一種保證精度的實(shí)時(shí)單分子定位方法及系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及超分辨定位成像技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種保證精度的實(shí)時(shí)單分子定位 方法及系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 在熒光顯微鏡領(lǐng)域，超分辨顯微成像技術(shù)由于突破了衍射極限，達(dá)到了數(shù)十納米 的分辨率，因而為生物學(xué)家提供了一種研究微小結(jié)構(gòu)的有效方法，并被廣泛應(yīng)用。光激活定 位顯微技術(shù)（PhotoActivatedLocalizationMicroscopy,PALM)和隨機(jī)光學(xué)重建顯微法 (StochasticOpticalReconstructionMicroscopy,STORM)是超分辨顯微成像技術(shù)中的 一類，它們基于全內(nèi)反射的光學(xué)成像系統(tǒng)，加之軟件算法，實(shí)現(xiàn)超分辨成像的納米分辨率， 并被統(tǒng)稱為超分辨定位成像技術(shù)。
[0003] 超分辨定位成像技術(shù)利用時(shí)間換取空間分辨率，一般由上千乃至上萬幀的原始圖 像得到一幅超分辨圖像。這樣，圖像處理速度就成了限制該技術(shù)發(fā)展的重要因素。正因如 此，眾多科學(xué)家們開始尋找在不犧牲空間分辨率的前提下能夠提高圖像處理速度的方法。
[0004] 同時(shí)，科研級(jí)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體傳感器（Scientific-gradeComplementary MetalOxideSemiconductor,sCMOS)由于其并行讀出的優(yōu)勢，彌補(bǔ)了常用的探測器--電 子倍增親合器件（ElectronMultiplyingChargeCoupledDevice,EMCCD)串行讀出速度 慢的缺點(diǎn)，并逐漸應(yīng)用于超分辨定位成像技術(shù)中。但是，這同時(shí)也帶來了另一項(xiàng)挑戰(zhàn)一一由 于全速率sCMOS的探測速度約是EMCCD的探測速度的47倍，因而sCMOS-秒鐘能夠采集到 的圖像數(shù)據(jù)量更多，這便為提高超分辨圖像的定位速度增加了難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施例通過提供一種保證精度的實(shí)時(shí)單分子定位方法及系統(tǒng)，在保證定位 精度的情況下，加快了超分辨圖像的定位速度的技術(shù)效果。
[0006] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種保證精度的實(shí)時(shí)單分子定位方法，包括：
[0007] 基于像素級(jí)定位參數(shù)對待處理圖像進(jìn)行區(qū)域提取；
[0008] 對提取到的圖像進(jìn)行粗定位，得到所述提取到的圖像的亞像素級(jí)定位參數(shù)；
[0009] 基于所述提取到的圖像的亞像素級(jí)定位參數(shù)對所述提取到的圖像進(jìn)行精定位。
[0010] 進(jìn)一步地，所述基于像素級(jí)定位參數(shù)對待處理圖像進(jìn)行區(qū)域提取，包括：
[0011] 獲取所述待處理圖像中每個(gè)像素點(diǎn)的像素值；
[0012] 判斷所述獲取到的像素值是否大于預(yù)設(shè)閾值；
[0013] 若是，獲取最大像素值所對應(yīng)的像素點(diǎn)的坐標(biāo)，所述最大像素值所對應(yīng)的像素點(diǎn) 的坐標(biāo)為所述像素級(jí)定位參數(shù)；
[0014] 提取出以所述獲取到的最大像素值所對應(yīng)的像素點(diǎn)的坐標(biāo)為中心的一定區(qū)域的 圖像；
[0015] 其中，所述一定區(qū)域由所述待處理圖像而定。
[0016] 進(jìn)一步地，所述對提取到的圖像進(jìn)行粗定位，得到所述提取到的圖像的亞像素級(jí) 定位參數(shù)，包括：
[0017]通過公式Gcy = (心)得 至|J所述提取到的圖像中像素點(diǎn)的X坐標(biāo)cx和Y坐標(biāo)Cy;其中，Iu表示像素點(diǎn)（i，j)處的灰 度值，Xl表示像素點(diǎn)（i，j)在X軸方向的坐標(biāo)，yi表示像素點(diǎn)（i，j)在y軸方向的坐標(biāo)，η 表示所述提取到的圖像的像素的個(gè)數(shù)；
