一種提高人Vδ2T細(xì)胞擴(kuò)增效率的體外培養(yǎng)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明涉及一種天然免疫細(xì)胞VS2T 的擴(kuò)增培養(yǎng)數(shù)量的提高及方案的優(yōu)化，是應(yīng)用唑來膦酸與細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)人VS2T細(xì)胞 的培養(yǎng)方法，可為該類細(xì)胞更廣泛應(yīng)用于臨床肝癌細(xì)胞治療提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002] yST細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一大類，是Brenner于1986年應(yīng)用T細(xì)胞受體的y基 因序列編碼肽段所制備的抗體中首先發(fā)現(xiàn)的。yST細(xì)胞主要分布于皮膚和粘膜組織，而 在健康人外周血中YST細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的1%~5%，其中VS2T細(xì)胞亞群主要占yST 細(xì)胞的50%-90% (經(jīng)常和Vy9配對(duì)形成Vy9VS2T細(xì)胞），VS1T細(xì)胞亞群則占yST 細(xì)胞的10%-50%。該類細(xì)胞具有特異性識(shí)別抗原而無MHC限制性。人們發(fā)現(xiàn)yST細(xì)胞， 特別是其亞群VS2T細(xì)胞的（大多數(shù)是以VY9VS2T細(xì)胞狀態(tài)存在時(shí)），在腫瘤免疫和抗 感染免疫中發(fā)揮了重要作用，成為重要的天然免疫防線。但由于YST細(xì)胞在外周血或組 織中含量不高，要獲得大量高細(xì)胞毒活性的YST細(xì)胞必須進(jìn)行體外的培養(yǎng)擴(kuò)增。
[0003] 人們發(fā)現(xiàn)磷酸化抗原或小分子可以激活VS2T細(xì)胞亞群，而該亞群在動(dòng)物模型和 多種難治性實(shí)體瘤以及病毒慢性感染疾病中被證明有殺傷腫瘤和抗病毒的作用。由于體外 磷酸化抗原等小分子可以在體內(nèi)外激活YST細(xì)胞特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，它們已經(jīng)應(yīng)用到 臨床成為治療腫瘤的一種新方式，免疫治療安全性好并且可以延長腫瘤患者生存期，具有 顯著的療效。
[0004] 雖然有臨床試驗(yàn)證明唑來膦酸聯(lián)合rhIL-2直接輸入癌癥患者體內(nèi)可以提高患者 機(jī)體的免疫力。但是為了達(dá)到該類細(xì)胞治療理想的效靶比和長期有效性，還是有必要在體 外大量擴(kuò)增后，進(jìn)行多次回輸。因此，有必要針對(duì)目前的體外誘導(dǎo)方案進(jìn)行患者自身的外周 血單個(gè)核細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并通過聯(lián)合加入rhIL-2提高其擴(kuò)增效率和活性。目前使用的 YSTCR抗體體外刺激yST細(xì)胞擴(kuò)增的研宄中，抗體價(jià)格昂貴，成本高，需要的外周血量 大，初始需要上億個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增才能達(dá)到較好擴(kuò)增效果；IPP的誘導(dǎo)則需 要在不同的時(shí)2-3次加入IPP，成本不高，但是擴(kuò)增數(shù)量較低，擴(kuò)增頻率不高；結(jié)核桿菌耐熱 性抗原體外誘導(dǎo)VS2T細(xì)胞的專利中指出其擴(kuò)增后VS2T細(xì)胞純度平均達(dá)80% ;用唑來 膦酸聯(lián)合IL-2和達(dá)沙替尼的專利中指出改良后VS2T細(xì)胞純度僅平均達(dá)80%，絕對(duì)數(shù)量 平均達(dá)到7X106。總之，雖然VS2T細(xì)胞的體外擴(kuò)增技術(shù)有了較大發(fā)展，但是不同方法中仍 存在成本較高，需要患者血液量大和擴(kuò)增效率有限或者純度不高等缺點(diǎn)，制約了該類細(xì)胞 免疫治療的推廣。
[0005] 眾所周知，rhIL-2是維持和擴(kuò)增細(xì)胞的重要細(xì)胞因子。在VS2T細(xì)胞不同的體 外培養(yǎng)方案中，其加入的時(shí)點(diǎn)和量也有所差別。若過早加入rhIL-2則會(huì)使VS2T細(xì)胞以 外的細(xì)胞在早期大量擴(kuò)增，加入過晚或是量不足則影響VS2T細(xì)胞的擴(kuò)增效率和數(shù)量。因 此rhIL-2加入的時(shí)和劑量需要進(jìn)一步摸索和確定。
[0006] 綜上所述，如能在提高VS2T細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量和功能的基礎(chǔ)上，減少患者采血量，降 低成本，克服目前面臨的主要障，將使該類細(xì)胞的免疫治療手段進(jìn)一步推廣，更廣泛地應(yīng)用 于臨床。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有VS2T細(xì)胞體外擴(kuò)增方案中擴(kuò)增效率有限，需血量 大等缺點(diǎn)，提供一種高效的體外大量擴(kuò)增外周血VS2T細(xì)胞的方法，克服現(xiàn)有制備VS2T 細(xì)胞數(shù)量不足、擴(kuò)增效率低、成本高的限制。為進(jìn)一步提高VS2T細(xì)胞為基礎(chǔ)的抗腫瘤免 疫治療療效提供支持。
