專利名稱::克隆和/或表達的新載體其制備方法及應用的制作方法
技術領域:
:本發(fā)明涉及在革蘭氏陰性細菌之廣泛宿主中克隆和/或表達的新載體。本發(fā)明還涉及這些載體的應用,特別是這些載體在生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物中或生物轉(zhuǎn)化反應中的應用,以及含有這些載體的宿主細胞。分子生物學的最新進展導致可用于遺傳基因方法之具有廣泛宿主之新載體的開發(fā)。這些載體與那些具有窄范圍宿主特異性的載體(如ColE1)截然不同,特征在于這些載體可在分類學上普遍存在的宿主內(nèi)復制。就可在幾乎所有革蘭氏陰性細菌內(nèi)復制的某些質(zhì)粒來說,這一特性是很明顯的。這樣的質(zhì)粒具有特別適用于大腸桿菌等細菌,以進行必要的構建,然后直接引入所選擇之革蘭氏陰性宿主的特點。這些載體的另一個特點是它們具有由供體細菌向受體細菌接合轉(zhuǎn)移的遷移或被遷移性質(zhì)。這種轉(zhuǎn)移一般可以很高頻率進行(在1-10-2之間),此大大高于已知的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。文獻中描述的在革蘭氏細菌中有廣泛宿主的質(zhì)粒屬于不相容性C、N、P、Q和W組群(incC、incN、incP、incQ和incW)。其中已對不相容性組群P和Q作了充分研究,并已構建了大量的衍生物(Schmidhauseretal.,1988)。這些組群也是幾乎無例外地得到了應用。在這方面,還描述過這些質(zhì)粒在除黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)、Bradyrhizobiumjaponicum和擬桿菌屬(Bacteroides)外之所有革蘭氏陰性細菌中的復制情況(KüesandStahl,1989)。對不相容性W組群質(zhì)粒的使用并不太重要,這一方面是因為它們的優(yōu)點比不相容性P和Q組群質(zhì)粒少,另外是對它們了解尚不多。不相容性P組群分兩個亞群incPα和incPβ,其中研究最多的是質(zhì)粒RK2、RP4(事實上它們是同種質(zhì)粒的兩個不同的分離物)和R751。這些質(zhì)粒具有自動接合特性,即它們都具有接合功能(tra和mob)。此外,它們都是具有低拷貝數(shù)(RK2在大腸桿菌內(nèi)的拷貝數(shù)為4-7)的大質(zhì)粒(RK2有60Kb的尾部)。Kües和Stahl已詳細研究了這些質(zhì)粒的復制情況。另外,已經(jīng)知道復制原點oriV由(ⅰ)8個17pb的片段、(ⅱ)大腸桿菌之DnaA蛋白質(zhì)固定位點周圍的推斷的啟動子和推斷的大腸桿菌之IHF蛋白質(zhì)固定位點、(ⅲ)富含AT的9bp序列及相接的DnaA蛋白質(zhì)固定位點,以及(ⅳ)一個富含GC的區(qū)域組成。與trfA基因相關聯(lián)的復制原點構成與RK2同樣普遍存在的復制子,其中所說的trf基因轉(zhuǎn)譯成由相同相編碼的兩種蛋白質(zhì)A1和A2,且該基因被賦予了不同的密碼子。就這些宿主來說,A2,或者A1與A2兩者對其復制似乎都是必不可少的(Thomas,1986)。這些質(zhì)粒的復制受到Kil和Kor基因所介入的復合調(diào)節(jié)系統(tǒng)的控制。Kor基因(Kil-override)拮抗Kil基因(KilA、KilB、KilC和KilD)的致死性作用,并且對trfA的表達起付調(diào)節(jié)作用。已鑒定出五個Kor基因(KorA、KorB、KorC、KorE和KorF)。鑒于RK2復制子能適應于用來進行復制的宿主,故證實了存在這些基因及trf基因之調(diào)節(jié)網(wǎng)(KüesandStahl,1989)。Schmidhauser和Helinski(1985)也證明當在某些宿主中有較差的分離穩(wěn)定性時,可造成其中某些基因的缺失。因此可見,這些基因?qū)τ谒^察到的RK2或RP4衍生物的好的穩(wěn)定性是不可缺少的。已構建了許多RK2的衍生物作為多宿主載體。這便是那些因離開復制原點(oriV)部位而保留了起始載體之四環(huán)素抗性基因的質(zhì)粒。例如質(zhì)粒PRK290、PRK404、PRK415(Dittaetal.,1980和1985;Keenetal.,1988;Schmidhauseretal.,1988)。其中特別應提到的是質(zhì)粒pRK290(Dittaetal.,1980),該質(zhì)粒在許多革蘭氏陰性菌中顯示出很高的穩(wěn)定性(SchmidhauserandHelinski,1985)。該質(zhì)??煞€(wěn)定地存在于大腸桿菌、固氮菌(Azotobacter)、臭味假單胞菌(PseudomonasPutita)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、球形紅色假單胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)中。然而,在其他革蘭氏陰性菌中該質(zhì)粒仍是不穩(wěn)定的;如在瘤病土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、Acetinobacter、柄桿菌屬(Caulobacter)及銅綠色假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中(SchmidhauseretHelinski,1985)。PRK290有一個20Kb的尾部,這對于一個克隆載體來說是很大的。由RK2開始,通過一系列連續(xù)缺失而得到了該質(zhì)粒。除轉(zhuǎn)移功能(tra基因)、卡那霉素抗性基因及轉(zhuǎn)座子Tnl外,這些缺失除去了KilA和KilC、KilC和KilE功能(SchmidhauseretHelinski,1985)。因此,盡管失去了某些Kil和Kor功能,仍有可能觀察到RK2衍生物的某些穩(wěn)定性。然而,已觀察到單純丟失KilB功能可表現(xiàn)出其在許多革蘭氏陰性菌中之穩(wěn)定性的凈減低,并且還觀察到PRK290比所有被試的有更小尾部的RK2衍生物之穩(wěn)定性都低(SchmidhauseretHelinski,1985)。除了有關在trfA表達調(diào)節(jié)系統(tǒng)中所涉及的不同RK2決定子之各自重要性的研究工作外,還發(fā)現(xiàn)了一個對這些質(zhì)粒之分離穩(wěn)定性可能起決定性作用的片段(Saurugeretal.,1986)。