一種兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法
【專利摘要】一種兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法。本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，具體為一種糖基化肽段兩性親水富集并質(zhì)譜分析的方法，其包括：首先對(duì)樹枝狀聚合物PAMAM進(jìn)行磺酸化衍生反應(yīng)使得末端氨基變?yōu)榛撬峄倮玫饧淄閷a(chǎn)物的骨架氮轉(zhuǎn)為季銨基團(tuán)，合成兩性親水的樹枝狀聚合物。利用該材料高效特異結(jié)合血清樣品酶解物中的糖基化肽段，通過(guò)超濾輔助技術(shù)將未和納米材料反應(yīng)的非糖肽清洗除去,最后再利用去糖鏈酶將捕獲的糖肽從材料上解離下來(lái)，送入液相色譜?質(zhì)譜分析糖基化肽。本發(fā)明方法步驟簡(jiǎn)單、操作方便、快速高效，可以實(shí)現(xiàn)糖基化肽的高特異性、高靈敏、高選擇性質(zhì)譜分析。
【專利說(shuō)明】
一種兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域，涉及一種糖基化肽段兩性親水富集并質(zhì)譜分析的方法，具體涉及利用一種兩性親水修飾的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物分子材料(PAMAM)富集糖基化肽并質(zhì)譜分析的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)糖基化是生物體內(nèi)普遍存在的一種翻譯后修飾。據(jù)報(bào)道，真核生物中至少有一半以上的蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化修飾。蛋白質(zhì)的糖基化修飾具有重要的生物學(xué)功能，它不僅影響蛋白質(zhì)的折疊、生物活性、運(yùn)輸和定位，而且在分子識(shí)別、細(xì)胞通信、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和精卵結(jié)合等特定生物生理過(guò)程發(fā)揮著重要的作用。此外糖基化在疾病中，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中具有極其重要的意義。高靈敏、高效地鑒定生物體內(nèi)的糖基化后修飾位點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)其進(jìn)一步研究的首要前提。
[0003]然而，目前的蛋白質(zhì)糖基化研究卻面臨著很大的困難和挑戰(zhàn):第一，雖然糖蛋白種類很豐富，但由于同一個(gè)糖基化位點(diǎn)可能被修飾上不同的糖鏈結(jié)構(gòu)而使得含量進(jìn)一步下降，這對(duì)于樣品的前處理和后續(xù)的質(zhì)譜分析來(lái)說(shuō)都是巨大的挑戰(zhàn);第二，帶有糖基化修飾的肽段在質(zhì)譜中的離子化效率往往比非修飾肽段低，因而不易被質(zhì)譜鑒定。第三，盡管目前已有基于酰肼材料和硼酸富集糖肽的方法，但酰肼材料破壞了糖鏈的結(jié)構(gòu)，不能夠用于完整糖肽的鑒定，硼酸材料的特異性的選擇性較差。
[0004]因此，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種反應(yīng)更加特異、水溶性高且含有豐富的末端修飾功能團(tuán)的樹枝狀聚合物納米材料兩性親水富集超濾分離并質(zhì)譜分析的方法，該方法將避免了容易造成大量樣品損失的轉(zhuǎn)移過(guò)程，有利于實(shí)現(xiàn)高選擇性和高靈敏度質(zhì)譜鑒定，尤其適用于少量珍貴樣品的糖基化分析，從而進(jìn)一步促進(jìn)糖蛋白質(zhì)的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有糖肽富集材料和富集手段存在的不足和缺陷，提供一種操作簡(jiǎn)單、快速高效的糖基化肽選擇性富集材料并高靈敏度質(zhì)譜鑒定的新方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述方案，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
I.合成磺酸基和季銨基修飾的樹枝狀聚合物分子材料ΡΑΜΑΜ;
2.利用該材料結(jié)合并富集蛋白胰酶酶解溶液中的糖基化肽段；
3.將糖基化肽段從材料上洗脫下來(lái)并進(jìn)行質(zhì)譜分析。
[0007]具體的，本發(fā)明通過(guò)兩步法合成一種兩性親水材料，利用親水相互作用和弱靜電相互作用選擇性富集糖基化肽段并進(jìn)行質(zhì)譜分析。
