一種提高人Vδ2T細(xì)胞擴(kuò)增效率的體外培養(yǎng)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體的,本發(fā)明涉及一種天然免疫細(xì)胞VS2T 的擴(kuò)增培養(yǎng)數(shù)量的提高及方案的優(yōu)化,是應(yīng)用唑來膦酸與細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)人VS2T細(xì)胞 的培養(yǎng)方法,可為該類細(xì)胞更廣泛應(yīng)用于臨床肝癌細(xì)胞治療提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] yST細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一大類,是Brenner于1986年應(yīng)用T細(xì)胞受體的y基 因序列編碼肽段所制備的抗體中首先發(fā)現(xiàn)的。yST細(xì)胞主要分布于皮膚和粘膜組織,而 在健康人外周血中YST細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的1%~5%,其中VS2T細(xì)胞亞群主要占yST 細(xì)胞的50%-90% (經(jīng)常和Vy9配對(duì)形成Vy9VS2T細(xì)胞),VS1T細(xì)胞亞群則占yST 細(xì)胞的10%-50%。該類細(xì)胞具有特異性識(shí)別抗原而無MHC限制性。人們發(fā)現(xiàn)yST細(xì)胞, 特別是其亞群VS2T細(xì)胞的(大多數(shù)是以VY9VS2T細(xì)胞狀態(tài)存在時(shí)),在腫瘤免疫和抗 感染免疫中發(fā)揮了重要作用,成為重要的天然免疫防線。但由于YST細(xì)胞在外周血或組 織中含量不高,要獲得大量高細(xì)胞毒活性的YST細(xì)胞必須進(jìn)行體外的培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0003] 人們發(fā)現(xiàn)磷酸化抗原或小分子可以激活VS2T細(xì)胞亞群,而該亞群在動(dòng)物模型和 多種難治性實(shí)體瘤以及病毒慢性感染疾病中被證明有殺傷腫瘤和抗病毒的作用。由于體外 磷酸化抗原等小分子可以在體內(nèi)外激活YST細(xì)胞特異性殺傷腫瘤細(xì)胞,它們已經(jīng)應(yīng)用到 臨床成為治療腫瘤的一種新方式,免疫治療安全性好并且可以延長腫瘤患者生存期,具有 顯著的療效。
[0004] 雖然有臨床試驗(yàn)證明唑來膦酸聯(lián)合rhIL-2直接輸入癌癥患者體內(nèi)可以提高患者 機(jī)體的免疫力。但是為了達(dá)到該類細(xì)胞治療理想的效靶比和長期有效性,還是有必要在體 外大量擴(kuò)增后,進(jìn)行多次回輸。因此,有必要針對(duì)目前的體外誘導(dǎo)方案進(jìn)行患者自身的外周 血單個(gè)核細(xì)胞的體外擴(kuò)增,并通過聯(lián)合加入rhIL-2提高其擴(kuò)增效率和活性。目前使用的 YSTCR抗體體外刺激yST細(xì)胞擴(kuò)增的研宄中,抗體價(jià)格昂貴,成本高,需要的外周血量 大,初始需要上億個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增才能達(dá)到較好擴(kuò)增效果;IPP的誘導(dǎo)則需 要在不同的時(shí)2-3次加入IPP,成本不高,但是擴(kuò)增數(shù)量較低,擴(kuò)增頻率不高;結(jié)核桿菌耐熱 性抗原體外誘導(dǎo)VS2T細(xì)胞的專利中指出其擴(kuò)增后VS2T細(xì)胞純度平均達(dá)80% ;用唑來 膦酸聯(lián)合IL-2和達(dá)沙替尼的專利中指出改良后VS2T細(xì)胞純度僅平均達(dá)80%,絕對(duì)數(shù)量 平均達(dá)到7X106。總之,雖然VS2T細(xì)胞的體外擴(kuò)增技術(shù)有了較大發(fā)展,但是不同方法中仍 存在成本較高,需要患者血液量大和擴(kuò)增效率有限或者純度不高等缺點(diǎn),制約了該類細(xì)胞 免疫治療的推廣。
[0005] 眾所周知,rhIL-2是維持和擴(kuò)增細(xì)胞的重要細(xì)胞因子。在VS2T細(xì)胞不同的體 外培養(yǎng)方案中,其加入的時(shí)點(diǎn)和量也有所差別。若過早加入rhIL-2則會(huì)使VS2T細(xì)胞以 外的細(xì)胞在早期大量擴(kuò)增,加入過晚或是量不足則影響VS2T細(xì)胞的擴(kuò)增效率和數(shù)量。因 此rhIL-2加入的時(shí)和劑量需要進(jìn)一步摸索和確定。
[0006] 綜上所述,如能在提高VS2T細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量和功能的基礎(chǔ)上,減少患者采血量,降 低成本,克服目前面臨的主要障,將使該類細(xì)胞的免疫治療手段進(jìn)一步推廣,更廣泛地應(yīng)用 于臨床。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有VS2T細(xì)胞體外擴(kuò)增方案中擴(kuò)增效率有限,需血量 大等缺點(diǎn),提供一種高效的體外大量擴(kuò)增外周血VS2T細(xì)胞的方法,克服現(xiàn)有制備VS2T 細(xì)胞數(shù)量不足、擴(kuò)增效率低、成本高的限制。為進(jìn)一步提高VS2T細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤免 疫治療療效提供支持。