這個位于tra2區(qū)域和卡那霉素抗性基因之間的片段編碼一個分配系統(tǒng)(par)。而且表明該片段可穩(wěn)定大腸桿菌中的PBR322和PACYC177(Saurugeretal.,1986)。至于不相容性組群Q的天然質(zhì)粒,其實例可包括RSF1010、R1162和R300B。這些質(zhì)粒在適當微生物中的拷貝數(shù)可為10至60個。這些質(zhì)粒的尾部小于不相容性P組群質(zhì)粒的尾部;事實上它們的尾部在10Kb以下。復制這些質(zhì)粒需要有一個Cis區(qū)域,其包括兩個亞區(qū)域(ⅰ)由3,5重復序列、40pb富AT、60pb富GC和推斷的大腸桿菌DnaA蛋白質(zhì)固定盒所形成的區(qū)域;以及(ⅱ)另一個有反向重復序列的區(qū)域,該反向重復序列構成了有40-60pb“桿”部分的次級結構。RSF1010復制的起始必需有由下述質(zhì)粒編碼的三種蛋白質(zhì)存在由repA、repB和repC基因編碼的RepA、RepB和RepC。RepC(與重復序列相對應)識別復制原點,并正向調(diào)節(jié)其復制的起始;RepA具有解螺旋酶活性;RepB和RePB*(它們相應于由相同相編碼的而又賦予各蛋白質(zhì)以不同密碼子的兩種蛋白質(zhì))具有體外RSF1010特異性的引物酶(Primase)活性。RSF1010的復制依賴于DNA聚合酶Ⅲ和宿主的促旋酶。RSF1010可借助不相容性IncIα、IncM、IncX,特別是IncP組群的質(zhì)粒的tra功能由一種革蘭氏陰性菌遷移到另一種革蘭氏陰性菌中(DerbyshireetWillets,1987)。迄今尚未描述過有關RSF1010及其衍生物之穩(wěn)定性的任何研究工作。此外,RSF1010的序列已為人們所熟知(ScholzetScherzinger,1989),但用功能性分析和分子分析法均不能鑒定出任何質(zhì)粒穩(wěn)定性的決定子。有各種理由認為不相容性Q組群質(zhì)粒,以及不相容性P組群質(zhì)粒都是不穩(wěn)定的。雖然作了上述工作,但有廣泛宿主的已知質(zhì)粒存在著許多與其性能及工業(yè)規(guī)模上的應用有關的缺點。尤其是對于工業(yè)應用,除不依賴于宿主細菌外,載體質(zhì)粒還應具有某些與開發(fā)限制及生物安全性相對應的性質(zhì)。應用上受到限制實質(zhì)上與質(zhì)粒的分離穩(wěn)定性有關。事實上,非常希望在抗生素工業(yè)應用中不選擇那么易于丟失的質(zhì)粒。基于這一觀點,要求工業(yè)上應用的載體應具有很好的穩(wěn)定性。這種穩(wěn)定性應大到能維持25次連續(xù)傳代,此即代表了達到200M3工業(yè)發(fā)酵罐之生產(chǎn)規(guī)模時仍能保留重組菌株所必須的傳代數(shù)(StanburryetWhitaker,1984)。而且,對于含有可擴增、表達等DNA序列之核苷酸插入段的這些質(zhì)粒的衍生物來說,也應有相近的穩(wěn)定性。另外,生物安全限制性規(guī)定迫使對重組菌株實行許多生物學限制。1987年5月7日NIH“有關重組DNA分子研究準則”中述及的I級(BL1)生物安全系統(tǒng)提出了相應較少的限制。這一大腸桿菌和臭味假單胞菌中的系統(tǒng)必須以利用非接合和非遷移質(zhì)粒為條件。事實上,如果重組微生物在天然介質(zhì)中偶然處于被釋放狀態(tài),則這些質(zhì)粒一定不能被轉(zhuǎn)移到其他生物體內(nèi)(Trevorsetal.,1987)。然而,文獻中描述的寬宿主范圍的質(zhì)粒中,沒有一種能完全滿足這些條件。首先,這些質(zhì)粒從未以普遍存在的方式達到一種良好的分離穩(wěn)定性。事實上,如果其中某些質(zhì)粒在某些宿主內(nèi)是很穩(wěn)定的,卻不能在所有革蘭氏陰性菌中有同樣的穩(wěn)定性。此外,長時間以來一直沒有研究過在將含有例如可擴增或表達之序列的DNA片段插入這些質(zhì)粒后的穩(wěn)定性。這里特別應提到的是質(zhì)粒PRK290,以前從未研究過該質(zhì)粒中插入DNA片段后的穩(wěn)定性特征。再者,現(xiàn)有技術中描述的有寬范圍宿主之質(zhì)粒的其他特性是它們可以遷移或被遷移,以便由供體細菌接合轉(zhuǎn)移到受體細菌中。具有mob座位的PRK290質(zhì)粒同樣是這種情況。為此,這些質(zhì)粒便不適合于對生物安全性的限制,而只能以很高遷移頻率從其他微生物中排除這些帶有特定DNA序列的質(zhì)粒。另外,這些質(zhì)粒中的某些質(zhì)粒因缺乏穩(wěn)定性而導致只能以低效率產(chǎn)生蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物,從而使其在工業(yè)發(fā)酵過程中的應用受到限制。本發(fā)明的一個目的是提供適于在廣泛宿主內(nèi)克隆和/或表達的載體,其特征在于該載體可在幾乎所有革蘭氏陰性菌內(nèi)復制,它具有很高的分離穩(wěn)定性,而且是不能遷移的。本發(fā)明的再一個目的是提供這種載體的所有衍生物。從本發(fā)明的意義來說,該載體的許多衍生物都包括了保留上述特征的載體,盡管可在其相對重要的區(qū)域內(nèi)有某些改變或修飾(缺失、突變、插入等)。本發(fā)明的載體衍生出在革蘭氏陰性菌中有廣泛宿主的不相容性P組群的質(zhì)粒。具體地說,它們具有由屬于不相容性P組群之質(zhì)粒衍生的復制原點。更有利的是它們可衍生RK2質(zhì)粒。它們結合了對載體來說從未描述過的特性,即它們在革蘭氏陰性菌中有廣泛宿主、具有高穩(wěn)定性,以及不存在遷移功能。本發(fā)明載體的高穩(wěn)定性是由于具有穩(wěn)定性特性之特定核苷酸序列的摻入。特別是可使用得自然RP4質(zhì)粒的特定片段。Saurugger等人(1986)描述了稱為par片段的已克隆之片段,并述及它們在大腸桿菌內(nèi)穩(wěn)定某些質(zhì)粒的能力。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn),插入par片段可大大提高穩(wěn)定性,而且這種增加與所選擇的宿主生物體、性質(zhì)(基因、啟動子等)或核苷酸插入段的尾部無關。事實上,本發(fā)明的載體及其衍生物的分離穩(wěn)定性比可用作克隆載體的RK2衍生物的穩(wěn)定性更高,而且在所有已試驗的革蘭氏陰性菌中都是這樣。遷移功能的丟失是本發(fā)明載體的第二個特征。因此,與如PRK290這樣的質(zhì)粒相反,本發(fā)明的載體不能從一種革蘭氏陰性菌向另一種遷移。