牛肝菌中煙堿碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法
【專利摘要】一種牛肝菌中煙堿碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法，其特征在于：采用正己烷/氫氧化鈉水溶液體系將牛肝菌中的煙堿提取出來后，再經過陽離子交換固相萃取對萃取液進行凈化，并采用配有毛細管色譜柱的氣相色譜儀將煙堿和萃取液中的其他雜質分開，利用氣相色譜—同位素質譜儀GC?IRMS分析牛肝菌中煙堿的碳穩(wěn)定同位素比值δ13C，氫穩(wěn)定同位素比值δD和氮穩(wěn)定同位素比值δ15N，再根據煙堿同位素標準物質中的δ12C、δD和δ15N測定值，校準計算牛肝菌中煙堿的δ12C、δD和δ15N值。本發(fā)明利用GC?IRMS技術，實現了牛肝菌中煙堿的碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的準確測定，為相關產品中煙堿的溯源提供了技術支持和科學依據。
【專利說明】
牛肝菌中煙堿碳、氨、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于穩(wěn)定同位素分析技術領域，具體設及一種牛肝菌中煙堿碳、氨、氮穩(wěn)定 同位素比值的測定方法。
【背景技術】
[0002] 當前，判定市售煙草提取物及不同純度煙堿中煙堿的來源，具有重要的意義。除煙 草外，牛肝菌等作物也含有煙堿，雖然牛肝菌的煙堿含量相對很低，但與其他茄科類植物相 比，其煙堿含量相對較高，所W，牛肝菌是自然界中煙堿的重要來源之一。當前，許多市售戒 煙產品、電子煙、保健產品等都含有煙堿，但是，對于其中煙堿的來源，尚無統(tǒng)一定論。所W， 煙堿溯源技術的開發(fā)，具有重要的理論及現實意義。
[0003] 在產品品種、產地等溯源的方法中，穩(wěn)定同位素技術是一項相對高效的分析手段。 由于生物體內的同位素組成受氣候，環(huán)境和生物代謝類型等因素的影響，不同種類及不同 地域來源的食品原料中同位素自然豐度存在差異，利用運種差異可W對不同種類及來源的 產品進行溯源(林光輝，穩(wěn)定同位素生態(tài)學.高等教育出版社，2013)。但是，目前尚未見牛 肝菌中煙堿碳、氨、氮穩(wěn)定同位素比值的相關報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的正是基于上述技術空白，建立了一種牛肝菌中煙堿碳、氨、氮穩(wěn)定同 位素比值的測定方法。本方法通過液液萃取、固相萃取等過程對牛肝菌中的煙堿進行提取、 濃縮和凈化，且一次樣品前處理過程即可同時測定牛肝菌中煙堿的碳、氨、氮穩(wěn)定同位素比 值。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過W下技術方案來實現的：一種牛肝菌中煙堿碳、氨、氮穩(wěn)定同 位素比值的測定方法，采用正己燒/氨氧化鋼水溶液體系將牛肝菌中的煙堿提取出來后，再 經過陽離子交換固相萃取對萃取液進行凈化，并采用配有毛細管色譜柱的氣相色譜儀將煙 堿和萃取液中的其他雜質分開，利用氣相色譜一同位素質譜儀GC-IRMS分析牛肝菌中煙堿 的碳穩(wěn)定同位素比值81化，氨穩(wěn)定同位素比值如和氮穩(wěn)定同位素比值Si5N,再根據煙堿同位 素標準物質中的Si化、如和Si5N測定值，校準計算牛肝菌中煙堿的51化、如和Si5N值。
[0006] 其具體步驟如下： (1) 牛肝菌中的煙堿的提取、濃縮與凈化:采用正己燒/氨氧化鋼水溶液體系將牛肝菌 中的煙堿提取出來后，再經過陽離子交換固相萃取對煙堿進行凈化； (2) 采用帶有毛細管氣相色譜柱的氣相色譜儀將煙堿與萃取液中的其他雜質分開； (3) 用在線燃燒裝置將煙堿中的C轉化成C〇2,將煙堿中的N轉化成的，用同位素質譜儀 (IRM^測定煙堿產生C〇2中的扣化和化中的8?值； (4) 將在線燃燒裝置切換為熱轉化模式，用同位素質譜儀(IRMS)測定煙堿產生也中的5 D值(即 S2h)。
[0007] (5)通過標準物質已標定的扣化，如和^5N值，得到牛肝菌中煙堿的如化，如和S15n 值。