[0008]本發(fā)明所提供的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，用末端磺酸化修飾和骨架氮的季銨化修飾的樹枝狀聚合物分子材料PAMAM作為吸附劑，利用材料上的磺酸基團(tuán)與糖鏈的親水相互作用和帶正電的季銨基團(tuán)與糖鏈間弱靜電相互作用，將糖肽結(jié)合在樹枝狀聚合物分子材料上，經(jīng)超濾的手段使得糖肽與未結(jié)合的非糖肽溶液分離，最終實(shí)現(xiàn)糖基化肽的選擇性富集和質(zhì)譜分析;具體步驟如下:
(I)將末端磺酸化修飾和骨架氮的季銨化修飾的樹枝狀聚合物分子材料與多肽溶液充分混合，將得到的混合溶液在室溫條件下孵育；
所述多肽溶液溶劑為含體積比70?85%乙腈、0.1-0.2%三氟乙酸的水溶液；
(2 )將混合溶液倒入超濾管并進(jìn)行離心超濾分離，使混合溶液中非糖肽和糖肽分離，分別位于超濾管的下部和上部，收集超濾管上部的含糖肽溶液；
(3)用清洗緩沖液清洗步驟(2)中分離后余留的結(jié)合著糖肽的樹枝狀聚合物分子材料，清洗后繼續(xù)重復(fù)步驟(2)若干次，收集上部的含糖肽溶液；
所述清洗緩沖液為含70?85%乙腈、0.5-0.6%三氟乙酸的水溶液；
(4)清洗結(jié)束后，在所得的含糖肽溶液中加入洗脫緩沖液，離心超濾分離，使該溶液中糖肽與聚合物分子材料分離，分別位于超濾管的下部和上部，收集超濾管下部分糖肽溶液并進(jìn)行冷凍干燥；
所述洗脫緩沖液為含I?1.5%三氟乙酸的水溶液；
(5)將經(jīng)冷凍干燥后的糖肽，用碳酸氫銨緩沖液重溶，加入去糖鏈酶PNGaseF充分混合;取上清液與有機(jī)基質(zhì)混合，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析。
[0009]本發(fā)明中，末端磺酸化修飾和骨架氮的季銨化修飾的樹枝狀聚合物分子材料PAMAM按以下步驟合成:
取2?200微摩爾聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物分子，0.5-0.6當(dāng)量(I當(dāng)量對(duì)應(yīng)摩爾比1:1)NH3.H2O和1-1.2當(dāng)量1，3_丙烷磺內(nèi)酯，加入按聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物分子摩爾數(shù):乙醇體積毫升數(shù)=1:1?1: 1.5的比例的乙醇，并充分溶解，在50-60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)18-24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸干，除去溶劑和多余的反應(yīng)原料，加入按聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物分子摩爾數(shù):二甲基甲酰胺(DMF)體積毫升數(shù)=1:1-1:1.2比例的DMF重溶，加入2-3當(dāng)量的無(wú)水Na2CO3，換氮?dú)獗Ｗo(hù)，緩慢加入1.5-2.0當(dāng)量碘甲烷，在50-60°C下攪拌反應(yīng)10-12小時(shí)；產(chǎn)物抽干DMF后用丙酮和乙醇重結(jié)晶;最后將產(chǎn)物分散在水溶液中備用。
[0010]本發(fā)明中，所述聚酰胺-胺型樹枝分子為第四代、第五代或者第六代PAMAM。
[0011]本發(fā)明中，所述磺酸化所用的試劑為I，3_丙烷磺酸酯、I，4_丁烷磺酸酯或者I，5戊烷磺酸酯。
[0012]本發(fā)明中，所述步驟(3)中，重復(fù)步驟(2)3?5次。
[0013]本發(fā)明中，所述步驟(I)中，多肽溶液與樹枝狀聚合物分子材料的質(zhì)量比為1:40?1:80；在25?37 °C下充分混合并孵育5-10分鐘。
[0014]本發(fā)明中，所述步驟(I)中，多肽溶液濃度為0.5-2微克/微升，體積為50-500微升。
[0015]本發(fā)明中，所述離心超濾分離為使用1k Da MW⑶的超濾管在12000_16000g，18-25°C下旋轉(zhuǎn)離心8-10分鐘，將非糖肽和糖肽分離。
[0016]本發(fā)明中，所述步驟(5)中，所述碳酸氫銨緩沖液為25mM-100mM。
[0017]本發(fā)明中，所述步驟(5)中，重溶冷凍干燥的糖肽形成約0.5-2微克/微升的肽段溶液，按蛋白初始質(zhì)量算，I毫克蛋白/I?2微升酶的比例加入糖苷酶PNGase F，在37 °C條件下孵育16-18小時(shí)將糖鏈從肽段上切下來(lái);孵育結(jié)束后，所得溶液與有機(jī)基質(zhì)含有α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)混合，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜MALD1-T0F-MS分析。