這樣它們便與這些細菌形成I類宿主-載體對,使之符合工業(yè)生產(chǎn)規(guī)則。特別是因缺失含mob座位的區(qū)域所得到的本發(fā)明載體更具有這種有利的特性。本發(fā)明載體的第三個特性是其能夠在大多數(shù)革蘭氏陰性菌中復制。這一特性是特別有利的,因為在將載體引入所選擇的革蘭氏陰性宿主之前,這種特性尤其能在完成構建所需的大腸桿菌內(nèi)發(fā)揮作用。同樣還可根據(jù)所要求的載體應用(擴增、表達等)或其核苷酸插入段之尾部等性質(zhì),以及適當宿主來選擇之。在一特定的實施方式中,本發(fā)明的載體具有多個克隆位點及許多獨特的克隆位點,這樣將大大有利于整合期望擴增或表達的核苷酸插入段。在另一實施方式中,本發(fā)明的載體含有選擇標志,如抗生素抗性基因。更可取的是它們含有RK2的四環(huán)素抗性基因。該抗性基因能用于選擇存在于幾乎所有革蘭氏陰性菌中的質(zhì)粒??蓪⑵渌剐曰虿迦氡景l(fā)明所述的載體及其衍生物上。本發(fā)明的一個特定目的是提供在革蘭氏陰性菌中有寬范圍宿主的克隆和/或表達載體,其特征在于它衍生于RK2質(zhì)粒、其尾部小于20Kb、含有一個攜帶RP4質(zhì)粒之par區(qū)域的DNA片段、不含mob座位,并可含有多個克隆位點及選擇標志。本發(fā)明的載體可用于擴增或表達給定的DNA序列。因此,本發(fā)明的一個目的是涉及前面限定之含重組DNA片段的載體。更具體地說,依賴于遺傳表達之調(diào)節(jié)序列的重組DNA含有一個或多個編碼一種或多種給定之多肽的結構基因。根據(jù)本發(fā)明,結構基因總是依賴于它們所特有的調(diào)節(jié)信號或不同的調(diào)節(jié)信號。在一優(yōu)選實施方案中,其遺傳表達的調(diào)節(jié)序列是由選自啟動子、決定子、信號肽和核蛋白體固定位點的一個或多個元件組成的。編碼多肽的結構基因可選自于編碼酶、激素或生長因子的基因。最好是選自編碼白蛋白、tPA、TIMP、白細胞介素、脫輔基脂蛋白及干擾素的結構基因。在本發(fā)明的一個特定實施方式中,一個或多個結構基因是在代謝產(chǎn)物的生物合成中,在遺傳或生物化學水平上起作用的基因,也就是說它們是為生物合成代謝產(chǎn)物之方法中所涉及的多肽編碼的基因。具體地說,代謝產(chǎn)物可以是維生素、氨基酸、抗生素或其他任何細菌代謝產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物最好選自于維生素B12、生物素、核黃素、賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、青霉素或四環(huán)素。在一更可取的實施方式中,本發(fā)明的載體含有位于允許表達的信號,可能還有允許分泌所需蛋白質(zhì)的信號之前的,編碼給定之蛋白質(zhì)的結構基因。本發(fā)明的另一個目的涉及生產(chǎn)蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物的方法,其特征在于-在革蘭氏陰性菌內(nèi)引入一個如上文中限定的載體,該載體含有編碼所述蛋白質(zhì)的結構基因,或在遺傳或生物化學水平上參予生物合成上述代謝產(chǎn)物的一個或多個基因。-在適于表達所說之基因的條件下培養(yǎng)該細菌;以及-回收所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物??稍诠I(yè)規(guī)模上在幾乎所有革蘭氏陰性菌中利用本發(fā)明所描述的載體。對于質(zhì)粒PXL1635來說,可在能復制質(zhì)粒RK2的幾乎所有革蘭氏陰性菌,即除黃色粘球菌、Bradyrhizobiumjapanium、擬桿菌屬細菌以外的所有革蘭氏陰性菌中使用該質(zhì)粒(KüesetStahl,1989)??砂聪铝蟹绞嚼眠@些質(zhì)粒如可在多克隆位點處克隆攜帶一個或多個將被擴增之基因的一個或多個DNA片段,然后將如此構建的質(zhì)粒引入期望在工業(yè)上使用的細菌中。如可使用電穿孔轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來引入已構建好的質(zhì)粒(Wirthetal.,1986)??苫谟少|(zhì)粒提供的抗性來選擇重組克隆。然后按照工業(yè)上應用的傳統(tǒng)保存技術保存這些克隆(StandburryetWhitaker,1984)。本發(fā)明的再一個目的是涉及含有本發(fā)明載體的革蘭氏陰性細菌及其應用。這樣的細胞特別適用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物,或直接用于生物轉(zhuǎn)化反應中。本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點可體現(xiàn)于下述實施例中,這些實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明??寺?、分子生物學及生物化學的一般技術用于本發(fā)明的傳統(tǒng)分子生物學方法,如在氯化銫-溴乙錠梯度下離心質(zhì)粒DNA、用限制酶消化、凝膠過濾、由瓊脂糖凝膠中電洗脫DNA片段、向大腸桿菌內(nèi)轉(zhuǎn)化及核苷酸沉淀等均如文獻所述(Maniatisetal.,1982;Ausubeletal.,1987)。按已提出的程序經(jīng)鏈終止法測定核苷酸序列(Ausubeletal.,1987)。所用限制酶由New-EnglandBiolabs(Biolabs)公司、BethesdaReseachLaboratories(BRL)公司或Amersham公司(Amersham)提供。為了進行連接,用0.7%瓊脂糖凝膠或8%丙烯酰胺根據(jù)其尾部分離DNA片段,經(jīng)電洗脫純化、用苯酚提取、在乙醇中沉淀,然后在T4噬菌體的DNA連接酶(Biolabs)存在下,于含50mMTris-HCl(PH7.4)、10mMMgCl2、10mMDTT、2mMATP的緩沖液中保溫。必要時可在緩沖液(10mM甘氨酸、1mMMgCl2、1mMZnCl2,PH10.5)中于37℃下用牛小腸堿性磷酸酶(ClP,Pharmacia)處理30分鐘,使帶有突出之5′末端的DNA片段脫磷酸化??捎猛瑯蛹夹g使突出的或跨越的3′末端脫磷酸化,但不同的是于37℃處理15分鐘,再于56℃處理15分鐘。于1%SDS和100mMNaCl存在下,65℃下加熱該反應混合物以使酶失活,然后用苯酚提取并用乙醇沉淀。