藏號分別為DSM12761和DSM12764。
具有α-淀粉酶活性的多肽α-淀粉酶(α-1，4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)構(gòu)成一組酶，其催化淀粉和其它線性和支鏈1，4-糖苷寡-和多糖的水解。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，采用下面“材料和方法”部分中描述的Phadebas分析方法或pNPG7分析方法測定α-淀粉酶的活性。
酶的同源性在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的多肽，該多肽具有與SEQ IDNO2或SEQ ID NO4(即，成熟多肽)的第1至485位氨基酸至少有約96％、優(yōu)選至少約97％、更優(yōu)選至少約98％、甚至更優(yōu)選至少約99％同源性的氨基酸序列，且該多肽具有α-淀粉酶的活性(下文稱作“同源多肽”)。在優(yōu)選的實施方案中，同源多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸有5個氨基酸，優(yōu)選有4個氨基酸，更優(yōu)選有3個氨基酸，甚至更優(yōu)選有2個氨基酸和最優(yōu)選有1個氨基酸的不同。值得注意的是SEQID NO2和SEQ ID NO4是相同的。然而，分別編碼以SEQ ID NO2和SEQID NO4表示的本發(fā)明α-淀粉酶的DNA序列，即SEQ ID NO1或SEQ IDNO3是不同的。
氨基酸序列同源性可以由表示第二個序列與第一個序列差異的兩序列間同源程度確定。同源性可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的計算機(jī)程序來適當(dāng)?shù)販y定。因此，利用默認(rèn)值的設(shè)置，GCG版本8中提供的GAP(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，分子生物學(xué)雜志，48，443-453)可被用于序列的成對(pairwise)對比排列和相同程度或同源程度的計算。可以按照下列參數(shù)進(jìn)行間距(gap)的設(shè)置5.0的間距(gap)創(chuàng)建罰值(penalty)和0.3的間距(gap)延伸罰值(penalty)。
與已知芽孢桿菌α-淀粉酶的同源性對已知序列的同源性檢索顯示本發(fā)明的序列與幾種芽孢桿菌淀粉酶在如上測定的氨基酸水平上具有65-95％的同源性。
特別是，發(fā)現(xiàn)同源性最高的α-淀粉酶是SP690(具有約87％同源性的美國專利5856164的SEQ ID NO1)，SP722(具有約87％同源性的美國專利5856164的SEQ ID NO2)，如WO97/00324的SEQ ID NO2所公開的從芽孢桿菌KSM-AP1378中獲得的、同源性約是86％的α-淀粉酶的成熟部分(即，第31-516個氨基酸)，和Tsukamoto等(1988)，生物化學(xué)及生物物理學(xué)研究通訊151，25-33頁中所公開的α-淀粉酶(按照
圖1的對比排列所顯示的序列“707amy”)，該α-淀粉酶與上述測定的SEQ ID NO2和SEQ ID NO4具有約95％的同源性。
優(yōu)選，本發(fā)明的多肽含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列或其等位突變體；或其具有α-淀粉酶活性的片段。SEQ ID NO2和SEQ IDNO4表示本發(fā)明堿性α-淀粉酶的成熟部分。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的片段是從這一氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失了一個或多個氨基酸的多肽。
等位變體表示占據(jù)相同染色體基因座的一個基因的任何兩個或多個可替換形式。等位變體通過突變自然產(chǎn)生，并且可以導(dǎo)致種群內(nèi)部的多樣性?；蛲蛔兛赡苁浅聊?編碼的多肽沒有發(fā)生變化)或可以編碼氨基酸序列改變的多肽。多肽的等位變體是由基因等位變體編碼的多肽。
通過插入或缺失一個或多個氨基酸殘基和/或被不同的氨基酸殘基置換了一個或多個氨基酸殘基，同源多肽的氨基酸序列可能與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列有區(qū)別。優(yōu)選，氨基酸的改變是次要性質(zhì)的改變，即不會明顯影響蛋白質(zhì)的折迭和/或活性的保守氨基酸的置換；小的缺失，通常一個至約30個氨基酸的缺失；小的氨基-或羧基-端延伸，如氨基-端的甲硫氨酸殘基；一種高達(dá)約20-25個殘基的小連接體肽；或通過改變凈電荷或其它性能而便于純化的小延伸，如聚-組氨酸序列段，抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
保守置換的實例是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。通常不會改變比活性的氨基酸置換在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的并且例如在H.Neurath和R.L.Hill所著的《蛋白質(zhì)》，1977，紐約，學(xué)院出版社(Academic Press)中描述過。最經(jīng)常發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及這些的反向交換。
在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及由核酸序列編碼的具有α-淀粉酶活性的分離的多肽，該核酸序列在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選在中等偏高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選在高等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，和最優(yōu)選在非常高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與在同樣條件下與(i)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1或SEQID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列雜交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus.1989，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約)。SEQ ID NO1的亞序列至少是100個核苷酸或優(yōu)選至少是200個核苷酸。此外，亞序列可以編碼具有α-淀粉酶活性的多肽片段。所述多肽還可以是具有α-淀粉酶活性的多肽的等位突變體或片段。
SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列或其亞序列，以及SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列或其片段可被用于設(shè)計核酸探針以便按照本領(lǐng)域已知方法從不同屬或種的菌株中鑒定和克隆編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA。具體地，這種探針可用于按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡方法，與目的屬或種的基因組或cDNA雜交以鑒定并分離其中的相應(yīng)基因。這種探針可能比全序列短得多，但是至少應(yīng)該是15個，優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少35個核苷酸的長度。也可以使用較長的探針。DNA和RNA探針都能使用。為了檢測相應(yīng)的基因，通常對探針進(jìn)行標(biāo)記(例如，采用32P、3H、35S、生物素或抗生素蛋白)。這些探針包括在本發(fā)明中。
因此，可篩選由其它這類生物得到的基因組DNA或cDNA文庫中與上述探針雜交并編碼具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA。由其它這類生物得到的基因組或其它DNA可通過瓊脂糖或聚丙酰胺凝膠電泳或其它分離技術(shù)分離。來源于所述文庫中的DNA或分離的DNA可被轉(zhuǎn)移到和固定在硝酸纖維素膜或其它合適的載體材料上。為了鑒定與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或其亞序列同源的克隆或DNA，在DNA印跡當(dāng)中使用了所述載體材料。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，雜交指在中等至非常高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下核酸序列與對應(yīng)于由SEQ ID NO1或SEQ ID NO3表示的核酸序列、其互補(bǔ)鏈或其亞序列的核酸探針進(jìn)行雜交。在這些條件下與核酸探針雜交的分子采用X-射線膜檢測。
在另一個優(yōu)選實施方案中，核酸探針是含在質(zhì)粒pLiH1274(AA349)或pTVB299(AA560)中的核酸序列(這兩種質(zhì)粒分別含在大腸桿菌DSM12761或大腸桿菌DSM12764中)，或者，其中所述核酸序列編碼本發(fā)明的具有α-淀粉酶活性的多肽并分別由SEQ ID NO2和SEQ ID NO4表示。
對于至少100個核苷酸長度的長探針，中等至非常高的嚴(yán)謹(jǐn)條件指按照標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡方法，預(yù)雜交和雜交為42℃，5×SSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切的變性鮭精DNA、35％甲酰胺(用于中等和中-高等的嚴(yán)謹(jǐn)條件)或50％甲酰胺(用于高和非常高的嚴(yán)謹(jǐn)條件)。
對于至少100個核苷酸長度的長探針，最終在至少55℃(中等嚴(yán)謹(jǐn)條件)，優(yōu)選至少60℃(中-高等嚴(yán)謹(jǐn)條件)，更優(yōu)選至少65℃(高等嚴(yán)謹(jǐn)條件)，和最優(yōu)選至少70℃(非常高等嚴(yán)謹(jǐn)條件)下，用2×SSC、0.2％SDS將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。
對于約15個核苷酸至約70個核苷酸長度的短探針，嚴(yán)謹(jǐn)條件指按照標(biāo)準(zhǔn)的DNA印跡方法，在比采用Bolton和McCarthy(1962，美國國家科學(xué)院院報481390)的計算所得的Tm低5℃至10℃下采用0.9M NaCl、0.09MTris-HCl pH7.6、6Mm EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸鈉、1mM磷酸二氫鈉(sodium monobasic phosphate)、0.1mM ATP和0.2mg/ml的酵母RNA進(jìn)行的預(yù)雜交、雜交和雜交后的漂洗。
對于約15個核苷酸至70個核苷酸長度的短探針，在低于計算的Tm5℃至10℃下用6×SSC加0.1％SDS將載體材料洗滌一次，15分鐘，并用6×SS將載體材料洗滌兩次，每次15分鐘。
在第三個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的多肽，即由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4表示，具有以下物理化學(xué)性質(zhì)的多肽采用Phadebas方法(37℃)測定的最適pH(見圖2)在pH8至9的范圍內(nèi)，更精確地是約8.5。
采用Phadebas方法(pH9.0)測定的最適溫度(見圖3)在55至65℃的范圍內(nèi)，更精確地是約60℃。
在7-8之間的pI(見實施例6中的表1)是通過等電聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)測定的。
35,000NU/mg的比活性(見實施例6中的表1)是采用Phadebas方法測定的，6,000NU/mg是采用pNPG7方法測定的。
本發(fā)明的多肽具有至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％，甚至更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少100％的由SEQ ID NO2和SEQ ID NO4表示的成熟多肽的α-淀粉酶活性。
本發(fā)明的多肽可以獲自任何屬的微生物。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本文與給定來源一起使用的術(shù)語“獲自”意味著由核酸序列編碼的多肽來自該來源或通過其中插入了該來源的核酸序列的細(xì)胞而生產(chǎn)。
本發(fā)明的多肽是細(xì)菌性多肽。例如所述多肽可以來自革蘭氏陽性細(xì)菌如芽孢桿菌，例如嗜堿性芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬，例如淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌或假單胞菌。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽是芽孢桿菌的多肽，更優(yōu)選的實施方案中該多肽是芽孢桿菌DSM 12648或芽孢桿菌DSM 12649的多肽，例如，分別具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。
應(yīng)該理解對于上述菌種，不管是哪種為人所知的菌種名稱，本發(fā)明既包括完美狀態(tài)又包括非理想狀態(tài)以及其它分類學(xué)等同物，例如，無性型。本領(lǐng)域技術(shù)人員能迅速識別相應(yīng)等同物的特性。
在一些培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)，如美國典型培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)(ATCC)、德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSM)、真菌菌種保藏中心(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)，這些菌種的菌株能方便地提供給公眾。
并且，這種多肽還可以通過使用上述探針從含有自自然界(例如，土壤、堆肥、水等)中分離的微生物的其它來源中鑒別和獲得。從自然棲息地分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。然后，通過以類似方法篩選另一微生物的基因組或cDNA文庫可以得到所述核酸序列。一旦利用探針檢測出編碼多肽的核酸序列，就可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(例見，Sambrook等，1989，出處同上)分離或克隆該序列。
如本文所定義的，“分離的”多肽是基本上不含其它非α-淀粉酶多肽的多肽，例如，通過SDS-PAGE測定的至少約20％的純度，優(yōu)選至少約40％的純度，更有選地約60％的純度，甚至更優(yōu)選約80％的純度，最優(yōu)選約90％的純度以及甚至最優(yōu)選約95％的純度。
由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽還包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中所述多肽或其片段的N-端或C-端融合了另一多肽。通過將編碼另一多肽的核酸序列(或其一部分)融合到本發(fā)明的核酸序列(或其一部分)上來生產(chǎn)融合多肽。生產(chǎn)融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，并且包括連接多肽編碼序列以便它們處于同一讀框中，并使融合多肽的表達(dá)受控于相同的啟動子和終止子。
術(shù)語“改進(jìn)的洗滌性能”指在本發(fā)明的上下文中，在實施例8中描述的洗滌條件下測定的性能，該性能比其它用于洗滌的α-淀粉酶，例如SP690、SP722和Termamyl的性能高，或者是在本發(fā)明的突變型/變異型與親代α-淀粉酶即未突變的，如未取代的α-淀粉酶主鏈進(jìn)行比較的情況下。
突變型α-淀粉酶AA560變體的改變的特點下面討論本發(fā)明AA560或A349α-淀粉酶中可引入的突變，特別是取代和缺失，與相對于親代α-淀粉酶的所需特性改變之間的關(guān)系。
發(fā)明還涉及SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示的α-淀粉酶的突變體(即α-淀粉酶變體)。本發(fā)明的突變型α-淀粉酶的特征是一個或多個甲硫氨酸殘基被除Cys和Met之外的任何氨基酸殘基所取代。因此，根據(jù)本發(fā)明取代甲硫氨酸殘基的氨基酸殘基是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val。
本發(fā)明突變型α-淀粉酶的一個優(yōu)選實施方案特征是，一個或多個甲硫氨酸殘基被一個Leu、Thr、Ala、Gly、Ser、Ile或Val氨基酸殘基置換，優(yōu)選被一個Leu、Thr、Ala或Gly氨基酸殘基所置換。在這個實施方案中，在有氧化劑存在的條件下獲得了非常滿意的活性值和穩(wěn)定性。尤其是這意味著下列位置上的一個或多個甲硫氨酸可以通過采用本領(lǐng)域已知的技術(shù)來進(jìn)行取代或刪除，尤其包括定點誘變和基因改組。采用SEQ ID NO2編號的可考慮的位置是9、10、105、116、202、208、261、309、323、382、430、440。
本發(fā)明突變型α-淀粉酶的一個優(yōu)選實施方案特征是，202位的甲硫氨酸殘基被除Cys和Met之外的任何氨基酸殘基所置換，優(yōu)選被一個Leu、Thr、Ala、Gly、Ser、Ile或Asp所置換。
其它預(yù)期優(yōu)選的突變包括氨基酸R181、G182、D183或G184、K185、G186的一個、兩個或多個殘基的缺失，或著一個或多個這些殘基的置換。一個優(yōu)選的突變是D183-G184的缺失。特別相關(guān)的突變是G186被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val所置換。特別優(yōu)選的置換是G186R。
另外預(yù)期的突變是N195被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val所置換。特別希望的置換是N195F。
上述突變的組合包括以下(D183-G184)的缺失+N195F；(D183-G184)的缺失+G186R(D183-G184)的缺失+G186R+N195F，和G186R+N195F。
增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生本發(fā)明變體，例如，具有增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，特別是在酸性pH和/或在低Ca2+濃度下的熱穩(wěn)定性的突變包括下列位置的突變(采用AA560α-淀粉酶編號，即SEQ ID NO2)R158、N174、G186、N195、N197、H210、E212、V214、V215、E216、K269、N270。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“酸性pH”指低于7.0的pH，特別是低于通常在其中進(jìn)行工業(yè)淀粉液化過程的pH范圍，該范圍為pH5.5至6.2。
本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“低鈣濃度”指低于工業(yè)淀粉液化時所采用的常規(guī)濃度。常規(guī)濃度隨谷物中游離Ca2+的濃度而變化。通常加入相當(dāng)于1mM(40ppm)的用量，該用量與谷物中的量加在一起達(dá)到40至60ppm的游離Ca2+。