[0018]本發(fā)明中所用的兩性親水修飾后的樹枝狀聚合物材料尺寸在100-120納米范圍，其具備高比表面，高水溶性的特點(diǎn)，能與待分離的肽段在溶液充分接觸，提高了糖肽富集的選擇性。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，快速高效等特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本富集方法的流程圖。
[0020]圖2為5pmol標(biāo)準(zhǔn)糖基化蛋白質(zhì)去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段的MALD1-T0F-MS譜圖，MALD1-T0F-MS譜圖縱坐標(biāo)為質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度(％ Intensity)，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比(m/z) ； a)富集前;b)從5 pM標(biāo)準(zhǔn)糖基化蛋白酶解溶液中富集得到的，上樣量和富集前相同?！?”為糖基化肽段單電荷峰，為糖基化肽段雙電荷峰。對(duì)比圖(a)和圖(b)可以看出，經(jīng)過(guò)富集后，糖基化肽可以被選擇性地富集下來(lái)。
[0021]圖3為5pmol標(biāo)準(zhǔn)糖基化蛋白質(zhì)去唾液酸胎球蛋白ASF酶解肽段經(jīng)兩性親水樹枝狀聚合物材料富集后的MALD1-T0F-MS譜圖，MALD1-T0F-MS譜圖縱坐標(biāo)為質(zhì)譜峰的相對(duì)強(qiáng)度(% Intensity)，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比(m/z) ； “+”為帶糖鏈糖基化肽段峰，從圖上可以看到，絕大部分完整糖肽可以通過(guò)該發(fā)明中的方法選擇性地富集下來(lái)，而且具有很好的性噪比。
[0022]圖4為起始糖基化肽段濃度0.0155、0.0310、0.0465、0.0620、0.0930、0.1085、
0.1240微克每微升的系列溶液經(jīng)本發(fā)明中的方法富集糖肽，MALD1-T0F-MS分析后譜圖中糖基化肽段(KLCPDCPLLAPLN#DSR，N為糖基化位點(diǎn))對(duì)應(yīng)譜圖峰的性噪比(S/N)對(duì)濃度的關(guān)系，從圖中可以看出，該發(fā)明中的方法對(duì)于糖基化肽段能達(dá)到0.0155微克每微升(約3.5飛摩)水平，在一個(gè)比較大的肽段樣品濃度范圍內(nèi)對(duì)糖基化肽段具有選擇性富集能力。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面的實(shí)例是對(duì)本發(fā)明提出的一種兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法的進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024]實(shí)施例1
兩性親水樹枝狀聚合物材料對(duì)糖基化肽段選擇性富集能力的實(shí)驗(yàn)用含80%乙腈，0.1%三氟乙酸的水溶液配制50?100微升濃度為I微克/微升的糖基化蛋白去唾液酸胎球蛋白ASF的胰酶酶解肽段，按照肽段:材料質(zhì)量比1:40的比例加入兩性親水樹枝狀聚合物材料，充分混合均勻后在室溫條件下孵育5分鐘；孵育結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移到1k Da超濾管中，18°C下14000g離心8分鐘去除未與材料結(jié)合的肽段(下層溶液);然后加入100?200微升含80%乙腈，0.5%三氟乙酸的水溶液進(jìn)行清洗，18°C下14000g離心8分鐘棄去下層溶液，清洗步驟重復(fù)進(jìn)行3次。清洗結(jié)束后將超濾管轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的套管中，加入含1%三氟乙酸TFA的水溶液作為洗脫緩沖液，18°C下14000g離心8分鐘后收集下層清液，進(jìn)行冷凍干燥。用50?100微升50mM碳酸氫銨水溶液重溶凍干的樣品，加入PNGase F酶，按蛋白初始質(zhì)量算，I毫克蛋白/I微升酶，在37 °(:下，振蕩反應(yīng)16?18小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后取0.5?I微升樣品溶液點(diǎn)樣于MALDI靶板中，待干燥后再點(diǎn)上等體積的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液，干燥結(jié)晶后進(jìn)行MALD1-T0F-MS分析，結(jié)果如圖2所示。