用大腸桿菌之DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)填充突出的5′末端,該反應于室溫下在50mMTris-HCl(PH7.2)、0.4mMdNTPs、10mMMgSO4、0.1mMDTT、50μg/mlBSA緩沖液中進行30分鐘。可按照制造商推薦的方法,在T4噬菌體的DNA聚合酶存在下,填充和/或消化突出的3′末端。用Biosearch8600型自動DNA合成儀,按制造商推薦的程序以氰乙基基團呈β型保護的氨基磷酸酯(phosphoramidites)化學(Simaetal.,1984;Giles,1985)方法合成寡核苷酸。按照Taylor等人(1985)建立的方法,用Amersham公司(France,SA)提供的試劑盒對寡核苷酸進行體外誘變。按照制造商推薦的程序使用Promega公司(Madison,WI,USA)的Erase-BaseTMSystem試劑盒,借助核酸外切酶Ⅲ和核酸酶S1以Henikoff(1984)的技術造成序列缺失。用已連接的DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株對于質(zhì)粒為大腸桿菌MC1060〔△(lacIOPZYA)φX74,galU,galK,StrAr,hsdR〕(Casadabanetal.,1983)和HB101〔hsdS20,supE44,recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,λ-〕(Maniatisetal.,1982),或?qū)τ谑删wM13之復制形式的衍生物則為大腸桿菌TG1〔△(lacproA,B),supE,thi,hsdD5/F′traD36,proA+,B+,lacIq,lacZ△M15〕(Gibson,1984)。所用polA菌株是具有萘啶酮酸抗性(Nalr)的SF800菌株(Stacheletal.,1985)。當大腸桿菌與大腸桿菌接合時,利用C600菌株〔thi-1,thr1,leu-B6,lacY1,tonAL1,supE44,λ-〕(Maniatisetal.,1982)自發(fā)利福平抗性克隆(C600Rifr)(50μg/ml)作為受體菌株。按照Birnboim和Doly(1979)的技術純化質(zhì)粒DNA。按照Klein等人(1980)的方法小量制備質(zhì)粒DNA。有關細菌部分的實驗使用LB培養(yǎng)基(Maniatisetal.,1982)。在LB培養(yǎng)基中和30℃保溫溫度下培養(yǎng)脫氮假單胞菌SC510Rifr、瘤病土壤桿菌C58C9(Cameronetal.,1989)、臭味假單胞菌KT2440(Bagdasarianetal.,1981)和苜蓿根瘤菌102F34(Leongetal.,1982)。按已述方法(Dittaetal.,1980)進行接合。將參予接合之各細菌的109個細胞經(jīng)過濾吸附到0.45μm微孔濾膜上。在LB培養(yǎng)基上37℃保溫該濾膜后將細胞懸浮在1ml的10mMMgSO4中。然后再將細胞懸浮液的稀釋液涂布在添加了適當抗生素的LB培養(yǎng)基上。實施例1質(zhì)粒pXL1635的構建本實施例舉例說明如何構建不能遷移的、具有高度分離穩(wěn)定性的多宿主載體。實施例1.1得到丟失mob座位之pRK290的衍生物本實施例舉例說明如何使RK2的衍生物上缺失RK2的mob座位。鑒于不清楚在靠近mob座位處有何獨特的限制性位點,因而給缺失該座位帶來困難。在這種情況下,如果使用已描述過的核酸外切酶Bal31,則將有可能進行體外缺失(Maniatisetal.,1982)。為了進行上述缺失,須在RK2的mob座位引入一個獨特的限制性位點。為此,我們按照Taylor等人(1985)的技術,分下述三個步驟在一小片段上進行定位誘變首先將含有轉(zhuǎn)移原點(oriT)的RK2的片段再克隆到噬菌體M13的噬菌體衍生物中,進行定位誘變以便引入一個獨特的限制性位點;其次將如此突變的片段再克隆到質(zhì)粒PUC13(VieraetMessing,1982)上,然后將攜帶卡那霉素抗性基因的暗盒克隆到存在于轉(zhuǎn)移原點內(nèi)的限制性位點上;第三,經(jīng)雙重重組將突變的片段與由pRK290攜帶的野生片段交換。所產(chǎn)生的質(zhì)粒即是在轉(zhuǎn)移原點水平上具有獨特限制性位點的pRK290衍生物。這樣便有可能通過核酸外切酶,然后是DNA連接酶的作用經(jīng)誘變完成缺失目的。有關構建細節(jié)如下文所述。將足以以cis得以遷移的RK2之760pbHeaⅡ片段(GuineyetYakobson,1982)克隆到M13mp10(VieraetMessing,1982)中。該片段含有RK2的轉(zhuǎn)移原點(GuineyetYakobson,1983),并且當其克隆到質(zhì)粒上時,可由RK2的tra功能提供以trans遷移的轉(zhuǎn)移原點。由對RK2的HaeⅡ消化開始純化該片段,并用T4噬菌體的DNA聚合酶消化末端。另外,經(jīng)pstⅠ和SstⅠ消化使可復制形式的噬菌體M13mp10線性化;并用T4噬菌體的DNA聚合酶消化其末端。連接如此制得的復制形式并已純化的片段,然后用以轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1的細胞。按已述方法(VieraetMessing,1982)檢測這些重組噬菌體。將所得到的復制形式定名為PXL1418(參見圖1)。也已公開了含有RK2轉(zhuǎn)移原點的112pb之HpaⅡ片段的序列(GuineyetYakobson,1983)。該片段包含于PXL1418之760pbHaeⅡ片段中。已觀察到它存在一個反向重復序列,且各重復序列均可形成有19pb的發(fā)夾結構(參見圖2)。按照Taylor等人(1985)建立的方法,對由這一復制形式開始制得的一小的噬菌體DNA進行定位誘變。所用的寡核苷酸具有下示序列5′-CCCGTTGAGCTCCGCCAGGTGC-3′。圖2中列出了112pb之HpaⅡ片段及寡核苷酸的序列;如該圖所示,寡核苷酸序列與該片段的序列只有一個核苷酸不同;經(jīng)這一突變而引入了SstⅠ位點。首先證實寡核苷酸與用復制形式之PXL1418感染大腸桿菌TG1所得到的單一小DNA片段完全互補。為此可使用所研究的寡核苷酸作為核苷酸序列的起始部分。已清楚地觀察到所發(fā)生的序列反應。已顯示出該核苷酸序列,并且前面的堿基相當于圖2中上一列的右側(cè)端序列。按已述方法進行上述誘變。得到一個在所期望的位置上引入了適當SstⅠ位點的突變克隆。