[0018] 獲取所述提取到的圖像的外圍像素點(diǎn)的像素值的平均值，將所述平均值作為背景 估計(jì)值b。；
[0019] 獲取所述最大像素值，將所述最大像素值減去所述背景估計(jì)值b。，得到信號(hào)亮度 的估計(jì)值A(chǔ)。；
[0020] 通過公式sQ= 0· 21*λ/ (NA*pixelsize)計(jì)算得到焚光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差 S〇；
[0021] 其中，λ為全內(nèi)反射的光學(xué)成像系統(tǒng)的光的波長，ΝΑ為數(shù)值孔徑，pixelsize為像 素尺寸的大小。
[0022] 進(jìn)一步地，所述對提取到的圖像進(jìn)行粗定位，得到所述提取到的圖像的亞像素級(jí) 定位參數(shù)，包括：
[0023] 將所述提取到的圖像與X軸的梯度算子
進(jìn)行卷積運(yùn)算，得到X 軸的梯度分布Gx;
[0024] 將所述提取到的圖像與Y軸的梯度算子
進(jìn)行卷積運(yùn)算，得到y(tǒng)軸 的梯度分布Gy;
[0025] 通過公式Θ(i,j) =arctan2(Gy(i,j)/Gx(i,j))，計(jì)算得到像素梯度方向 Θ(i,j);
[0026] 通過公式Cy=K(i,j)*Cx+C(i,j)計(jì)算得到平行于所述像素梯度方向Θ(i,j)的 直線，即輻射線；
[0027] 其中，K(i，j)為所述輻射線的斜率，由所述像素梯度方向Θ(i，j)決定；C(i，j)為 所述輻射線在y軸上的截距；
[0028]
得到與所述輻射線之間的 距離的平方和最小的像素點(diǎn)的X坐標(biāo)cx和Y坐標(biāo)cy;
[0029] 獲取所述提取到的圖像的外圍像素點(diǎn)的像素值的平均值，將所述平均值作為背景 估計(jì)值b。；
[0030] 獲取所述最大像素值，將所述最大像素值減去所述背景估計(jì)值b。，得到信號(hào)亮度 的估計(jì)值A(chǔ)。；
[0031] 通過公式sQ=0·21*λ/(NA*pixelsize)計(jì)算得到焚光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差 S〇；
[0032] 其中，λ為全內(nèi)反射的光學(xué)成像系統(tǒng)的光的波長，ΝΑ為數(shù)值孔徑，pixelsize為像 素尺寸的大小。
[0033] 進(jìn)一步地，所述基于所述提取到的圖像的亞像素級(jí)定位參數(shù)對所述提取到的圖像 進(jìn)行精定位，包括：
[0035] 其中，^^為像素點(diǎn)（i，j)處的理論光強(qiáng)，A為所述信號(hào)亮度的估計(jì)值A(chǔ)yi為所述 提取到的區(qū)域的X軸坐標(biāo)，j為所述提取到的區(qū)域的y軸坐標(biāo)，X(]為所述提取到的圖像中像 素點(diǎn)的X坐標(biāo)cx，y。為所述提取到的圖像中像素點(diǎn)的Y坐標(biāo)Cy，s為所述熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的 估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差s。，b為所述背景估計(jì)值b。；
[0036] 對所述計(jì)算模型進(jìn)行估計(jì)，即以所述信號(hào)亮度的估計(jì)值A(chǔ)。、所述提取到的圖像中 像素點(diǎn)的X坐標(biāo)Cx、所述提取到的圖像中像素點(diǎn)的Y坐標(biāo)Cy、所述熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的估計(jì)標(biāo) 準(zhǔn)差％和所述背景估計(jì)值b。作為初值代入所述計(jì)算模型進(jìn)行迭代計(jì)算& 直至與觀測 值的差值在誤差閾值之內(nèi)，將此時(shí)的所述信號(hào)亮度的估計(jì)值A(chǔ)。記作信號(hào)亮度的精確值A(chǔ)，所 述提取到的圖像中像素點(diǎn)的X坐標(biāo)Cx記作像素點(diǎn)精度的X坐標(biāo)X。、所述提取到的圖像中像 素點(diǎn)的Y坐標(biāo)cy記作像素點(diǎn)精度的Y坐標(biāo)y。、所述熒光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差s。記作熒 光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)精確的標(biāo)準(zhǔn)差s，所述背景估計(jì)值b。記作背景精確值b。