[0025]實(shí)施例2
兩性親水樹枝狀聚合物材料對(duì)完整糖肽選擇性富集能力的實(shí)驗(yàn)
用含80%乙腈，0.1%三氟乙酸的水溶液配制100微升濃度為I微克每微升的糖基化蛋白去唾液酸胎球蛋白ASF的胰酶酶解肽段，按照肽段:材料質(zhì)量比1:40的比例加入兩性親水樹枝狀聚合物材料，充分混合均勻后在室溫條件下孵育5分鐘;孵育結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移到1kDa超濾管中，18°C下14000g離心8分鐘去除未與材料結(jié)合的肽段(下層溶液);然后加入200微升含80%乙腈，0.5%三氟乙酸的水溶液進(jìn)行清洗，18°C下14000g離心8分鐘棄去下層溶液，清洗步驟重復(fù)進(jìn)行3次。清洗結(jié)束后將超濾管轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的套管中，加入含1%三氟乙酸TFA的水溶液作為洗脫緩沖液，18°C下14000g離心8分鐘后收集下層清液;取0.5?I微升樣品溶液點(diǎn)樣于MALDI靶板中，待干燥后再點(diǎn)上等體積的2，5_ 二羥基苯甲酸基質(zhì)溶液(1%磷酸50%乙腈水溶液)基質(zhì)溶液，干燥結(jié)晶后進(jìn)行MALD1-TOF-MS分析，結(jié)果如圖3所示。
[0026] 實(shí)施例3
兩性親水樹枝狀聚合物材料對(duì)糖基化肽段富集能力穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)用含80%乙腈，0.1%三氟乙酸的水溶液配制按照濃度0.0155,0.0310,0.0465,0.0620、
0.0930、0.1085、0.1240微克每微升的梯度配置一系列糖基化蛋白去唾液酸胎球蛋白ASF的胰酶酶解肽段溶液各50微升，按照肽段:材料質(zhì)量比1:60的比例加入兩性親水樹枝狀聚合物材料，充分混合均勻后在室溫條件下孵育5分鐘;孵育結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移到1k Da超濾管中，20°C下12000g離心10分鐘去除未與材料結(jié)合的肽段(下層溶液)；然后加入100?200微升含80%乙腈，0.5%三氟乙酸的水溶液進(jìn)行清洗，18°(:下1200(^離心8分鐘棄去下層溶液，清洗步驟重復(fù)進(jìn)行3次。清洗結(jié)束后將超濾管轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的套管中，加入含1%三氟乙酸TFA的水溶液作為洗脫緩沖液，18°C下12000g離心8分鐘后收集下層清液，進(jìn)行冷凍干燥。用50?100微升50mM碳酸氫銨水溶液重溶凍干的樣品，加入PNGase F酶，按蛋白初始質(zhì)量算，I毫克蛋白/I微升酶，在37 °C下，振蕩反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后取0.5微升樣品溶液點(diǎn)樣于MALDI靶板中，待干燥后再點(diǎn)上等體積的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶液，干燥結(jié)晶后進(jìn)行MALD1-TOF-MS分析，將結(jié)果譜圖中的糖基化肽段(KLCPDCPLLAPLN#DSR，N為糖基化位點(diǎn))的峰性噪比對(duì)濃度作圖，如圖4所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于用末端磺酸化修飾和骨架氮的季銨化修飾的樹枝狀聚合物分子材料PAMAM作為吸附劑，利用材料上的磺酸基團(tuán)與糖鏈的親水相互作用和帶正電的季銨基團(tuán)與糖鏈間弱靜電相互作用，將糖肽結(jié)合在樹枝狀聚合物分子材料上，經(jīng)超濾的手段使得糖肽與未結(jié)合的非糖肽溶液分離，最終實(shí)現(xiàn)糖基化肽的選擇性富集和質(zhì)譜分析;具體步驟如下: (I)將末端磺酸化修飾和骨架氮的季銨化修飾的樹枝狀聚合物分子材料與多肽溶液充分混合，將得到的混合溶液在室溫條件下孵育； 所述多肽溶液溶劑為含體積比70?85%乙腈、0.1-0.2%三氟乙酸的水溶液； (2 )將混合溶液倒入超濾管并進(jìn)行離心超濾分離，使混合溶液中非糖肽和糖肽分離，分別位于超濾管的下部和上部，收集超濾管上部的含糖肽溶液； (3)用清洗緩沖液清洗步驟(2)中分離后余留的結(jié)合著糖肽的樹枝狀聚合物分子材料，清洗后繼續(xù)重復(fù)步驟(2)若干次，收集上部的含糖肽溶液； 所述清洗緩沖液為含70?85%乙腈、0.5-0.6%三氟乙酸的水溶液； (4)清洗結(jié)束后，在所得的含糖肽溶液中加入洗脫緩沖液，離心超濾分離，使該溶液中糖肽與聚合物分子材料分離，分別位于超濾管的下部和上部，收集超濾管下部分糖肽溶液并進(jìn)行冷凍干燥； 所述洗脫緩沖液為含I?1.5%三氟乙酸的水溶液； (5)將經(jīng)冷凍干燥后的糖肽，用碳酸氫銨緩沖液重溶，加入去糖鏈酶PNGaseF充分混合;取上清液與有機(jī)基質(zhì)混合，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜分析。