本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“高溫”指95至160℃之間的溫度，特別是通常在其中進(jìn)行工業(yè)淀粉液化過程的溫度范圍，該范圍為95至105℃。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將包括上述突變和/或I206的其它突變相互組合，能增強(qiáng)熱穩(wěn)定性，尤其是在酸性pH和/或在低Ca2+濃度下的熱穩(wěn)定性。
所述“其它”突變是指下列突變(相對AA560α-淀粉酶，SE2 ID NO2)N195、E212、E216、K269和I206。
所述突變可進(jìn)一步與WO96/23873中所述的一個，優(yōu)選兩個或甚至三個位置的缺失進(jìn)行組合(即，本文SEQ ID NO2中的位置R181、G182、D183、G182、G184)。
本發(fā)明涉及親代AA560α-淀粉酶的具有α-淀粉酶活性且包括兩個、三個、四個、五個、六個或七個上述位置突變的變體。
應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是不僅涉及所述AA560α-淀粉酶。在本發(fā)明的范圍內(nèi)還涉及具有如下定義的一定程度同源性(相同性)的α-淀粉酶。
應(yīng)指出，分別相對于SEQ ID NO2中的N195、I206、E212和E216位置的氨基酸殘基組成了在多種Termamyl-樣α-淀粉酶，即Termamyl(地衣芽孢桿菌α-淀粉酶)中保守的氨基酸。因此，例如，從
圖1的對比排列和下表1和表2中能夠看到AA560和Termamyl中殘基的相應(yīng)位置。表1Termamyl-樣α-淀粉酶地衣芽孢桿菌(Termamyl) N190 I201 H205 E211 N265AA560(SEQ ID NO5) N195 I206 H210 E211 N270表2Termamyl-樣α-淀粉酶SP690 R181，G182，T183，G184，K185，A186SP722 R181，G182，D183，G184，K185，A186AA560(SEQ ID NO2) R181，G182，D183，G184，K185，A186這些保守的氨基酸殘基的突變對于特性的改變是非常重要的。
當(dāng)采用SEQ ID NO2進(jìn)行編號時，為了改變特性，尤其是為了增強(qiáng)在酸性pH和/或在低Ca2+濃度下的熱穩(wěn)定性，本發(fā)明在下列位置進(jìn)行了兩個、三個、四個、五個、六個或七個突變(此處相對于SEQ ID NO2)1R181*，G182*，D183*，G184*；2N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；3I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；4E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；5E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；6K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；7R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
本發(fā)明涉及三個、四個、五個、六個或七個突變的組合。
本發(fā)明特定的雙突變是(采用SEQ ID NO2進(jìn)行編號)-R181*/G182*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V-R181*/G182*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V.
在一個優(yōu)選的實施方案中，變體包括下列突變在SEQ ID NO2中或在本文定義的96％同源之α-淀粉酶中相應(yīng)位置的N195F/K264S。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的變體包括下列突變在SEQ ID NO2中或另一同源α-淀粉酶的相應(yīng)位置中的R181*/G182*/N195F。所述變體可進(jìn)一步包括E216Q位置上的一個置換。
AA560變體在pH8-10.5時的改進(jìn)的Ca2+穩(wěn)定性改進(jìn)的Ca2+穩(wěn)定性指在Ca2+耗盡的情況下，酶的穩(wěn)定性得到改進(jìn)。本發(fā)明的上下文中，就在高pH下獲得改進(jìn)的Ca2+穩(wěn)定性而言，重要的突變(包括氨基酸置換和缺失)包括上文“增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性”部分中公開的突變和/或缺失。
本發(fā)明變體中的一般突變優(yōu)選本發(fā)明的變體除了含有上述變化外，還含有一個或多個修飾。因此，經(jīng)修飾的α-淀粉酶變體中一個或多個脯氨酸殘基被非脯氨酸殘基取代較為有利，所述非脯氨酸殘基可以是任何可能的天然非脯氨酸殘基，優(yōu)選為丙氨酸，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，纈氨酸或亮氨酸。
類似地，優(yōu)選親代α-淀粉酶被修飾的氨基酸殘基中存在的一個或多個半胱氨酸殘基被非半胱氨酸殘基取代，所述非半胱氨酸殘基可以是例如絲氨酸，丙氨酸，蘇氨酸，甘氨酸，纈氨酸或亮氨酸。
另外，本發(fā)明的變體可以(作為唯一的修飾或與上述任何修飾聯(lián)合)被修飾，以使對應(yīng)于SEQ ID NO2中190-214的氨基酸片段中存在的一個或多個Asp和/或Glu分別被Asn和/或Gln取代。另外，用Arg取代對應(yīng)于SEQ IDNO2中190-214的氨基酸片段中存在的一個或多個Lys殘基也很有意義。
應(yīng)理解本發(fā)明包含摻入了兩個或多個上述修飾的變體。
另外，在本文所述的任何變體中導(dǎo)入點突變較為有利。
突變可適當(dāng)?shù)匕ㄏ铝形恢玫耐蛔僘133、L17、M202、V214。
克隆編碼本發(fā)明α-淀粉酶的DNA序列可使用本領(lǐng)域眾所周知的多種方法，從產(chǎn)生所述α-淀粉酶的任何細(xì)胞或微生物中分離出編碼親代α-淀粉酶的DNA序列。首先，應(yīng)使用源自產(chǎn)生待研究之α-淀粉酶的生物的染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針，使用該探針從生產(chǎn)自所述生物的基因組文庫中鑒定編碼α-淀粉酶的克隆。或者，將含有與已知α-淀粉酶基因同源之序列的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針用作探針，使用較低嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件鑒定編碼α-淀粉酶的克隆。
另一種鑒定編碼α-淀粉酶的克隆的方法包括將基因組DNA片段插入表達(dá)載體，如質(zhì)粒，用所得基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化α-淀粉酶-陰性細(xì)菌，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪于含有α-淀粉酶底物的瓊脂上，從而鑒定出表達(dá)α-淀粉酶的克隆。
或者，可通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成生產(chǎn)編碼酶的DNA序列，所述方法例如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)所述的膦酰胺法或Matthes等(1984)所述的方法。在膦酰胺法中，可在例如自動化的DNA合成儀中合成寡核苷酸，對其進(jìn)行純化，退火，再連接并克隆至適當(dāng)?shù)妮d體。
最終，DNA序列可以是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過連接合成的，基因組的或cDNA來源的片段(適當(dāng)時是對應(yīng)于完整DNA序列的多個部分的片段)而生產(chǎn)的混合的基因組和合成來源，混合的合成和cDNA來源或混合的基因組和cDNA來源的DNA序列。也可以使用特定的引物，如US 4,683,202或R.K.Saiki等(1988)所述的引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)生產(chǎn)DNA序列。
定點誘變一旦分離出編碼α-淀粉酶的DNA序列，并鑒定出合乎需要的突變位點，可使用合成的寡核苷酸導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有側(cè)翼于所需突變位點的核苷酸序列；在合成寡核苷酸的過程中插入突變的核苷酸。在特定的方法中，在攜有α-淀粉酶基因的載體中產(chǎn)生橋連α-淀粉酶-編碼序列的單鏈DNA缺口。然后，使攜有所需突變的合成核苷酸與該單鏈DNA的同源部分退火。然后用DNA聚合酶I(Klenow片段)補(bǔ)平其余缺口，使用T4連接酶連接構(gòu)建體。該方法的特例描述于Morinaga等(1984)。US 4,760,025公開了通過對盒進(jìn)行微小的改變而導(dǎo)入編碼多個突變的寡核苷酸。然而，由于Morinaga法可以導(dǎo)入多種長度的多個寡核苷酸，因此可在任何一次導(dǎo)入甚至更多個突變。
Nelson和Long(1989)描述了另一種將突變導(dǎo)入編碼α-淀粉酶的DNA序列的方法。所述方法包括以3個步驟產(chǎn)生含有所需突變的PCR片段，所述突變是通過使用化學(xué)合成的DNA鏈作為PCR反應(yīng)的一個引物而導(dǎo)入的。通過用限制性內(nèi)切核酸酶裂解，可從PCR-產(chǎn)生的片段中分離出攜有突變的DNA片段，并將該片段重新插入表達(dá)質(zhì)粒。
隨機(jī)誘變可在翻譯成本文所示氨基酸序列的基因的至少3個部分中，或在整個基因內(nèi)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行隨機(jī)誘變，所述誘變可以是定域的或區(qū)域-特異性的隨機(jī)誘變。
利用本領(lǐng)域已知的任何方法，可以方便地對編碼親代α-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變。
關(guān)于上文，本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生親代α-淀粉酶的變體的方法，例如，其中變體相對于親代而言，表現(xiàn)出經(jīng)改變的或增加的熱穩(wěn)定性，所述方法包括(a)對編碼親代α-淀粉酶的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)誘變，(b)在宿主細(xì)胞中表達(dá)步驟(a)中得到的突變DNA序列，和(c)篩選表達(dá)α-淀粉酶變體的宿主細(xì)胞，所述變體相對于親代α-淀粉酶而言具有經(jīng)改變的特性(如熱穩(wěn)定性)。
優(yōu)選使用添加引物進(jìn)行本發(fā)明上述方法中的步驟(a)。
例如，可使用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)誘變劑，使用適當(dāng)?shù)墓押塑账?，或通過對DNA序列進(jìn)行PCR以產(chǎn)生誘變來進(jìn)行隨機(jī)誘變。另外，可使用這些誘變劑的任何組合進(jìn)行隨機(jī)誘變。誘變劑可以是例如誘導(dǎo)堿基轉(zhuǎn)換，顛換，倒位，倒頻，缺失和/或插入的試劑。
適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射，羥胺，N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)，鄰甲基羥胺，亞硝酸，乙基甲磺酸(EMS)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類似物。當(dāng)使用這些誘變劑時，一般通過在適于發(fā)生誘變的條件下，在選定誘變劑的存在下保溫待誘變的編碼親代酶的DNA序列來進(jìn)行誘變，然后篩選具有所需特性的突變DNA。
當(dāng)利用寡核苷酸進(jìn)行誘變時，在合成待改變位置處的寡核苷酸的過程中，可同時添加寡核苷酸和3個非-親代核苷酸。添加的目的是避免不必要氨基酸的密碼子?？赏ㄟ^任何公開的技術(shù)，例如使用PCR，LCR或適當(dāng)時使用任何DNA聚合酶和連接酶，將添加的寡核苷酸摻入編碼α-淀粉酶的DNA。
優(yōu)選使用“恒隨機(jī)的添加”進(jìn)行添加，其中各個位置的野生型和突變的百分比是預(yù)先確定好的。另外，添加可以導(dǎo)致優(yōu)先導(dǎo)入某些核苷酸，從而優(yōu)先導(dǎo)入一個或多個特定的氨基酸殘基。例如，進(jìn)行添加后可在每個位置導(dǎo)入90％野生型和10％突變。選擇添加方案的其它考慮基于遺傳學(xué)以及蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)的限制?？墒褂肈OPE程序(見“材料和方法”部分)制訂添加方案，所述程序可特別地確保不導(dǎo)入終止密碼子。
當(dāng)使用PCR-產(chǎn)生的誘變時，可在增加核苷酸錯誤摻入的條件下，對經(jīng)化學(xué)處理或未經(jīng)處理的編碼親代α-淀粉酶的基因進(jìn)行PCR(Deshler 1992；Leung等，技術(shù)，Vol.1，1989，pp.11-15)。
可使用大腸桿菌(Fowler等，Molec.Gen.Genet.，133，1974，pp.179-191)，釀酒酵母或任何其它微生物的增變株對編碼α-淀粉酶的DNA進(jìn)行隨機(jī)誘變，誘變方法包括例如將含有親代糖基酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至增變株，培養(yǎng)含有質(zhì)粒的增變株，從增變株中分離突變的質(zhì)粒。隨后，將突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)生物。
待誘變的DNA序列可以方便地存在于基因組或cDNA文庫中，所述文庫生產(chǎn)自表達(dá)親代α-淀粉酶的生物?；蛘?，DNA序列可以存在于適當(dāng)?shù)妮d體，如質(zhì)粒或噬菌體上，再與誘變劑一起保溫或要不然暴露于誘變劑中。待誘變的DNA也可存在于宿主細(xì)胞中，或者整合于所述細(xì)胞的基因組中，或者存在于細(xì)胞所攜帶的載體上。最后，待誘變的DNA也可以是分離的形式。應(yīng)理解接受隨機(jī)誘變的DNA序列優(yōu)選為cDNA或基因組DNA序列。
在某些情況下，在進(jìn)行表達(dá)步驟b)或篩選步驟c)前，可以方便地擴(kuò)增突變的DNA序列?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行擴(kuò)增，本發(fā)明優(yōu)選的方法是使用根據(jù)親代酶的DNA或氨基酸序列生產(chǎn)的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
與誘變劑保溫或暴露于誘變劑之后，通過在允許發(fā)生表達(dá)的條件下培養(yǎng)攜有突變DNA序列的適當(dāng)宿主細(xì)胞來表達(dá)突變的DNA。用于此目的的宿主細(xì)胞可以是被突變的DNA序列(任選其存在于載體上)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或者是在誘變處理的過程中攜有編碼親代酶的DNA序列的宿主細(xì)胞。適當(dāng)宿主細(xì)胞的例子如下革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌；和革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。
突變的DNA序列可進(jìn)一步含有能使突變的DNA序列表達(dá)的DNA序列。
定域隨機(jī)誘變隨機(jī)誘變可有利地定域于所述親代α-淀粉酶的一部分。例如，當(dāng)酶的某些區(qū)域被鑒定為對酶的給定特性特別重要時，以及當(dāng)預(yù)期修飾能導(dǎo)致具有改良特性的變體時，定域隨機(jī)誘變較為有利。當(dāng)親代酶的三級結(jié)構(gòu)已被闡明，且所述結(jié)構(gòu)與酶的功能相關(guān)時，一般可鑒定出所述區(qū)域。
通過使用上述的PCR產(chǎn)生的誘變技術(shù)或本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，可以方便地進(jìn)行定域的或區(qū)域-特異性的隨機(jī)誘變?；蛘?，通過例如插入適當(dāng)?shù)妮d體來分離編碼待修飾的DNA序列部分的DNA序列，隨后可使用上述任何誘變方法對所述部分進(jìn)行誘變。
提供α-淀粉酶變體的其它方法提供α-淀粉酶變體的其它方法包括本領(lǐng)域已知的基因改組方法，所述方法包括例如WO 95/22625(Affymax Technologies N.V.)和WO 96/00343(NovoNordisk A/S)所述的方法。
表達(dá)本發(fā)明的α-淀粉酶變體根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過上述方法，或通過本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結(jié)合位點，翻譯起始信號的控制序列，并任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是能對其方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自我復(fù)制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，所述載體的復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，所述載體包括例如質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體?；蛘撸d體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時可以整合至宿主細(xì)胞基因組，并與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，DNA序列應(yīng)該與適當(dāng)?shù)膯幼有蛄锌刹僮飨噙B。啟動子可以是在選定宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，啟動子可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。介導(dǎo)編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動子的例子是得自編碼下列酶的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體也含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當(dāng)?shù)氐米耘c啟動子相同的來源。
載體可進(jìn)一步含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外，載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可通過WO 91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來完成選擇。
盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在某些方面(例如當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時)有利，但一般優(yōu)選在細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)。通常，本文所述的芽孢桿菌α-淀粉酶含有允許表達(dá)的蛋白酶分泌至培養(yǎng)基的前區(qū)。必要時，該前區(qū)可被不同的前區(qū)或信號序列取代，通過取代編碼各個前區(qū)的DNA序列可以方便地實現(xiàn)此目的。