[0037] 本發(fā)明實(shí)施例提供的保證精度的實(shí)時(shí)單分子定位系統(tǒng)，包括：
[0038] 區(qū)域提取模塊，用于基于像素級(jí)定位參數(shù)對待處理圖像進(jìn)行區(qū)域提?。?br>[0039] 粗定位模塊，用于對提取到的圖像進(jìn)行粗定位，得到所述提取到的圖像的亞像素 級(jí)定位參數(shù)；
[0040] 精定位模塊，用于基于所述提取到的圖像的亞像素級(jí)定位參數(shù)對所述提取到的圖 像進(jìn)行精定位。
[0041] 進(jìn)一步地，所述區(qū)域提取模塊，具體包括：
[0042] 像素值獲取單元，用于獲取所述待處理圖像中每個(gè)像素點(diǎn)的像素值；
[0043] 判斷單元，用于判斷所述獲取到的像素值是否大于預(yù)設(shè)閾值；
[0044] 像素點(diǎn)獲取單元，用于若所述判斷單元的判斷結(jié)果為是，獲取最大像素值所對應(yīng) 的像素點(diǎn)的坐標(biāo)，所述最大像素值所對應(yīng)的像素點(diǎn)的坐標(biāo)為所述像素級(jí)定位參數(shù)；
[0045] 區(qū)域提取執(zhí)行單元，用于提取出以所述獲取到的最大像素值所對應(yīng)的像素點(diǎn)的坐 標(biāo)為中心的一定區(qū)域的圖像；其中，所述一定區(qū)域由所述待處理圖像而定。
[0046] 進(jìn)一步地，所述粗定位模塊，具體包括：
[0047] 第一計(jì)算單元
得到所述提取到的圖像中像素點(diǎn)的X坐標(biāo)cx和Y坐標(biāo)Cy;其中，Iu表示像素點(diǎn)（i，j)處 的灰度值，Xl表示像素點(diǎn)（i，j)在χ軸方向的坐標(biāo)，yi表示像素點(diǎn)（i，j)在y軸方向的坐 標(biāo)，η表示所述提取到的圖像的像素的個(gè)數(shù)；
[0048] 第二計(jì)算單元，用于計(jì)算所述提取到的圖像的外圍像素點(diǎn)的像素值的平均值，將 所述平均值作為背景估計(jì)值b。；
[0049] 第三計(jì)算單元，用于獲取所述最大像素值，將所述最大像素值減去所述背景估計(jì) 值b。，得到信號(hào)亮度的估計(jì)值A(chǔ)。；
[0050] 第四計(jì)算單元，用于通過公式sQ= 0· 21*λ/(NA*pixelsize)計(jì)算得到焚光點(diǎn)擴(kuò) 散函數(shù)的估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差s。;其中，λ為全內(nèi)反射的光學(xué)成像系統(tǒng)的光的波長，NA為數(shù)值孔徑， pixelsize為像素尺寸的大小。
[0051] 進(jìn)一步地，所述粗定位模塊，具體包括：
[0052] 第一運(yùn)算單元，用于將所述提取到的圖像與X軸的梯度算子 進(jìn)行卷積運(yùn)算，得到X軸的梯度分布Gx;
[0053] 第二運(yùn)算單元，用于將所述提取到的圖像與Y軸的梯度算子 卷積運(yùn)算，得到y(tǒng)軸的梯度分布Gy;
[0054] 第三運(yùn)算單元，用于通過公式Θ(i,j) =arctan2(Gy(i,j)/Gx(i,j))，計(jì)算得到 像素梯度方向Θ(i，j);
[0055] 第四運(yùn)算單元，用于通過公式Cy=K(i，j)*Cx+C(i，j)計(jì)算得到平行于所述像素 梯度方向? (i，j)的直線，即輻射線；其中，K(i，j)為所述輻射線的斜率，由所述像素梯度 方向Θ(i,j)決定；C(i,j)為所述福射線在y軸上的截距；
[0056] 第五運(yùn)算單元，用于通過求解方 與所述輻射線之間的距離的平方和最小的像素點(diǎn)的X坐標(biāo)cx和Y坐標(biāo)cy;
[0057] 第六運(yùn)算單元，用于獲取所述提取到的圖像的外圍像素點(diǎn)的像素值的平均值，將 所述平均值作為背景估計(jì)值b。；
[0058] 第七運(yùn)算單元，用于獲取所述最大像素值，將所述最大像素值減去所述背景估計(jì) 值b。，得到信號(hào)亮度的估計(jì)值A(chǔ)。；
[0059] 第八運(yùn)算單元，用于通過公式sQ= 0. 21*λ/(NA*pixelsize)計(jì)算得到