2.如權(quán)利要求1所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于末端磺酸化修飾和骨架氮的季銨化修飾的樹枝狀聚合物分子材料PAMAM按以下步驟合成: 取2?200微摩爾聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物分子，0.5-0.6當(dāng)量NH3.H2O和1_1.2當(dāng)量I，3-丙烷磺內(nèi)酯，I當(dāng)量對(duì)應(yīng)摩爾比1:1，加入按聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物分子摩爾數(shù):乙醇體積毫升數(shù)=1:1?1: 1.5的比例的乙醇，并充分溶解，在50-60°C氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)18-24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸干，除去溶劑和多余的反應(yīng)原料，加入按聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物分子摩爾數(shù):二甲基甲酰胺體積毫升數(shù)=1:1?1: 1.2比例的二甲基甲酰胺重溶，加入2-3當(dāng)量的無(wú)水Na2CO3，換氮?dú)獗Ｗo(hù)，緩慢加入1.5-2.0當(dāng)量碘甲烷，在50-60°C下攪拌反應(yīng)10-12小時(shí);產(chǎn)物抽干DMF后用丙酮和乙醇重結(jié)晶;最后將產(chǎn)物分散在水溶液中備用。3.如權(quán)利要求1所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述步驟(3)中，重復(fù)步驟(2)3?5次。4.如權(quán)利要求1?3之一所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述磺酸化所用的試劑為I，3-丙烷磺酸酯、I，4-丁烷磺酸酯或者I，5戊烷磺酸酯。5.如權(quán)利要求1所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述步驟(I)中，多肽溶液與樹枝狀聚合物分子材料的質(zhì)量比為1:40-1:80;在25?37 V下充分混合并孵育5-10分鐘。6.如權(quán)利要求1?3之一所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述步驟(I)中，多肽溶液濃度為0.5-2微克/微升，體積為50-500微升。7.如權(quán)利要求1?3之一所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述離心超濾分離為使用1k Da MffCO的超濾管在12000-16000g，18-25°c下旋轉(zhuǎn)離心8-10分鐘，將非糖肽和糖肽分離。8.如權(quán)利要求1?3之一所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述步驟(5)中，所述碳酸氫銨緩沖液為25mM-100mM。9.如權(quán)利要求1?3之一所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述步驟(5)中，重溶冷凍干燥的糖肽形成約0.5-2微克/微升的肽段溶液，按蛋白初始質(zhì)量算，I毫克蛋白/I?2微升酶的比例加入糖苷酶PNGase F，在37°C條件下孵育16-18小時(shí)將糖鏈從肽段上切下來(lái);孵育結(jié)束后，所得溶液與有機(jī)基質(zhì)含有氰基-4-羥基肉桂酸混合，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜MALD1-TOF-MS分析。10.如權(quán)利要求2所述的兩性親水富集糖基化肽段并質(zhì)譜分析的方法，其特征在于所述聚酰胺-胺型樹枝分子為第四代、第五代或者第六代ΡΑΜΑΜ。
【文檔編號(hào)】G01N27/62GK106053199SQ201610302904
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】黃江銘, 曹緯倩, 蔣碧云, 楊芃原
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)