[0008] 本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種提高人VS2T細(xì)胞擴(kuò)增效率的體外培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0010] (1)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并使用培養(yǎng)基（AMV+10%FBS)制成細(xì)胞懸液，加入唑 來膦酸進(jìn)行體外刺激；
[0011] (2)唑來膦酸刺激一天后，每天加入細(xì)胞因子rhIL-2 ;
[0012] (3)人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)72-96h，培養(yǎng)液微變黃后半量或2/3量更換培養(yǎng) 液；
[0013] (4)96h后，培養(yǎng)液顏色變黃就進(jìn)行半量換液；培養(yǎng)到第11-14天中，當(dāng)擴(kuò)增的VS2 T細(xì)胞頻率和絕對(duì)數(shù)均達(dá)到要求時(shí)，收獲細(xì)胞。
[0014] 所述唑來膦酸的使用濃度為3-10uM唑來膦酸加于1ml單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液懸液中， 細(xì)胞濃度為300-500萬/ml。
[0015] 所述細(xì)胞培養(yǎng)當(dāng)天加入唑來膦酸刺激，22-26h后加入rhIL-2,隨后每天加入 rhIL-2〇
[0016] 所述rhIL-2的使用濃度為每ml單個(gè)核細(xì)胞懸液中加入50-200IUrhIL-2。
[0017] 所述細(xì)胞培養(yǎng)72-96小時(shí)之進(jìn)行半量到2/3量更換培養(yǎng)液，并加入對(duì)應(yīng)量的 rhIL-2 ;優(yōu)選每ml細(xì)胞懸液50-200IU。
[0018] 96h后，所述根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)及培養(yǎng)液顏色變化進(jìn)行半量換液，同時(shí)并補(bǔ)加對(duì) 應(yīng)量的rhIL-2 ;優(yōu)選每ml細(xì)胞懸液50-200IU。當(dāng)VS2T細(xì)胞頻率達(dá)到90%以上，絕對(duì)細(xì) 胞數(shù)達(dá)到3億以上時(shí)即可收獲細(xì)胞，一般是在第11-14天完成。
[0019] 在上述發(fā)明方法的基礎(chǔ)上，我們針對(duì)上述的細(xì)胞擴(kuò)增效率和純度進(jìn)行了評(píng)測：
[0020] Vs2T細(xì)胞擴(kuò)增頻率檢測：使用流式的方法，檢測第0、3、6、9、12天時(shí)VS2T細(xì) 胞擴(kuò)增純度；
[0021] VS2T細(xì)胞擴(kuò)增絕對(duì)數(shù)。檢測第0、3、6、9、12天時(shí)VS2T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，對(duì)不同天 數(shù)總的活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，乘以對(duì)應(yīng)天數(shù)的VS2T細(xì)胞純度，將上述兩數(shù)相乘即得到VS2T 細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。
[0022] 經(jīng)過技術(shù)改進(jìn)，我們發(fā)現(xiàn)，發(fā)明方案中唑來膦酸使用濃度為5uM/ml，rhIL-2使用 濃度為l〇〇IU/ml時(shí)，在培養(yǎng)的第12天時(shí)VS2T細(xì)胞純度即達(dá)到93%以上，收獲時(shí)總細(xì)胞 均能數(shù)達(dá)到3X108以上。以初始VS2T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)為基數(shù)，擴(kuò)增效率達(dá)到2300倍。（純度 和絕對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他專利中描述的細(xì)胞平均純度（80% )和絕對(duì)計(jì)數(shù)（7X106)增殖情 況，且培養(yǎng)時(shí)較某些專利研宄中的培養(yǎng)時(shí)（14-20天不等）縮短。
[0023] 在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們將該項(xiàng)發(fā)明應(yīng)用在乙肝肝癌患者中進(jìn)行了體外細(xì)胞擴(kuò) 增并進(jìn)行了細(xì)胞特性的檢測：
[0024] 我們檢測了健康人和乙肝肝癌患者擴(kuò)增后VS2T細(xì)胞表面活化分子、凋亡、NK類 似分子、顆粒酶、穿孔素及細(xì)胞因子分泌：于第12天收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞 術(shù)檢測兩組人群擴(kuò)增后，VS2T細(xì)胞表面活化分子：⑶38、⑶69 ;NK類似分子：⑶56、⑶16、 NKG2D、NKG2A;殺傷性顆粒：顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素；細(xì)胞因子IFN-y、TNF-a分泌表達(dá) 情況。以VS2T細(xì)胞⑶38陽性為例，計(jì)算公式為：⑶38+VS2T細(xì)胞表達(dá)（％ )=⑶38+VS2 T細(xì)胞/總VS2T細(xì)胞X100% ;