分別連接編碼α-淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，1989)。
含有上文所定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞可以有利地用作宿主細(xì)胞，以重組產(chǎn)生本發(fā)明的α-淀粉酶變體?？梢苑奖愕赝ㄟ^將編碼變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般認(rèn)為整合是有利的，因為整合后DNA序列可以在細(xì)胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源重組可以將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體。或者，可用與不同類型的宿主細(xì)胞有關(guān)的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選其為微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
在有利于產(chǎn)生變體的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，并從細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并表達(dá)本發(fā)明α-淀粉酶變體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以商購，或者可根據(jù)公開的配方(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中所述的配方)生產(chǎn)。
通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾將培養(yǎng)基與細(xì)胞分開，利用諸如硫酸銨等鹽沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接著利用層析法，如離子交換層析，親和層析等，可以從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的α-淀粉酶變體。
核酸序列本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，其編碼本發(fā)明的多肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列由SEQ ID NO1或SEQ ID NO3給出。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是含在質(zhì)粒pLiH1274或質(zhì)粒pTVB299中的序列，該兩個質(zhì)粒分別含在大腸桿菌DSM12761和大腸桿菌DSM12764中。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼區(qū)域。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的核酸序列，其由于基因密碼的簡并性而不同于SEQ ID NO1或SEQ IDNO3。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的亞序列，該兩個亞序列分別編碼具有α-淀粉酶活性的SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的片段。
SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的亞序列是包含在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3中的，除5’和/或3’端一個或多個核苷酸被刪除以外的核酸序列。
本發(fā)明還涉及在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3成熟多肽的編碼序列中包括至少一個突變的突變核酸序列，其中突變核酸序列編碼一種由SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成的多肽。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且包括從基因組DNA中分離、由cDNA生產(chǎn)或其組合。從所述基因組cDNA中克隆本發(fā)明核酸序列可以通過，例如，采用已知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或用抗體篩選表達(dá)文庫來檢測具有共享結(jié)構(gòu)特征的克隆的DNA片段。見，例如Innis等，1990，PCR方法及應(yīng)用指南，學(xué)院出版社，紐約?？梢圆捎闷渌暮怂釘U(kuò)增方法如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，連接激活轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增反應(yīng)(NASBA)。核酸序列可以從芽孢桿菌的菌株或另外一種或有關(guān)的生物克隆，因此，例如，其可以是核酸序列的多肽編碼區(qū)域的等位變體或種特異性變體。
本文所述的術(shù)語“分離的核酸序列”指基本不含其它核酸序列的核酸序列，例如，由瓊脂糖凝膠電泳測定的至少約20％的純度，優(yōu)選至少約40％的純度，更優(yōu)選至少約60％的純度，甚至更優(yōu)選至少約80％的純度，最優(yōu)選至少約90％的純度。例如，通過基因工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法獲得一種分離的核酸序列，以便將所述核酸序列從它的天然位置重新定位到它將被復(fù)制的另一位點上?？寺》椒òㄇ懈詈头蛛x含有編碼所述多肽之核酸序列的所需核酸片段，將該片段插入載體分子，將重組載體摻入宿主細(xì)胞，使所述核酸序列的多拷貝或克隆在該宿主細(xì)胞中復(fù)制。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成的、合成來源或其任意組合。
編碼所述酶的DNA序列的同源性本發(fā)明還涉及與SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列(即，核苷酸1至1458)或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列(即，核苷酸1至1458)具有一定同源性并編碼活性多肽的核酸序列，所述同源性為至少約96％的DNA水平同源性，優(yōu)選至少約97％，優(yōu)選至少約98％，更優(yōu)選至少約99％。
DNA序列同源性可以測定為能指示第二序列與第一序列之間差異的兩個序列之間的相同程度。同源性可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的計算機(jī)程序如GCG程序包中提供的GAP來進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y定(如上所述)。因此，Gap GCGv8可同下列默認(rèn)值一起使用5.0的GAP創(chuàng)建罰值和0.3的GAP延伸罰值，默認(rèn)評分矩陣。GAP采用Needleman/Wunsch/Sellers的方法來對比排列。
編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列的修飾對于合成與所述多肽基本類似的多肽可能是必需的。術(shù)語與所述多肽“基本類似”指所述多肽的非天然存在形式。這些多肽的某些改造方式不同于從其自然來源分離到的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、PH最適值等方面不同的變體。可以根據(jù)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的多肽編碼部分例如，其亞序列，的核酸序列來構(gòu)建變體序列，和/或通過引入不產(chǎn)生所述核酸序列編碼多肽的另一種氨基酸序列，但對應(yīng)于用來生產(chǎn)所述酶的宿主生物的密碼子利用特點的核苷酸置換，或者通過引入產(chǎn)生另一種氨基酸序列的核苷酸置換。關(guān)于核苷酸置換的一般描述，例見，F(xiàn)ord等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化295-107。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，這種置換可以在對分子功能關(guān)鍵的區(qū)域外進(jìn)行并且仍能產(chǎn)生活性肽。本發(fā)明分離的核酸序列所編碼多肽的活性必需的，因而優(yōu)選不進(jìn)行置換的氨基酸序列，可以按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行鑒定，如定點誘變或丙氨酸-掃描誘變(例見，Cunningham和Wells，1989，科學(xué)2441081-1085)。在后一技術(shù)中，在分子中的每一個帶正電荷的殘基處引入突變，并檢測所得突變體分子的[酶]活性來鑒別對該分子活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點還可以通過三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，所述三維結(jié)構(gòu)是通過諸如核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記技術(shù)測定的(例見，deVos等，1992，科學(xué)255306-312；Smith等，1992，分子生物學(xué)雜志244899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS Letters 30959-64)。
本發(fā)明還涉及分離的編碼本發(fā)明多肽的核酸序列，該核酸序列在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選在中等偏高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，更優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，和最優(yōu)選非常高度的嚴(yán)謹(jǐn)條件下與在同樣條件下與本文所定義的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的核酸序列或其互補(bǔ)鏈；或其等位變體及其亞序列雜交的核酸探針雜交(Sambrook等，1989，出處同上)。
本發(fā)明還涉及分離的核酸序列，該核酸序列是通過以下方法生產(chǎn)的(a)在中等、中等偏高或非常高的嚴(yán)謹(jǐn)條件下將一種DNA與SEQ ID NO1或SEQID NO3的序列或其互補(bǔ)鏈或其亞序列雜交；和(b)分離該核酸序列。亞序列優(yōu)選是至少有100個核苷酸的序列如編碼具有α-淀粉酶活性的多肽片段的序列。
生產(chǎn)突變的核酸序列的方法本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)突變的核酸序列的方法，包括將至少一個突變引入SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列或其亞序列中，其中突變的核酸序列編碼一種由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位或其具有α-淀粉酶活性的片段組成的多肽。
為了將突變引入核酸序列以便使一個核苷酸換為另一個核苷酸，可以通過本領(lǐng)域中任何已知方法經(jīng)定點誘變來完成。特別有用的是利用具有所需插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和兩個具有所需突變的合成引物的方法。每一與載體的相對鏈互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物在采用了pfu DNA聚合酶的循環(huán)變溫過程中延伸。通過引物的結(jié)合，產(chǎn)生了含有交錯切口的突變質(zhì)粒。循環(huán)變溫后，用對甲基化和半甲基化DNA特異的DpnI處理產(chǎn)物，以便消化親代DNA模板并選出含有突變的合成DNA。也可以采用本領(lǐng)域其它已知的方法。其它那些方法包括基因改組，例如，WO95/22625所述(來源于AffymaxTechnologies N.V.)和WO96/00343所述(來源于Novo Nordisk A/S)。
核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸序列并使其可操作性地連接一個或多個控制序列的核酸構(gòu)建體，所述控制序列指導(dǎo)編碼序列在與控制序列相匹配地條件下于合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)應(yīng)當(dāng)理解為包括任何多肽產(chǎn)生的步驟，其包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
“核酸構(gòu)建體”在本文中被定義為單鏈-或雙鏈的核酸分子，其分離自天然基因或經(jīng)修飾而含有以非天然方式組合和連接的核酸片段的基因。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明編碼序列的表達(dá)所需的全部控制序列時，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是術(shù)語“表達(dá)盒”的同義詞。術(shù)語“編碼序列”在本文中被定義為核酸序列的一部分，其直接確定了其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列。編碼序列的界限通常通過核糖體結(jié)合位點(原核生物)或通過緊鄰mRNA 5’端開放讀框上游的ATG起始密碼子(真核生物)和緊鄰mRNA 3’端開放讀框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列來確定。編碼序列可以包括，但不限于，DNA、cDNA和重組核酸序列。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列可用多種方式處理以便多肽表達(dá)。根據(jù)表達(dá)載體的不同，有時優(yōu)選或必需在插入載體前對核酸序列進(jìn)行操作。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
術(shù)語“控制序列”在本文中被定義為包括表達(dá)本發(fā)明多肽所需或有利的所有組件。每一控制序列可以是編碼所述多肽之核酸序列固有的或外來的。這種控制序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，所述控制序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？刂菩蛄锌梢院杏糜谝胩囟ㄏ拗莆稽c的接頭，以便于控制序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進(jìn)行連接。術(shù)語“可操作性地連接”在這里被定義為一種構(gòu)型，其中控制序列被置于相對于DNA序列的編碼序列的適當(dāng)位置，以便于控制序列能指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
啟動子序列控制序列可以是適當(dāng)?shù)膯幼有蛄校从杀磉_(dá)所述核酸序列的宿主細(xì)胞識別的核酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)所述多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在所選宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變型、截短型和雜交型啟動子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。
指導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子有大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核生物β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美國國家科學(xué)院學(xué)報753727-3731)的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，美國國家科學(xué)院學(xué)報8021-25)。其它啟動子見“來源于重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”，Scientific American，1980，24274-94；和在Sambrook等，1989，出處同上。
終止子序列控制序列也可以是適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子序列，其被宿主細(xì)胞識別后終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列可操作性地連接到編碼所述多肽的核酸序列的3’端。在所選宿主細(xì)胞中具有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。
信號肽控制序列也可以是編碼連接到多肽氨基末端之氨基酸序列并指導(dǎo)該編碼多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑的信號肽-編碼區(qū)。核酸序列的編碼序列5’端可天然含有與編碼區(qū)片段天然連接于一個翻譯讀框中的信號肽-編碼區(qū)，其編碼分泌型多肽。或者，編碼序列5’端可以含有一個相對該編碼區(qū)外來的信號肽-編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列并非天然含有信號肽-編碼區(qū)時，就需要外來的信號肽-編碼區(qū)。另外，可將外來信號肽-編碼區(qū)簡單地取代天然信號肽-編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，任何指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選細(xì)胞分泌途徑的信號肽-編碼區(qū)都可用于本發(fā)明。
對細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號肽-編碼區(qū)是從枯草桿菌NCIB 11837產(chǎn)麥芽淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA的基因中獲得的信號肽-編碼區(qū)。另外的信號肽如Simonen和Palva，1993，微生物學(xué)綜述(Microbiological Reviews)57109-137中所述。
調(diào)控系統(tǒng)此外還優(yōu)選添加調(diào)控序列，其可調(diào)節(jié)所述多肽相對于宿主細(xì)胞之生長的表達(dá)。調(diào)控系統(tǒng)的實例是使基因應(yīng)答化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)控化合物的存在而開啟或關(guān)閉表達(dá)的那些。原核系統(tǒng)中的調(diào)控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子可作為調(diào)控序列使用。調(diào)控序列的其它實例是允許基因擴(kuò)增的那些。在真核系統(tǒng)中，這些包括在有氨甲蝶呤存在時被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和有重金屬時被擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列與調(diào)控序列可操作性地連接。