將其中一個復制形式的突變克隆定名為PXL1454(參見圖1)。下述步驟旨在將含有抗生素抗性基因的暗盒引入SstⅠ位點,以使其中存在供選擇的標志。為此,用SstⅠ處理PXL1461使之線性化,然后與從PUC4KIXX(PharmaciaFrance,SA)純化的SstⅠ片段連接。該1.6Kb片段攜帶來自Tn5轉(zhuǎn)座子的卡那霉素抗性基因。在添加氨芐青霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化之后,選擇重組體克隆。將如此得到的質(zhì)粒定名為PXL1462(參見圖1)。將質(zhì)粒PRK290轉(zhuǎn)化到大腸桿菌polA,SF800菌株(Stacheletal.,1985)中。由RK2衍生的質(zhì)粒可在該菌株中復制,因為它們的復制并不依賴于大腸桿菌的DNA聚合酶;而PUC13則不能被復制。然后將PXL1462轉(zhuǎn)化到菌株SF800/PRK290中。轉(zhuǎn)化后,將細菌鋪敷在添加了四環(huán)素、卡那霉素和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。因為質(zhì)粒PXL1462不能在該菌株中復制,所以要使該質(zhì)粒具有這一抗性,只有在兩質(zhì)粒之間進行同源重組。事實上,這兩種質(zhì)粒共同具有攜帶轉(zhuǎn)移原點的760pbHaeⅡ片段。這樣,在兩質(zhì)粒的同源區(qū)域間進行同源重組,便可導致兩復制子之間的融合。用限制性酶切法分析三種抗生素抗性克隆的質(zhì)粒DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠分析表明其只含有單一的質(zhì)粒。經(jīng)限制性酶切分析,表明就轉(zhuǎn)移原點水平來說,PXL1462與質(zhì)粒PRK290重組很好。由兩復制子融合所得到的質(zhì)粒具有兩個RK2的轉(zhuǎn)移原點一個是野生型的,一個則具有經(jīng)誘變而引入的SstⅠ位點,以用于克隆攜帶卡那霉素抗性基因的暗盒(見圖3)。然后在添加四環(huán)素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,用稀釋的培養(yǎng)物培養(yǎng)含有這類質(zhì)粒的克隆。因切除攜帶轉(zhuǎn)移原點之760pb片段之野生拷貝的PUC13會發(fā)生簡單重組,從而可在沒有芐芐青霉素情況下選擇之。既然PUC13及其衍生質(zhì)粒未被復制,已切除的質(zhì)粒會立即丟失。在可以選擇PRK290和突變之復制原點標志的液體培養(yǎng)基中,經(jīng)代表60次傳代的一系列稀釋培養(yǎng)后,將細菌涂布在添加同樣抗生素的LB培養(yǎng)基上。將2000個菌落接種到相同培養(yǎng)基和添加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上。得到2個對氨芐青霉素敏感的克隆。純化由這些克隆攜帶的質(zhì)粒,進行限制性酶切分析。分析結果表明,這些質(zhì)粒完全符合于切除了RK2轉(zhuǎn)移原點之野生拷貝及PUC13的質(zhì)粒。該質(zhì)粒被定名為PXL1561(見圖3)。既然該質(zhì)粒具有兩個與轉(zhuǎn)移原點相應的HindⅢ位點,那么就有可能在經(jīng)HindⅢ消化后再用核酸外切酶切割以實現(xiàn)缺失(見圖3)。為此,先用HindⅢ消化pXL1561,再用Henikoff(1984)的技術進行一系列缺失;該技術中利用了核酸外切酶和核酸酶S1的連續(xù)作用;所得到的缺失是雙向的。然后連接這些缺失,并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化MC1060。用限制性酶切法分析如此得到之轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA。結果表明許多克隆經(jīng)受了與mob座位相應的缺失。我們得到了缺失3.5Kb的質(zhì)粒。如果核酸外切酶相對于HindⅢ位點以兩個方向相同的動力學消化質(zhì)粒DNA,則該缺失應有相對于質(zhì)粒轉(zhuǎn)移原點為1.75Kb的缺失。將如此得到的質(zhì)粒定名為PXL1570(見圖3)。PXL1570具有獨特的限制性位點EcoRⅠ和BglⅡ。我們試圖在EcoRⅠ位點處引入克隆的多位點,以便使所得質(zhì)粒包含多個克隆位點。使用具有以兩個EcoRⅠ位點為邊界之多克隆位點的質(zhì)粒PFR10(Shapiraetal.,1983)作為多克隆位點的來源。同PXL1570一樣,用EcoRⅠ消化PFR10。連接兩消化產(chǎn)物,并將連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MC1060中。將所得到的已確定了多位點取向的重組克隆定名為PXL1594(參見圖4)。實施例1.2構建具有RK2之par座位的不可遷移的PRK290衍生物本實施例舉例說明如何將具有RP4之par座位的片段克隆到RK2衍生物上,以得到分離穩(wěn)定的質(zhì)粒。將含RP4之par座位的PGMA28(Gerlitzetal.,1988)的2.2KbBamHⅠ片段純化后,與用BglⅡ線性化的PXL1594相連接。用該連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1060。經(jīng)限制性消化分析24個轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA,以及3個攜帶2.2Kb片段的克隆。其中兩個具有相同定向的片段,第3個則相當于相反定向。與前兩個克隆相應的質(zhì)粒命名為PXL1635,而有另一取向之片段者則定名為PXL1634(圖4)。如此得到的質(zhì)粒是RK2,更準確地說是PRK290的衍生物,它缺失轉(zhuǎn)移原點周圍的3.5Kb,整合了RP4的par區(qū)域,且還可以具有克隆的多位點。對于對稱性克隆可依次利用下列位點EcoRⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、HindⅢ、ClaⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ和SstⅠ;對于非對稱性克隆應排除EcoRⅠ,但可使用其他的酶。實施例2PXL1635的遷移已研究過PXL1635的遷移。這種遷移是基于從大腸桿菌到大腸桿菌的接合轉(zhuǎn)移而達到的。