[0025] 總之，本發(fā)明通過應(yīng)用和調(diào)整唑來膦酸和rhIL-2濃度和培養(yǎng)方案在體外誘導(dǎo)人 2T細(xì)胞的擴(kuò)增，得到了誘導(dǎo)效率更高及活性更高的VS2T細(xì)胞。該方法具有如下特 點(diǎn)：培養(yǎng)方法簡單，需要外周血量少，誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)量多，擴(kuò)增效率極高，重復(fù)性好，經(jīng)體外培 養(yǎng)后得到的細(xì)胞數(shù)量、活性以及功能上都與健康人擴(kuò)增后無差異。有望提高目前VS2T細(xì) 胞免疫治療肝癌療效，具有很好的應(yīng)用潛能。
【附圖說明】
[0026] 圖1:實(shí)施例1中，唑來膦酸和rhIL-2誘導(dǎo)人VS2T細(xì)胞體外擴(kuò)增，不同天數(shù)VS2 T細(xì)胞占總細(xì)胞的頻率。第0、3、6、9、12天使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測VS2T細(xì)胞純度結(jié)果 如圖，第十二天時(shí)即可達(dá)到90%以上。
[0027] 圖2:實(shí)施例1中，唑來膦酸和rhIL-2誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞后，第0、3、6、9、12 天VS2T細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)圖，顯示的是不同培養(yǎng)時(shí)VS2T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析圖。
[0028] 圖3:健康人（10個(gè)）和乙肝肝癌患者（10個(gè)）同樣按實(shí)施例1方案條件擴(kuò)增后， 第十二天收獲細(xì)胞，進(jìn)行不同的檢測指標(biāo)對(duì)比。包括活化指標(biāo)、NK相關(guān)分子表達(dá)、顆粒酶穿 孔素分泌、干擾素和腫瘤壞死因子分泌。結(jié)果顯示各指標(biāo)均無顯著差異。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明：
[0030] 基本方法如下：
[0031] 1、取10_15ml肝素鈉抗凝外周血標(biāo)本，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離分離外周血單 個(gè)核細(xì)胞，使用培養(yǎng)基（AMV+10%FBS)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為300-500萬/ml。將細(xì) 胞懸液接種于24孔板中，加入唑來膦酸（每ml細(xì)胞懸液加入3-10uM)進(jìn)行體外刺激，將孔 板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0032] 2、以接種天數(shù)為第0天，唑來膦酸刺激22-26小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)小團(tuán)的細(xì)胞簇 形態(tài)時(shí)，以每ml細(xì)胞懸液50-200IU的濃度加入rhIL-2,此后每天以此濃度加入細(xì)胞因子 rhIL-2 ；
[0033] 3、人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)72_96h小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)大量細(xì)胞簇形態(tài)，培養(yǎng)液微 變黃后進(jìn)行半量到2/3量更換培養(yǎng)液，并加入對(duì)應(yīng)量的rhIL-2 (每ml細(xì)胞懸液50-200IU rhIL-2)；
[0034] 4、96h后，所述根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)及培養(yǎng)液顏色變化（1-2天）進(jìn)行半量換液，同 時(shí)并補(bǔ)加對(duì)應(yīng)量的rhIL-2 (每ml細(xì)胞懸液50-200IU)。培養(yǎng)液顏色變黃就進(jìn)行半量換液。 當(dāng)細(xì)胞的形態(tài)大部分為長條狀，VS2T細(xì)胞頻率達(dá)到93%以上，絕對(duì)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3億以上 時(shí)即可收獲細(xì)胞，一般是第11-14天。
[0035] 本實(shí)驗(yàn)所用外周血均來自天津市第一中心醫(yī)院，本實(shí)驗(yàn)入組了十個(gè)健康人外周血 標(biāo)本和十個(gè)乙肝肝癌患者的外周血標(biāo)本。
[0036] 實(shí)施例1:VS2T細(xì)胞體外刺激擴(kuò)增
[0037] 1.將獲取的15ml肝素鈉抗凝外周血1500rpmlOmin離血漿后，使用等量PBS緩 沖液充分混勻剩余的靜脈血；在15ml離心管中小心加入4ml淋巴細(xì)胞提取液（注意不要 沾到管壁上），再將已經(jīng)混勻的人血稀釋液加入15ml離心管中，每管加入6ml;室溫，600g， 30min，離心（離心機(jī)升