表達(dá)載體本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。可將上述各種核酸和調(diào)控序列連接在一起以生產(chǎn)一種重組表達(dá)載體，使其包含一個或多個方便的限制位點，所述位點能允許編碼多肽的核酸序列在這類位點插入或置換。或者，本發(fā)明的核酸序列可以通過將該核酸序列或含有該核酸序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達(dá)載體來表達(dá)。在創(chuàng)建表達(dá)載體的過程中，可使編碼序列在表達(dá)載體中與適當(dāng)調(diào)控序列可操作性地連接以便表達(dá)。
重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其可方便地進(jìn)行重組DNA操作并且能使核酸序列表達(dá)。載體的選擇將主要決定于載體與引入了該載體的宿主細(xì)胞之間的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外實體形式存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒，染色體外元件，小染色體(minichrmosome)或人工染色體。載體可含有任何確保自我復(fù)制的手段?；蛘撸d體可以是引入宿主細(xì)胞后整合到基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的那種。此外，可使用單個載體或質(zhì)粒，或一起含有待引入宿主細(xì)胞基因組中的全長DNA的兩個或更多個載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有一個或多個選擇性標(biāo)記，其能容易地選擇出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一個選擇性標(biāo)記是一種基因，其產(chǎn)物能提供對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營養(yǎng)缺陷型的轉(zhuǎn)變等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是來源于枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予了抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記。適合于酵母宿主細(xì)胞的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在絲狀真菌細(xì)胞中使用的可篩選標(biāo)志可以選自，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)，及它們的等同物。優(yōu)選用于曲霉細(xì)胞中的為構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明的載體優(yōu)選含有使所述載體可以穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中或者可以在細(xì)胞中不依賴于細(xì)胞的基因組而自我復(fù)制的元件。
為了整合到宿主細(xì)胞的基因組中，載體可以借助于編碼多肽的核酸序列或任何其它通過同源或非同源重組將載體穩(wěn)定地整合到基因組上的載體元件?；蛘?，載體可含有指導(dǎo)其通過同源重組整合到宿主細(xì)胞基因組中的附加核酸序列。附加核酸序列能使載體整合到宿主細(xì)胞基因組染色體的精確位置上。為了增加在精確位置上的整合可能性，整合元件優(yōu)選含有足夠數(shù)目的核酸，如100至1500個堿基對，優(yōu)選400至1500個堿基對，最優(yōu)選800至1500個堿基對，其與相應(yīng)的靶序列高度同源以便增強(qiáng)同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細(xì)胞基因組中的靶序列同源的任何序列。而且，整合元件可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
為了自主復(fù)制，載體可進(jìn)一步含有使得載體在所選宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起始點。細(xì)菌復(fù)制起始點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACY177和pACY184的復(fù)制起始點，和允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復(fù)制起始點。在酵母宿主細(xì)胞中使用的復(fù)制起始點的實例是2微米(micron)復(fù)制起始點，ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的組合，以及ARS4與CEN6的組合。復(fù)制起始點可以含有突變，該突變使其在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能時為溫度敏感型方式(例見，Ehrlich，1978，美國國家科學(xué)院學(xué)報751433))。
可將本發(fā)明核酸序列的一個以上拷貝插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。核酸序列拷貝數(shù)的增加可通過將該序列的至少一個附加拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組或通過包含一個能擴(kuò)增的與所述核酸序列并置的選擇標(biāo)記基因來實現(xiàn)。由于細(xì)胞所含選擇標(biāo)記基因的拷貝增加，使所述核酸序列的拷貝增加，通過在有適當(dāng)選擇劑的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞可篩選核酸序列。
用于連接上述的元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(見，例如Sambrook，等，同上)。
宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸序列的重組宿主細(xì)胞，其優(yōu)選在多肽的重組生產(chǎn)中使用。將含有本發(fā)明核酸序列的載體引入宿主細(xì)胞中，使載體以上述染色體整合體的形式或自我復(fù)制的染色體外載體的形式維持。術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括親代細(xì)胞的因在復(fù)制過程中發(fā)生突變而不同于親代細(xì)胞的任何子代。對宿主細(xì)胞的選擇很大程度上決定于編碼所述多肽的基因和它的來源。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物，或非單細(xì)胞微生物，例如真核生物。
有用的單細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞如革蘭氏陽性細(xì)菌包括，但不局限于，芽孢桿菌，例如嗜堿性芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結(jié)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌細(xì)胞，例如，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌和假單胞菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，細(xì)菌宿主細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，芽孢桿菌細(xì)胞是嗜堿性芽孢桿菌。
將表達(dá)載體引入細(xì)菌宿主細(xì)胞可通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例見，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(xué)168111-115)，通過利用感受態(tài)細(xì)胞(例見，Young和Spizizin，1961，細(xì)菌學(xué)雜志81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學(xué)雜志56209-221)，通過電穿孔(例見，Shigekawa和Dower，1988，生物技術(shù)6742-751)，或通過接合作用(例見，Koehler和Thome，1987，細(xì)菌學(xué)雜志1695771-5278)而實現(xiàn)。
生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)在野生型時能產(chǎn)生所述多肽的菌株以產(chǎn)生含有所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。優(yōu)選所述菌株為芽孢桿菌屬的菌株。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞含有在SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的成熟多肽編碼區(qū)有至少一個突變的突變性核酸序列，其中該突變型核酸序列編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成的多肽；和(b)回收所述多肽。
組合物另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的α-淀粉酶或其變體的組合物。優(yōu)選所述組合物富含本發(fā)明的α-淀粉酶或其變體。在本文中，術(shù)語“富含”表示組合物的α-淀粉酶活性增加了，例如，具有1.1的增強(qiáng)系數(shù)。
該組合物可含有本發(fā)明的多肽作為主要酶組分，例如，單組分組合物?；蛘?，該組合物可含有多種酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角化酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、萄糖淀粉酶、α-糖苷酶、β-糖苷酶、鹵過氧化物酶(haloperoxidase)、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。附加酶可利用下列微生物來生產(chǎn)，所述微生物屬于曲霉屬，優(yōu)選棘孢曲霉、泡盛曲霉、黑曲霉或米曲霉，或木霉屬，腐質(zhì)霉屬，優(yōu)選Humicola insolens，或鐮孢屬，優(yōu)選桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖孢鐮孢、多枝鐮孢、玫瑰色鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium toruloseum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum。
所述多肽組合物可以按照本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法來生產(chǎn)并且可以是液體或干組合物的形式。例如，多肽組合物可以是粒狀或微粒狀的形式。含在組合物中的多肽可以按照本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法使之穩(wěn)定。
下面給出了本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選用途實例。本發(fā)明多肽組合物的用量和使用組合物的其它條件可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來確定。
工業(yè)應(yīng)用性由于在堿性pH時的活性，本發(fā)明的α-淀粉酶能良好適用于各種工業(yè)方法，尤其是所述酶發(fā)現(xiàn)了作為洗滌劑成分，例如，洗衣、洗碗和堅硬表面洗滌劑組合物的潛在用途，但它也可以用于使紡織品、織物和衣服退漿，啤酒制作或釀造，在紙漿和紙生產(chǎn)中應(yīng)用，并進(jìn)一步在從淀粉或全谷物中生產(chǎn)增甜劑和乙醇(如燃料、飲料和工業(yè)酒精)的過程中應(yīng)用。
淀粉轉(zhuǎn)化常規(guī)的淀粉-轉(zhuǎn)化方法，如液化和糖化方法在，例如美國專利3912590和歐洲專利申請252730和63909中進(jìn)行了描述，此處引入作為參考。
紙漿和紙的生產(chǎn)本發(fā)明的堿性α-淀粉酶也可在從淀粉增強(qiáng)的廢紙和紙板生產(chǎn)木質(zhì)素纖維素材料如紙漿、紙和硬紙板的過程中應(yīng)用，尤其當(dāng)在pH7以上發(fā)生再制漿以及當(dāng)?shù)矸勖竿ㄟ^增強(qiáng)型淀粉的降解而促進(jìn)廢料的分解時。本發(fā)明的α-淀粉酶尤其適用于由淀粉-涂裹的印刷紙生產(chǎn)造紙紙漿的過程。所述過程可以按照WO95/14807所述進(jìn)行，包括以下步驟a)分解紙來產(chǎn)生紙漿，b)在步驟a)之前、期間、之后用-淀粉降解酶進(jìn)行處理，和c)在步驟a)和b)后從紙漿分離墨汁顆粒。
本發(fā)明的α-淀粉酶也非常適用于當(dāng)經(jīng)酶修飾的淀粉與堿性填充劑如碳酸鈣、陶土和粘土一起被用于造紙時修飾淀粉。采用本發(fā)明的堿性α-淀粉酶，使得有可能在有填充劑存在的條件下修飾淀粉，并因此允許較簡單的整合方法(integrated process)。
使紡織品、織物和衣物退漿本發(fā)明的α-淀粉酶也非常適用于紡織品、織物和衣物的退漿。在紡織品加工工業(yè)中，α-淀粉酶通常作為退漿過程中的助劑使用以利于含淀粉膠料的去除，這種膠料在紡織過程中充當(dāng)緯紗的保護(hù)層。在紡織后徹底去除膠料層對于確保在后續(xù)加工(即織物的洗刷、漂白和染色)中得到最佳結(jié)果非常重要。酶解淀粉因不涉及對纖維材料的任何損壞，故為優(yōu)選。為了降低加工成本和提高工廠的生產(chǎn)能力，有時將退漿過程與洗刷和漂白步驟結(jié)合到一起。在這種情況下，通常用非酶助劑如堿或氧化劑降解淀粉，因為傳統(tǒng)的α-淀粉酶與高pH值和漂白劑不能很好地相容。由于使用了破壞性強(qiáng)的化學(xué)劑，淀粉漿料的非酶性降解確實導(dǎo)致某種程度的纖維損壞。因此，由于本發(fā)明的α-淀粉酶在堿性溶液中具有改進(jìn)的性能，所以使用本發(fā)明的α-淀粉酶將是理想的。α-淀粉酶可以單獨使用或在含有纖維素的纖維或紡織品退漿時與纖維素酶結(jié)合使用。
退漿和漂白方法在本領(lǐng)域是已知的。例見WO95/21247，美國專利4643736，EP119920，這里引進(jìn)作為參考。
市售退漿產(chǎn)品有Novo Nordisk A/S的Aquazyme和AquazymeUltra。
啤酒制作本發(fā)明的α-淀粉酶還可有效用于啤酒的制作加工是；所述α-淀粉酶通常在磨碎(mashing)過程中加入。
洗滌劑組合物可將本發(fā)明的酶加入洗滌劑組合物并因此使之成為其中的組分。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以例如配成手洗或機(jī)洗的洗滌劑組合物，該組合物包括一種適于污染織物預(yù)處理的洗衣添加劑組合物和一種清洗添加的織物柔軟劑組合物，或者配成一種在普通家庭堅硬表面清潔操作過程中使用的洗滌劑組合物，或者配成手或機(jī)器洗碗操作中使用的洗滌劑。
在一個具體方面，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明的酶的洗滌劑添加劑。所述洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物可以含有一種或多種其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶和/或過氧化物酶。
通常所選酶的特性應(yīng)當(dāng)與所選洗滌劑相容，(即，pH最適值，同其它酶組分和非酶組分的相容性等)，并且所述酶應(yīng)當(dāng)以有效量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括動物、植物或微生物來源的蛋白酶。優(yōu)選微生物來源?；瘜W(xué)修飾型或蛋白質(zhì)工程化的突變體也可包括在內(nèi)。蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例是枯草蛋白酶，尤其源自芽孢桿菌屬的枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(WO89/06279所述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是WO89/06270和WO94/25583中所述的胰蛋白酶(例如，來源于豬或牛)和鐮孢屬(Fusarium)蛋白酶。
有效蛋白酶的實例是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中所述變體，尤其是在一個或多個下列位置具有置換的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。
優(yōu)選市售蛋白酶包括Alcalase、Savinase、Primase、Duralase、Esperase和Kannase(Novo Nordisk A/S)、Maxatase、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、Purafect OxP、FN2、和FN3(Genencor InternationalInc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的脂肪酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。有效脂肪酶的實例有腐質(zhì)霉屬(Humicola)(同義詞Thermomyces)的脂肪酶，如來自EP 258068和EP 305216所述H.lanuginosa(T.lanuginosus)或WO96/13580所述H.insolens；假單胞菌脂肪酶，如來自產(chǎn)堿假單胞菌或P.pseudoalcaligenes(EP 218272)、洋蔥假單胞菌(EP 331376)、司徒茨假單胞菌(GB 1372034)、熒光假單胞菌、假單胞菌屬菌株SD705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO 96/12012)；芽孢桿菌脂肪酶，如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等，(1993)，Biochemica etBiophysica Acta，1131，253-360)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短芽孢桿菌(WO 91/16422)。
其它實例是脂肪酶變體，如WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202所述的脂肪酶變體。
優(yōu)選市售脂肪酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo NordiskA/S)。
淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌和真菌來源的淀粉酶。化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。淀粉酶包括，例如從芽孢桿菌(如GB1296839所述地衣芽孢桿菌菌株)中獲得的α-淀粉酶。有效的α-淀粉酶的實例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424所述變體，尤其是在一個或多個下列位置上具有置換的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。