按照Ditta等人已述及的技術,利用下列菌株進行三對間的轉(zhuǎn)移-攜帶遷移質(zhì)粒的菌株HB101(PXL1635)或HB101(PRK290)或HB101(PXL1570)或HB101(PUC9tet)。-含有RK2衍生物遷移所需之“輔助”質(zhì)粒的菌株。-受體菌株C600Rifr。質(zhì)粒PUC9tet得自PharmaciaFranceS.A.;其為不能遷移的、PBR322衍生的質(zhì)粒,并被賦予與PRK290、PXL1635和PXL1570相同的抗性。在添加四環(huán)素和利福平的LB培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)移接合體。按常規(guī)方法(Dittaetal.,1980),根據(jù)有效地獲得質(zhì)??剐灾荏w細胞數(shù)對受體細胞總數(shù)之比計算接合的頻率。用HB101作供體菌株進行接合。這涉及到recA菌株,它可避免了因具有同源序列而在PRK2013與PXL1570、PRK290、PXL1635和PUC9tet之間發(fā)生同源重組的可能性。表RK2的衍生物由大腸桿菌HB101向C600Rifr接合的頻率。試驗細節(jié)如正文所述。一無供體質(zhì)粒。實施例3將PXL1635引入大腸桿菌以外的革蘭氏陰性菌中本實施例舉例說明如何將質(zhì)粒PXL1635(非遷移性的)引入各種革蘭氏陰性菌中。既然質(zhì)粒PXL1635不具有轉(zhuǎn)移原點,便不可能由大腸桿菌向其他革蘭氏陰性菌中遷移。為將PXL1635引入各種革蘭氏陰性細菌中,可使用經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化的方法(Wirthetal.,1989)。借助這一方法用質(zhì)粒PRK290、PXL1570和PXL1635轉(zhuǎn)化下列細菌-脫氮假單胞菌SC510Rifr-瘤病土壤桿菌C58C9-臭味假單胞菌KT2440-苜蓿根瘤菌102F34對每種細菌均再次分離重組克隆;純化質(zhì)粒DNA表明與經(jīng)過許多限制性消化的起始質(zhì)粒沒有差異。據(jù)此可將質(zhì)粒PXL1635引入革蘭氏陰性細菌中。實施例4PXL1635的穩(wěn)定性本實施例舉例說明在革蘭氏陰性菌中為什么PXL1635比PRK290更穩(wěn)定。不同的重組體細菌及其親代菌株均培養(yǎng)于添加抗生素的LB培養(yǎng)基中。達到生長穩(wěn)定期時進行1/1000稀釋。如此培養(yǎng)這些菌株達到平均50代(傳代數(shù)估計為50代,包括在40-60代之間),然后將培養(yǎng)物稀釋液分散到LB瓊脂培養(yǎng)基上。對每份培養(yǎng)物,取200個獨立的克隆轉(zhuǎn)移到對質(zhì)粒有選擇性的培養(yǎng)基上。計算失去抗性,因而也就是失去了質(zhì)粒之克隆的頻率。所得數(shù)值列于下表中。表各種革蘭氏陰性細菌中PRK290、PXL1570和PXL1635的丟失頻率這些數(shù)值相應于在非選擇性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)50代后,丟失質(zhì)??剐灾寺〉念l率(%)。由此表可以清楚地看出,PXL1635比PRK290和PXL1570穩(wěn)定得多;這種特性對于所研究的所有細菌都是符合事實的。攜帶后兩種質(zhì)粒的克隆均以同樣的頻率丟失質(zhì)粒;從統(tǒng)計學上看所觀察到的差異性并不顯著。可見缺失3.5Kb并不影響PRK290的復制特性和穩(wěn)定性。相反,克隆PGMA28的2.2Kb片段對于引起穩(wěn)定性的增加卻是極為重要的。這些結果清楚地表明,從穩(wěn)定性角度看,質(zhì)粒PXL1635是一種比PRK290更為有利的質(zhì)粒。其他的RK2衍生物同樣保留了這些優(yōu)點。對于工業(yè)應用來說,按照已公開的材料,RK2之其他衍生物的優(yōu)點要比PRK290少。圖1PXL1418、PXL1454、PXL1461和PXL1462的構建。有關構建細節(jié)如正文所述。圖2含有RK2之轉(zhuǎn)移原點的110bpHpaⅡ片段的序列(據(jù)GuineyetYakobson,1983)。標出了用于誘變之寡核苷酸的序列及所引入的SstⅠ位點。用箭頭著重標示了兩個應形成發(fā)夾結構的反向重復序列。圖3PXL1561和PXL1570的構建。構建的細節(jié)如正文所述。圖4PXL1594、PXL1635和PXL1634的構建。所用術語的定義與縮寫重組DNA技術組合,它們或者在同一微生物中使微生物固有的DNA序列相結合,或者對特定DNA片段進行誘變。ATP腺苜-5′三磷酸BSA牛血清白蛋白CodonStop轉(zhuǎn)導終止密碼子dNTP2′-脫氧核苜5′-三磷酸DTT二硫蘇糖醇Kb千堿基pb堿基對參考文獻RéférencesbibliographiquesAusubelF.M.,R.Brent,R.E.Kinston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.SeidmanandK.Struhl.1987.Currentprotocolsinmolecularbiology1987-1988.JohnWilleyandSons,NewYork.Bagdasarian,J.Frey,andK.Timmis.1981.Specific-purposeplasmidcloningvectors.Ⅱ.Broadhostrange,highcopynumber,RSF1010-derivedvectors,andahostvectorsystemforgenecloninginPseudomonas.Gene16,237-247.CameronB,K.Briggs,S.Pridmore,G.BrefortandJ.Crouzet,1989.CloningandanalysisofgenesinvolvedincoenzymeB12biosynthesisinPseudomonasdenitrificans.J.Bacteriol,171,547-557.Casadaban,M.J.,A.Martinez-Arias,S.T.ShapiraandJ.Chou.1983.