一種提高膠原蛋白乳化穩(wěn)定性的糖基化方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)的殼寡糖修飾技術領域，具體涉及一種提高膠原蛋白乳化穩(wěn)定性的糖基化方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是一種含有三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白，常見類型為I型、π型、m型、V型和?型，其具有良好的生物相容性、生物降解性以及生物活性。食用級膠原蛋白外觀通常為白色，味道清淡，口感柔和，易于消化。常用作食品領域的營養(yǎng)成分和功能物質(zhì)，可以作為保健食品和包裝材料，也可以作為食品添加劑應用在肉制品改良、冷凍食品、飲料、糕點以及乳制品等方面。
[0003]蛋白質(zhì)的乳化特性對食品乳狀液的形成和穩(wěn)定具有重要作用，較大程度上影響食品的品質(zhì)和貨架期。目前，食品領域中蛋白質(zhì)糖基化最常用的技術手段是美拉德反應，已經(jīng)得到充分的研究和開發(fā)。通過還原糖分子與蛋白質(zhì)側(cè)鏈之間的羰-胺縮合反應，美拉德反應將糖基引入蛋白質(zhì)分子之中。食品蛋白質(zhì)的美拉德反應糖基化改造，提高蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)(乳化性質(zhì)和起泡能力)，增加了其親水性能(膠凝性質(zhì)和流變學性質(zhì))等，蛋白質(zhì)的整體功能性質(zhì)得到改善。
[0004]雖然美拉德反應進行蛋白質(zhì)的糖基化、揭示糖基化與功能性質(zhì)之間的關系的研究很多，但是應用美拉德反應于蛋白質(zhì)的修飾時，反應過程復雜，除了所希望發(fā)生的蛋白質(zhì)_糖縮合反應外，還存在其他的副反應，導致食品安全問題。例如，可能產(chǎn)生致誘變物質(zhì)(食品安全性問題)，或者產(chǎn)生褐色物質(zhì)(感官質(zhì)量問題)。另外，美拉德反應發(fā)生的優(yōu)先位點是蛋白質(zhì)分子中的賴氨酸殘基，會導致賴氨酸的生物利用率下降，影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。因此，有必要探尋反應條件相對溫和、副反應少、安全性高的其他途徑。
[0005]殼寡糖是自然界中唯一含有正電荷的堿性氨基寡糖，具有綠色、天然、無副作用的特點。作為新型的生理活性物質(zhì)，除了具有抗腫瘤抗癌，增強免疫，降血壓，降血糖，降低膽固醇，加速體鈣、鐵的吸收及關節(jié)組織的修復等功能外，還具有調(diào)節(jié)人體PH值，防腐抑菌等作用。鑒于水產(chǎn)膠原蛋白獨特的優(yōu)越性和其他替代材料無可比擬的特點，尋找一種適用于水產(chǎn)膠原蛋白的殼寡糖修飾就顯得尤為重要，這對于解決美拉德反應進行蛋白質(zhì)的糖基化修飾時產(chǎn)生的問題，改善水產(chǎn)膠原蛋白的功能特性，為食品工業(yè)開發(fā)出具有特殊功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)配料，提供新的理論依據(jù)和技術方法都具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種水產(chǎn)膠原蛋白的糖基化修飾方法，能夠顯著改善其功能特性，例如乳化穩(wěn)定性，從而彌補了現(xiàn)有技術的不足。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG酶)實現(xiàn)膠原蛋白的殼寡糖修飾，不僅能改善其功能特性(包括吸水性、凝膠性以及熱穩(wěn)定性等)，使其具有一定生理活性(包括增強免疫，降血壓，降血糖，降低膽固醇等)，而且解決了美拉德反應進行蛋白質(zhì)的糖基化修飾時產(chǎn)生的問題，為食品工業(yè)開發(fā)出具有特殊功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)配料，提供新的理論依據(jù)和技術方法。
[0008]本發(fā)明的技術方案采用了一種提高膠原蛋白乳化穩(wěn)定性的糖基化方法，采用殼寡糖對水產(chǎn)膠原蛋白進行糖基化修飾，得到改性的糖基化膠原蛋白。
[0009]具體由以下步驟組成:
[0010](I)制備魚皮明膠:將魚皮浸泡在堿性溶液中，然后用清水沖洗至中性，再將魚皮浸泡在酸性溶液中，浸泡結(jié)束后用清水洗至PH5.0-5.5，在水中進行提取;再離心取上清液，超濾、冷凍干燥后得到魚皮明膠；
[0011](2)制備糖基化蛋白:魚皮明膠溶于檸檬酸鈉溶液制備成蛋白質(zhì)濃度為3%_6%溶液，殼寡糖溶于相同的檸檬酸鈉溶液制備成質(zhì)量分數(shù)為3 %~6%溶液，然后將明膠溶液和殼寡糖溶液按1:3體積比例混合，使反應體系中蛋白質(zhì)?；w與?；荏w殼寡糖的摩爾比為1:3;調(diào)節(jié)混合溶液pH為7.5，加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，在37-47°C恒溫水浴反應3.5-5.5h后，于80°C滅酶終止反應；
[0012](3)純化、收集:利用(NH4)2S04溶液沉淀步驟(2)的反應產(chǎn)物，離心后沉淀備用;將離心后沉淀復溶于水，超濾，將濾液冷凍干燥收集，即為改性的糖基化膠原蛋白。
[0013]作為優(yōu)選，所述步驟(I)中所用魚皮為鱈魚皮或大西洋鮭魚皮。
[0014]作為優(yōu)選，所述步驟(I)中的堿性溶液為0.05mol/L的NaOH溶液。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟(I)中的酸性溶液為0.02mol/L的梓檬酸溶液。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟(I)中將魚皮浸泡在酸性溶液中，用清水沖洗后，在55_65°C的水中進行提取3-6h，得到平均分子量10kDa的魚皮明膠;超濾采用截留分子量30kDa超濾，得到分子量大于30kDa的魚皮明膠。