市售淀粉酶有DuramylTM、TermamylTM、FungamylTM和BANTM(NovoNordisk A/S)、RapidaseTM和PurastarTM(Genencor International Inc.)。
纖維素酶合適的纖維素酶包括細(xì)菌和真菌來源的纖維素酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、草根霉屬、支頂孢屬的纖維素酶，例如產(chǎn)自US4435307、US5648263、US5691178、US5776757和WO89/09259中所公開的Humicola isolens、嗜熱毀絲霉和尖孢鐮孢的真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有顏色保護(hù)優(yōu)點的堿性或中性纖維素酶。這種纖維素酶的實例是EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中所述的纖維素酶。其它實例是纖維素酶變體如WO94/07998、EP0531315、US5457046、US5686593、US5763254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中所述的那些變體。
市售纖維素酶包括Celluzyme和Carezym(Novo Nordisk A/S)，Clazinase和Puradax HA(Genencor International Inc.)，及KAC-500(B)(KaoCorporation)。
過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶?；瘜W(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程化的突變體也包括在內(nèi)。有效的過氧化物酶實例包括來自Coprinus，例如來自C.cinereus的過氧化物酶及其在WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述的變體。
市售過氧化物酶包括Guardzme(Novo Nordisk A/S)。
洗滌劑組合物中可包含去污酶，方式是加入分別含一或多種酶的不同添加劑，或加入含所有這些酶的組合添加劑。本發(fā)明的洗滌添加劑，即獨立添加劑或組合添加劑可配制成顆粒、液體、漿等。優(yōu)選的洗滌添加劑形式是顆粒(特別是不起塵的顆粒)，液體(特別是穩(wěn)定的液體)，或漿。
不起塵的顆?？梢匀鏤S4106991和4661452中所公開的來生產(chǎn)，并可以任選通過本領(lǐng)域已知方法加涂層。蠟涂材料的實例是平均摩爾量為1000至20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚；其中醇含有12至20個碳原子并且其中存在15至80個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；及脂肪酸的單-和雙-和甘油三酯。適于通過流體床技術(shù)來應(yīng)用的成膜涂層材料的實例在GB1483591中給出。液體酶預(yù)制劑可以按已有方法通過加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩(wěn)定。被保護(hù)的酶可以按照EP238216中的方法來生產(chǎn)。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何適當(dāng)?shù)男螤?，例如條狀、片狀、粉狀、顆粒狀、糊狀或液體。液體洗滌劑可以是含水型(通常含有高達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑)，或不含水型。
洗滌劑組合物含有一種或多種表面活性劑，其可以是非離子型(包括半極性形式)和/或陰離子型和/或陽離子型和/或兩性離子型。表面活性劑通常占總重量的0.1％至60％。
當(dāng)包含在其中時，所述洗滌劑通常含有約1％至約40％的陰離子表面活性劑如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯屬磺酸酯、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、仲鏈烷磺酸鹽(alkanesulfonate)、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸或(肥)皂。
當(dāng)包括其中時洗滌劑通常含有約0.2％至40％的非離子表面活性劑如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷(polyglycoside)、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基脂肪酸單乙醇胺、脂肪酸單乙醇胺、多羥基烷基脂肪酸胺或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“glucamide”)。
洗滌劑可含有0-65％的洗滌助洗劑或絡(luò)合劑如沸石、二磷酸、三磷酸鹽、膦酸酯、碳酸鹽、檸檬酸鹽、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或分層硅酸鹽(例如來源于Hoechst的SKS-6)。
洗滌劑可含有一種或多種聚合物。實例是羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯基醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧化物如聚丙烯酸類、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
所述洗滌劑可含有漂白系統(tǒng)，其可含有H2O2源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，所述H2O2源可以同過酸-形成漂白激活劑如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ醣交撬犷愡M(jìn)行混合。或者，漂白系統(tǒng)可以含有過氧酸的例如酰胺、亞胺或砜形式。
本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶可以采用傳統(tǒng)的穩(wěn)定劑來進(jìn)行穩(wěn)定，所述穩(wěn)定劑是，例如多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基硼酸，并且所述組合物可以按照WO92/19709和WO92/19708中所述進(jìn)行配制。
洗滌劑也可含有其它傳統(tǒng)的洗滌劑成分如織物調(diào)節(jié)劑，這些有粘土、增泡劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、增白劑、水助溶劑、抑銹劑或香料。
根據(jù)本發(fā)明的設(shè)計，任何酶，特別是本發(fā)明的酶可以以相當(dāng)于每升洗滌液0.01-100mg酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液0.05-5mg酶蛋白，特別優(yōu)選每升洗滌液0.1-1mg酶蛋白的量加到所述洗滌劑組合物中。
還可將本發(fā)明的酶加至WO97/07202(引入作為參考)中公開的洗滌劑配方中。
洗碗洗滌劑組合物本發(fā)明的酶也可用于洗碗洗滌劑組合物中，包括下列1)粉狀自動洗碗組合物
2)粉狀自動洗碗組合物
3)粉狀自動洗碗組合物
4)粉狀自動洗碗組合物
5)粉狀自動洗碗組合物
6)具有洗凈型表面活性劑系統(tǒng)的粉狀和液體洗碗組合物
7)無水液體自動洗碗組合物
8)無水液體自動洗碗組合物
9)觸變液體自動洗碗組合物
10)液體自動洗碗組合物
11)含有受保護(hù)的漂白顆粒的液體自動洗碗組合物
11)如1)、2)、3)、4)、6)和10)所述的自動洗碗組合物，其中的過硼酸鹽被過碳酸鹽所取代。
12)如1)-6)所述的自動洗碗組合物，該組合物另外含有錳催化劑。錳催化劑可以是“用于低溫漂白的有效錳催化劑”，自然369，1994，637-639中所述的化合物之一。
應(yīng)用本發(fā)明還涉及本發(fā)明具有α-淀粉酶活性的多肽在洗滌劑，尤其洗衣洗滌劑組合物和洗碗洗滌劑組合物，堅硬表面清潔組合物，以及使紡織品、織物或衣服退漿，生產(chǎn)紙漿和紙、啤酒制作和淀粉轉(zhuǎn)化等上述工藝中應(yīng)用的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實施例描述，但不應(yīng)理解為本發(fā)明限于此。
材料和方法用作緩沖劑和底物的化學(xué)試劑是至少試劑純的商品。
材料酶SP690美國專利5856164的SEQ ID NO1中公開的α-淀粉酶。
SP722美國專利5856164的SEQ ID NO2中公開的α-淀粉酶。
Termamyl美國專利5830837的SEQ ID NO1中公開的地衣芽胞桿菌α-淀粉酶。
AA560本發(fā)明SEQ ID NO2所示的α-淀粉酶。
BAN解淀粉芽胞桿菌α-淀粉酶，可從Novo Nordisk A/S得到。
BSG嗜熱脂肪芽胞桿菌α-淀粉酶，可從Novo Nordisk A/S得到。
洗滌劑型號A/P(亞洲/太平洋)型洗滌劑具有下列組分20％STPP(三聚磷酸鈉)、25％Na2SO4、15％Na2CO3、20％LAS(線性烷基苯磺酸鹽，Nansa 80S)、5％C12-C15脂肪醇乙氧基化物(Dobanol 25-7)、5％Na2Si2O5、0.3％NaCl。
Omo Multi Acao(巴西)，Omo濃縮粉(EU)(聯(lián)合利華(Unilever))Ariel Futur液體(EU)(Procter和Gamble)生物材料的保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，下列生物材料被保藏在德意志微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig DE，并被給予下列保藏號
保藏物保藏號保藏時間NN017557 DSM 12648 1999年1月25日NN017560 DSM 12649 1999年1月25日NN049467 DSM 12761 1999年4月7日NN049470 DSM 12764 1999年4月7日菌株保藏的條件是在由專利和商標(biāo)委員會根據(jù)37 C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122決定是否授權(quán)該專利申請的過程中確保能夠得到該培養(yǎng)物。保藏物代表被保藏菌株的基本純的培養(yǎng)物。在進(jìn)行主體申請的再申請或它的子案進(jìn)行再申請的境外國家中專利法的要求下，所述寄存物應(yīng)當(dāng)能得到。然而，應(yīng)理解得到保藏物并不非許可實施所述主體發(fā)明而對由政府行為授予的專利權(quán)造成損害。
宿主生物枯草芽孢桿菌菌株SHa273公開于WO95/10603。
大腸桿菌菌株SJ2(Diderichsen等，(1990)，細(xì)菌學(xué)雜志172卷，4315-4321)。
質(zhì)粒Genebank載體pSJ1678進(jìn)一步由WO94/19454(引入作為參考)公開。
pTVB110是利用pUB110的復(fù)制起始點在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒(Gryczan，T.(1978)，細(xì)菌學(xué)雜志134318-329)。所述質(zhì)粒進(jìn)一步編碼cat基因，該基因賦予氯霉素抗性并源自質(zhì)粒pC194(Horonouchi，S.和Weisblum，B.(1982)，細(xì)菌學(xué)雜志150815-825)。所述質(zhì)粒攜有地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因amyL的截短形式，因此存在amyL啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子，但是該質(zhì)粒并不提供amy-+表型(在含淀粉的瓊脂上形成暈圈(halo))。
pTVB299見實施例10中的構(gòu)建方法普通分子生物學(xué)方法除非另外提到，所述DNA操作和轉(zhuǎn)化都是通過采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行的(Sambrook等，(1989)；Ausubel等，(1995)；Harwood和Cutting(1990))。
α-淀粉酶及其變體的發(fā)酵生產(chǎn)可以通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法或按下述方法進(jìn)行發(fā)酵。
攜有相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒的一株枯草芽孢桿菌菌株在含有-80℃貯存的10微克/毫升卡那霉素的LB-瓊脂平板上劃線接種，并在37℃下過夜培養(yǎng)。將菌落轉(zhuǎn)移到裝在500ml搖瓶中的添加有10微克/毫升卡那霉素的100ml BPX培養(yǎng)基中。
BPX培養(yǎng)基的組成馬鈴薯淀粉100g/l大麥粉50g/lBAN 5000 SKB 0.1g/l酪蛋白酸鈉10g/l大豆粉(Soy Bean Meal) 100g/lNa2HPO4，12H2O9g/lPluronicTM0.1g/l培養(yǎng)物在37℃下以270rpm振蕩培養(yǎng)5天。
通過4500rpm離心20-25分鐘除去發(fā)酵液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后將上清液過濾來獲得完全澄清的溶液。濃縮濾液并在UF濾器上進(jìn)行洗滌(10000截留膜)，再將緩沖液換成pH5.5的20mM的醋酸(Acetate)。將UF濾液上樣到S-Sepharose F.F上并且在同樣的緩沖液中通過采用0.2MNaCl的逐步洗脫法進(jìn)行洗脫。洗脫液對10mM Tris pH9.0透析，上樣到Q-Sepharose F.F上，利用0-0.3M NaCl的線性梯度洗脫6個柱體積。收集具有活性(通過Phadebas分析法測定)的餾分，調(diào)節(jié)pH到pH7.5并通過采用0.5％W/vol.的活性碳處理5分鐘來除去殘留色素。
α-淀粉酶活性的測定1.Phadebas分析法通過以Phadebas片為底物的方法測定α-淀粉酶活性。Phadebas片(Phadebas淀粉酶試驗，由Pharmacia Diagnostic提供)含有交聯(lián)的不可溶藍(lán)色淀粉聚合物，其與牛血清白蛋白和一種緩沖物質(zhì)相混合并被壓片。
每次測定時，將一個片劑懸浮在含有5ml 50mM Britton-Robinson緩沖液(50mM醋酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mM CaCl2，用NaOH將pH調(diào)到所需值)的試管中。試驗在所需溫度的水浴中進(jìn)行。要測定的α-淀粉酶用xml的50mM Britton-Robinson緩沖液稀釋。1ml的該α-淀粉酶溶液被加到5ml 50mM Britton-Robinsond緩沖液中。淀粉被該α-淀粉酶水解并產(chǎn)生可溶的藍(lán)色片段。在620nm下分光光度法測定藍(lán)色溶液的吸光度，其是α-淀粉酶活性的函數(shù)。
重要的是經(jīng)10或15分鐘溫育(試驗時間)后在620nm下測定的吸光度是在0.2至2.0個620nm光吸收單位的范圍內(nèi)。在這一光吸收范圍內(nèi)活性與光吸收值之間成線性關(guān)系(Lambert-Beer定律)。因此必須調(diào)節(jié)酶的稀釋度以適合這一標(biāo)準(zhǔn)。在一系列特定的條件(溫度、pH、反應(yīng)時間、緩沖液)下，1mg的給定α-淀粉酶將水解一定量的底物并產(chǎn)生藍(lán)色。在620nm下測定顏色的強(qiáng)度。測定的吸光值直接與在所述一系列特定條件下測得的目標(biāo)α-淀粉酶的比活性成比例(活性/mg純α-淀粉酶蛋白)。
2.另一種方法(PNG-G7分析法)通過采用PNP-G7底物測定α-淀粉酶的活性。PNG-G7是對硝基苯-α，D-麥芽酚庚糖苷(maltoheptaoside)的縮寫，它能被內(nèi)淀粉酶裂解的嵌段(blocked)寡糖。裂解后，試劑盒中包括的α-葡萄糖苷酶消化底物而釋放一種游離PNP分子，該PNP分子呈黃色因而通過在λ＝405nm(400-420nm)下的可視分光光度測定法(spectophometry)來測定。包括PNP-G7低物和α-葡萄糖苷酶的試劑盒是由Boehringer-Mannheim生產(chǎn)的(目錄號1054635)。
為了生產(chǎn)底物，將一瓶底物(BM1442309)加到5ml緩沖液(BM1442309)中。為了生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶，將一瓶α-葡萄糖苷酶(BM1462309)加到45ml緩沖液(BM1442309)中。工作溶液通過混合5ml的α-葡萄糖苷酶溶液和0.5ml底物來制得。
分析是通過將20μl酶溶液轉(zhuǎn)到96孔微滴板中并在25℃下溫育。在25℃下加入200μl工作溶液。將所述溶液混合并預(yù)溫育1分鐘，然后每15秒在OD 405nm下測定吸光值一次，共測3分鐘。
依賴時間的吸光值-曲線的斜率直接與所述一系列特定條件下目標(biāo)α-淀粉酶的比活性成比例(每mg酶的活性)。
鈣-和pH-依賴的穩(wěn)定性的測定為了改進(jìn)95℃-105℃時的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)的工業(yè)化液化處理過程是在以pH6.0-6.2為液化pH和加入40ppm的游離鈣來操作的。通過進(jìn)行本文建議的一些替換來改進(jìn)在以下條件下的穩(wěn)定性1.比pH6.2低的pH和/或2.在游離鈣濃度低于40ppm游離鈣的情況下。
利用兩種不同方法來測定通過在AA560α-淀粉酶中進(jìn)行不同的替換而得到的穩(wěn)定性的改變。
方法1一種在降低的pH即pH5.0、5ppm游離鈣的條件下測定穩(wěn)定性的分析方法。
在下列條件下溫育10μg所述變體0.1M的醋酸鹽溶液、調(diào)到pH 5.0、含有5ppm鈣和5％w/w的普通玉米淀粉(不含鈣)。溫育是在95℃的水浴中進(jìn)行30分鐘。
方法2一種在不存在游離鈣和pH被維持在pH6.0的條件下測定穩(wěn)定性的分析方法。這種分析方法測定鈣敏感性的降低。
在下列條件下溫育10μg所述變體0.1M的醋酸鹽溶液、調(diào)到pH 6.0并5％w/w的普通玉米淀粉(不含鈣)。溫育是在95℃的水浴中進(jìn)行30分鐘。
穩(wěn)定性的測定所有的穩(wěn)定性試驗都采用相同的設(shè)置進(jìn)行。方法如下在相關(guān)條件(1-4)下溫育所述酶。在0、5、10、15和30分鐘取樣并用分析緩沖液(0.1M 50mM Britton緩沖液pH7.3)稀釋25倍(所有取樣采用相同稀釋度)，在標(biāo)準(zhǔn)條件pH7.3、37℃下采用Phadebas分析方法(Pharmacia)測定活性。
溫育前(0分)所測活性被用作參考(100％)。百分?jǐn)?shù)的下降被計算為溫育時間的函數(shù)。
比活性的測定采用Phadebas分析方法(Pharmacia)將比活性測定為活性/mg酶。
用AA560及其變體進(jìn)行噴射蒸煮(Jet cooking)和液化液化實驗是在微型-噴射(mini-jet)系統(tǒng)中用50NU/g DS在pH 5.5下加入5ppm Ca++而進(jìn)行，以便比較所配制的α-淀粉酶變體與親代α-淀粉酶的性能。反應(yīng)通過測量DE增長對時間的函數(shù)(Neocuproine方法)來進(jìn)行監(jiān)控。
通過用去離子水懸浮約11.8kg的Cerestar C*pharm GL03406(89％的淀粉)至接近30kg來生產(chǎn)玉米淀粉漿。在室溫下加入0.55g的CaCl2.2H2O后將pH調(diào)到5.5。
加入相當(dāng)于50NU/g DS的酶，并用NaCl將電導(dǎo)率調(diào)到300mS。標(biāo)準(zhǔn)條件如下所示底物濃度 35％w/w(起始)