β-galactosidasegenefusionforanalysinggeneexpressioninEscherichiacoliandYeast.MethodsEnzymol.100,293-308.Derbyshire,K.M.andN.S.Willets.1987.MobilizationofthenonconjugativeplasmidRSF1010ageneticanalysisofitsoriginoftransfer.Mol.Gen.Genet.,206,154-160.DittaG.,SchmidhauserT.,YakobsonE.,LuP.,LiangX.-W.,F(xiàn)inlayD.R.,GuineyD.,HelinskiD.R.,1985.PlasmidsrelatedtothebroadhostrangevectorpRK290,usefulforgenecloningandformonitoringgeneexpression.Plasmid,13,149-154.DittaG.,StanfieldS.,CorbinD.,HelinskiD.R.,1980.BroadhostrangeDNAcloningsystemforGram-negativebacteriaConstructionofagenebankofRhizobiummelitoti.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77,7347-7351.Gerlitz,M.,O.HrabakandH.Schwab.Abstract8thInternationalBiothechnologySymposium,1988,A156,p.129.Giles,J.W.1985.AdancesinautomatedDNAsynthesis.Am.Biotechnol.,Nov./Dec.GuidelinesforresearchinvolvingrecombinantDNAmolecules;Notice.NationalInstituteofHealth,F(xiàn)ederalRegister,Vol.51,No.88,16958-16965.Guiney,D.G.andE.Yakobson.1983.LocationandnucleotidesequenceofthetransferoriginofthebroadhostrangeplasmidRK2.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,3595-3598.HenikoffS.1984.UnidirectionaldigestionwithexonucleaseⅢcreatestargetedbreakpointsforDNAsequencing.Gene,28,351-359.Keen,N.T.,S.Tamaki,D.KobayashiandD.Trollinger.1988.ImprovedbroadhostrangeplasmidsforDNAcloningingram-negativebacteria.Gene,70,191-197.Kües,U.andU.Stahl.1989.Replicationofplasmidingram-negativebacteria.Mic.Rev.,53,491-516.Leong,L.S.,G.S.Ditta,andD.R.Helinski.1982.Identificationofaclonedgenecodingforδ-aminolevulinicacidsynthetasefromRhizobiummelitoti.J.Biol.Chem.257,8724-8730.Maniatis,T.,E.F.Fritsch,andJ.Sambrook.1982.Molecularcloningalaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork.Saurugger,P.N.,O.Hrabak,H.SchwabandR.M.Lafferty.1986.Mappingandcloningofthepar-regionofbroad-host-rangeplasmidRP4.J.Biotechnol.,4,333-343.Schmidhauser,T.J.andD.R.Helinski.1985.Regionsofbroad-host-rangeplasmidRK2involvedinreplicationandstablemaintenanceinninespeciesofgram-negativebacteria.J.Bacteriol.,164,446-455.Schmidhauser,T.J.,G.DittaandD.R.Helinski.1988.Broad-Host-Rangeplasmidcloningvectorsforgram-negativebacteria.InR.L.RodriguerandD.T.Denhardt(ed.),Vectors,asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,Butterworths,Boston.Scholz,P.,V.Haring,B.Wittman-Liebholt,K.Ashman,M.BagdasarianandE.Scherzinger.1989.Completenucleotidesequenceandgeneorganizationofthebroad-host-rangeplasmidRSF1010.Gene,75,271-288.ShapiraS.K.,J.Chou,F(xiàn).V.Richaud,andM.C.Casadaban.1983.NewversatileplasmidvectorforexpresssionofhybridproteinscodedbyaclonedgenefusedtolacZgenesequencesencodingenzymaticallyactivecarboxy-terminalportionofβ-galactosidase.Gene25,71-83.Sinha,N.D.,J.Biernat,J.McManusandH.Koester.1984.Polymersupportoligonucleotidesynthesis,ⅩⅤⅢUseofβ-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramiditeofdeoxynucleosidesforthesynthesisofDNAfragmentssimplifyingdeprotectionandisolationofthefinalproduct.Nucl.AcidsRes.,12,4539-4557.StachelS.E.,G.An,C.FloresandE.W.Nester