[0008] 本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0009] -種提高人VS2T細(xì)胞擴(kuò)增效率的體外培養(yǎng)方法,包括如下步驟:
[0010] (1)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并使用培養(yǎng)基(AMV+10%FBS)制成細(xì)胞懸液,加入唑 來膦酸進(jìn)行體外刺激;
[0011] (2)唑來膦酸刺激一天后,每天加入細(xì)胞因子rhIL-2 ;
[0012] (3)人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)72-96h,培養(yǎng)液微變黃后半量或2/3量更換培養(yǎng) 液;
[0013] (4)96h后,培養(yǎng)液顏色變黃就進(jìn)行半量換液;培養(yǎng)到第11-14天中,當(dāng)擴(kuò)增的VS2 T細(xì)胞頻率和絕對(duì)數(shù)均達(dá)到要求時(shí),收獲細(xì)胞。
[0014] 所述唑來膦酸的使用濃度為3-10uM唑來膦酸加于1ml單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液懸液中, 細(xì)胞濃度為300-500萬/ml。
[0015] 所述細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)天加入唑來膦酸刺激,22-26h后加入rhIL-2,隨后每天加入 rhIL-2〇
[0016] 所述rhIL-2的使用濃度為每ml單個(gè)核細(xì)胞懸液中加入50-200IUrhIL-2。
[0017] 所述細(xì)胞培養(yǎng)72-96小時(shí)之進(jìn)行半量到2/3量更換培養(yǎng)液,并加入對(duì)應(yīng)量的 rhIL-2 ;優(yōu)選每ml細(xì)胞懸液50-200IU。
[0018] 96h后,所述根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)及培養(yǎng)液顏色變化進(jìn)行半量換液,同時(shí)并補(bǔ)加對(duì) 應(yīng)量的rhIL-2 ;優(yōu)選每ml細(xì)胞懸液50-200IU。當(dāng)VS2T細(xì)胞頻率達(dá)到90%以上,絕對(duì)細(xì) 胞數(shù)達(dá)到3億以上時(shí)即可收獲細(xì)胞,一般是在第11-14天完成。
[0019] 在上述發(fā)明方法的基礎(chǔ)上,我們針對(duì)上述的細(xì)胞擴(kuò)增效率和純度進(jìn)行了評(píng)測:
[0020] Vs2T細(xì)胞擴(kuò)增頻率檢測:使用流式的方法,檢測第0、3、6、9、12天時(shí)VS2T細(xì) 胞擴(kuò)增純度;
[0021] VS2T細(xì)胞擴(kuò)增絕對(duì)數(shù)。檢測第0、3、6、9、12天時(shí)VS2T細(xì)胞絕對(duì)數(shù),對(duì)不同天 數(shù)總的活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),乘以對(duì)應(yīng)天數(shù)的VS2T細(xì)胞純度,將上述兩數(shù)相乘即得到VS2T 細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。
[0022] 經(jīng)過技術(shù)改進(jìn),我們發(fā)現(xiàn),發(fā)明方案中唑來膦酸使用濃度為5uM/ml,rhIL-2使用 濃度為l〇〇IU/ml時(shí),在培養(yǎng)的第12天時(shí)VS2T細(xì)胞純度即達(dá)到93%以上,收獲時(shí)總細(xì)胞 均能數(shù)達(dá)到3X108以上。以初始VS2T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為基數(shù),擴(kuò)增效率達(dá)到2300倍。(純度 和絕對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他專利中描述的細(xì)胞平均純度(80% )和絕對(duì)計(jì)數(shù)(7X106)增殖情 況,且培養(yǎng)時(shí)較某些專利研宄中的培養(yǎng)時(shí)(14-20天不等)縮短。
[0023] 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上,我們將該項(xiàng)發(fā)明應(yīng)用在乙肝肝癌患者中進(jìn)行了體外細(xì)胞擴(kuò) 增并進(jìn)行了細(xì)胞特性的檢測:
[0024] 我們檢測了健康人和乙肝肝癌患者擴(kuò)增后VS2T細(xì)胞表面活化分子、凋亡、NK類 似分子、顆粒酶、穿孔素及細(xì)胞因子分泌:于第12天收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞,采用流式細(xì)胞 術(shù)檢測兩組人群擴(kuò)增后,VS2T細(xì)胞表面活化分子:⑶38、⑶69 ;NK類似分子:⑶56、⑶16、 NKG2D、NKG2A;殺傷性顆粒:顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素;細(xì)胞因子IFN-y、TNF-a分泌表達(dá) 情況。以VS2T細(xì)胞⑶38陽性為例,計(jì)算公式為:⑶38+VS2T細(xì)胞表達(dá)(% )=⑶38+VS2 T細(xì)胞/總VS2T細(xì)胞X100% ;