31.6-31.9％w/w(終)溫度 105℃、5分鐘(首次液化)95℃、90分鐘(第二次液化)pH(起始) 5.5噴射(jet)后，收集液化了的淀粉并用密封的熱燒瓶從小規(guī)模的工廠轉(zhuǎn)運到試驗室中，在這里于95℃下繼續(xù)進(jìn)行第二次液化。
15至90分鐘內(nèi)每隔15分鐘取10ml的樣品。加入2滴1N的HCl以使酶失活。從這些樣品中稱出0.3-0.1g(根據(jù)期望的DE)并稀釋到100ml。然后，根據(jù)Neocuproine方法測定還原糖(精度改進(jìn)的還原糖測定。Dygert，Li，F(xiàn)lorida和Thomas(1965).Anal.Biochem 13，368)并測定的DE值。比較作為時間函數(shù)的DE的變化。
退漿材料標(biāo)準(zhǔn)織物 TS526，斜紋織法，100％棉浸漬 55℃，60ppm CaCl2，pH6.5酶溶液 親代AA560(1g/l)用量 浸漬液中0.05，0.1，0.2，0.5和2.0g/l酶溶液。
溫育 在55或65℃下2小時在30℃下22小時洗滌 水中10分鐘干燥 室溫程序 退漿結(jié)果的評估-Violet scale(TEGEWA)。
利用DOPE程序進(jìn)行隨機(jī)誘變的常規(guī)方法通過以下步驟可以進(jìn)行隨機(jī)誘變1.在親代酶中選擇用于修飾的目標(biāo)區(qū)域，2.在所選區(qū)域中決定突變位點和非突變位點，3.根據(jù)如待構(gòu)建變體的所需穩(wěn)定性和/或性能，決定突變的類型，4.選擇結(jié)構(gòu)合理的突變，5.根據(jù)步驟4調(diào)整步驟3所選殘基，6.通過采用適當(dāng)?shù)膿饺胨惴?dope algorithm)分析核苷酸的分布，
7.如果需要，調(diào)整所需殘基使之符合基因密碼的真實性，如考慮基因密碼導(dǎo)致的限制因素，如為了避免引入終止密碼子；技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識到某些密碼子組合不能應(yīng)用于實踐，需要調(diào)整，8.生產(chǎn)引物，9.利用所述引物進(jìn)行隨機(jī)誘變，10.通過篩選所需要改進(jìn)的性能來選擇所得葡萄糖淀粉酶變體。
摻入算法用于步驟6的合適摻入算法為本領(lǐng)域已知。如Tomandl，D.等，1997，計算機(jī)-輔助的分子設(shè)計雜志(Journal of Computer-Aided MolecularDesign)1129-38。另一種算法是DOPE(Jensen，LJ，Andersen，KV，Svendsen，A，和Kretzschmar，T，(1998)，核酸研究26697-702)。
濾膜篩選試驗該試驗可用于根據(jù)對篩選溫度的設(shè)置，篩選在高pH下比親代酶穩(wěn)定性提高的AA560變體，和在高pH和中溫下比親代酶穩(wěn)定性提高的AA560α-淀粉酶變體。
高pH濾膜試驗將芽孢桿菌文庫鋪于含有10μg/ml卡那霉素之TY瓊脂平板上醋酸纖維素(OE67，Schleicher & Schuell，Dassel，德國)-硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba85，Schleicher & Schuell，Dassel，德國)的夾心結(jié)構(gòu)上，37℃保持至少21小時。醋酸纖維素層被安置在TY瓊脂平板上。
每一濾膜夾心于鋪板后但溫育前用針做特別標(biāo)記，以便能定位濾膜上的陽性變體，將結(jié)合了變體的硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到盛有對羥苯基甘氨酸(glycin)-NaOH緩沖液(pH8.6-10.6)的容器中，室溫(可以變?yōu)?0℃-60℃)溫育15分鐘。將有菌落的醋酸纖維素濾膜室溫保存在TY-平板上備用。溫育后，在含有1％瓊脂糖、0.2％淀粉之對羥苯基甘氨酸-NaOH緩沖液(pH8.6-10.6)的平板上測定殘留活性。帶硝酸纖維素濾膜的試驗板按照與濾膜夾心相同的方法標(biāo)記，室溫溫育2小時。除去濾膜后，試驗板用10％Lugol溶液染色。淀粉降解變體為深藍(lán)背景下的白點，然后保存板上對其進(jìn)行鑒定。陽性變體相同于第一次篩選的條件再篩選兩次。
低鈣濾膜試驗將芽孢桿菌文庫鋪板于含有相關(guān)抗生素如卡那霉素或氯霉素之TY瓊脂平板上的醋酸纖維素(OE67，Schleicher & Schuell，Dassel，德國)-硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85，Schleicher & Schuell，Dassel，德國)的夾心結(jié)構(gòu)中，37℃保持至少21小時。醋酸纖維素層被安置在TY瓊脂平板上。
每一濾膜夾心于鋪板后但溫育前用針做特別標(biāo)記，以便能定位濾膜上的陽性變體，將結(jié)合了變體的硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移到盛有碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH8.5-10)和不同EDTA濃度(0.001mM-100mM)的容器中。將有菌落的醋酸纖維素濾膜室溫保存在TY-平板上備用。溫育后，在含有1％瓊脂糖、0.2％淀粉之碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH8.5-10)的平板上測定殘留活性。帶硝酸纖維素濾膜的試驗板按照與濾膜夾心相同的方法標(biāo)記，室溫溫育2小時。除去濾膜后，試驗板用10％Lugol溶液染色。淀粉降解變體為深藍(lán)背景下的白點，然后保存板上對其進(jìn)行鑒定。陽性變體相同于第一次篩選的條件再篩選兩次。
實施例實施例1 從DSM 12648和DSM 12649中分離基因組DNA芽孢桿菌屬菌株DSM 12649(AA560α-淀粉酶)和芽孢桿菌屬菌株DSM12648(AA349α-淀粉酶)在TY液體培養(yǎng)基(如Ausubel等(1995)所述)中傳代。37℃，300rpm培養(yǎng)16小時后，收集細(xì)胞，用Pitcher等(1989)所述方法(1989)分離基因組DNA。
基因組文庫的構(gòu)建DSM 12649的基因組DNA用限制酶Sau3A部分消化，經(jīng)0.7％瓊脂糖凝膠電泳分級分離。2至10kb大小的片段在DEAE-纖維素紙上電泳分離(Dretzen等，(1981))。
將所分離到的DNA片段連接至BamHI消化的pSJ1678質(zhì)粒DNA上，用該連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2。
轉(zhuǎn)化用BIO-RAD的基因PULSERTM電穿孔儀按說明書制備大腸桿菌SJ2宿主細(xì)胞并通過電穿孔轉(zhuǎn)化。
陽性轉(zhuǎn)化體的鑒定上述構(gòu)建的大腸桿菌SJ2的DNA文庫在含有0.5％AZCL-淀粉酶(Megazyme)和10μg/ml氯霉素的LB瓊脂平板(Ausbel等所述(1995))上篩選，并在37℃下培養(yǎng)過夜。顯示淀粉酶活性的克隆呈現(xiàn)出藍(lán)色擴(kuò)散型暈圈。一個這種克隆被命名為LiH1274。通過對所克隆的Sau3A DNA片段的一部分進(jìn)行DNA測序來進(jìn)一步鑒定該DNA。
實施例2 對DSM 12648(AA349)α-淀粉酶的編碼基因的DNA測序用含較大染色體片段的克隆作模板，利用針對已知芽孢桿菌α-淀粉酶的保守區(qū)的簡并引物經(jīng)特異性PCR擴(kuò)增α-淀粉酶編碼基因的內(nèi)部DNA片段，其中所述較大染色體片段含有插入到質(zhì)粒pSJ1678、pLiH1274中的編碼淀粉分解活性的基因。
簡并引物針對下列區(qū)域/氨基酸序列For36GITA(L/V/I)W(I/L) (SEQ ID NO5)For97VY(G/A)D(V/F/L)V(M/L/I/F)NH (SEQ ID NO6)For227DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH (SEQ ID NO7)Rev235DG(F/I)R(F/L/I/V)DA(A/V)KH (SEQ ID NO8)Rev328VTFV(D/E)NHD (SEQ ID NO9)Rev410GWTREG (SEQ ID NO10)用正向(For)和反向(Rev)引物的不同組合進(jìn)行PCR可擴(kuò)增內(nèi)部DNA片段。
DNA片段用QIA快速離心柱(QIAquick spin colums)(QUIGEN)純化，并用相同簡并引物測序。
通過標(biāo)準(zhǔn)的引物-步行接近法(primer-walking approach)從序列中確定編碼成熟AA349α-淀粉酶(SEQ ID NO2)的完整編碼區(qū)域的DNA序列(SEQID NO1)。
實施例3 對DSM 12649(SS560)α-淀粉酶之編碼基因的DNA測序用DSM 12649(實施例1)之染色體DNA為模板，進(jìn)行類似上述實施例2所述的試驗，以測定AA560α-淀粉酶的DNA序列(SEQ ID NO4)。
實施例4 將AA349α-淀粉酶亞克隆到pTVB110上pTVB110是利用pUB110的復(fù)制起始點在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒(Gryczan，T.(1978)，細(xì)菌學(xué)雜志134318-329)。所述質(zhì)粒進(jìn)一步編碼cat基因，該基因賦予氯霉素抗性并源自質(zhì)粒pC194(Horonouchi，S.和Weisblum，B.(1982)，細(xì)菌學(xué)雜志150815-825)。所述質(zhì)粒攜有地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因amyL的截短形式，因此存在amyL啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子，但是該質(zhì)粒并不提供amy+表型(在含淀粉的瓊脂上形成暈圈)。
為表達(dá)大量AA349α-淀粉酶，將成熟基因精確融合到amyl信號序列上，以使轉(zhuǎn)錄由amyl啟動子起始，轉(zhuǎn)位由amyl信號序列指導(dǎo)。
在成熟的AA349α-淀粉酶內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個PstI位點。由于將所述基因克隆到pTVB110中利用了pTVB110的PstI位點，所以AA349α-淀粉酶基因中的PstI位點在克隆期間遭到破壞(通過在88位的丙氨酸處引入沉默突變(GCA變?yōu)镚CG))。
用Pwo聚合酶按廠商(Boehringer Mannheim)建議，以引物188克隆N和188(Pst-)經(jīng)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pLiH1274上約280bp的片段。該片段用瓊脂糖凝膠純化，并與引物188克隆C一起作為大范圍引物(megaprimer)(G.Sarkar和S.S.Sommer，(1990)，生物技術(shù)8404-407)在第二輪PCR中擴(kuò)增編碼成熟淀粉酶的全長基因。
所得約1480bp的片段用限制性核酸內(nèi)切酶PstI和SfiI消化，與用同樣酶消化的質(zhì)粒pTVB110連接。
用該連接混合物轉(zhuǎn)化蛋白酶和淀粉酶缺陷型枯草芽孢桿菌菌株SHa273(WO 95/10603所述)，檢驗amy+轉(zhuǎn)化體的DNA序列。稱該質(zhì)粒為pTVB231。
寡核苷酸188(Pst-)5’GGC GTT AAC CGC AGC TTG TAA C (SEQ ID NO11)188克隆C5’CCG AGC TCG GCC GGC TGG GCC GTC GAC TTA TTT GTT TACCCA AAT AGA AAC (SEQ ID NO12)188克隆N5’CAT TCT GCA GCA GCG GCG CAC CAT AAT GGT ACG AAC G(SEQ ID NO13)實施例5 將AA560α-淀粉酶亞克隆到pTVB110上DNA測序表明菌株DSM12648(AA349)和菌株DSM12649(AA560)的α-淀粉酶具有高度同一性。因此相同的寡核苷酸和策略被用于將AA560α-淀粉酶克隆到表達(dá)載體pTVB110上而產(chǎn)生質(zhì)粒pTVB232，然后采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對該質(zhì)粒進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
實施例6 親代AA560α-淀粉酶的純化每毫升培養(yǎng)液中加入0.01ml 50％(w/w)CaCl2.2H2O，0.0125ml 12％(w/w)鋁酸鈉，0.025ml 10％C521和0.075ml 0.1％A130使之絮凝。離心后獲得清亮溶液。在酶溶液中加入硫酸銨至終濃度1.2M，然后上樣到已用1.2M硫酸銨、10mM Tris-HCl，pH7.0預(yù)平衡的Butyl Toyo Pearl柱(100ml)。淀粉酶用5mM Tris-HCl，pH7.0洗脫，使洗脫收集液對5mM Tris-HCl透析過夜。然后用20mM的Tris-HCl，pH9.0預(yù)平衡的Q-Sepharose柱(200ml)對餾分進(jìn)行離子交換層析。用平衡緩沖液洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，淀粉酶用線性梯度0-1MNaCl，20mM Tris-HCl，pH9.0洗脫。淀粉酶制劑的純度經(jīng)SDS-PAGE測定在95％以上。
實施例7 親代AA560α-淀粉酶的定性α-淀粉酶活性用上述Phadebas試驗(37℃，pH7.3)和pNPG7分析法(25℃，pH7.1)測定。在選定的pH值和溫度值下制作pH圖譜和溫度圖譜。PH圖譜在37℃測定，溫度圖譜在pH9.0測定。
用等電聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH3.5-9.3)測定等電點。表1. 比活性和pI
對AA560、SP722和SP690而言，E＝3.0cm-1×(g/l)-1最佳pH和最佳溫度的測定結(jié)果分別示于
圖1和圖2。
實施例8 親代AA560α-淀粉酶的洗滌試驗在含有本發(fā)明AA560α-淀粉酶的洗滌劑溶液中，將測試污布于25℃和40℃分別洗滌15和30分鐘，以此評價洗滌性能。
所用洗滌劑見下表2。A/P型洗滌劑在材料部分中描述。其它洗滌劑為購買的商品。含有α-淀粉酶的商用洗滌劑在洗滌前用微波滅活。
實施例6中純化重組的AA560α-淀粉酶以下面所示的濃度加到洗滌劑溶液中。所述測試污布用桔子大米淀粉(orange rice starch)弄臟(CS-28污布來源于CFT，測試材料中心，荷蘭)。
洗滌后，污布通過用Elrepho減退分光光度計(Elrepho RemissionSpectrophotometer)測定460nm時的減退值(remission)來評價。結(jié)果表示為ΔR＝用α-淀粉酶洗滌的污布的減退值-在相同條件下未用α-淀粉酶洗滌的污布的減退值。
表2.洗滌劑和洗滌條件地區(qū) 洗滌劑 測定量 滅活 酶量 溫度時間 pH 水硬度 Ca∶Mgg/l mg/l℃ mins°dhA/P 洗滌劑97型 3 - 1 25 15 10.56 2∶1拉丁美洲Omo Multi Acao 3 - 1 25 15 10.66 2∶1歐洲Omo濃縮粉 4 + 0.2 40 30 10.215 4∶1歐洲Ariel Futur液體5 + 0.2 40 30 9.0 15 4∶1結(jié)果顯示于圖4-7。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的α-淀粉酶在所有強(qiáng)堿性pH下的洗滌劑中都有效，還表明AA560α-淀粉酶的洗滌性能分別比SP690和SP722改進(jìn)。
實施例9 用AA560α-淀粉酶進(jìn)行的退漿試驗用親代AA560α-淀粉酶經(jīng)TEGEWA法(方法和標(biāo)準(zhǔn)等級(scales)，可得自Verband TEGEWA，Karlstrasse 21，法蘭克福a.M.，德國)使織物退漿。條件在“材料和方法”部分中進(jìn)行了描述。
AA560α-淀粉酶用于在30和55℃下進(jìn)行的退漿試驗。酶在浸漬溶液中的用量為0.05至2g/l。后洗步驟為用水而不是通常的用熱碳酸氫鈉水(soda)來洗滌織物。
采用Violet等級(TEGEWA)測定效果TEGEWA等級1-9。
等級1＝未退漿，等級9＝完全退漿。
實施例10 保藏材料pTVB299的構(gòu)建將成熟基因亞克隆到質(zhì)粒pZero-2(Invitrogen，Groningen，TheNederlands)上。將含有AA560完整成熟區(qū)的約1.5kb PstI-SacI片段(來源于pTVB232)與用相同限制性酶消化的載體pZero-2連接。將該連接混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化體經(jīng)PCR檢驗該插入片段的存在，并測序該片段中編碼成熟α-淀粉酶的部分。將所得質(zhì)粒(稱為pTVB299)保藏在DSMZ，保藏號為DSM 12764。
實施例11 AA560α-淀粉酶變體的構(gòu)建編碼SEQ ID NO2所示AA560α-淀粉酶的基因位于質(zhì)粒pTVB223上。在枯草芽孢桿菌中淀粉酶的表達(dá)由該構(gòu)建體中的amyL啟動子起始。
本發(fā)明的具有δ(D183-G184)突變的變體通過Sarkar和Sommer，(1990)生物技術(shù)8404-407)所述大范圍引物法來構(gòu)建。
用基因特異性引物B1和誘變引物101458經(jīng)PCR從編碼AA560的pTVB223質(zhì)粒擴(kuò)增約645bp的DNA片段，如SEQ ID NO12所示。
該645bp片段經(jīng)瓊脂糖凝膠純化，并與引物Y2一起作為大范圍引物用于以相同模板進(jìn)行的第二輪PCR中。
所得約1080bp片段用限制酶BstEII和AflIII消化，所得約510bp的DNA片段經(jīng)純化后與用相同酶消化的pTVB223質(zhì)粒連接?？莶菅挎邨U菌SHA273(淀粉酶和蛋白酶低)的感受態(tài)細(xì)胞用所述連接物轉(zhuǎn)化，氯霉素抗性轉(zhuǎn)化體經(jīng)DNA測序來檢測以證實質(zhì)粒上正確突變的存在。
引物B15’CGA TTG CTG ACG CTG TTA TTT GCG 3’ (SEQ ID NO14)引物Y25’CTT GTT CCC TTG TCA GAA CCA ATG 3’ (SEQ ID NO15)引物1014585’GT CAT AGT TGC CGA AAT CTG TAT CGA CTT C3’ (SEQ IDNO16)所得質(zhì)粒編碼具有δ(D183-G184)+N195F的AA560α-淀粉酶，將該質(zhì)粒命名為pTVB232。
本發(fā)明其它變體的構(gòu)建可用相似的方式進(jìn)行。
實施例12 AA560變體的洗滌性能的測試本發(fā)明的AA560變體的洗滌性能如實施例8濃縮述進(jìn)行測試。
實施例13 AA560變體的比活性的測試AA560變體的比活性如實施例7所述進(jìn)行測試。
實施例14 AA560變體的鈣穩(wěn)定性的測試AA560變體的鈣穩(wěn)定性用“材料和方法”部分所述試驗測定。
本文描述的和要求保護(hù)的本發(fā)明并不局限于本文公開的特定實施方案的范圍，因為這些實施方案旨在說明本發(fā)明的幾個方面。任何等同的實施方案都應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。事實上，除了本文顯示和描述的內(nèi)容，相對于上述內(nèi)容對本發(fā)明做出的各種改動對于本技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這樣的改動也會落入所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。在沖突的情況下，本文包括定義的公開內(nèi)容將起作用。
本文引用了多篇參考文獻(xiàn)，其公開內(nèi)容的全部被引入作為參考。
參考文獻(xiàn)Sambrook等；分子克隆實驗室手冊(Molcular CloningA LaboratoryManual)；1989；冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Lab)；冷泉港；紐約。