[000引步驟(1)中的提取與凈化過程如下： 提取:稱取約5 g牛肝菌樣品，置于50 mL離屯、管中，分別加入30 mL 1%氨氧化鋼水溶液 和5 mL正己燒，2000巧m下滿旋10 min后，在10000巧m下離屯、2 min,將上層有機相轉移至 另一個50 mL離屯、管中，再W5 mL正己燒萃取兩次，合并有機相； 濃縮、凈化：用甲酸將有機相的抑值調至3-4,然后在40°C下將其氮吹濃縮近干，加入3 ml 2%甲酸水溶液溶解殘渣后，使用陽離子交換固相萃取小柱(60 mg，Waters Oasis MCX) 進行凈化處理，其步驟為：萃取柱使用前分別用3 mL甲醇、3 mL水和3 ml 2%甲酸水溶液活 化，之后將待凈化溶液轉移至柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，然后用10 mL 5%氨化甲 醇洗脫，收集洗脫液;洗脫液用甲酸調pH值至3-4，40°C下氮吹濃縮近干，殘渣用5%氨氧化鋼 水溶液調抑值至堿性，加入1.5 mL二氯甲燒，在2000巧m下滿旋2 min后，WlOOOO rpm離屯、 1 min,再取有機相進行GC-IRMS分析。
[0009]所述方法的儀器分析條件為： (1) 氣相色譜條件： 色譜柱：中等極性毛細管色譜柱（30 m X 0.32 mm X 0.25 Ml);檢測器溫度：250 °(：;進樣口溫度:250 °(：;載氣：氮氣(純度>99.999%)，恒流流速:2.0血/111111;進樣量：1^ L，不分流進樣;升溫程序:初始溫度80 °C，保持1 min, W15 TVmin的速率至260 °C，保持6 min. (2) 燃燒轉化裝置條件： 測定Si3C或Si5N:使用氧化燃燒管，設置溫度為looor。管內填裝儀/氧化儀（Ni/NiO)， 氧化儀作弱氧化劑，將樣品中的C氧化成C〇2，將樣品中N氧化成NxOy，同時，氧化儀轉化為儀 單質，充入化可再生氧化儀，另外，儀單質可作特殊還原劑，將NxOy轉化為化，樣品最終反應 生成C〇2和化。氧化燃燒管使用前應注入化一個小時用于氧化管的再生。
[0010]巧憶Si5N,需使用液氮冷阱凍結除去C〇2高凝固點氣體，防止C〇2進入離子源打出碎 片離子[CO+ ] m/z 28，29對[化+ ]m/z 28，29造成干擾。
[0011] 測定如:使用高溫裂解管，設置溫度為1450°c。高溫裂解管使用前應注入CH4-個 小時用于反應管涂炭。
[0012] (3)質譜條件為： 離子源真空為1.8x 1〇-6 HiBar，電壓3.04 kV，電流1.50 mA。
[0013] 本方法通過液液萃取、陽離子交換固相萃取等步驟對牛肝菌中的煙堿進行提取、濃縮 和凈化，且一次樣品前處理過程即可同時測定牛肝菌中煙堿的碳、氨、氮穩(wěn)定同位素比值， 具有效率高、重復性好的優(yōu)點，為煙草提取物中煙堿的溯源提供了技術支持和科學依據。
【附圖說明】
[0014] 圖1為GC-IRMS測定標準溶液煙堿中Si3C的離子流圖譜，其中上圖縱坐標是比率 (Ratio)，下圖縱坐標是強度（Intensity [mV]); 圖2為GC-IRMS測定標準溶液煙堿中Si5N的離子流圖譜，其中上圖縱坐標是比率 (Ratio)，下圖縱坐標是強度（Intensity [mV]); 圖3為GC-IRMS測定標準溶液煙堿中如的離子流圖譜，其中上圖縱坐標是比率(Ratio)， 下圖縱坐標是強度（Intensity [mV])。
【具體實施方式】
[0015] 本發(fā)明通過W下具體實施例作進一步描述，但不限制本發(fā)明。
[0016] 實施例1: 1、儀器及試劑 同位素質譜儀(AS1310自動進樣器，Trace GC叫tra氣相色譜儀，GC IsoLink燃燒與熱 轉化裝置(燃燒裝置用來測定煙堿中的碳和氮，熱轉化裝置用來測定煙堿中的氨）,Delta V Advantage穩(wěn)定同位素比質譜儀。美國Hiermo Fisher公司）；AE163電子天平（感量：0.0 OOl g，瑞±Mettler公司）;全自動氮吹儀(型號:JTZD-DCY12S，杭州聚同電子有限公司）；高速粉 碎機（武漢銀彩科技有限公司）；縱滿振蕩器（美國Coleparmer Votex-Genie);高速臺式冷 凍型離屯、機(德國SIGMA 3-30K);高純氮氣(99.999%，載氣）;煙堿標準物質來自于美國印第 安納大學同位素實驗室，#2(51化=7.72±0.02%。，515片-5.94±0.15°/〇。），#3(51化=-30.05 ±0.02%〇,5^=-33.62±0.18%〇),#4(51? =-2.06±0.02%〇,5^=-15.49±0,13%〇) ,#5(5 "C 二-29.63 ±0.01%〇，滬片一6.03 ±0.04%〇，如=-161.30 ± 1.7%〇);正己燒（色譜純，美國 T抓IA公司）；氨氧化鋼(分析純，國藥集團）；超純水(Milli-Q Integral超純水系統(tǒng)制）；陽 離子交換固相萃取小柱(60 mg ,Waters Oasis MCX)。