[0025] 總之,本發(fā)明通過應(yīng)用和調(diào)整唑來膦酸和rhIL-2濃度和培養(yǎng)方案在體外誘導(dǎo)人 2T細(xì)胞的擴(kuò)增,得到了誘導(dǎo)效率更高及活性更高的VS2T細(xì)胞。該方法具有如下特 點(diǎn):培養(yǎng)方法簡單,需要外周血量少,誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量多,擴(kuò)增效率極高,重復(fù)性好,經(jīng)體外培 養(yǎng)后得到的細(xì)胞數(shù)量、活性以及功能上都與健康人擴(kuò)增后無差異。有望提高目前VS2T細(xì) 胞免疫治療肝癌療效,具有很好的應(yīng)用潛能。
【附圖說明】
[0026] 圖1:實(shí)施例1中,唑來膦酸和rhIL-2誘導(dǎo)人VS2T細(xì)胞體外擴(kuò)增,不同天數(shù)VS2 T細(xì)胞占總細(xì)胞的頻率。第0、3、6、9、12天使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測VS2T細(xì)胞純度結(jié)果 如圖,第十二天時(shí)即可達(dá)到90%以上。
[0027] 圖2:實(shí)施例1中,唑來膦酸和rhIL-2誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞后,第0、3、6、9、12 天VS2T細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)圖,顯示的是不同培養(yǎng)時(shí)VS2T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析圖。
[0028] 圖3:健康人(10個(gè))和乙肝肝癌患者(10個(gè))同樣按實(shí)施例1方案條件擴(kuò)增后, 第十二天收獲細(xì)胞,進(jìn)行不同的檢測指標(biāo)對(duì)比。包括活化指標(biāo)、NK相關(guān)分子表達(dá)、顆粒酶穿 孔素分泌、干擾素和腫瘤壞死因子分泌。結(jié)果顯示各指標(biāo)均無顯著差異。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明:
[0030] 基本方法如下:
[0031] 1、取10_15ml肝素鈉抗凝外周血標(biāo)本,應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離分離外周血單 個(gè)核細(xì)胞,使用培養(yǎng)基(AMV+10%FBS)制成細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為300-500萬/ml。將細(xì) 胞懸液接種于24孔板中,加入唑來膦酸(每ml細(xì)胞懸液加入3-10uM)進(jìn)行體外刺激,將孔 板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
[0032] 2、以接種天數(shù)為第0天,唑來膦酸刺激22-26小時(shí)后,細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)小團(tuán)的細(xì)胞簇 形態(tài)時(shí),以每ml細(xì)胞懸液50-200IU的濃度加入rhIL-2,此后每天以此濃度加入細(xì)胞因子 rhIL-2 ;
[0033] 3、人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)72_96h小時(shí)后,細(xì)胞出現(xiàn)大量細(xì)胞簇形態(tài),培養(yǎng)液微 變黃后進(jìn)行半量到2/3量更換培養(yǎng)液,并加入對(duì)應(yīng)量的rhIL-2 (每ml細(xì)胞懸液50-200IU rhIL-2);
[0034] 4、96h后,所述根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)及培養(yǎng)液顏色變化(1-2天)進(jìn)行半量換液,同 時(shí)并補(bǔ)加對(duì)應(yīng)量的rhIL-2 (每ml細(xì)胞懸液50-200IU)。培養(yǎng)液顏色變黃就進(jìn)行半量換液。 當(dāng)細(xì)胞的形態(tài)大部分為長條狀,VS2T細(xì)胞頻率達(dá)到93%以上,絕對(duì)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3億以上 時(shí)即可收獲細(xì)胞,一般是第11-14天。
[0035] 本實(shí)驗(yàn)所用外周血均來自天津市第一中心醫(yī)院,本實(shí)驗(yàn)入組了十個(gè)健康人外周血 標(biāo)本和十個(gè)乙肝肝癌患者的外周血標(biāo)本。
[0036] 實(shí)施例1:VS2T細(xì)胞體外刺激擴(kuò)增
[0037] 1.將獲取的15ml肝素鈉抗凝外周血1500rpmlOmin離血漿后,使用等量PBS緩 沖液充分混勻剩余的靜脈血;在15ml離心管中小心加入4ml淋巴細(xì)胞提取液(注意不要 沾到管壁上),再將已經(jīng)混勻的人血稀釋液加入15ml離心管中,每管加入6ml;室溫,600g, 30min,離心(離心機(jī)升