Ausubel，F(xiàn).M.等(eds.)；分子生物學(xué)流行草案(Current protocols inMolecular Biology)；1995；John Wiley和Sons。
Harwood C.R.，和Cutting S.M.(eds.)；用芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)；1990；John Wiley和Sons。
Diderichsen B.，Wedsted U.，Hedegaard L.，Jensen B.R.，Sjholm C.；aldB的克隆，其編碼α--乙酸乙酯脫羧酶，一種來源于短芽孢桿菌的胞外酶；細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，1990，172卷，4315-4321頁。
Pitcher D.G.，Saunders N.A.，Owen R.J.；用硫氰酸胍(guanidiumthiocyanate)快速提取細(xì)菌基因組DNA；應(yīng)用微生物學(xué)通訊(Lett.Appl.Microbiol.；)；1989；8卷；151-156頁。
Dretzen G.，Bellard M.，Sassone-Corsi P.，Chambon P.；用于從瓊脂糖和丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段的有效方法；生物化學(xué)分析(Anal.Biochem.)；1981；112卷；295-298頁。
序列表<110>Novo Nordisk A/S<120><130><160>16<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>1458<212>DNA<213>芽孢桿菌菌株<220><221>CDS<222>(1)..(1458)<220><221>成熟肽<222>(1)..(1458)<400>1cac cat aat ggt acg aac ggc aca atg atg cag tac ttt gaa tgg tat 48His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr1 5 10 15cta cca aat gac gga aac cat tgg aat aga tta agg tct gat gca agt 96Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser20 25 30aac cta aaa gat aaa ggg atc tca gcg gtt tgg att cct cct gca tgg 144Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45aag ggt gcc tct caa aat gat gtg ggg tat ggt gct tat gat ctg tat 192Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60gat tta gga gaa ttc aat caa aaa gga acc att cgt aca aaa tat gga 240Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80acg cgc aat cag tta caa gct gca gtt aac gcc ttg aaa agt aat gga 288Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly85 90 95att caa gtg tat ggc gat gtt gta atg aat cat aaa ggg gga gca gac 336Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110gct acc gaa atg gtt agg gca gtt gaa gta aac ccg aat aat aga aat 384Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn115 120 125caa gaa gtg tcc ggt gaa tat aca att gag gct tgg aca aag ttt gac 432Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp130 135 140ttt cca gga cga ggt aat act cat tca aac ttc aaa tgg aga tgg tat 480Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160cac ttt gat gga gta gat tgg gat cag tca cgt aag ctg aac aat cga 528His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg165 170 175att tat aaa ttt aga ggt gat gga aaa ggg tgg gat tgg gaa gtc gat 576Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190aca gaa aac ggt aac tat gat tac cta atg tat gca gat att gac atg 624Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met195 200 205gat cac cca gag gta gtg aat gag cta aga aat tgg ggt gtt tgg tat 672Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220acg aat aca tta ggc ctt gat ggt ttt aga ata gat gca gta aaa cat 720Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240ata aaa tac agc ttt act cgt gat tgg att aat cat gtt aga agt gca 768Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala245 250 255act ggc aaa aat atg ttt gcg gtt gcg gaa ttt tgg aaa aat gat tta 816Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270ggt gct att gaa aac tat tta aac aaa aca aac tgg aac cat tca gtc 864Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val275 280 285ttt gat gtt ccg ctg cac tat aac ctc tat aat gct tca aaa agc gga 912Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly290 295 300ggg aat tat gat atg agg caa ata ttt aat ggt aca gtc gtg caa aga 960Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg305 310 315 320cat cca atg cat gct gtt aca ttt gtt gat aat cat gat tcg caa cct 1008His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro325 330 335gaa gaa gct tta gag tct ttt gtt gaa gaa tgg ttc aaa cca tta gcg 1056Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350tat gct ttg aca tta aca cgt gaa caa ggc tac cct tct gta ttt tat 1104Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr355 360 365gga gat tat tat ggc att cca acg cat ggt gta cca gcg atg aaa tcg 1152Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser370 375 380aaa att gac ccg att cta gaa gcg cgt caa aag tat gca tat gga aga 1200Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg385 390 395 400caa aat gac tac tta gac cat cat aat atc atc ggt tgg aca cgt gaa 1248Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415ggg aat aca gca cac ccc aac tcc ggt tta gct act atc atg tcc gat 1296Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430ggg gca gga gga aat aag tgg atg ttt gtt ggg cgt aat aaa gct ggt 1344Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly435 440 445caa gtt tgg acc gat atc act gga aat cgt gca ggt act gtt acg att 1392Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile450 455 460aat gct gat gga tgg ggt aat ttt tct gta aat gga gga tca gtt tct 1440Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480att tgg gta aac aaa taa 1458Ile Trp Val Asn Lys485<210>2<211>485<212>PRT<213>芽孢桿菌菌株<400>2His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr1 5 10 15Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser20 25 30Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly85 90 95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp130 135 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met195 200 205Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala245 250 255Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val275 280 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly290 295 300Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg305 310 315 320His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro325 330 335Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser370 375 380Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg385 390 395 400Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly435 440 445Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480Ile Trp Val Asn Lys485<210>3<211>1458<212>DNA<213>芽孢桿菌菌株<220><221>CDS<222>(1)..(1458)<220><221>成熟肽<222>(1)..(1458)<400>3cac cat aat ggt acg aac ggc aca atg atg cag tac ttt gaa tgg tat 48His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr1 5 10 15cta cca aat gac gga aac cat tgg aat aga tta agg tct gat gca agt 96Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser20 25 30aac cta aaa gat aaa ggg atc tca gcg gtt tgg att cct cct gca tgg 144Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45aag ggt gcc tct caa aat gat gtg ggg tat ggt gct tat gat ctg tat 192Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60gat tta gga gaa ttc aat caa aaa gga acc att cgt aca aaa tat gga 240Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80acg cgc aat cag tta caa gct gca gtt aac gcc ttg aaa agt aat gga 288Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly85 90 95att caa gtg tat ggc gat gtt gta atg aat cat aaa ggg gga gca gac 336Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110gct acc gaa atg gtt agg gcg gtt gaa gta aac ccg aat aat aga aat 384Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn115 120 125caa gaa gtg tcc ggt gaa tat aca att gag gct tgg aca aag ttt gac 432Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp130 135 140ttt cct gga cga ggt aat acc cat tca aac ttc aaa tgg aga tgg tat 480Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160cac ttt gat gga gta gat tgg gat cag tca cgt aag ctg aac aat cga 528His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg165 170 175att tat aaa ttt aga ggt gat gga aaa ggg tgg gat tgg gaa gtc gat 576Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190aca gaa aac ggt aac tat gat tac cta atg tat gca gat att gac atg 624Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met
195 200 205gat cac cca gag gta gtg aat gag cta aga aat tgg ggt gtt tgg tat 672Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220acg aat aca tta ggc ctt gat ggt ttt aga ata gat gca gta aaa cat 720Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240ata aaa tac agc ttt act cgt gat tgg atc aat cat gtt aga agt gca 768Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala245 250 255act ggc aaa aat atg ttt gcg gtt gcg gaa ttt tgg aaa aat gat tta 816Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270ggt gct att gaa aac tat tta aac aaa aca aac tgg aac cat tca gtc 864Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val275 280 285ttt gat gtt ccg ctg cac tat aac ctc tat aat gct tca aaa agc gga 912Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly290 295 300ggg aat tat gat atg agg caa ata ttt aat ggt aca gtc gtg caa aga 960Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg305 310 315 320cat cca atg cat gct gtt aca ttt gtt gat aat cat gat tcg caa cct 1008His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro325 330 335gaa gaa gct tta gag tct ttt gtt gaa gaa tgg ttc aaa cca tta gcg 1056Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350tat gct ttg aca tta aca cgt gaa caa ggc tac cct tct gta ttt tat 1104Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr355 360 365gga gat tat tat ggc att cca acg cat ggt gta cca gcg atg aaa tcg 1152Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser370 375 380aaa att gac ccg att cta gaa gcg cgt caa aag tat gca tat gga aga 1200Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg385 390 395 400caa aat gac tac tta gac cat cat aat atc att ggt tgg aca cgt gaa 1248Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415ggg aat aca gca cac ccc aac tct ggt tta gct act atc atg tcc gat 1296Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430gga gca gga gga aat aag tgg atg ttt gtt ggg cgt aat aaa gct ggt 1344Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly435 440 445caa gtt tgg acc gat atc act gga aat cgt gca ggt act gtt acg att 1392Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile450 455 460aat gct gat gga tgg ggt aat ttt tct gta aat gga gga tca gtt tct 1440Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480att tgg gta aac aaa taa 1458Ile Trp Val Asn Lys485<210>4<211>485<212>PRT<213>芽孢桿菌菌株<400>4His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr1 5 10 15Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser20 25 30Asn Leu Lys Asp Lys Gly Ile Ser Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45Lys Gly Ala Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr
50 55 60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Asn Gln Leu Gln Ala Ala Val Asn Ala Leu Lys Ser Asn Gly85 90 95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110Ala Thr Glu Met Val Arg Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn115 120 125Gln Glu Val Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp130 135 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Lys Leu Asn Asn Arg165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Gly Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Thr Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met195 200 205Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220Thr Asn Thr Leu Gly Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Ile Asn His Val Arg Ser Ala245 250 255Thr Gly Lys Asn Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270Gly Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val275 280 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Lys Ser Gly
290 295 300Gly Asn Tyr Asp Met Arg Gln Ile Phe Asn Gly Thr Val Val Gln Arg305 310 315 320His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro325 330 335Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Glu Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Leu Thr Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser370 375 380Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Lys Tyr Ala Tyr Gly Arg385 390 395 400Gln Asn Asp Tyr Leu Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415Gly Asn Thr Ala His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly435 440 445Gln Val Trp Thr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ala Gly Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser465 470 475 480Ile Trp Val Asn Lys485<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220><221>肽<222>(1)..(9)<220><223>人工序列的描述簡并引物區(qū)<400>5Gly Ile Thr Ala Xaa Trp Xaa1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><221>肽<222>(1)..(9)<220><223>人工序列的描述簡并引物區(qū)<400>6Val Tyr Xaa Asp Xaa Val Xaa Asn His1 5<210>7<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述簡并引物區(qū)<220><221>肽<222>(1)..(10)<400>7Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His1 5 10<210>8<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述簡并引物區(qū)<220><221>肽<222>(1)..(10)<400>8Asp Gly Xaa Arg Xaa Asp Ala Xaa Lys His1 5 10<210>9<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述簡并引物區(qū)<220><221>肽<222>(1)..(8)<400>9Val Thr Phe Val Xaa Asn His Asp1 5<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述簡并引物區(qū)<220><221>肽<222>(1)..(6)<400>10Gly Trp Thr Arg Glu Gly1 5<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物188(Pst-)<400>11ggcgttaacc gcagcttgta ac 22<210>12<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物188克隆C<400>12ccgagctcgg ccggctgggc cgtcgactta tttgtttacc caaatagaaa c 51<210>13<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物188克隆N<400>13cattctgcag cagcggcgca ccataatggt acgaacg 37<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物B1<400>14cgattgctga cgctgttatt tgcg24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物Y2<400>15cttgttccct tgtcagaacc aatg 24<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物101458<400>16gtcatagttg ccgaaatctg tatcgacttc 30
權(quán)利要求
1.具有α-淀粉酶活性及一種或多種選自下組的特點或性質(zhì)的分離的多肽(a)一種含有與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸至少具有96％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)一種多肽，編碼該多肽的核酸序列在中等嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(i)SEQ IDNO1或SEQ ID NO3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；(c)(a)或(b)的等位變體；(d)(a)、(b)或(c)的具有α-淀粉酶活性的片段；(e)一種多肽，其具有用Phadebas方法(37℃)測定的在pH 8至9范圍內(nèi)的最適pH值；(f)一種多肽，其具有用Phadebas方法(pH 9.0)測定的在55至65℃范圍內(nèi)的最適溫度；(g)一種具有介于7-8之間的pI的多肽，所述pI通過等電聚焦(Pharmacia，Ampholine，pH 3.5-9.3)測定；和(i)一種在pH 9-11的范圍內(nèi)洗滌和/或洗碗性能得到改進(jìn)的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其含有與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸至少具有96％同源性的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的氨基酸序列或其片段組成。
5.如權(quán)利要求1所述的多肽，其由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成。
6.如權(quán)利要求1所述的多肽，其由在中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與(i)SEQ IDNO1或SEQ ID NO3的核酸序列，(ii)SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交的核酸序列所編碼。
7.如權(quán)利要求1所述的多肽，其由分別含在大腸桿菌DSM12761或大腸桿菌DSM12764的質(zhì)粒pLiH1274或pTVB299中的核酸序列所編碼。
8.一種具有與權(quán)利要求1-7中任一項所述多肽相同的α-淀粉酶活性的多肽。
9.一種含有編碼權(quán)利要求1-8中任一項所述多肽的核酸序列的分離的核酸序列。
10.一種含有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列中至少具有一個突變的核酸序列的分離的核酸序列，其中所述突變的核酸序列編碼一種由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成的多肽。
11.如權(quán)利要求9或10所述的分離的核酸序列，其通過以下步驟生產(chǎn)(a)將一種DNA在中等嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下與(i)SEQ ID NO1的核酸序列，(ii)SEQID NO1的cDNA序列，(iii)(i)或(ii)的至少100個核苷酸的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互補(bǔ)鏈雜交；(b)分離所述核酸序列。
12.一種含有權(quán)利要求9-11中任一項所述核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體。
13.一種含有權(quán)利要求12所述核酸構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞。
14.一種生產(chǎn)突變的核酸序列的方法，包括(a)在SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的成熟多肽編碼序列中引入至少一個突變，其中突變的核酸序列編碼一種由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成的多肽；和(b)回收所述突變的核酸序列。
15.一種由權(quán)利要求14所述方法生產(chǎn)的突變的核酸序列。
16.一種生產(chǎn)多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)一株含有如權(quán)利要求15所述編碼所述多肽的突變核酸序列的菌株以便生產(chǎn)一種含有所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。
17.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-8中任一項所述多肽的方法，其包括(a)培養(yǎng)一株菌株來生產(chǎn)含有所述多肽的上清液；和(b)回收所述多肽。
18.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1-8中任一項所述多肽的方法，其包括(a)在適于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)一株含有核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，所述核酸構(gòu)建體含有編碼所述多肽的核酸序列；和(b)回收所述多肽。
19.一種生產(chǎn)多肽的方法，其包括(a)在益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞含有一種在SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的成熟多肽編碼序列中至少具有一個突變的突變核酸序列，其中突變的核酸序列編碼一種由SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的1至485位氨基酸組成的多肽，和(b)回收所述多肽。
20.一種如權(quán)利要求1-8中任一項所述的具有α-淀粉酶活性的多肽的突變體，其中所述α-淀粉酶在下列位置(相對于SEQ ID NO2)具有一個或多個突變，尤其是置換或刪除1R181*，G182*，D183*，G184*；2N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；3I206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；4E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；5E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；6K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；7R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。21.如權(quán)利要求20所述的突變體，選自具有下列突變的一組變體-R181*/G182*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/R181A，N，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-G182*/T183*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-T183*/G184*/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-R181*/G182*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V-R181*/G182*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-R181*/G182*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-G182*/T183*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-T183*/G184*/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；/V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-N195A，R，D，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-V206A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；E212A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V；-E216A，R，D，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V/K269A，R，D，N，C，E，Q，G，H，I，L，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
22.如權(quán)利要求20或21所述的突變體，進(jìn)一步在位置E216Q含有一個置換。
23.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽或如權(quán)利要求20-22中任一項所述的突變體在洗滌劑組合物，特別是洗衣洗滌劑組合物和洗碗洗滌劑組合物中的用途。
24.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽或如權(quán)利要求20-22中任一項所述的突變體在退漿組合物中的用途。
25.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽或如權(quán)利要求20-22中任一項所述的突變體在淀粉液化中的用途。
26.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的多肽或如權(quán)利要求20-22中任一項所述的突變體在乙醇生產(chǎn)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有α－淀粉酶活性的分離的多肽和編碼該多肽的分離的核酸序列。本發(fā)明還涉及含有所述核酸序列的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和應(yīng)用所述多肽的方法。
文檔編號C12N1/19GK1367824SQ00805948
公開日2002年9月4日 申請日期2000年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月31日
發(fā)明者赫利·奧特拉普, 利斯貝思·H·霍克, 比約恩·R·尼爾森, 托本·V·博徹特, 維比克·S·尼爾森, 亨里克·比斯加德-弗蘭岑, 艾倫·斯文德森, 卡斯滕·安德森 申請人:諾維信公司