[0017] 2、樣品前處理 (1) 將牛肝菌樣品置于40吧烘箱中，1小時后取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標準篩； (2) 稱取約5 g牛肝菌樣品，置于50 mL離屯、管中，分別加入30 mL 1%氨氧化鋼水溶液和 5血正己燒，2000巧m下滿旋10 min后，在10000 rpm下離屯、2 min,將上層有機相轉移至另 一個50 mL離屯、管中，再W5 mL正己燒萃取兩次，合并有機相。
[001引（3)用甲酸將有機相的抑值調至3-4,然后在40°C下將其氮吹濃縮近干，加入3 ml 2%甲酸水溶液溶解殘渣后，使用陽離子交換固相萃取小柱(60 mg，Waters Oasis MCX)進行 凈化處理，其步驟為:萃取柱使用前分別用3 mL甲醇、3 mL水和3 ml 2%甲酸水溶液活化，之 后將待凈化溶液轉移至柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，然后用10 ml 5%氨化甲醇洗 脫，收集洗脫液;洗脫液用甲酸調pH值至3-4，40°C下氮吹濃縮近干，殘渣用5%氨氧化鋼水溶 液調pH值至堿性，加入1.5 mL二氯甲燒，在2000 rpm下滿旋2 min后，W10000 rpm離屯、1 min，再取有機相進行GC-IRMS分析。
[0019] 本案中的%若無特別說明，均為質量％。
[0020] 3、儀器分析條件 (1) 氣相色譜條件： 色譜柱：中等極性毛細管色譜柱（30 m X 0.32 mm X 0.25 Ml);檢測器溫度：250 °(：;進樣口溫度:250 °(：;載氣：氮氣(純度>99.999%)，恒流流速:2.0血/111111;進樣量：1^ 1，分流比：10:1;升溫程序:初始溫度80°(：，保持1111111，^15°(：/111111的速率至260°(：，保持 6 min. (2) 燃燒轉化裝置條件： 測定Si3C或Si5N:使用氧化燃燒管，設置溫度為looor。管內填裝儀/氧化儀（Ni/NiO)， 氧化儀作弱氧化劑，將樣品中的C氧化成C〇2，將樣品中N氧化成NxOy，同時，氧化儀轉化為儀 單質，充入化可再生氧化儀，另外，儀單質可作特殊還原劑，將NxOy轉化為化，樣品最終反應 生成C〇2和化。氧化燃燒管使用前應注入化一個小時用于氧化管的再生。
[0021] 測定Si5N,需使用液氮冷阱凍結除去C〇2高凝固點氣體，防止C〇2進入離子源打出碎 片離子[CO+ ] m/z 28，29對[化+ ]m/z 28，29造成干擾。
[0022] 測定如:使用高溫裂解管，設置溫度為1450°C。高溫裂解管使用前應注入CH4-個 小時用于反應管涂炭。
[0023] (3)質譜條件為： 離子源真空為1.8x 1〇-6 HiBar，電壓3.04 kV，電流1.50 mA。
[0024] 4、精密度測定 將牛肝菌樣品稀釋萃取后，通過本發(fā)明所述GC-IRMS技術重復測定牛肝菌中煙堿的5 1化，如和Si5N值(n = 6)，測定結果的相對標準偏差(RSD)分別為1.16%，0.36%和1.02%(表 1)，測定精度均能達到要求。
[0025] 表1.牛肝菌中煙堿C、H、N立種元素穩(wěn)定同位素比值的精密度測定
根據上述GC-IRMS測定方法，測得牛肝菌樣品中煙堿的51化，如和Si5N分別為-30.82、- 215.60和-9.54。
【主權項】