.1985.ATn3lacZtransposonfortherandomgenerationofβ-galactosidasegenefusionsapplicationtotheanalysisofgeneexpressioninAgrobacterium.EmboJ.,4,891-898.Stanburry,P.F.andA.Whitaker.1984.Principlesoffermentationtechnology.PergamonPress,Oxford.TaylorJ.W.,J.OttandF.Eckstein.1985.Therapidgenerationofoligonucleotide-directedmutationsathighfrequencyusingphophorothioate-modifiedDNA.Nucl.AcidRes.,13,8764-8765.ThomasC.M.1986.EvidencefortheinvolvementoftheincClocusofbroadhostrangeplasmidRK2inplasmidmaintenance.Plasmid,16,15-29.Trevors,J.T.,T.BarkayandA.W.Bourquin.1987.Genetransferamongbacteriainsoilandaquaticenvironmentsareview.Can.J.Microbiol.,33,191-198.VieraJ.andJ.Messing.1982.ThepUCplasmids,anM13mp7-derivedsystemforinsertionmutagenesisandsequencingwithsyntheticuniversalprimers.Gene,19,259-268.Wirth,R.,A.FriesenegerandS.F.Fielder.1989.Transformationofvariu-ousspeciesofgram-negativebacteriabelongingto11differentgenerabyelectroporation.Mol.Gen.Genet.,216,175-177.權利要求1.有寬范圍宿主的克隆和/或表達載體,其特征在于它能在幾乎所有的革蘭氏陰性細菌中復制、具有很高的分離穩(wěn)定性,并且是不遷移的。2.根據(jù)權利要求1所述的載體,其特征在于它具有在不相容性P組群革蘭氏陰性細菌中有由寬范圍宿主之質(zhì)粒衍生的復制原點。3.根據(jù)權利要求2所述的載體,其特征在于它具有質(zhì)粒RK2的復制原點。4.根據(jù)權利要求1所述的載體,其特征在于它含有攜帶質(zhì)粒RP4之par區(qū)域的DNA片段。5.根據(jù)權利要求1所述的載體,其中缺失了mob座位。6.根據(jù)權利要求1所述的載體,其特征在于它還含有克隆的多位點。7.根據(jù)權利要求1所述的載體,其特征在于它還含有最好由抗菌素抗性基因構成的選擇標志。8.在革蘭氏陰性細菌中有寬范圍宿主的克隆和/或表達載體,其特征在于它是由質(zhì)粒RK2衍生的、有一個小于20Kb的尾部、含有攜帶質(zhì)粒RP4之par區(qū)域的DNA片段、不含mob座位、并且可能含克隆的多位點和選擇標志。9.質(zhì)粒PXL1635,其特征在于它是由RK2質(zhì)粒衍生的、有一個小于20Kb的尾部、含有攜帶質(zhì)粒RP4之par區(qū)域的DNA片段,不含mob座位,并且含克隆的多位點和抗生素抗性基因。10.根據(jù)上述權利要求中任一項所述的載體,其特征在于它還含有重組DNA。11.根據(jù)權利要求10所述的載體,其特征在于依賴于遺傳表達的調(diào)節(jié)序列的重組DNA含有編碼給定之一種或多種多肽的一個或多個結構基因。12.根據(jù)權利要求11所述的載體,其特征在于所說的結構基因依賴于其固有的調(diào)節(jié)序列或不同的調(diào)節(jié)序列。13.根據(jù)權利要求11或12中之任一項所述的載體,其特征在于遺傳表達的調(diào)節(jié)序列是由選自于啟動子、決定子、信號肽和核蛋白體固定位點的一個或多個元件組成的。14.根據(jù)權利要求11所述的載體,其特征在于其中一個或多個結構基因編碼選自于酶、激素、生長因子,最好是選自于白蛋白、tPA、TIMP、白細胞介素、脫輔基脂蛋白和干擾素的蛋白質(zhì)。15.根據(jù)權利要求11所述的載體,其特征在于其中的一個或多個結構基因是在遺傳與生物化學水平上參與代謝產(chǎn)物之生物合成的基因。16.根據(jù)權利要求15所述的載體,其特征在于其中代謝產(chǎn)物選自于維生素、抗生素、氨基酸和所有其他細菌代謝產(chǎn)物。17.根據(jù)權利要求16所述的載體,其特征在于所說的代謝產(chǎn)物選自于維生素B12、生物素、核黃素、賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、青霉素和四環(huán)素。18.生產(chǎn)蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物的方法,其特征在于-在革蘭氏陰性細菌中引入權利要求10至17中之任一項所述的載體,該載體含有編碼所述蛋白質(zhì)的結構基因或在遺傳或生物化學水平上參與所述代謝產(chǎn)物之生物合成的一個或多個基因。-在一個或多個所述基因的表達條件下培養(yǎng)所說的細菌,-回收所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物。19.含有權利要求1至17中之任一項所述的載體的革蘭氏陰性細菌。20.權利要求19所述的細菌用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物。21.權利要求19所述的細菌直接用于生物轉(zhuǎn)化反應中。全文摘要本發(fā)明涉及在革蘭氏陰性細菌中有寬范圍宿主的、不能遷移的、并且有較大穩(wěn)定性的新的克隆和/或表達載體。本發(fā)明還涉及這些載體的應用,尤其是在生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)與代謝產(chǎn)物中的應用或在生物轉(zhuǎn)化反應中的應用,以及含有這種載體的宿主細胞。文檔編號C12N15/74GK1056712SQ9110334公開日1991年12月4日申請日期1991年4月22日優(yōu)先權日1990年4月24日發(fā)明者貝齊思·凱莫龍,約爾·科勞瑟特,奧非·雷威·齊爾申請人:羅納-布朗克生物化學公司