[0017]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中檸檬酸鈉溶液為質(zhì)量分數(shù)0.3%的溶液，pH為7.0。
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中殼寡糖為的分子量為1000_2000Da，脫乙酰度為90%。
[0019]作為優(yōu)選，所述步驟(3)中超濾時使用截留分子量為2000Da_4000Da的超濾膜。
[0020]作為優(yōu)選，所述步驟(3)中(NH4)2SO4溶液的濃度為40%。
[0021]—種用上述糖基化方法得到的改性的糖基化膠原蛋白，其乳化能力基本無變化，乳化穩(wěn)定性是未乳化膠原蛋白的6.8-15.0倍。
[0022]—種上述改性的糖基化膠原蛋白的用途，可以作為具有特殊功能性質(zhì)的食品蛋白質(zhì)配料，增加產(chǎn)品乳化穩(wěn)定性。
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0024]1.本發(fā)明制備得到的魚皮明膠平均分子量為lOOkDa，便于制備高乳化穩(wěn)定性的產(chǎn)品O
[0025]2.本發(fā)明選用檸檬酸鈉作為明膠和殼寡糖的溶劑，制備出的糖基化膠原蛋白其乳化穩(wěn)定性顯著提高。
[0026]3.本發(fā)明的糖基化方法，用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG酶)實現(xiàn)膠原蛋白的殼寡糖修飾，不僅能改善其功能特性(包括吸水性、凝膠性以及熱穩(wěn)定性等)，使其具有一定生理活性(包括增強免疫，降血壓，降血糖，降低膽固醇等)，而且解決了美拉德反應進行蛋白質(zhì)的糖基化修飾時產(chǎn)生的問題，為未來食品工業(yè)開發(fā)出具有特殊功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)配料，提供新的理論依據(jù)和技術方法，為食品業(yè)的未來發(fā)展以及新產(chǎn)品的開發(fā)，提供理論和技術支撐。
[0027]4.本發(fā)明制備的糖基化膠原蛋白其乳化穩(wěn)定性顯著提高。乳化性是指油和水混合在一起形成乳狀液的性能，對食品品質(zhì)的改善和貨架期的延長有重要作用。
[0028]3.本發(fā)明將能夠服務于國家戰(zhàn)略需要，產(chǎn)生蛋白質(zhì)糖基化新技術和一種綠色加工途徑，所生產(chǎn)的糖基化蛋白可以作為具有特殊功能性質(zhì)的食品蛋白質(zhì)配料。
【具體實施方式】
[0029]為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部實施例?；诒景l(fā)明的實施例，本領域其他人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0030]實施例1:
[0031]利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備得到糖基化膠原蛋白，獲得一種基于殼寡糖的水產(chǎn)膠原蛋白糖基化方法，顯著改善其乳化穩(wěn)定性。
[0032]具體由以下步驟組成:
[0033](I)制備魚皮明膠:冷凍大西洋鮭魚皮流水解凍，去肉、去鱗；將魚皮剪碎，于0.05mol/L NaOH溶液(1:6，v/v)常溫浸泡40min，水洗中性;然后用0.02moVL檸檬酸溶液(料液比為1/6)浸泡40min，水洗至pH5.3;在60°C恒溫水浴中提取5h(料液比1/2)，過濾去除魚皮，離心取上清液，用截留分子量30kDa超濾膜超濾，冷凍干燥收集產(chǎn)物即為大西洋鮭魚皮明膠。
[0034](2)制備糖基化蛋白:上述大西洋鮭魚皮明膠溶于檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量分數(shù)為0.3%, pH為7.0)制備成蛋白質(zhì)濃度為6 %溶液，將殼寡糖(分子量為1000-2000Da，脫乙酰度為90% )溶于相同的檸檬酸鈉溶液制備成質(zhì)量分數(shù)為6%溶液，明膠溶液和殼寡糖溶液按1:3體積比例混合，使反應體系中蛋白質(zhì)酰基供體與?；荏w殼寡糖的摩爾比為1:3;調(diào)節(jié)混合溶液PH固定為7.5，加入酶活力為2440kU/kg的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其添加量為1500kU/kg蛋白質(zhì)，在45°C恒溫水浴反應3.5h后，樣品于80°C水浴滅酶5min，冷卻。
[0035](3)純化、收集:用濃度為40 %的(NH4)2S04(w/v)固體顆粒沉淀步驟(3)修飾產(chǎn)物，冰浴中靜置25min后，4°C下4000r/min離心lOmin，得到沉淀;將沉淀復溶于水后，用膜截留分子量為3000Da的超濾膜抽濾除去(NH4)2SO4和反應體系中未結(jié)合的殼寡糖;冷凍干燥收集糖基化產(chǎn)物，該糖基化產(chǎn)物的殼寡糖導入量為98.16g氨基葡萄糖/kg蛋白質(zhì)。
[0036]—種用上述糖基化方法得到的改性的糖基化膠原蛋白，其乳化能力基本無變化，乳化穩(wěn)定性是未乳化膠原蛋白的8.2-14.9倍。
[0037]其中乳化能力評價步驟為:稱取一定量的樣品，分別配成質(zhì)量分數(shù)為0.1%、
0.5%、1.0%、2.0%、3.0%(即分別為1、5、10、20、3011^/1^)的溶液，調(diào)節(jié)口!1至7.0，取不同質(zhì)量分數(shù)的溶液，在室溫下同玉米油按l:l(v/V)比例混合，于高速分散器中以1400r/min的轉(zhuǎn)速乳化30s，然后5000r/min離心7min，記