1. 一種牛肝菌中煙堿碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法，其特征在于:采用正己烷/ 氫氧化鈉水溶液體系將牛肝菌中的煙堿提取出來后，再經過陽離子交換固相萃取對萃取液 進行凈化，并采用配有毛細管色譜柱的氣相色譜儀將煙堿與萃取液中的其他雜質分開，利 用氣相色譜一同位素質譜儀GC-IRMS分析牛肝菌中煙堿的碳穩(wěn)定同位素比值δ 13(：，氫穩(wěn)定同 位素比值SD和氮穩(wěn)定同位素比值δ15Ν，再根據煙堿同位素標準物質中的S 12CjD和δ15Ν測定 值，校準計算牛肝菌中煙堿的S12CjD和δ 15Ν值。2. 根據權利要求1所述的牛肝菌中煙堿碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法，其特征 在于:該方法的具體步驟如下： (1) 牛肝菌中的煙堿的提取、濃縮與凈化:采用正己烷/氫氧化鈉水溶液體系將牛肝菌 中的煙堿提取出來后，再經過陽離子交換固相萃取對煙堿進行凈化； (2) 采用帶有毛細管氣相色譜柱的氣相色譜儀將煙堿與萃取液中的其他雜質分開； (3) 用在線燃燒裝置將煙堿中的C轉化成C02,將煙堿中的N轉化成Ν2,用同位素質譜儀 (IRMS)測定煙堿產生CO 2中的S13C和N2中的δ15Ν值； (4) 將在線燃燒裝置切換為熱轉化模式，用同位素質譜儀IRMS測定煙堿產生H2中的δ? 值； (5) 通過標準物質已標定的S13CJD和δ15Ν值，得到牛肝菌中煙堿的S13CJD和δ 15Ν值。3. 根據權利要求1所述的牛肝菌中煙堿碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法，其特征 在于:步驟(1)中的提取與凈化過程如下： 提取:稱取5 g牛肝菌樣品，置于50 mL離心管中，分別加入30 mL 1%氫氧化鈉水溶液和 5 mL正己燒，2000 rpm下禍旋10 min后，在10000 rpm下離心2 min，將上層有機相轉移至另 一個50 mL離心管中，再以5 mL正己烷萃取兩次，合并有機相； 濃縮、凈化：用甲酸將有機相的pH值調至3-4,然后在40°C下將其氮吹濃縮近干，加入3 mL 2%甲酸水溶液溶解殘渣后，使用陽離子交換固相萃取小柱進行凈化處理，其步驟為:萃 取柱使用前分別用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 2%甲酸水溶液活化，之后將待凈化溶液轉移至 柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，然后用10 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液;洗脫液 用甲酸調pH值至3-4，40 °C下氮吹濃縮近干，殘渣用5%氫氧化鈉水溶液調pH值至堿性，加入 1.5 mL二氯甲燒，在2000 rpm下禍旋2 min后，以10000 rpm離心I min，再取有機相進行GC-IRMS分析。4. 根據權利要求2所述的牛肝菌中煙堿碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法，其特征 在于:步驟(2)中的氣相色譜條件為： 色譜柱：中等極性毛細管色譜柱，規(guī)格30 m X 0.32 mm X 0.25 μπι;檢測器溫度:250 °C;進樣口溫度:250 °C;載氣:氮氣，恒流流速:2.0 mL/min;進樣量:1 yL，分流比：10:1，測 定δ?和δ15Ν時采用不分流模式;升溫程序:初始溫度80 °C，保持I min，以15 °C/min的速率 至260 °C，保持6 min。5. 根據權利要求2所述的牛肝菌中煙堿碳、氫、氮穩(wěn)定同位素比值的測定方法，其特征 在于:步驟(3)、（4)所用的在線燃燒裝置條件為： 測定S13C或δ15Ν:使用氧化燃燒管，設置溫度為1000°C，管內填裝鎳/氧化鎳（Ni/NiO)， 氧化鎳作弱氧化劑，將樣品中的C氧化成CO2，將樣品中N氧化成NxOy，同時，氧化鎳轉化為鎳 單質，充入O 2可再生氧化鎳，另外，鎳單質可作特殊還原劑，將NxOy轉化為N2，樣品最終反應 生成CO2和N2，氧化燃燒管使用前應注入〇2 -個小時用于氧化管的再生； 測定S15N,需使用液氮冷阱凍結除去CO2高凝固點氣體，防止CO2進入離子源打出碎片離 子[CO+ ] m/z 28，29對[N2+ ]m/z 28，29造成干擾； 測定SD:使用高溫裂解管，設置溫度為1450Γ，高溫裂解管使用前應注入CH4-個小時用 于反應管涂炭。
【文檔編號】G01N30/02GK105954428SQ201610518597
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】韓書磊, 陳歡, 馬瀟, 付亞寧, 劉彤, 侯宏衛(wèi), 胡清源
【申請人】國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心